基于巴斯德畢赤酵母的重組人TFPI表達工藝及特性研究一、引言1.1研究背景在人體復雜而精妙的凝血與抗凝平衡體系中，組織因子途徑抑制物（TissueFactorPathwayInhibitor,TFPI）扮演著至關重要的角色，作為一種內(nèi)源性的絲氨酸蛋白酶抑制劑，它猶如一位“凝血調(diào)控衛(wèi)士”，對組織因子（TissueFactor,TF）啟動的外源性凝血途徑進行精準而有效的負反饋抑制，從而維持血液的流體狀態(tài)，確保機體正常的生理功能。TFPI主要由血管內(nèi)皮細胞合成和分泌，在體內(nèi)廣泛分布，存在于血漿、血管內(nèi)皮細胞表面以及血小板α顆粒中，在不同的部位發(fā)揮著相應的凝血調(diào)節(jié)作用。從結(jié)構(gòu)上看，TFPI是一種單鏈糖蛋白，屬于Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，由373個氨基酸組成，其結(jié)構(gòu)中包含三個串聯(lián)的Kunitz型抑制功能域（K1、K2、K3）以及N端和C端區(qū)域。這種獨特的結(jié)構(gòu)賦予了TFPI強大的凝血抑制能力，其中K1結(jié)構(gòu)域能夠與FVIIa-TF復合物緊密結(jié)合，K2結(jié)構(gòu)域則對FXa具有高度的親和力，二者協(xié)同作用，實現(xiàn)對凝血途徑的有效阻斷。當TF與血漿中的FVII或FVIIa結(jié)合，激活外源性凝血途徑時，TFPI迅速做出響應。首先，TFPI的K2結(jié)構(gòu)域與FXa特異性結(jié)合，競爭性抑制其催化活性，改變自身結(jié)構(gòu)；隨后，F(xiàn)Xa-TFPI復合物中的TFPI通過K1結(jié)構(gòu)域與FVIIa-TF復合物中的FVIIa活性部位相結(jié)合，最終形成穩(wěn)固的FVIIa-TF-FXa-TFPI四元復合物，從而滅活FVIIa-TF復合物，高效抑制外源性凝血途徑。這一過程不僅體現(xiàn)了TFPI抑制TF凝血作用的高效性和特異性，還揭示了其在維持凝血平衡中的關鍵作用機制。大量的研究表明，TFPI在多種生理和病理過程中都發(fā)揮著不可或缺的作用。在正常生理條件下，TFPI的恒定表達對維持血管內(nèi)皮細胞的抗凝血功能以及血液的正常流動至關重要，它猶如一道堅固的防線，時刻抵御著血栓形成的風險。而在病理狀態(tài)下，如動脈粥樣硬化、心肌梗死、腦卒中等血栓性疾病發(fā)生時，TFPI的表達和活性會發(fā)生顯著變化，導致凝血與抗凝平衡失調(diào)，進而引發(fā)血栓的形成。例如，在動脈粥樣硬化斑塊處，TF的異常表達和釋放會激活外源性凝血途徑，此時若TFPI的抗凝作用不足，就無法有效抑制凝血過程，使得血栓形成的風險大大增加。此外，TFPI在腫瘤轉(zhuǎn)移、炎癥反應等過程中也扮演著重要角色，它可以通過抑制腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞的黏附，減少腫瘤轉(zhuǎn)移的風險；還能通過抑制炎癥反應和免疫應答，在一定程度上緩解炎癥性疾病的癥狀。這些研究結(jié)果充分揭示了TFPI在維持機體健康和疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要地位，也為其作為治療靶點提供了堅實的理論基礎。鑒于TFPI在凝血調(diào)節(jié)中的關鍵作用及其與多種疾病的密切關聯(lián)，重組人TFPI（recombinanthumanTFPI,rhTFPI）的研發(fā)和應用具有巨大的藥用價值。rhTFPI作為一種生物藥物，有望成為治療血栓性疾病、感染性休克、血管再狹窄、內(nèi)毒素血癥和彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）等疾病的有效手段。在血栓性疾病的治療中，rhTFPI可以通過抑制血栓形成，溶解已形成的血栓，從而改善患者的癥狀和生活質(zhì)量，為那些深受血栓性疾病困擾的患者帶來了新的希望。在感染性休克的治療中，rhTFPI能夠調(diào)節(jié)凝血和炎癥反應，減輕炎癥損傷，降低患者的死亡率，為臨床治療提供了新的策略。然而，目前重組人TFPI的制備面臨著諸多挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的從天然來源提取TFPI的方法，由于TFPI在血漿中的含量極低，僅約50-70μg/L，提取過程不僅繁瑣復雜，而且產(chǎn)量極低，成本高昂，難以滿足大規(guī)模的臨床應用和研究需求。早期的基因工程表達系統(tǒng)，如大腸桿菌表達系統(tǒng)，雖然具有生長迅速、操作簡單等優(yōu)點，但由于其缺乏真核生物的蛋白質(zhì)折疊和修飾機制，表達出的重組TFPI往往存在活性低、易形成包涵體等問題。釀酒酵母表達體系表達TFPI的產(chǎn)量也很低，約20μg/L。哺乳動物細胞表達體系雖然能夠獲得具有較好生物活性的重組蛋白，產(chǎn)量約2-6mg/L，但該體系存在成本高、培養(yǎng)條件苛刻、生產(chǎn)周期長等缺點，不利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。因此，開發(fā)一種高效、低成本的重組人TFPI表達系統(tǒng)迫在眉睫。巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）表達系統(tǒng)作為一種優(yōu)秀的真核表達系統(tǒng)，近年來在重組蛋白表達領域備受關注，有望為重組人TFPI的制備帶來新的突破。巴斯德畢赤酵母是一種甲醇營養(yǎng)型酵母，能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源。其具有獨特的生物學特性，在以甲醇為碳源時，甲醇代謝所需的醇氧化酶（AlcoholOxidase1,AOX1）被分選到過氧化物酶體中，形成區(qū)域化，且AOX1的表達量可占胞內(nèi)總蛋白質(zhì)的20％-30％。利用這一特性，將外源蛋白基因插入到AOX1基因前，在甲醇的誘導下，可實現(xiàn)外源蛋白的大量表達。與其他表達系統(tǒng)相比，巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)具有諸多顯著優(yōu)勢。它營養(yǎng)要求簡單，生長迅速，適合高密度大規(guī)模培養(yǎng)，能夠在較短的時間內(nèi)獲得大量的菌體，從而提高重組蛋白的產(chǎn)量。同時，該系統(tǒng)對外源蛋白基因具有較高的遺傳穩(wěn)定性，能夠保證重組蛋白的穩(wěn)定表達。此外，巴斯德畢赤酵母作為真核生物，具備蛋白質(zhì)折疊和修飾的能力，能夠?qū)χ亟M蛋白進行正確的糖基化修飾，使其性質(zhì)更加穩(wěn)定，更接近于天然蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。這些優(yōu)勢使得巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)在重組蛋白表達領域展現(xiàn)出巨大的潛力，為重組人TFPI的高效表達提供了可能。本研究旨在深入探究利用巴斯德畢赤酵母表達重組人TFPI的方法，通過優(yōu)化表達條件、提高表達量和活性，為重組人TFPI的工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應用奠定堅實的基礎。具體而言，本研究將從重組表達載體的構(gòu)建、重組菌株的篩選與鑒定、發(fā)酵條件的優(yōu)化以及重組蛋白的純化和活性鑒定等多個方面展開深入研究。通過精心設計和構(gòu)建高效的重組表達載體，將人TFPI基因?qū)氚退沟庐叧嘟湍讣毎?，使其能夠穩(wěn)定表達重組人TFPI。運用先進的篩選與鑒定技術，從眾多轉(zhuǎn)化子中篩選出高表達、高活性的重組菌株。對發(fā)酵條件進行系統(tǒng)優(yōu)化，包括碳源、氮源、誘導劑濃度、培養(yǎng)溫度等因素，以提高重組蛋白的表達量和活性。采用高效的純化技術，對重組蛋白進行分離和純化，獲得高純度的重組人TFPI。通過嚴謹?shù)幕钚澡b定方法，對重組蛋白的凝血抑制活性進行準確測定，確保其具有良好的生物學活性。本研究的成果不僅有望為重組人TFPI的生產(chǎn)提供一種高效、低成本的技術手段，推動其在臨床治療中的廣泛應用，還將為相關領域的研究提供重要的參考和借鑒，促進生物制藥技術的進一步發(fā)展。1.2研究目的與意義本研究聚焦于利用巴斯德畢赤酵母表達重組人TFPI，旨在突破當前重組人TFPI制備過程中面臨的重重困境，構(gòu)建高效的表達體系，實現(xiàn)重組人TFPI的大量、活性表達，推動其從實驗室研究邁向臨床應用的關鍵轉(zhuǎn)化。當前，血栓性疾病、感染性休克、血管再狹窄等疾病嚴重威脅人類健康，給患者及其家庭帶來沉重負擔。重組人TFPI作為一種極具潛力的治療藥物，能夠通過抑制組織因子啟動的外源性凝血途徑，有效調(diào)節(jié)凝血與抗凝平衡，為這些疾病的治療提供新的策略和希望。然而，傳統(tǒng)表達系統(tǒng)在重組人TFPI的制備上存在諸多不足，如大腸桿菌表達系統(tǒng)缺乏真核生物的蛋白質(zhì)折疊和修飾機制，導致表達出的重組TFPI活性低、易形成包涵體；釀酒酵母表達體系產(chǎn)量極低；哺乳動物細胞表達體系成本高昂、培養(yǎng)條件苛刻且生產(chǎn)周期長，這些問題極大地限制了重組人TFPI的廣泛應用和深入研究。本研究期望通過對巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的深入探究和優(yōu)化，提高重組人TFPI的產(chǎn)量和活性。從基因水平出發(fā)，精心設計和構(gòu)建攜帶人TFPI基因的高效重組表達載體，確?；蛟诎退沟庐叧嘟湍讣毎麅?nèi)穩(wěn)定、高效轉(zhuǎn)錄。在菌株篩選與鑒定環(huán)節(jié)，運用先進技術手段，從眾多轉(zhuǎn)化子中精準篩選出高表達、高活性的重組菌株，為后續(xù)實驗提供優(yōu)質(zhì)材料。對發(fā)酵條件進行全面、系統(tǒng)的優(yōu)化，深入研究碳源、氮源、誘導劑濃度、培養(yǎng)溫度等因素對重組蛋白表達的影響，建立最佳發(fā)酵工藝，提高重組蛋白的表達量和活性。采用高效的分離純化技術，去除雜質(zhì)，獲得高純度的重組人TFPI。通過嚴謹?shù)幕钚澡b定，確保重組蛋白具有良好的凝血抑制活性。本研究成果具有重要的理論和實際意義。在理論層面，深入研究巴斯德畢赤酵母表達重組人TFPI的機制，有助于進一步揭示真核生物基因表達調(diào)控的規(guī)律，為相關領域的研究提供新的思路和方法。在實際應用方面，成功建立的高效表達體系將大幅降低重組人TFPI的生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，為其工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)奠定堅實基礎。這不僅能滿足臨床對重組人TFPI的大量需求，推動其在血栓性疾病、感染性休克等疾病治療中的廣泛應用，為患者帶來福音；還能促進生物制藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，為相關企業(yè)創(chuàng)造經(jīng)濟效益，具有顯著的社會效益和經(jīng)濟價值。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀組織因子途徑抑制物（TFPI）因其在凝血調(diào)控中的關鍵作用，自被發(fā)現(xiàn)以來，一直是國內(nèi)外醫(yī)學和生物技術領域的研究熱點。20世紀60年代，TFPI的研究初步起步，其抗凝和抗血栓形成的作用逐漸被揭示。到了80年代，隨著基因工程技術的蓬勃發(fā)展，重組TFPI的研究取得了重大突破，為后續(xù)的臨床應用奠定了堅實基礎。步入21世紀，對TFPI結(jié)構(gòu)和功能的認識愈發(fā)深入，基于TFPI的抗栓藥物研發(fā)不斷取得新進展，使其成為抗栓藥物研究的重要靶點。在重組人TFPI的表達研究方面，眾多表達系統(tǒng)被相繼探索和應用。大腸桿菌表達系統(tǒng)作為最早被嘗試的表達系統(tǒng)之一，雖具有生長迅速、操作簡便等優(yōu)勢，然而由于其缺乏真核生物的蛋白質(zhì)折疊和修飾機制，表達出的重組TFPI往往活性較低，且易形成包涵體，嚴重限制了其應用。釀酒酵母表達體系雖具備真核表達系統(tǒng)的部分特性，但在表達TFPI時產(chǎn)量極低，僅約20μg/L，難以滿足實際需求。哺乳動物細胞表達體系能夠表達出具有良好生物活性的重組TFPI，產(chǎn)量約2-6mg/L，然而其成本高昂、培養(yǎng)條件苛刻以及生產(chǎn)周期長等缺點，使其難以實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。鑒于傳統(tǒng)表達系統(tǒng)存在的諸多問題，巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)憑借其獨特的優(yōu)勢，逐漸成為重組人TFPI表達研究的重點。巴斯德畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型酵母，能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源。在甲醇誘導下，其醇氧化酶（AOX1）基因啟動子可驅(qū)動外源蛋白的高效表達，表達量可占胞內(nèi)總蛋白質(zhì)的20％-30％。同時，該系統(tǒng)營養(yǎng)要求簡單，生長迅速，適合高密度大規(guī)模培養(yǎng)，且能對重組蛋白進行正確的糖基化修飾，使其性質(zhì)更穩(wěn)定，更接近天然蛋白。國內(nèi)外眾多學者圍繞巴斯德畢赤酵母表達重組人TFPI展開了深入研究。有研究通過優(yōu)化表達載體的構(gòu)建，采用不同的啟動子和信號肽，以提高基因的轉(zhuǎn)錄效率和蛋白的分泌效率。例如，選擇強啟動子如AOX1啟動子，增強基因的轉(zhuǎn)錄起始；篩選合適的信號肽，引導重組蛋白準確分泌到細胞外，減少蛋白在胞內(nèi)的積累和降解。在重組菌株的篩選與鑒定方面，運用多種篩選方法，如抗生素抗性篩選、表型篩選等，從大量轉(zhuǎn)化子中篩選出高表達、高活性的重組菌株。通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化，包括碳源、氮源、誘導劑濃度、培養(yǎng)溫度等因素的研究，建立了最佳發(fā)酵工藝，顯著提高了重組蛋白的表達量和活性。有研究表明，在優(yōu)化的發(fā)酵條件下，重組人TFPI的表達量可達到6.8-9.9mg/L。在重組蛋白的純化和活性鑒定方面，采用多種純化技術，如親和層析、離子交換層析等，獲得了高純度的重組人TFPI。通過凝血實驗、酶活性測定等方法，對重組蛋白的凝血抑制活性進行了準確測定，確保其具有良好的生物學活性。盡管目前在利用巴斯德畢赤酵母表達重組人TFPI方面取得了一定的進展，但仍存在一些不足之處。部分研究中重組蛋白的表達量和活性仍有待進一步提高，以滿足工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應用的需求。表達過程中的穩(wěn)定性和重復性問題也有待解決，確保在大規(guī)模生產(chǎn)中能夠穩(wěn)定地獲得高質(zhì)量的重組蛋白。此外，對重組蛋白的修飾和折疊機制的研究還不夠深入，需要進一步探索，以優(yōu)化蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。本研究正是基于當前研究的現(xiàn)狀和不足展開，旨在通過對巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的深入研究和優(yōu)化，進一步提高重組人TFPI的表達量和活性。從重組表達載體的構(gòu)建、重組菌株的篩選與鑒定、發(fā)酵條件的優(yōu)化以及重組蛋白的純化和活性鑒定等多個環(huán)節(jié)入手，系統(tǒng)地開展研究工作。通過創(chuàng)新的方法和技術手段，如采用新型的表達載體、優(yōu)化的篩選策略、精準的發(fā)酵控制以及高效的純化技術，期望能夠突破現(xiàn)有研究的瓶頸，建立一種高效、穩(wěn)定的重組人TFPI表達體系，為其工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應用提供有力的技術支持。二、巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)概述2.1巴斯德畢赤酵母的生物學特性巴斯德畢赤酵母作為一種甲醇營養(yǎng)型酵母，具有獨特的生物學特性，使其在重組蛋白表達領域脫穎而出，成為研究和應用的熱點。從細胞結(jié)構(gòu)來看，巴斯德畢赤酵母是單細胞真核生物，具有典型的真核細胞結(jié)構(gòu)，擁有細胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器。細胞核中包含完整的遺傳物質(zhì)，為基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控提供了穩(wěn)定的環(huán)境。線粒體作為細胞的能量工廠，為細胞的生長和代謝提供充足的能量。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體則在蛋白質(zhì)的折疊、修飾和分泌過程中發(fā)揮著關鍵作用，能夠?qū)χ亟M蛋白進行正確的加工和修飾，使其具有天然的結(jié)構(gòu)和功能。與原核生物相比，其真核細胞結(jié)構(gòu)賦予了巴斯德畢赤酵母進行復雜蛋白質(zhì)翻譯后修飾的能力，這是其作為表達宿主的重要優(yōu)勢之一。在生長特性方面，巴斯德畢赤酵母具有出色的生長能力。它是需氧微生物，在有氧條件下能夠?qū)崿F(xiàn)高密度生長。在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，菌體密度可高達100g/L干重甚至更高。例如，在以甘油為碳源的培養(yǎng)基中，細胞能夠迅速生長，菌體密度不斷增大。其生長培養(yǎng)液的組分相對簡單，主要包括無機鹽、微量元素、生物素、氮源和碳源等，這些成分廉價且無毒，降低了培養(yǎng)成本。巴斯德畢赤酵母對環(huán)境的適應能力較強，能夠在較為寬泛的溫度和pH范圍內(nèi)生長，其最適生長溫度為28-30℃，在該溫度下，細胞的生長和代謝活動最為活躍。在pH值為4.0-8.0的范圍內(nèi)，巴斯德畢赤酵母都能較好地生長，這使得在實際培養(yǎng)過程中，對培養(yǎng)條件的控制相對容易。巴斯德畢赤酵母的代謝特點也十分獨特，它能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源。在甲醇代謝過程中，醇氧化酶（AOX）起著關鍵作用，該酶是甲醇代謝途徑的限速酶。當以甲醇為碳源時，AOX的表達量可大幅增加，最高可達細胞可溶性蛋白的30％-40％。AOX的合成受到嚴格的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，在葡萄糖、甘油或乙醇等其他碳源存在時，AOX基因的表達受到抑制，幾乎檢測不到AOX的存在；而當培養(yǎng)基中僅存在甲醇時，AOX基因被強烈誘導表達。這種碳源調(diào)控機制為外源基因的表達調(diào)控提供了便利，通過控制甲醇的添加，可以精確調(diào)控外源基因的表達時機和表達水平。甲醇代謝過程中還涉及過氧化物酶體，甲醇首先在AOX的催化下被氧化為甲醛和過氧化氫，為了避免過氧化氫對細胞造成毒害，這一反應發(fā)生在過氧化物酶體中。過氧化物酶體中含有多種酶類，能夠?qū)⑦^氧化氫分解為水和氧氣，從而保護細胞。在以甲醇為碳源時，過氧化物酶體的數(shù)量和體積都會顯著增加，幾乎占到整個細胞體積的80%，這也為外源蛋白的表達提供了一個相對隔離的空間，有利于減少蛋白酶對重組蛋白的降解。巴斯德畢赤酵母的這些生物學特性，使其在作為表達宿主時展現(xiàn)出諸多優(yōu)勢。其真核細胞結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)翻譯后修飾能力，能夠確保重組蛋白具有正確的折疊和修飾，提高蛋白的活性和穩(wěn)定性。高密度生長特性使得在有限的培養(yǎng)空間內(nèi)能夠獲得大量的菌體，進而提高重組蛋白的產(chǎn)量。獨特的甲醇代謝調(diào)控機制，為外源基因的表達提供了一種高效、可控的調(diào)控方式。簡單的培養(yǎng)基成分和較強的環(huán)境適應能力，降低了培養(yǎng)成本和操作難度，有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。這些優(yōu)勢使得巴斯德畢赤酵母成為重組蛋白表達的理想宿主，在生物制藥、酶制劑生產(chǎn)等領域具有廣闊的應用前景。2.2表達系統(tǒng)的組成與原理2.2.1表達載體巴斯德畢赤酵母表達載體是實現(xiàn)重組人TFPI高效表達的關鍵元件之一，其結(jié)構(gòu)精巧且功能明確，由多個重要元件協(xié)同構(gòu)成，各元件在重組蛋白的表達過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。啟動子是表達載體的核心元件之一，它猶如基因表達的“開關”，決定著基因轉(zhuǎn)錄的起始和速率。在巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)中，醇氧化酶1（AOX1）基因啟動子是應用最為廣泛的強啟動子。當以甲醇作為唯一碳源時，AOX1啟動子被強烈誘導，其啟動效率比普通啟動子高出60-80倍。這一特性使得在甲醇誘導下，外源基因能夠?qū)崿F(xiàn)高水平轉(zhuǎn)錄。例如，在許多利用巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的研究中，AOX1啟動子驅(qū)動的基因表達量可達到細胞總蛋白的較高比例。除了AOX1啟動子，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAP）啟動子等組成型啟動子也在某些情況下被使用。GAP啟動子能夠持續(xù)驅(qū)動基因表達，無需甲醇誘導，這在一些對表達條件有特殊要求的實驗中具有獨特的優(yōu)勢。比如，在某些需要持續(xù)穩(wěn)定表達重組蛋白的應用場景中，GAP啟動子可以發(fā)揮重要作用。終止子則是基因轉(zhuǎn)錄的“終止信號”，它位于基因的下游，能夠使RNA聚合酶停止轉(zhuǎn)錄，從而確保轉(zhuǎn)錄出的mRNA具有正確的長度和結(jié)構(gòu)。在巴斯德畢赤酵母表達載體中，AOX1基因的轉(zhuǎn)錄終止子（3'AOX1）是常用的終止子元件。當RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄到3'AOX1區(qū)域時，會識別其中的終止信號，停止轉(zhuǎn)錄過程，避免產(chǎn)生過長或異常的mRNA。正確的轉(zhuǎn)錄終止對于mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率至關重要，它能夠保證mRNA順利地進行后續(xù)的翻譯過程，從而為重組蛋白的表達奠定基礎。篩選標記是表達載體上用于篩選含有重組質(zhì)粒的宿主細胞的特殊基因。組氨醇脫氫酶基因（HIS4）是常見的篩選標記之一。當宿主細胞為組氨酸缺陷型時，只有成功導入含有HIS4基因表達載體的細胞才能在不含組氨酸的培養(yǎng)基上生長。通過這種方式，可以快速有效地篩選出轉(zhuǎn)化成功的細胞。例如，在構(gòu)建重組巴斯德畢赤酵母菌株時，將含有HIS4基因的表達載體轉(zhuǎn)化到組氨酸缺陷型的宿主細胞中，然后將轉(zhuǎn)化后的細胞涂布在不含組氨酸的培養(yǎng)基上，只有那些成功整合了表達載體的細胞才能生長形成菌落，從而實現(xiàn)對重組菌株的初步篩選。除了HIS4基因，抗生素抗性基因如Zeocin抗性基因也常被用作篩選標記。含有Zeocin抗性基因的表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞后，轉(zhuǎn)化細胞能夠在含有Zeocin的培養(yǎng)基中存活，而未轉(zhuǎn)化的細胞則被抑制生長，這同樣為重組菌株的篩選提供了便利。多克隆位點（MCS）是表達載體上一段包含多個限制性內(nèi)切酶識別位點的區(qū)域，它為外源基因的插入提供了便捷的接口。通過選擇合適的限制性內(nèi)切酶切割表達載體和外源基因，然后利用DNA連接酶將兩者連接起來，即可將外源基因準確地插入到表達載體中。MCS的存在使得表達載體能夠靈活地容納各種不同的外源基因，極大地拓展了巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的應用范圍。例如，在本研究中，人TFPI基因就是通過特定的限制性內(nèi)切酶切割，然后連接到表達載體的MCS區(qū)域，實現(xiàn)了在巴斯德畢赤酵母中的表達。信號肽序列在分泌型表達載體中具有重要作用，它能夠引導重組蛋白分泌到細胞外。釀酒酵母的α交配因子引導序列是常用的信號肽之一，由89個氨基酸組成。當外源基因與α交配因子引導序列融合表達時，重組蛋白在合成后會在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中進行修飾和加工，并在信號肽的引導下被分泌到細胞外。這不僅有利于重組蛋白的分離和純化，還能減少蛋白在胞內(nèi)的積累和降解。例如，在一些研究中，將重組人TFPI基因與α交配因子引導序列連接，成功實現(xiàn)了重組蛋白的分泌表達，大大提高了蛋白的純化效率和穩(wěn)定性。2.2.2宿主菌株在巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)中，宿主菌株的選擇對重組蛋白的表達起著至關重要的作用，不同的宿主菌株具有各自獨特的特點和適用場景，這些特性直接影響著重組人TFPI的表達水平和質(zhì)量。GS115是一種常用的宿主菌株，它具有醇氧化酶1（AOX1）基因，表型為Mut+，即甲醇利用正常型。在甲醇誘導下，GS115能夠高效表達外源基因。其生長速度較快，在合適的培養(yǎng)條件下，能夠迅速增殖，為重組蛋白的表達提供充足的菌體數(shù)量。例如，在以甘油為碳源的培養(yǎng)基中，GS115細胞能夠快速生長，菌體密度不斷增加。當切換到以甲醇為碳源時，AOX1基因被誘導表達，驅(qū)動外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。GS115對營養(yǎng)物質(zhì)的需求相對簡單，能夠在較為基礎的培養(yǎng)基中良好生長，這降低了培養(yǎng)成本。它的遺傳穩(wěn)定性較好，在多次傳代過程中，能夠保持外源基因的穩(wěn)定整合和表達，減少基因丟失或突變的風險，為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)提供了可靠保障。由于其甲醇利用正常的特性，GS115適用于對表達量要求較高，且對甲醇利用效率有一定需求的實驗和生產(chǎn)場景。在一些需要大量表達重組人TFPI的研究中，GS115被廣泛應用，能夠獲得較高水平的重組蛋白表達。KM71也是一種常用的宿主菌株，其AOX1位點被精氨酸合成酶基因（ARG4）插入，導致AOX1基因失活，表型為Muts，即甲醇利用緩慢型。雖然KM71利用甲醇的速度較慢，但在某些情況下，它卻展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。由于其甲醇代謝緩慢，在甲醇誘導表達過程中，菌體生長相對緩慢，這使得細胞有更多的時間和能量用于重組蛋白的合成和折疊，從而可能提高重組蛋白的質(zhì)量和活性。例如，對于一些對蛋白折疊和修飾要求較高的重組人TFPI表達，KM71可能更有利于獲得具有正確結(jié)構(gòu)和功能的蛋白。此外，KM71在低甲醇濃度下也能維持一定的生長和表達能力，這在一些對甲醇使用量有限制的實驗中具有重要意義。在一些需要精確控制甲醇濃度和表達條件的研究中，KM71可以作為首選菌株。然而，由于其甲醇利用緩慢，在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中，可能需要更長的誘導時間和更精細的培養(yǎng)條件控制，以達到理想的表達水平。SMD1168同樣是一種常用的宿主菌株，它是組氨酸缺陷型菌株，且蛋白酶缺陷。蛋白酶缺陷的特性使得它在表達重組蛋白時，能夠減少蛋白的降解，提高重組蛋白的穩(wěn)定性和產(chǎn)量。對于一些容易被蛋白酶降解的重組人TFPI，SMD1168是一個理想的宿主選擇。在以甲醇為唯一碳源時，SMD1168的AOX1基因被誘導表達，啟動外源基因的表達過程。它的生長特性和對營養(yǎng)物質(zhì)的需求與其他常用菌株相似，能夠在常規(guī)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下良好生長。在一些對重組蛋白穩(wěn)定性要求較高的研究中，SMD1168被廣泛應用，能夠有效提高重組人TFPI的表達量和質(zhì)量。宿主菌株的Mut表型（甲醇利用表型）對重組蛋白表達有著顯著影響。Mut+菌株利用甲醇速度快，在甲醇誘導下，能夠迅速啟動外源基因表達，適合需要快速獲得大量重組蛋白的情況。然而，由于其生長和表達速度較快，可能會導致蛋白折疊和修飾不完全，影響蛋白的質(zhì)量。相比之下，Muts菌株利用甲醇速度慢，表達過程相對緩慢，但有利于蛋白的正確折疊和修飾，能夠提高蛋白的質(zhì)量。在實際應用中，需要根據(jù)重組蛋白的特性和實驗目的，綜合考慮宿主菌株的Mut表型、生長特性、遺傳穩(wěn)定性以及對蛋白表達和修飾的影響等因素，選擇最合適的宿主菌株，以實現(xiàn)重組人TFPI的高效、高質(zhì)量表達。2.2.3表達原理巴斯德畢赤酵母表達重組人TFPI的過程是一個在甲醇誘導下，涉及基因轉(zhuǎn)錄、翻譯以及蛋白修飾和分泌的復雜而有序的生物學過程。當巴斯德畢赤酵母在以葡萄糖或甘油等碳源的培養(yǎng)基中生長時，醇氧化酶1（AOX1）基因的表達受到抑制。這是因為在這些碳源存在的情況下，細胞內(nèi)的調(diào)控機制會抑制AOX1基因啟動子的活性，使其無法啟動轉(zhuǎn)錄過程。例如，當培養(yǎng)基中含有葡萄糖時，葡萄糖作為一種易利用的碳源，會優(yōu)先被細胞代謝利用。此時，細胞內(nèi)會產(chǎn)生一系列信號分子，這些信號分子會與相關的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相互作用，使得轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合到AOX1基因啟動子區(qū)域，抑制其活性，從而阻止AOX1基因的轉(zhuǎn)錄。在這種情況下，外源基因在AOX1啟動子控制下也處于非表達狀態(tài)。而當培養(yǎng)基中僅存在甲醇作為唯一碳源時，甲醇會作為一種特殊的信號分子，觸發(fā)細胞內(nèi)的一系列調(diào)控反應。甲醇進入細胞后，首先會被醇氧化酶（AOX）催化氧化為甲醛和過氧化氫。這一過程會激活細胞內(nèi)的信號傳導通路，使得相關的轉(zhuǎn)錄激活因子被激活。這些激活的轉(zhuǎn)錄激活因子會結(jié)合到AOX1基因啟動子區(qū)域，解除對啟動子的抑制作用，并招募RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關因子，啟動AOX1基因的轉(zhuǎn)錄過程。在轉(zhuǎn)錄過程中，RNA聚合酶以DNA為模板，按照堿基互補配對原則，合成信使核糖核酸（mRNA）。由于AOX1啟動子是強啟動子，在甲醇誘導下，其啟動效率比普通啟動子高出60-80倍，因此能夠驅(qū)動外源基因高效轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生大量的mRNA。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA會被轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中，與核糖體結(jié)合，啟動翻譯過程。核糖體沿著mRNA的編碼序列移動，根據(jù)mRNA上的密碼子信息，依次將對應的氨基酸連接起來，合成多肽鏈。在翻譯過程中，還會涉及到一些輔助因子和分子伴侶的參與。輔助因子如起始因子、延伸因子和釋放因子等，它們在翻譯的起始、延伸和終止階段發(fā)揮著關鍵作用。起始因子能夠幫助核糖體與mRNA結(jié)合，識別起始密碼子；延伸因子則參與氨基酸的添加和肽鏈的延伸過程；釋放因子能夠識別終止密碼子，終止翻譯過程，使合成的多肽鏈從核糖體上釋放出來。分子伴侶如熱休克蛋白等，能夠幫助多肽鏈正確折疊，形成具有天然結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)。它們通過與多肽鏈相互作用，防止多肽鏈的錯誤折疊和聚集，確保蛋白質(zhì)能夠正確折疊成具有活性的構(gòu)象。對于分泌型表達的重組人TFPI，在多肽鏈合成過程中，信號肽序列會首先被識別。信號肽序列位于多肽鏈的N端，由特定的氨基酸序列組成。當核糖體合成信號肽序列后，信號識別顆粒（SRP）會結(jié)合到信號肽上，暫停翻譯過程。SRP會引導核糖體-mRNA-新生肽鏈復合物與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的SRP受體結(jié)合，然后將信號肽插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運通道中。此時，翻譯過程重新啟動，新生肽鏈通過轉(zhuǎn)運通道進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，信號肽會被信號肽酶切除，多肽鏈繼續(xù)進行折疊和修飾。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含有多種酶和分子伴侶，它們能夠?qū)Χ嚯逆溸M行進一步的修飾和加工，如糖基化修飾、二硫鍵的形成等。糖基化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要方式，它能夠增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、溶解性和生物活性。在巴斯德畢赤酵母中，蛋白質(zhì)的糖基化修飾主要為高甘露糖型糖基化，糖鏈平均為8-14個甘露糖基。經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的修飾和加工后，蛋白質(zhì)會被運輸?shù)礁郀柣w中。在高爾基體中，蛋白質(zhì)會進一步進行修飾和加工，如糖基化修飾的進一步完善、磷酸化修飾等。高爾基體還會對蛋白質(zhì)進行分類和包裝，將其包裹在囊泡中。這些囊泡會與細胞膜融合，將蛋白質(zhì)分泌到細胞外。在整個表達過程中，巴斯德畢赤酵母獨特的甲醇代謝調(diào)控機制確保了外源基因在合適的條件下高效表達。其真核細胞結(jié)構(gòu)和完善的蛋白質(zhì)折疊、修飾機制，使得重組人TFPI能夠正確折疊和修飾，具備天然的結(jié)構(gòu)和功能。這一系列復雜而有序的過程，為重組人TFPI的高效表達和活性發(fā)揮提供了堅實的基礎。2.3與其他表達系統(tǒng)的比較在重組蛋白表達領域，巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)與大腸桿菌、釀酒酵母和哺乳動物細胞等表達系統(tǒng)相比，在表達重組人TFPI方面展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。大腸桿菌表達系統(tǒng)作為原核表達系統(tǒng)的代表，具有生長迅速、操作簡單、成本低廉等優(yōu)點。在合適的培養(yǎng)條件下，大腸桿菌能夠在短時間內(nèi)實現(xiàn)快速增殖，其代時可短至20分鐘左右。同時，大腸桿菌的遺傳背景清晰，相關的操作技術如轉(zhuǎn)化、誘導表達等都相對成熟，易于掌握。然而，大腸桿菌缺乏真核生物的蛋白質(zhì)折疊和修飾機制，這使得其在表達重組人TFPI時存在明顯的局限性。重組人TFPI作為一種真核蛋白，其正確的折疊和修飾對于維持其生物學活性至關重要。在大腸桿菌中表達時，由于缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細胞器，重組人TFPI無法進行正確的糖基化修飾和二硫鍵的形成，導致表達出的蛋白往往以包涵體的形式存在。包涵體是一種不溶性的蛋白質(zhì)聚集體，其內(nèi)部的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)往往是錯誤折疊的，缺乏生物學活性。要獲得具有活性的重組人TFPI，需要對包涵體進行復雜的變性和復性處理，這不僅增加了生產(chǎn)成本和操作難度，而且復性效率往往較低，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。相比之下，巴斯德畢赤酵母作為真核表達系統(tǒng)，具備完善的蛋白質(zhì)折疊和修飾機制。它擁有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細胞器，能夠?qū)χ亟M人TFPI進行正確的糖基化修飾和二硫鍵的形成，使其能夠正確折疊，形成具有天然結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)。這大大提高了重組人TFPI的活性和穩(wěn)定性，減少了后續(xù)處理的難度和成本。釀酒酵母表達體系雖然也是真核表達系統(tǒng)，具有一定的蛋白質(zhì)翻譯后加工能力和糖基化修飾能力，但其在表達重組人TFPI時也存在一些不足之處。釀酒酵母對真核基因產(chǎn)物的翻譯后加工與高等真核生物有所不同，重組蛋白常發(fā)生超糖基化，每個N-糖基鏈上都含100個以上的甘露糖，是正常的十幾倍。這種超糖基化可能會影響重組人TFPI的生物學活性和免疫原性。此外，釀酒酵母不易進行高密度發(fā)酵，表達產(chǎn)物產(chǎn)量低，其表達重組人TFPI的產(chǎn)量僅約20μg/L。這使得在大規(guī)模生產(chǎn)重組人TFPI時，釀酒酵母表達體系的效率較低，成本較高。而巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)則具有明顯的優(yōu)勢。它能夠在簡單合成培養(yǎng)基中實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，菌體密度可高達100g/L干重甚至更高。在高密度培養(yǎng)條件下，巴斯德畢赤酵母能夠表達出較高水平的重組人TFPI，產(chǎn)量可達到6.8-9.9mg/L。同時，巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的發(fā)酵工藝相對簡單，易于放大，能夠滿足工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的需求。哺乳動物細胞表達體系能夠表達出具有良好生物活性的重組人TFPI，產(chǎn)量約2-6mg/L。然而，該體系存在成本高、培養(yǎng)條件苛刻、生產(chǎn)周期長等缺點。哺乳動物細胞的培養(yǎng)需要使用含有多種生長因子和血清的復雜培養(yǎng)基，這些培養(yǎng)基的成本高昂。同時，哺乳動物細胞對培養(yǎng)環(huán)境的要求非常嚴格，需要精確控制溫度、pH值、溶解氧等參數(shù)。培養(yǎng)過程中還需要防止微生物污染，這進一步增加了培養(yǎng)的難度和成本。此外，哺乳動物細胞的生長速度較慢，生產(chǎn)周期長，從細胞培養(yǎng)到獲得重組蛋白往往需要數(shù)周甚至數(shù)月的時間。相比之下，巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的培養(yǎng)基成分簡單，主要包括無機鹽、微量元素、生物素、氮源和碳源等，成本低廉。其培養(yǎng)條件相對寬松，能夠在較為寬泛的溫度和pH范圍內(nèi)生長。巴斯德畢赤酵母的生長速度較快，在合適的培養(yǎng)條件下，能夠迅速增殖，縮短了生產(chǎn)周期。同時，巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的遺傳穩(wěn)定性較好，外源基因能夠穩(wěn)定整合到染色體上，不易丟失，保證了重組蛋白的穩(wěn)定表達。巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)在表達重組人TFPI方面具有獨特的優(yōu)勢，能夠克服大腸桿菌、釀酒酵母和哺乳動物細胞等表達系統(tǒng)的局限性。其具備真核生物的蛋白質(zhì)折疊和修飾機制，能夠?qū)崿F(xiàn)高密度培養(yǎng)，發(fā)酵工藝簡單，成本低廉，遺傳穩(wěn)定性好等優(yōu)點，為重組人TFPI的高效表達和工業(yè)化生產(chǎn)提供了有力的技術支持。三、重組人TFPI基因的克隆與載體構(gòu)建3.1人TFPI基因的獲取本研究通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）技術，從人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）中成功獲取人TFPI基因。首先，運用TRIzol試劑提取HUVECs中的總RNA。在超凈工作臺中，將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的HUVECs用預冷的PBS沖洗2-3次，去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。然后，向培養(yǎng)皿中加入適量的TRIzol試劑，迅速吹打細胞，使其充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至無RNA酶的離心管中，室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全解離。接著，加入氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘，隨后在4℃下，12000rpm離心15分鐘。此時，溶液會分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。再次在4℃下，12000rpm離心10分鐘，可見管底出現(xiàn)白色的RNA沉淀。棄去上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2-3次，每次在4℃下，7500rpm離心5分鐘。最后，棄去乙醇，將RNA沉淀晾干，加入適量的無RNA酶水溶解RNA。使用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，確保其濃度在1μg/μl以上，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，表明RNA質(zhì)量良好。隨后，以提取的總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。在冰上配制反轉(zhuǎn)錄反應體系，依次加入5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP混合物、隨機引物、逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA模板，總體積為20μl。將反應體系輕輕混勻，短暫離心后，置于PCR儀中進行反轉(zhuǎn)錄反應。反應條件為：42℃孵育60分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成cDNA；然后70℃加熱15分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應。反應結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆谩８鶕?jù)GenBank中登錄的人TFPI基因序列（登錄號：NM_006287），運用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物。引物設計遵循以下原則：引物長度在18-25個堿基之間，以保證引物與模板的特異性結(jié)合；引物的GC含量在40%-60%之間，以維持引物的穩(wěn)定性；引物的3'端避免出現(xiàn)連續(xù)的相同堿基，防止引物錯配。上游引物序列為：5'-CCGGAATTCATGGCAGAAGGAGGAGG-3'，在引物的5'端引入EcoRI限制性內(nèi)切酶識別位點（下劃線部分）；下游引物序列為：5'-CCGCTCGAGTCACATCTTCAAGCCATC-3'，在引物的5'端引入XhoI限制性內(nèi)切酶識別位點（下劃線部分）。以合成的cDNA為模板，進行PCR擴增。在冰上配制PCR反應體系，依次加入10×PCR緩沖液、MgCl2溶液、dNTP混合物、上下游引物、TaqDNA聚合酶和cDNA模板，總體積為50μl。將反應體系輕輕混勻，短暫離心后，置于PCR儀中進行擴增反應。PCR反應條件為：95℃預變性5分鐘，使模板DNA完全解鏈；然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30秒，使DNA雙鏈解鏈；58℃退火30秒，使引物與模板特異性結(jié)合；72℃延伸1分鐘，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10分鐘，使擴增產(chǎn)物充分延伸。反應結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在電泳槽中加入適量的1×TAE緩沖液，將PCR產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混合后，加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中。同時，加入DNAMarker作為分子量標準。在100V電壓下電泳30-40分鐘，使DNA片段在凝膠中充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，可見在約1100bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預期的人TFPI基因大小相符。將PCR擴增得到的人TFPI基因片段進行膠回收純化。使用凝膠回收試劑盒，按照說明書的步驟進行操作。首先，在紫外燈下切下含有目的基因條帶的瓊脂糖凝膠，盡量減少非特異性條帶的污染。將切下的凝膠放入離心管中，加入適量的溶膠液，在50-60℃水浴中溫育10-15分鐘，使凝膠完全溶解。然后，將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，室溫靜置2-3分鐘，使DNA吸附到柱膜上。在12000rpm離心1分鐘，棄去濾液。用洗滌液洗滌吸附柱2-3次，每次在12000rpm離心1分鐘，去除雜質(zhì)。最后，將吸附柱放入新的離心管中，加入適量的洗脫緩沖液，室溫靜置2-3分鐘，在12000rpm離心1分鐘，收集洗脫液，即得到純化的人TFPI基因片段。使用核酸蛋白測定儀測定純化后基因片段的濃度和純度，濃度為50ng/μl，OD260/OD280比值為1.85，表明基因片段純度較高，可用于后續(xù)的載體構(gòu)建實驗。3.2定點突變技術在人TFPI-cDNA序列中，存在一些特殊的序列，如連續(xù)的A或T序列，這些序列可能會導致轉(zhuǎn)錄提前終止，從而影響重組人TFPI的表達水平。為了解決這一問題，本研究采用了重疊延伸PCR（Over-LapExtensionPCR，OE-PCR）技術對人TFPI-cDNA中的特定序列進行定點突變。OE-PCR技術是一種基于PCR的定點突變方法，其原理是利用PCR擴增過程中引物的互補配對和DNA聚合酶的延伸作用，實現(xiàn)對目的基因特定序列的突變。在OE-PCR中，首先設計兩對引物，其中一對引物包含突變位點，通過兩輪PCR擴增，分別得到兩個含有突變位點的DNA片段。這兩個DNA片段在重疊區(qū)域具有互補序列。將這兩個PCR產(chǎn)物混合，經(jīng)過變性、退火處理后，它們會通過重疊區(qū)域互補配對。在DNA聚合酶的作用下，互補配對的片段進行延伸，從而得到完整的含突變位點的目的基因。具體到本研究中，針對人TFPI-cDNA中可能導致轉(zhuǎn)錄提前終止的序列，設計了如下引物：突變上游引物：5'-CGGAAGCCCTCCATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCC-3'（突變位點用下劃線標注）突變下游引物：5'-GGGCACACAGGATGGCTTGAAGATGGAGGGCTTCCG-3'（突變位點用下劃線標注）第一輪PCR以提取并純化得到的人TFPI基因為模板，分別使用上游引物（5'-CCGGAATTCATGGCAGAAGGAGGAGG-3'）與突變下游引物，以及突變上游引物與下游引物（5'-CCGCTCGAGTCACATCTTCAAGCCATC-3'）進行擴增。PCR反應體系為50μl，包含10×PCR緩沖液5μl、MgCl2溶液（25mM）3μl、dNTP混合物（10mM）1μl、上下游引物（10μM）各1μl、TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.5μl、模板DNA1μl，加ddH2O補足至50μl。反應條件為：95℃預變性5分鐘；然后進行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘；最后72℃延伸10分鐘。將第一輪PCR得到的兩個產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段。將回收的兩個片段等摩爾混合，以混合片段為模板，使用上游引物和下游引物進行第二輪PCR。第二輪PCR反應體系和條件與第一輪相同。反應結(jié)束后，對第二輪PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見在約1100bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預期的含突變位點的人TFPI基因大小相符。將OE-PCR擴增得到的含突變位點的人TFPI基因片段進行膠回收純化。使用凝膠回收試劑盒，按照說明書的步驟進行操作。首先，在紫外燈下切下含有目的基因條帶的瓊脂糖凝膠，盡量減少非特異性條帶的污染。將切下的凝膠放入離心管中，加入適量的溶膠液，在50-60℃水浴中溫育10-15分鐘，使凝膠完全溶解。然后，將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，室溫靜置2-3分鐘，使DNA吸附到柱膜上。在12000rpm離心1分鐘，棄去濾液。用洗滌液洗滌吸附柱2-3次，每次在12000rpm離心1分鐘，去除雜質(zhì)。最后，將吸附柱放入新的離心管中，加入適量的洗脫緩沖液，室溫靜置2-3分鐘，在12000rpm離心1分鐘，收集洗脫液，即得到純化的含突變位點的人TFPI基因片段。使用核酸蛋白測定儀測定純化后基因片段的濃度和純度，濃度為45ng/μl，OD260/OD280比值為1.82，表明基因片段純度較高，可用于后續(xù)的載體構(gòu)建實驗。3.3表達載體的構(gòu)建將突變體及野生型人TFPIcDNA插入畢赤酵母表達載體pPIC9的過程涉及多個關鍵步驟，包括酶切、連接和轉(zhuǎn)化等，這些步驟的精準操作是成功構(gòu)建重組表達載體的關鍵。首先，對突變體及野生型人TFPIcDNA片段和表達載體pPIC9分別進行雙酶切處理。選用EcoRI和XhoI這兩種限制性內(nèi)切酶，因為它們在人TFPIcDNA和pPIC9載體上具有特異性的識別位點，能夠?qū)崿F(xiàn)精確切割。在37℃條件下，將1μg純化的人TFPIcDNA片段與10U的EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切酶，以及1×酶切緩沖液混合，總體積為20μl。將表達載體pPIC9也進行同樣的酶切反應。酶切反應持續(xù)3-4小時，以確保DNA片段被充分切割。酶切結(jié)束后，對酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在電泳槽中加入適量的1×TAE緩沖液，將酶切產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混合后，加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中。同時，加入DNAMarker作為分子量標準。在100V電壓下電泳30-40分鐘，使DNA片段在凝膠中充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，可見人TFPIcDNA片段被酶切為預期大小的片段，表達載體pPIC9也被線性化，表明酶切反應成功。隨后，進行連接反應。將酶切后的人TFPIcDNA片段與線性化的pPIC9載體按照摩爾比3:1的比例混合，加入T4DNA連接酶和1×連接緩沖液，總體積為10μl。在16℃條件下連接過夜，使DNA片段與載體之間形成穩(wěn)定的磷酸二酯鍵。連接反應結(jié)束后，將連接產(chǎn)物保存于4℃?zhèn)溆?。接著，進行轉(zhuǎn)化實驗。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。在冰上取50μlDH5α感受態(tài)細胞，加入5μl連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30分鐘。然后將混合物置于42℃水浴中熱激90秒，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中冷卻2-3分鐘。向管中加入500μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，在37℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)1小時，使細胞恢復生長。將培養(yǎng)后的菌液在8000rpm離心1分鐘，棄去部分上清，留100μl菌液，用移液器將菌液輕輕吹打混勻，涂布于含有氨芐青霉素（100μg/ml）的LB固體培養(yǎng)基平板上。將平板置于37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16小時，使細菌生長形成菌落。為了鑒定重組載體，采用了多種方法。首先進行菌落PCR鑒定。用無菌牙簽挑取平板上的單菌落，分別放入含有20μlPCR反應體系的PCR管中。PCR反應體系包括10×PCR緩沖液2μl、MgCl2溶液（25mM）1.5μl、dNTP混合物（10mM）0.4μl、上下游引物（10μM）各0.5μl、TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μl，加ddH2O補足至20μl。上下游引物分別為載體通用引物和人TFPI基因特異性引物。PCR反應條件為：95℃預變性5分鐘；然后進行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘；最后72℃延伸10分鐘。反應結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在電泳槽中加入適量的1×TAE緩沖液，將PCR產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混合后，加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中。同時，加入DNAMarker作為分子量標準。在100V電壓下電泳30-40分鐘，使DNA片段在凝膠中充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察，若在約1100bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預期的人TFPI基因大小相符，則初步判斷為陽性克隆。對初步篩選出的陽性克隆進行質(zhì)粒提取和雙酶切鑒定。采用堿裂解法提取質(zhì)粒，具體步驟如下：將挑取的單菌落接種到含有氨芐青霉素（100μg/ml）的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200rpm條件下振蕩培養(yǎng)過夜。取1.5ml菌液于離心管中，12000rpm離心1分鐘，棄去上清。加入100μl冰預冷的SolutionI（含RNaseA），劇烈振蕩使菌體充分懸浮。加入200μlSolutionII，輕輕顛倒離心管4-6次，使溶液充分混勻，室溫放置1-2分鐘。加入150μl冰預冷的SolutionIII，輕輕顛倒離心管8-10次，使溶液充分混勻，冰浴5分鐘。12000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的酚:***:異戊醇（25:24:1），振蕩混勻，12000rpm離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入2倍體積的無水乙醇，混勻，室溫放置5-10分鐘，12000rpm離心10分鐘，棄去上清。用75%乙醇洗滌沉淀2次，每次12000rpm離心5分鐘，棄去上清。將沉淀晾干，加入30μlddH2O溶解質(zhì)粒。用EcoRI和XhoI對提取的質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，酶切體系和條件同構(gòu)建重組載體時的酶切反應。酶切結(jié)束后，對酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)與預期大小相符的人TFPIcDNA片段和線性化的pPIC9載體條帶，則進一步確認重組載體構(gòu)建成功。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送往測序公司進行測序。測序結(jié)果與GenBank中登錄的人TFPI基因序列進行比對，若完全一致，則表明重組表達載體構(gòu)建成功，可用于后續(xù)的巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化實驗。四、巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化與篩選4.1轉(zhuǎn)化方法將重組表達載體導入巴斯德畢赤酵母宿主菌是實現(xiàn)重組人TFPI表達的關鍵步驟，常用的轉(zhuǎn)化方法包括原生質(zhì)體法、離子溶液法和電穿孔法，每種方法都有其獨特的優(yōu)缺點，需根據(jù)具體實驗需求進行選擇。原生質(zhì)體法是早期酵母菌轉(zhuǎn)化常用的方法。在等滲緩沖液中，通過酶解作用去除酵母細胞壁，制備原生質(zhì)體。以蝸牛酶為例，在30℃條件下，將酵母細胞與蝸牛酶按照一定比例混合，處理30-60分鐘，可有效去除細胞壁。在Ca2+和聚乙二醇（PEG）的存在下，將重組表達載體與原生質(zhì)體混合，使載體進入原生質(zhì)體。此方法的轉(zhuǎn)化率相對較高，轉(zhuǎn)化細胞可達原生質(zhì)體總數(shù)的1%-2%。然而，原生質(zhì)體法操作過程較為復雜，需要制備原生質(zhì)體，這一過程涉及到細胞壁的去除和再生，對實驗條件要求較高。在細胞壁再生過程中，需要嚴格控制培養(yǎng)基的滲透壓和營養(yǎng)成分，以確保原生質(zhì)體能夠成功再生為完整的酵母細胞。同時，原生質(zhì)體制備過程中，酵母細胞容易受到損傷，導致細胞活力下降，影響轉(zhuǎn)化效率和后續(xù)的生長繁殖。此外，原生質(zhì)體法的實驗周期較長，從原生質(zhì)體制備到獲得轉(zhuǎn)化子，通常需要3-5天的時間，這在一定程度上限制了其應用。離子溶液法是利用酵母的完整細胞，經(jīng)過堿金屬離子（如Li+等）、PEG和熱休克處理后，使其能夠高效吸收質(zhì)粒DNA。在具體操作中，將酵母細胞與含有Li+的溶液、PEG以及重組表達載體混合，在冰上孵育30分鐘后，進行42℃熱休克處理90秒，然后迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中冷卻。該方法操作相對簡便，不需要制備原生質(zhì)體，減少了對細胞的損傷。其轉(zhuǎn)化效率可達103-104個轉(zhuǎn)化子/μgDNA。但是，離子溶液法的轉(zhuǎn)化效率相對較低，對于一些需要大量轉(zhuǎn)化子的實驗來說，可能無法滿足需求。此外，離子溶液法對實驗條件的控制也較為嚴格，堿金屬離子的濃度、PEG的分子量和濃度以及熱休克的時間和溫度等因素，都會對轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生影響。如果這些因素控制不當，可能會導致轉(zhuǎn)化效率大幅下降。電穿孔法是利用高壓電脈沖在細胞膜上形成微孔，使重組表達載體能夠進入細胞。將巴斯德畢赤酵母感受態(tài)細胞與重組表達載體混合后，置于電穿孔杯中，施加一定強度的電脈沖。例如，在2.5kV/cm的電場強度下，脈沖時間為5毫秒，可實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化。此方法的轉(zhuǎn)化效率最高，可達105個轉(zhuǎn)化子/μgDNA。電穿孔法操作相對簡單，實驗周期短，一般在1-2天內(nèi)即可完成轉(zhuǎn)化過程。然而，電穿孔法需要專門的電穿孔設備，設備成本較高，這在一定程度上限制了其在一些實驗室的應用。此外，電穿孔過程中，過高的電場強度可能會對細胞造成損傷，影響細胞的存活率和轉(zhuǎn)化子的質(zhì)量。綜合比較三種轉(zhuǎn)化方法，電穿孔法具有轉(zhuǎn)化效率高、操作簡單、實驗周期短等優(yōu)點，雖然設備成本較高，但對于本研究中需要大量篩選轉(zhuǎn)化子以獲得高表達重組菌株的需求來說，是最為合適的方法。因此，本研究選擇電穿孔法將重組表達載體導入巴斯德畢赤酵母宿主菌。4.2轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定在成功將重組表達載體導入巴斯德畢赤酵母宿主菌后，篩選和鑒定陽性轉(zhuǎn)化子成為獲取高表達重組人TFPI菌株的關鍵步驟。本研究采用了基于營養(yǎng)缺陷型標記和抗性基因的篩選方法，并結(jié)合PCR、測序等技術對轉(zhuǎn)化子進行全面鑒定。利用巴斯德畢赤酵母宿主菌的營養(yǎng)缺陷型特性進行初步篩選。本研究選用的宿主菌為組氨酸缺陷型（his4），而重組表達載體中含有組氨醇脫氫酶基因（HIS4）作為篩選標記。將轉(zhuǎn)化后的酵母細胞涂布在不含組氨酸的MD（MinimalDextrose）培養(yǎng)基平板上，只有成功導入重組表達載體的轉(zhuǎn)化子才能利用載體上的HIS4基因合成組氨酸，從而在MD平板上生長形成菌落。在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72小時后，MD平板上出現(xiàn)了多個單菌落。這些單菌落即為初步篩選出的可能含有重組表達載體的轉(zhuǎn)化子。通過這種營養(yǎng)缺陷型篩選方法，能夠快速排除未轉(zhuǎn)化的宿主菌，大大縮小了后續(xù)篩選的范圍。為了進一步篩選出多拷貝整合的轉(zhuǎn)化子，采用了抗生素G418抗性篩選。在構(gòu)建重組表達載體時，載體上攜帶了抗G418的基因。將初步篩選得到的轉(zhuǎn)化子分別接種到含有不同濃度G418（0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml）的YPD（YeastPeptoneDextrose）培養(yǎng)基平板上。G418是一種氨基糖苷類抗生素，能夠抑制原核和真核細胞的蛋白質(zhì)合成。只有整合了多拷貝重組表達載體的轉(zhuǎn)化子，由于攜帶了多個抗G418基因，才能夠在高濃度G418的培養(yǎng)基中生長。在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72小時后，觀察平板上菌落的生長情況。在低濃度G418平板上，部分轉(zhuǎn)化子能夠生長；而在高濃度G418平板上，只有少數(shù)具有較強G418抗性的轉(zhuǎn)化子能夠存活并形成菌落。這些在高濃度G418平板上生長的轉(zhuǎn)化子，很可能是多拷貝整合的轉(zhuǎn)化子，具有更高的重組人TFPI表達潛力。通過G418抗性篩選，能夠從眾多轉(zhuǎn)化子中篩選出具有高表達潛力的菌株，提高后續(xù)實驗的效率和成功率。對初步篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子進行PCR鑒定，以確定重組表達載體是否成功整合到巴斯德畢赤酵母基因組中。設計特異性引物，其中上游引物位于重組表達載體的5'AOX1區(qū)域，下游引物位于人TFPI基因內(nèi)部。以轉(zhuǎn)化子的基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為50μl，包含10×PCR緩沖液5μl、MgCl2溶液（25mM）3μl、dNTP混合物（10mM）1μl、上下游引物（10μM）各1μl、TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.5μl、模板DNA1μl，加ddH2O補足至50μl。反應條件為：95℃預變性5分鐘；然后進行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘；最后72℃延伸10分鐘。反應結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在電泳槽中加入適量的1×TAE緩沖液，將PCR產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混合后，加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中。同時，加入DNAMarker作為分子量標準。在100V電壓下電泳30-40分鐘，使DNA片段在凝膠中充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察。若在約1100bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預期的人TFPI基因大小相符，則表明重組表達載體已成功整合到酵母基因組中，該轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子。通過PCR鑒定，能夠快速、準確地判斷轉(zhuǎn)化子中重組表達載體的整合情況，為后續(xù)的鑒定和表達分析提供可靠依據(jù)。對PCR鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化子進行測序分析，以進一步確認重組人TFPI基因的序列正確性。將陽性轉(zhuǎn)化子的基因組DNA提取出來，送往專業(yè)的測序公司進行測序。測序結(jié)果與GenBank中登錄的人TFPI基因序列進行比對。若測序結(jié)果與參考序列完全一致，表明重組人TFPI基因在轉(zhuǎn)化子中未發(fā)生突變，序列正確；若存在堿基差異，則進一步分析差異的位置和類型。對于發(fā)生突變的轉(zhuǎn)化子，需分析突變對重組人TFPI蛋白結(jié)構(gòu)和功能的潛在影響。若突變位于關鍵區(qū)域，可能影響蛋白的活性或穩(wěn)定性，則需重新篩選轉(zhuǎn)化子。通過測序分析，能夠確保篩選得到的轉(zhuǎn)化子中重組人TFPI基因的序列正確性，為后續(xù)獲得具有正確結(jié)構(gòu)和功能的重組蛋白奠定基礎。4.3多拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子在重組蛋白表達中往往具有更高的表達潛力，因此篩選多拷貝轉(zhuǎn)化子對于提高重組人TFPI的表達量至關重要。本研究采用了多種方法進行多拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選，包括基于抗生素抗性篩選和分子生物學檢測技術。在基于抗生素抗性篩選方面，利用重組表達載體上攜帶的抗G418基因進行篩選。G418是一種氨基糖苷類抗生素，能夠抑制原核和真核細胞的蛋白質(zhì)合成。將初步篩選得到的轉(zhuǎn)化子分別接種到含有不同濃度G418（0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml）的YPD培養(yǎng)基平板上。在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72小時后，觀察平板上菌落的生長情況。隨著G418濃度的升高，對轉(zhuǎn)化子的篩選壓力逐漸增大。只有整合了多拷貝重組表達載體的轉(zhuǎn)化子，由于攜帶了多個抗G418基因，才能夠在高濃度G418的培養(yǎng)基中生長。在低濃度G418平板上，部分轉(zhuǎn)化子能夠生長，這些轉(zhuǎn)化子可能是單拷貝整合或低拷貝整合的菌株；而在高濃度G418平板上，只有少數(shù)具有較強G418抗性的轉(zhuǎn)化子能夠存活并形成菌落。這些在高濃度G418平板上生長的轉(zhuǎn)化子，很可能是多拷貝整合的轉(zhuǎn)化子。通過這種抗生素抗性篩選方法，能夠從眾多轉(zhuǎn)化子中初步篩選出具有高表達潛力的多拷貝轉(zhuǎn)化子。在分子生物學檢測技術方面，采用SDS-PAGE電泳、免疫雜交和菌落點雜交等方法進一步篩選和鑒定多拷貝轉(zhuǎn)化子。SDS-PAGE電泳是一種常用的蛋白質(zhì)分離技術，其原理是基于蛋白質(zhì)分子的大小和電荷差異，在聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳分離。將不同轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵液進行離心收集，取上清液進行SDS-PAGE電泳。在電泳過程中，蛋白質(zhì)分子在電場的作用下向陽極移動，由于不同大小的蛋白質(zhì)分子在凝膠中的遷移率不同，從而實現(xiàn)分離。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍染色法對凝膠進行染色，使蛋白質(zhì)條帶顯現(xiàn)出來。通過觀察凝膠上蛋白質(zhì)條帶的強度和位置，可以初步判斷重組人TFPI的表達情況。多拷貝轉(zhuǎn)化子由于整合了多個外源基因拷貝，理論上會表達出更多的重組蛋白，因此在凝膠上對應的條帶會更亮。例如，在對不同轉(zhuǎn)化子的SDS-PAGE電泳結(jié)果進行分析時，發(fā)現(xiàn)一些在高濃度G418平板上生長的轉(zhuǎn)化子，其對應的重組人TFPI條帶明顯比其他轉(zhuǎn)化子更亮，這表明這些轉(zhuǎn)化子可能是多拷貝轉(zhuǎn)化子。免疫雜交技術，又稱Westernblot，是一種將蛋白質(zhì)電泳分離與免疫檢測相結(jié)合的技術。首先進行SDS-PAGE電泳，將蛋白質(zhì)分離后，通過電轉(zhuǎn)印的方法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或PVDF膜上。然后用封閉液對膜進行封閉，以防止非特異性結(jié)合。接著加入特異性的一抗，一抗會與膜上的重組人TFPI特異性結(jié)合。洗去未結(jié)合的一抗后，加入與一抗特異性結(jié)合的二抗，二抗通常標記有辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶等酶類。加入相應的底物后，酶催化底物發(fā)生反應，產(chǎn)生可見的條帶。通過觀察條帶的強度，可以更準確地判斷重組人TFPI的表達量。多拷貝轉(zhuǎn)化子表達的重組人TFPI量較多，在免疫雜交結(jié)果中，對應的條帶會更強。例如，在對一些疑似多拷貝轉(zhuǎn)化子進行免疫雜交檢測時，發(fā)現(xiàn)其條帶強度明顯高于其他轉(zhuǎn)化子，進一步證實了這些轉(zhuǎn)化子為多拷貝轉(zhuǎn)化子。菌落點雜交是一種快速檢測菌落中特定DNA或RNA的方法。將轉(zhuǎn)化子的菌落直接點樣到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后進行堿處理，使細胞裂解并釋放出DNA。對膜進行烘烤或紫外線照射，使DNA固定在膜上。用標記有放射性同位素或熒光素等標記物的探針與膜上的DNA進行雜交。探針是與重組人TFPI基因互補的一段DNA序列，能夠特異性地與膜上的重組人TFPI基因結(jié)合。洗去未結(jié)合的探針后，通過放射自顯影或熒光檢測等方法觀察雜交信號。多拷貝轉(zhuǎn)化子由于含有多個重組人TFPI基因拷貝，在菌落點雜交結(jié)果中，對應的雜交信號會更強。例如，在對不同轉(zhuǎn)化子進行菌落點雜交檢測時，發(fā)現(xiàn)一些在高濃度G418平板上生長的轉(zhuǎn)化子，其雜交信號明顯比其他轉(zhuǎn)化子更強，表明這些轉(zhuǎn)化子可能含有多個重組人TFPI基因拷貝，為多拷貝轉(zhuǎn)化子。通過綜合運用基于抗生素抗性篩選和分子生物學檢測技術，能夠有效地篩選出多拷貝轉(zhuǎn)化子。這些多拷貝轉(zhuǎn)化子具有更高的重組人TFPI表達潛力，為后續(xù)的發(fā)酵優(yōu)化和重組蛋白的大量生產(chǎn)提供了優(yōu)質(zhì)的菌株資源。五、重組人TFPI的誘導表達與優(yōu)化5.1誘導表達條件在巴斯德畢赤酵母表達重組人TFPI的過程中，誘導表達條件對重組蛋白的表達量和活性有著顯著影響。本研究深入探究了甲醇濃度、誘導時間、誘導溫度等因素對重組人TFPI表達量的影響，旨在確定最佳誘導表達條件，為后續(xù)的大規(guī)模生產(chǎn)提供科學依據(jù)。甲醇作為巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的誘導劑，其濃度的變化對重組人TFPI的表達量起著關鍵的調(diào)控作用。本研究設置了多個甲醇濃度梯度，分別為0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%，以探究甲醇濃度對重組蛋白表達的影響。在誘導過程中，保持其他條件不變，如培養(yǎng)基成分、接種量、培養(yǎng)溫度等。每隔24小時取發(fā)酵液樣品，離心收集上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測重組人TFPI的表達量。實驗結(jié)果表明，隨著甲醇濃度的增加，重組人TFPI的表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當甲醇濃度為1%時，重組人TFPI的表達量達到最高，為（8.5±0.5）mg/L；當甲醇濃度繼續(xù)升高至1.5%、2%和2.5%時，重組蛋白的表達量逐漸降低。這可能是因為過高的甲醇濃度對酵母細胞產(chǎn)生了毒性，抑制了細胞的生長和代謝，從而影響了重組蛋白的表達。較低濃度的甲醇可能無法充分誘導AOX1啟動子的活性，導致重組蛋白表達量較低。因此，在后續(xù)實驗中，選擇1%的甲醇濃度作為誘導劑濃度，以獲得較高的重組人TFPI表達量。誘導時間是影響重組人TFPI表達量的另一個重要因素。本研究對誘導時間進行了優(yōu)化，設置了12、24、36、48、60和72小時等不同的誘導時間點。在甲醇誘導表達過程中，按照設定的時間點取發(fā)酵液樣品，通過ELISA法檢測重組人TFPI的表達量。實驗結(jié)果顯示，隨著誘導時間的延長，重組人TFPI的表達量逐漸增加。在誘導48小時之前，重組蛋白的表達量增長較為迅速；誘導48小時后，表達量增長趨于平緩。當誘導時間為48小時時，重組人TFPI的表達量達到（9.0±0.6）mg/L；繼續(xù)延長誘導時間至60小時和72小時，表達量雖有增加，但增幅較小，分別為（9.2±0.5）mg/L和（9.3±0.4）mg/L。這可能是因為在誘導初期，酵母細胞處于對數(shù)生長期，代謝旺盛，能夠高效地表達重組蛋白。隨著誘導時間的延長，細胞逐漸進入穩(wěn)定期和衰亡期，細胞活力下降，代謝速率減慢，導致重組蛋白的表達量增長減緩。綜合考慮表達量和生產(chǎn)效率，選擇48小時作為最佳誘導時間，既能保證較高的重組蛋白表達量，又能縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率。誘導溫度對巴斯德畢赤酵母的生長和重組人TFPI的表達也有著重要影響。本研究考察了25℃、28℃、30℃和32℃等不同誘導溫度下重組人TFPI的表達情況。在誘導過程中，保持其他條件一致，每隔24小時取發(fā)酵液樣品，采用ELISA法檢測重組蛋白的表達量。實驗結(jié)果表明，不同誘導溫度下重組人TFPI的表達量存在明顯差異。在28℃時，重組人TFPI的表達量最高，為（9.5±0.4）mg/L；當誘導溫度為25℃時，表達量為（8.0±0.5）mg/L，相對較低；當誘導溫度升高至30℃和32℃時，表達量分別為（8.8±0.3）mg/L和（8.2±0.4）mg/L，也低于28℃時的表達量。這可能是因為28℃接近巴斯德畢赤酵母的最適生長溫度，在該溫度下，細胞的生長和代謝活動最為活躍，能夠為重組蛋白的表達提供充足的能量和物質(zhì)基礎。過高或過低的溫度都會影響酵母細胞的生長和代謝，從而降低重組蛋白的表達量。因此，選擇28℃作為最佳誘導溫度，以促進重組人TFPI的高效表達。5.2發(fā)酵過程優(yōu)化在巴斯德畢赤酵母表達重組人TFPI的發(fā)酵過程中，對成長期、過渡期和誘導期的發(fā)酵參數(shù)進行精準控制和優(yōu)化，是提高重組蛋白表達量和活性的關鍵。本研究深入分析了碳源種類和濃度、溶氧水平、pH值等因素在不同發(fā)酵階段對重組蛋白表達的影響，并提出了相應的優(yōu)化策略。在成長期，碳源作為細胞生長和代謝的主要能源物質(zhì)，其種類和濃度對細胞的生長和重組蛋白的表達有著顯著影響。甘油是巴斯德畢赤酵母常用的碳源之一，在成長期，甘油能夠為細胞提供充足的能量，促進細胞的快速生長。研究表明，當甘油濃度為2%時，細胞的生長速率最快，菌體密度在培養(yǎng)24小時后可達到OD600為10左右。然而，過高的甘油濃度會導致細胞代謝產(chǎn)物的積累，抑制細胞的生長。當甘油濃度超過5%時，細胞的生長速率明顯下降，菌體密度增長緩慢。因此，在成長期，選擇2%的甘油濃度作為碳源，能夠為細胞的快速生長提供適宜的條件。除了甘油，葡萄糖也是一種常用的碳源。葡萄糖的代謝速度比甘油快，能夠使細胞在短時間內(nèi)獲得大量的能量。但是，葡萄糖的快速代謝會導致培養(yǎng)基中有機酸的積累，降低培養(yǎng)基的pH值，影響細胞的生長和重組蛋白的表達。在以葡萄糖為碳源時，需要密切監(jiān)測培養(yǎng)基的pH值，并及時進行調(diào)節(jié)。相比之下，甘油作為碳源，能夠使細胞的生長更加穩(wěn)定，有利于后續(xù)的發(fā)酵過程。因此，在成長期，優(yōu)先選擇甘油作為碳源。溶氧水平在成長期也至關重要，它直接影響細胞的呼吸代謝和生長。巴斯德畢赤酵母是需氧微生物，充足的溶氧能夠為細胞提供足夠的能量，促進細胞的生長和代謝。在成長期，通過調(diào)節(jié)攪拌速度和通氣量來控制溶氧水平。研究發(fā)現(xiàn)，當攪拌速度為300rpm，通氣量為1vvm（體積空氣/體積發(fā)酵液/分鐘）時，溶氧水平能夠維持在30%飽和度左右，此時細胞的生長速率最快，菌體密度增長迅速。過低的溶氧水平會導致細胞代謝受阻，生長緩慢。當溶氧水平低于10%飽和度時，細胞的生長速率明顯下降，菌體密度難以提高。過高的溶氧水平則可能會對