基于慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建肝癌細(xì)胞多熒光EMT指示模型及功能探究一、引言1.1研究背景原發(fā)性肝癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，在所有惡性腫瘤中，其致死率居高不下，位于惡性腫瘤總致死原因的第五位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年中國(guó)新增肝癌病例高達(dá)39萬多人，位居新發(fā)惡性腫瘤的第三位；同年，因肝癌死亡的人數(shù)超過36萬，死亡人數(shù)亦居惡性腫瘤第三位，且全世界近47%的肝癌病例發(fā)生在中國(guó)。肝癌的高發(fā)病率和高死亡率給社會(huì)和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存預(yù)期。和其他惡性腫瘤一樣，肝癌治療失敗的主要原因是復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。一旦肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移，病情往往迅速惡化，治療難度大幅增加。肝內(nèi)轉(zhuǎn)移會(huì)致使肝臟出現(xiàn)多個(gè)病灶或彌漫性病灶，大量正常肝細(xì)胞被癌細(xì)胞取代，肝功能嚴(yán)重受損甚至衰竭；癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至門靜脈形成癌栓，引發(fā)門靜脈高壓，導(dǎo)致食管胃底靜脈曲張、破裂出血以及肝性腹水等嚴(yán)重并發(fā)癥；通過血液途徑轉(zhuǎn)移到肺組織、骨關(guān)節(jié)等其他部位，會(huì)造成相應(yīng)器官的損害。此外，轉(zhuǎn)移引發(fā)的嚴(yán)重癌性消耗癥狀，會(huì)使患者體質(zhì)極度虛弱、身形消瘦，甚至出現(xiàn)全身衰竭，危及生命。轉(zhuǎn)移性肝癌還會(huì)導(dǎo)致肝功能下降，出現(xiàn)黃疸、腹水等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)肝性腦病，導(dǎo)致認(rèn)知障礙、人格改變和意識(shí)障礙等，患者的生存時(shí)間也會(huì)大大縮短。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）所表現(xiàn)出的細(xì)胞學(xué)機(jī)制，即細(xì)胞粘附性的喪失和遷移能力的獲得，作為腫瘤轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，受到了眾多學(xué)者的高度關(guān)注。EMT的主要特征是上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白E-cadherin表達(dá)降低，而間質(zhì)標(biāo)記蛋白表達(dá)上調(diào)。越來越多的證據(jù)表明，EMT是肝癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵事件，在肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著極為重要的作用。例如，李勤喜教授課題組的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子ZEB1在高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞系中通過非經(jīng)典轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式促進(jìn)磷酸果糖激酶PFK1的肌肉型同工酶PFKM轉(zhuǎn)錄表達(dá)，增強(qiáng)瓦伯格效應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、原位成瘤和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。李博安教授課題組揭示了Wnt信號(hào)在誘導(dǎo)肝細(xì)胞肝癌EMT過程中，可通過Snail、Slug抑制HNF4α表達(dá)，同時(shí)HNF4α與TCF4競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合β-catenin抑制Wnt信號(hào)誘導(dǎo)的EMT過程，二者形成雙負(fù)反饋環(huán)控制肝癌轉(zhuǎn)移。鑒于EMT在肝癌轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵地位，如何動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肝癌細(xì)胞的EMT事件，對(duì)深入剖析肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)理，開發(fā)針對(duì)性治療策略至關(guān)重要。通過實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)EMT過程，可以及時(shí)了解肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為變化，為早期診斷和干預(yù)提供依據(jù)；有助于篩選出對(duì)EMT過程具有關(guān)鍵調(diào)控作用的分子靶點(diǎn)，為研發(fā)新型抗癌藥物奠定基礎(chǔ)；還能為臨床治療方案的選擇和優(yōu)化提供指導(dǎo)，提高治療效果，改善患者預(yù)后。1.2研究目的與意義本研究旨在構(gòu)建基于慢病毒表達(dá)系統(tǒng)的、由EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Slug啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的多熒光報(bào)告系統(tǒng)，從而建立肝癌細(xì)胞多熒光EMT指示模型。該模型能夠動(dòng)態(tài)顯示肝癌細(xì)胞的EMT過程，為標(biāo)記示蹤肝癌EMT細(xì)胞，深入研究肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制提供有力工具。通過利用該模型，進(jìn)一步剖析肝癌細(xì)胞EMT過程中的分子調(diào)控機(jī)制，明確關(guān)鍵調(diào)控因子及其相互作用網(wǎng)絡(luò)，揭示EMT在肝癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，為肝癌轉(zhuǎn)移的防治提供理論依據(jù)。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。從理論意義來看，構(gòu)建肝癌細(xì)胞多熒光EMT指示模型，為研究EMT過程提供了一種全新的可視化工具，有助于深入了解EMT的分子機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，豐富和完善腫瘤轉(zhuǎn)移理論，為進(jìn)一步揭示肝癌轉(zhuǎn)移的奧秘奠定基礎(chǔ)。從臨床應(yīng)用價(jià)值而言，通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肝癌細(xì)胞的EMT事件，能夠篩選出與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分子標(biāo)志物，為肝癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的指標(biāo)；明確EMT過程中的關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)，為開發(fā)針對(duì)性的治療策略提供理論支持，有助于研發(fā)新型抗癌藥物，提高肝癌的治療效果，改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在肝癌研究領(lǐng)域，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）機(jī)制一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。國(guó)外學(xué)者在EMT的基礎(chǔ)理論研究方面取得了諸多成果，明確了多種調(diào)控EMT過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，如Snail、Slug、Twist等。這些轉(zhuǎn)錄因子通過與上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin等基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制其表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如Vimentin、N-cadherin等的表達(dá)，從而推動(dòng)EMT進(jìn)程。例如，美國(guó)學(xué)者在乳腺癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，Snail蛋白能夠直接結(jié)合E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列，抑制其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在肝癌研究中，也證實(shí)了類似的調(diào)控機(jī)制。國(guó)內(nèi)學(xué)者在肝癌EMT機(jī)制研究方面也成果豐碩，通過對(duì)大量臨床樣本和肝癌細(xì)胞系的研究，揭示了EMT在肝癌轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用，并發(fā)現(xiàn)了一些與肝癌EMT相關(guān)的新分子和信號(hào)通路。例如，有研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）在肝癌EMT過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，通過影響相關(guān)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在熒光報(bào)告基因用于細(xì)胞生物學(xué)研究方面，國(guó)外起步較早，已成功構(gòu)建多種基于熒光報(bào)告基因的細(xì)胞模型，用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)特定基因的表達(dá)和信號(hào)通路的激活。例如，利用綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記特定基因的啟動(dòng)子，實(shí)時(shí)觀察基因在細(xì)胞發(fā)育和分化過程中的表達(dá)變化。國(guó)內(nèi)在這一領(lǐng)域也緊跟國(guó)際步伐，不斷創(chuàng)新和改進(jìn)熒光報(bào)告基因技術(shù)。通過將不同顏色的熒光蛋白與特定基因結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)基因表達(dá)的同時(shí)監(jiān)測(cè)。有研究構(gòu)建了紅色熒光蛋白（RFP）和黃色熒光蛋白（YFP）雙標(biāo)記的報(bào)告系統(tǒng)，用于研究細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)變化。慢病毒載體作為高效的基因轉(zhuǎn)移工具，在國(guó)內(nèi)外基因治療和基礎(chǔ)研究中得到了廣泛應(yīng)用。國(guó)外利用慢病毒載體將治療基因?qū)氚屑?xì)胞，開展了多項(xiàng)基因治療臨床試驗(yàn)。在癌癥治療研究中，通過慢病毒載體將抑癌基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。國(guó)內(nèi)在慢病毒載體的應(yīng)用研究方面也取得了顯著進(jìn)展，不僅優(yōu)化了慢病毒載體的構(gòu)建和包裝技術(shù)，提高了載體的安全性和轉(zhuǎn)染效率，還將其應(yīng)用于多種疾病模型的構(gòu)建和藥物研發(fā)。例如，利用慢病毒載體構(gòu)建了攜帶特定基因的細(xì)胞模型，用于篩選和評(píng)價(jià)新型抗癌藥物的療效。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于肝癌EMT的研究，大多是通過傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法，如實(shí)時(shí)定量PCR、Westernblot等，在靜態(tài)層面檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化，難以實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地觀察EMT的全過程。雖然已有一些基于熒光報(bào)告基因的細(xì)胞模型用于研究特定基因的表達(dá)，但針對(duì)肝癌EMT過程，構(gòu)建多熒光EMT指示模型的研究相對(duì)較少。本研究提出構(gòu)建基于慢病毒表達(dá)系統(tǒng)的、由EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Slug啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的多熒光報(bào)告系統(tǒng)，建立肝癌細(xì)胞多熒光EMT指示模型，具有創(chuàng)新性和必要性。該模型能夠彌補(bǔ)現(xiàn)有研究的不足，實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞EMT過程的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，為深入研究肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制提供全新的工具和思路。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）2.1.1EMT的概念與過程上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下，向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程。在這個(gè)過程中，上皮細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生顯著改變。上皮細(xì)胞通常具有緊密的細(xì)胞連接和極性，細(xì)胞間通過緊密連接、橋粒和黏著連接等結(jié)構(gòu)相互作用，形成有序的上皮組織。在EMT過程中，這些細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，細(xì)胞極性喪失。上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-cadherin表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，上皮細(xì)胞之間的緊密聯(lián)系被打破。與此同時(shí)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如N-cadherin、Vimentin等表達(dá)上調(diào)。細(xì)胞形態(tài)也由原來的多邊形或柱狀轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮位虺衫w維細(xì)胞樣，具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。這種形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變使得細(xì)胞能夠從上皮組織中脫離出來，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，進(jìn)而侵入周圍組織和血管，為腫瘤的轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。EMT的發(fā)生涉及多個(gè)信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)通路是誘導(dǎo)EMT的關(guān)鍵通路之一。TGF-β與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，激活下游的Smad蛋白，Smad蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因的表達(dá)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路也在EMT中發(fā)揮重要作用。當(dāng)Wnt信號(hào)激活時(shí)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子（TCF）/淋巴增強(qiáng)因子（LEF）等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。此外，Notch、Hedgehog等信號(hào)通路以及Snail、Slug、Twist等轉(zhuǎn)錄因子也參與了EMT的調(diào)控過程。這些信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)EMT的發(fā)生和發(fā)展。在胚胎發(fā)育過程中，EMT起著至關(guān)重要的作用。例如，在原腸胚形成過程中，上皮細(xì)胞通過EMT轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，使得細(xì)胞能夠遷移和分化，形成不同的組織和器官。在神經(jīng)嵴形成過程中，神經(jīng)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，遷移到身體的不同部位，分化為多種細(xì)胞類型，如神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，EMT同樣扮演著重要角色。腫瘤細(xì)胞通過EMT獲得遷移和侵襲能力，從而突破基底膜，侵入周圍組織和血管，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。EMT還與腫瘤的耐藥性、干細(xì)胞特性以及免疫逃逸等密切相關(guān)。研究表明，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和放療的敏感性降低，更容易存活和增殖。同時(shí)，EMT賦予腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性，使其具有自我更新和分化的能力，增加了腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。此外，EMT過程中的腫瘤細(xì)胞能夠逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，降低機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫攻擊。2.1.2EMT在肝癌中的作用機(jī)制在肝癌的發(fā)展進(jìn)程中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）扮演著極為關(guān)鍵的角色，其通過多種機(jī)制促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。首先，EMT能夠顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在正常情況下，上皮細(xì)胞之間通過緊密連接、橋粒和黏著連接等結(jié)構(gòu)相互作用，形成穩(wěn)定的上皮組織，限制了細(xì)胞的遷移。然而，在EMT過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-cadherin的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)被破壞。同時(shí)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如N-cadherin、Vimentin等表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞形態(tài)由上皮樣轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮位虺衫w維細(xì)胞樣，獲得了更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。這些發(fā)生EMT的肝癌細(xì)胞能夠突破基底膜，侵入周圍的組織和血管，為肝癌的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。其次，EMT與肝癌的血管生成密切相關(guān)。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于充足的血液供應(yīng)，血管生成是腫瘤獲取營(yíng)養(yǎng)和氧氣的關(guān)鍵過程。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生EMT的肝癌細(xì)胞能夠分泌多種血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等。這些因子可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，促進(jìn)腫瘤血管的生成。腫瘤血管的生成不僅為腫瘤細(xì)胞提供了營(yíng)養(yǎng)和氧氣，還為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)提供了通道，進(jìn)一步促進(jìn)了肝癌的轉(zhuǎn)移。再者，EMT在肝癌的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵御腫瘤的重要防線，但腫瘤細(xì)胞可以通過多種機(jī)制逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。發(fā)生EMT的肝癌細(xì)胞能夠下調(diào)表面主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子的表達(dá)，減少腫瘤抗原的呈遞，降低免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和攻擊。此外，EMT還可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分泌免疫抑制因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些免疫抑制因子可以抑制免疫細(xì)胞的活性，如T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）等，削弱機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和攻擊，從而促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移和發(fā)展。最后，EMT賦予肝癌細(xì)胞抗凋亡和耐藥性。在腫瘤治療過程中，腫瘤細(xì)胞的抗凋亡和耐藥性是導(dǎo)致治療失敗的重要原因之一。發(fā)生EMT的肝癌細(xì)胞能夠激活一系列抗凋亡信號(hào)通路，如PI3K/Akt、NF-κB等信號(hào)通路，上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，如Bcl-2、Bcl-XL等，同時(shí)下調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)，如Bax、Bad等，從而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的抗凋亡能力。此外，EMT還可以導(dǎo)致肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物和放療的敏感性降低。發(fā)生EMT的肝癌細(xì)胞能夠上調(diào)藥物外排泵的表達(dá)，如P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）等，促進(jìn)化療藥物的外排，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而產(chǎn)生耐藥性。這些機(jī)制使得發(fā)生EMT的肝癌細(xì)胞在腫瘤治療過程中能夠存活和增殖，增加了肝癌治療的難度。2.1.3EMT相關(guān)標(biāo)志物上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程涉及多種標(biāo)志物的表達(dá)變化，這些標(biāo)志物在EMT的發(fā)生、發(fā)展以及肝癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。E-cadherin是上皮細(xì)胞的重要標(biāo)志物，其表達(dá)水平的變化是EMT的關(guān)鍵特征之一。E-cadherin是一種鈣黏蛋白，主要介導(dǎo)上皮細(xì)胞之間的黏附作用。在正常上皮組織中，E-cadherin高表達(dá)，通過與相鄰細(xì)胞表面的E-cadherin分子相互作用，形成緊密的細(xì)胞連接，維持上皮組織的完整性和極性。在EMT過程中，E-cadherin的表達(dá)受到多種轉(zhuǎn)錄因子的抑制，如Snail、Slug、ZEB1等。這些轉(zhuǎn)錄因子通過與E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下調(diào)。E-cadherin表達(dá)的降低使得上皮細(xì)胞間的黏附力下降，細(xì)胞連接被破壞，上皮細(xì)胞逐漸失去極性，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。在肝癌中，E-cadherin表達(dá)的缺失與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。研究表明，肝癌組織中E-cadherin表達(dá)越低，腫瘤的惡性程度越高，患者的生存時(shí)間越短。Slug是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在EMT過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Slug可以通過與E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-box序列結(jié)合，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生。此外，Slug還可以調(diào)節(jié)其他EMT相關(guān)基因的表達(dá)，如N-cadherin、Vimentin等，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞的間質(zhì)特性和遷移能力。在肝癌中，Slug的高表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Slug在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常肝組織，且其表達(dá)水平與肝癌的TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)。高表達(dá)Slug的肝癌患者更容易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，生存率更低。N-cadherin是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物之一，在EMT過程中其表達(dá)上調(diào)。N-cadherin主要介導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞之間以及間質(zhì)細(xì)胞與其他細(xì)胞之間的黏附作用。在正常上皮細(xì)胞中，N-cadherin的表達(dá)水平較低。當(dāng)上皮細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，N-cadherin的表達(dá)被誘導(dǎo)上調(diào)。N-cadherin的表達(dá)上調(diào)不僅可以增強(qiáng)間質(zhì)細(xì)胞之間的黏附，還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等的黏附，從而有利于腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。在肝癌中，N-cadherin的高表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)。研究表明，N-cadherin在肝癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，高表達(dá)N-cadherin的肝癌患者更容易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，預(yù)后更差。Vimentin是一種中間絲蛋白，主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞中。在EMT過程中，Vimentin的表達(dá)上調(diào)，其可以參與細(xì)胞骨架的重構(gòu)，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Vimentin還可以與其他細(xì)胞骨架蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)。在肝癌中，Vimentin的高表達(dá)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Vimentin在肝癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤的TNM分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)。高表達(dá)Vimentin的肝癌患者更容易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移，生存率更低。2.2熒光蛋白報(bào)告基因2.2.1熒光蛋白的種類與特性熒光蛋白是一類能夠在特定波長(zhǎng)激發(fā)光下發(fā)出熒光的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用。常見的熒光蛋白包括綠色熒光蛋白（GFP）、紅色熒光蛋白（RFP）、黃色熒光蛋白（YFP）、青色熒光蛋白（CFP）和藍(lán)色熒光蛋白（BFP）等。這些熒光蛋白具有以下特性：穩(wěn)定性：熒光蛋白具有較高的化學(xué)穩(wěn)定性，能夠在多種實(shí)驗(yàn)條件下保持其熒光特性。例如，GFP在經(jīng)過甲醛固定和石蠟包埋等處理后，其熒光性質(zhì)依然不受影響，這使得它可以用于組織切片的免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)，便于對(duì)細(xì)胞和組織進(jìn)行長(zhǎng)期觀察和分析。檢測(cè)便利性：熒光蛋白的熒光信號(hào)可以通過熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀等設(shè)備進(jìn)行快速、靈敏的檢測(cè)。在熒光顯微鏡下，能夠直接觀察到表達(dá)熒光蛋白的細(xì)胞或組織發(fā)出的熒光，直觀地了解其分布和動(dòng)態(tài)變化。流式細(xì)胞儀則可以對(duì)大量細(xì)胞進(jìn)行快速分析，準(zhǔn)確測(cè)量細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白的表達(dá)水平，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞群體的定量研究。無細(xì)胞毒性：熒光蛋白對(duì)細(xì)胞的正常生理功能幾乎沒有影響，不會(huì)干擾細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化等過程。這使得研究人員能夠在不影響細(xì)胞正常生命活動(dòng)的前提下，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)、蛋白質(zhì)定位等進(jìn)行研究。例如，將熒光蛋白基因與目的基因融合表達(dá)，不會(huì)改變目的基因的功能和蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，從而可以準(zhǔn)確地研究目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的行為。多重標(biāo)記：不同顏色的熒光蛋白可以同時(shí)使用，實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)目標(biāo)的同時(shí)標(biāo)記和檢測(cè)。通過選擇激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)不同的熒光蛋白，如GFP和RFP，可以在同一實(shí)驗(yàn)中對(duì)兩種不同的細(xì)胞群體或分子進(jìn)行區(qū)分和研究。在腫瘤研究中，可以用GFP標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，用RFP標(biāo)記免疫細(xì)胞，觀察腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的相互作用。2.2.2在細(xì)胞示蹤與監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用原理熒光蛋白在細(xì)胞示蹤與監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用原理基于其能夠與目標(biāo)分子或細(xì)胞進(jìn)行特異性結(jié)合或表達(dá)。通過基因工程技術(shù)，將熒光蛋白基因與目標(biāo)基因融合，構(gòu)建成融合基因表達(dá)載體。將該載體導(dǎo)入細(xì)胞后，細(xì)胞會(huì)表達(dá)出融合蛋白，其中熒光蛋白作為標(biāo)記物，與目標(biāo)蛋白緊密結(jié)合在一起。這樣，在特定波長(zhǎng)激發(fā)光的照射下，融合蛋白會(huì)發(fā)出熒光，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的定位和動(dòng)態(tài)變化的監(jiān)測(cè)。在研究蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位時(shí)，將GFP基因與待研究的蛋白質(zhì)基因融合，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，通過熒光顯微鏡觀察GFP的熒光信號(hào)，就可以確定該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的具體位置。在細(xì)胞示蹤方面，將熒光蛋白基因?qū)爰?xì)胞后，細(xì)胞會(huì)持續(xù)表達(dá)熒光蛋白。當(dāng)細(xì)胞在體內(nèi)或體外環(huán)境中遷移、增殖時(shí)，熒光蛋白會(huì)隨著細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)而移動(dòng)。通過熒光成像技術(shù)，可以實(shí)時(shí)追蹤細(xì)胞的軌跡和分布情況。在腫瘤轉(zhuǎn)移研究中，將熒光蛋白標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞注射到動(dòng)物體內(nèi)，利用活體成像系統(tǒng)可以觀察腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的遷移路徑和轉(zhuǎn)移部位，為研究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制提供重要信息。此外，熒光蛋白還可以用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)的生理過程和基因表達(dá)變化。某些熒光蛋白的熒光強(qiáng)度會(huì)受到細(xì)胞內(nèi)環(huán)境因素的影響，如pH值、離子濃度等。通過設(shè)計(jì)對(duì)特定生理參數(shù)敏感的熒光蛋白，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)這些參數(shù)的變化。利用pH敏感的熒光蛋白可以監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)的酸堿度變化，了解細(xì)胞的代謝狀態(tài)。在基因表達(dá)監(jiān)測(cè)方面，將熒光蛋白基因置于特定基因的啟動(dòng)子下游，當(dāng)該基因被激活表達(dá)時(shí)，熒光蛋白也會(huì)隨之表達(dá)，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度可以定量分析基因的表達(dá)水平。2.3慢病毒載體2.3.1慢病毒載體的結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)慢病毒載體屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，其基因組由兩條相同的單鏈RNA組成，被包裹在一個(gè)直徑約80-120nm的包膜中。病毒粒子的核心部分是由p24蛋白形成的錐形衣殼，保護(hù)著病毒基因組。包膜上鑲嵌著病毒糖蛋白（gp41和gp120），這些糖蛋白在病毒進(jìn)入細(xì)胞的過程中起著至關(guān)重要的作用，它們能夠與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜的融合，從而使病毒核心進(jìn)入細(xì)胞。慢病毒載體具有諸多獨(dú)特的特點(diǎn)，使其在基因傳遞領(lǐng)域備受關(guān)注。首先，它對(duì)分裂和非分裂細(xì)胞都具有強(qiáng)大的感染能力。這一特性使得慢病毒載體能夠廣泛應(yīng)用于多種細(xì)胞類型的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括神經(jīng)元、干細(xì)胞和免疫細(xì)胞等難以感染的細(xì)胞。例如，在神經(jīng)科學(xué)研究中，需要將特定基因?qū)肷窠?jīng)元細(xì)胞以研究其功能，慢病毒載體就能夠有效地將基因傳遞到神經(jīng)元中，為研究神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)退行性疾病等提供了有力的工具。其次，慢病毒載體引發(fā)的免疫反應(yīng)較小。傳統(tǒng)的病毒載體在進(jìn)入機(jī)體后，往往會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致載體被免疫系統(tǒng)迅速清除，影響基因治療的效果。而慢病毒載體經(jīng)過改造，去除了一些病毒毒性相關(guān)基因，極大地降低了免疫原性，減少了免疫系統(tǒng)對(duì)載體的攻擊，從而提高了基因傳遞的效率和穩(wěn)定性。再者，慢病毒載體幾乎無毒性。在基因治療中，載體的毒性是一個(gè)重要的安全問題。慢病毒載體通過優(yōu)化設(shè)計(jì)，降低了對(duì)宿主細(xì)胞的毒性，減少了對(duì)細(xì)胞正常生理功能的干擾，使得基因治療更加安全可靠。最后，慢病毒載體能夠穩(wěn)定地整合外源基因到宿主細(xì)胞基因組中。這一特點(diǎn)使得外源基因能夠在宿主細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的基因功能研究和治療。在基因治療中，穩(wěn)定的基因表達(dá)對(duì)于治療遺傳性疾病、癌癥等具有重要意義。例如，對(duì)于一些遺傳性單基因疾病，可以通過慢病毒載體將正常的基因?qū)牖颊叩募?xì)胞中，使其穩(wěn)定表達(dá)，從而達(dá)到治療疾病的目的。2.3.2在基因傳遞中的優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用與其他基因傳遞載體相比，慢病毒載體具有顯著的優(yōu)勢(shì)。與腺病毒載體相比，腺病毒載體雖然具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但它不能將基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致基因表達(dá)時(shí)間較短，且容易引起免疫反應(yīng)。而慢病毒載體能夠穩(wěn)定整合外源基因，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的基因表達(dá)，并且免疫原性較低。與質(zhì)粒載體相比，質(zhì)粒載體雖然操作簡(jiǎn)單，但轉(zhuǎn)染效率較低，尤其是對(duì)于一些難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型效果不佳。慢病毒載體則能夠高效地感染多種細(xì)胞，彌補(bǔ)了質(zhì)粒載體的不足。在基因治療領(lǐng)域，慢病毒載體已被廣泛應(yīng)用于多種疾病的研究和治療。在癌癥治療中，通過慢病毒載體將抑癌基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。研究人員利用慢病毒載體將p53基因?qū)敫伟┘?xì)胞中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡增加。在遺傳性疾病治療中，慢病毒載體也展現(xiàn)出巨大的潛力。對(duì)于一些遺傳性單基因疾病，如鐮狀細(xì)胞貧血、血友病等，可以通過慢病毒載體將正常的基因?qū)牖颊叩脑煅杉?xì)胞中，再將這些改造后的干細(xì)胞回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，使其分化為正常的血細(xì)胞，從而達(dá)到治療疾病的目的。在科學(xué)研究中，慢病毒載體同樣發(fā)揮著重要作用。在基因功能研究中，利用慢病毒載體將目的基因?qū)爰?xì)胞，通過觀察細(xì)胞的表型變化來研究基因的功能。在干細(xì)胞研究中，慢病毒載體可以用于對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，研究干細(xì)胞的分化機(jī)制和應(yīng)用。研究人員利用慢病毒載體將特定基因?qū)肱咛ジ杉?xì)胞中，成功誘導(dǎo)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化，為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的思路。三、肝癌細(xì)胞多熒光EMT指示模型的構(gòu)建3.1實(shí)驗(yàn)材料與準(zhǔn)備3.1.1細(xì)胞株與菌株本實(shí)驗(yàn)選用人肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/PRF/5，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。PLC/PRF/5細(xì)胞具有上皮樣形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)，能夠表達(dá)甲胎蛋白（AFP），在肝癌研究中應(yīng)用廣泛，可用于探究肝癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為。同時(shí)選用人宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞，其來源于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）。Hela細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，具有無限增殖的能力，常用于基因表達(dá)、蛋白質(zhì)功能研究等領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)中使用的大腸桿菌菌株DH5α購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。DH5α是一種常用于分子克隆的感受態(tài)細(xì)胞，其具有轉(zhuǎn)化效率高、生長(zhǎng)速度快等特點(diǎn)，能夠高效攝取外源DNA，并在合適的培養(yǎng)條件下大量繁殖，為后續(xù)的質(zhì)粒構(gòu)建和擴(kuò)增提供了便利。3.1.2主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要生化試劑包括：限制性內(nèi)切酶EcoRI、HindIII、BamHI等，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，用于DNA片段的切割；T4DNA連接酶，同樣購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，可催化DNA片段的連接反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)目的基因與載體的連接；高保真DNA聚合酶，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，在PCR擴(kuò)增過程中能夠保證DNA擴(kuò)增的準(zhǔn)確性，減少堿基錯(cuò)配的發(fā)生；質(zhì)粒小提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒，均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，分別用于質(zhì)粒DNA的提取和PCR產(chǎn)物、酶切片段等DNA的回收；RNA提取試劑Trizol，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，用于從細(xì)胞中提取總RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，可將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和基因表達(dá)分析；實(shí)時(shí)定量PCR試劑，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，用于定量檢測(cè)基因的表達(dá)水平。細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑有：RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，分別用于肝癌細(xì)胞和Hela細(xì)胞的培養(yǎng)；胎牛血清，購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)成分；胰蛋白酶，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于細(xì)胞的消化傳代。主要溶液包括：LB培養(yǎng)基，用于大腸桿菌的培養(yǎng)，配方為：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，pH7.0，高壓滅菌后備用；氨芐青霉素溶液，濃度為100mg/mL，用于篩選含有氨芐青霉素抗性基因的大腸桿菌菌株，使用時(shí)按1:1000的比例加入到LB培養(yǎng)基中；卡那霉素溶液，濃度為50mg/mL，用于篩選含有卡那霉素抗性基因的菌株，添加比例同氨芐青霉素溶液；PBS緩沖液，配方為：氯化鈉8g/L，氯化鉀0.2g/L，磷酸氫二鈉1.44g/L，磷酸二氫鉀0.24g/L，pH7.4，用于細(xì)胞的洗滌和實(shí)驗(yàn)操作中的緩沖。主要儀器設(shè)備有：PCR擴(kuò)增儀，型號(hào)為ABI2720，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，用于DNA的擴(kuò)增；凝膠成像系統(tǒng)，型號(hào)為Bio-RadGelDocXR+，購(gòu)自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，用于觀察和分析DNA凝膠電泳結(jié)果；離心機(jī)，型號(hào)為Eppendorf5424R，購(gòu)自艾本德（中國(guó)）有限公司，用于細(xì)胞和DNA樣品的離心分離；熒光顯微鏡，型號(hào)為OlympusIX73，購(gòu)自奧林巴斯（中國(guó)）有限公司，用于觀察細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白的表達(dá)；流式細(xì)胞儀，型號(hào)為BDFACSCalibur，購(gòu)自美國(guó)BD公司，用于檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物和分選特定細(xì)胞群體；CO?培養(yǎng)箱，型號(hào)為ThermoScientificHeracellVios160i，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境。3.1.3引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank中登錄的人E-cadherin基因（NM_004360）和Slug基因（NM_003068）序列，使用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)引物時(shí)，遵循以下原則：引物長(zhǎng)度一般為18-25bp，以保證引物與模板的特異性結(jié)合；引物的GC含量控制在40%-60%，以維持引物的穩(wěn)定性；引物3’端避免出現(xiàn)連續(xù)的堿基重復(fù)，防止錯(cuò)配；引物的Tm值（解鏈溫度）在55-65℃之間，以確保引物在PCR反應(yīng)中的有效退火。針對(duì)E-cadherin基因，設(shè)計(jì)上游引物5’-CCCGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’，其中下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn)；下游引物5’-CCCAAGCTTCTACTCCTTGCTCCTTGATG-3’，下劃線部分為HindIII酶切位點(diǎn)。對(duì)于Slug基因，上游引物設(shè)計(jì)為5’-CGCGGATCCATGGCTGCCGAGCAGCGC-3’，下劃線部分是BamHI酶切位點(diǎn)；下游引物為5’-CCCAAGCTTTCAGGGGTGGAAGGTGCTG-3’，下劃線部分為HindIII酶切位點(diǎn)。將設(shè)計(jì)好的引物序列發(fā)送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。合成后的引物經(jīng)PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）純化，以去除雜質(zhì)和引物二聚體，確保引物的質(zhì)量和純度。引物溶解于無菌去離子水中，配制成100μmol/L的儲(chǔ)存液，保存于-20℃冰箱備用。使用時(shí)，將儲(chǔ)存液稀釋至10μmol/L的工作液用于PCR反應(yīng)。3.2慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建3.2.1E-cadherin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的慢病毒載體構(gòu)建從Hela細(xì)胞基因組中抽提E-cadherin啟動(dòng)子。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，以1000r/min離心5min收集細(xì)胞。按照Trizol試劑說明書的步驟，加入適量Trizol試劑裂解細(xì)胞，充分混勻后，室溫靜置5min。隨后加入氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000r/min離心15min，此時(shí)溶液分為三層，取上層無色水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10min，4℃、12000r/min離心10min，可見管底出現(xiàn)白色絮狀沉淀，即為基因組DNA。棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀兩次，每次4℃、7500r/min離心5min。最后將沉淀晾干，加入適量的無菌去離子水溶解基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ猿樘岬玫降腍ela細(xì)胞基因組DNA為模板，進(jìn)行E-cadherin啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：5×PrimeSTARMaxBuffer10μL，dNTPMixture（各2.5mM）8μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，PrimeSTARMaxDNAPolymerase1μL，模板DNA1μL，加無菌去離子水至總體積50μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，可見在預(yù)期大小位置出現(xiàn)特異性條帶，表明E-cadherin啟動(dòng)子擴(kuò)增成功。隨后，使用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，按照試劑盒說明書操作，得到純化后的E-cadherin啟動(dòng)子片段。將純化后的E-cadherin啟動(dòng)子片段與pMD19-TSimple載體進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為：pMD19-TSimpleVector1μL，E-cadherin啟動(dòng)子片段4μL，SolutionI5μL，總體積10μL。輕輕混勻后，16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。取10μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱激90s，迅速冰浴2min。加入900μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)1h。將培養(yǎng)物以5000r/min離心5min，棄去部分上清，留約100μL重懸菌體，將其涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，挑取平板上的單菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系為：10×HBuffer2μL，EcoRI1μL，HindIII1μL，質(zhì)粒DNA5μL，加無菌去離子水至總體積20μL。37℃酶切2h后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若在預(yù)期位置出現(xiàn)與E-cadherin啟動(dòng)子大小相符的條帶，則表明重組質(zhì)粒T-pE-cad構(gòu)建成功。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保E-cadherin啟動(dòng)子序列的準(zhǔn)確性。將E-cadherin啟動(dòng)子與熒光蛋白片段連接，構(gòu)建pE-cad-RFP/YFP/BFP載體。首先，用EcoRI和HindIII雙酶切重組質(zhì)粒T-pE-cad和含有RFP/YFP/BFP基因的載體，酶切體系同上述雙酶切鑒定體系。37℃酶切2h后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用DNA凝膠回收試劑盒分別回收E-cadherin啟動(dòng)子片段和RFP/YFP/BFP基因片段。將回收的E-cadherin啟動(dòng)子片段與RFP/YFP/BFP基因片段進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系為：E-cadherin啟動(dòng)子片段4μL，RFP/YFP/BFP基因片段3μL，T4DNALigase1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，總體積10μL。16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化及篩選步驟同前。挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保pE-cad-RFP/YFP/BFP載體構(gòu)建正確。將pE-cad-RFP/YFP/BFP載體與慢病毒骨架質(zhì)粒pRRLSIN.cPPT.PGK/GFP.WPRE進(jìn)行連接，構(gòu)建慢病毒表達(dá)質(zhì)粒Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP。用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶（如EcoRI和HindIII）分別雙酶切pE-cad-RFP/YFP/BFP載體和慢病毒骨架質(zhì)粒pRRLSIN.cPPT.PGK/GFP.WPRE，酶切體系及條件同前。酶切后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段。將回收的pE-cad-RFP/YFP/BFP片段與慢病毒骨架質(zhì)粒片段進(jìn)行連接，連接體系及條件同前。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化及篩選步驟同前。挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，最終成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)質(zhì)粒Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP。3.2.2Slug啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的慢病毒載體構(gòu)建以類似的方法構(gòu)建Slug啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP。首先，以Hela細(xì)胞基因組DNA為模板，進(jìn)行Slug啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和條件與E-cadherin啟動(dòng)子擴(kuò)增類似，僅引物更換為針對(duì)Slug啟動(dòng)子設(shè)計(jì)的引物。PCR擴(kuò)增體系為：5×PrimeSTARMaxBuffer10μL，dNTPMixture（各2.5mM）8μL，Slug上游引物（10μmol/L）1μL，Slug下游引物（10μmol/L）1μL，PrimeSTARMaxDNAPolymerase1μL，模板DNA1μL，加無菌去離子水至總體積50μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物，在預(yù)期大小位置出現(xiàn)特異性條帶，使用DNA凝膠回收試劑盒回收純化Slug啟動(dòng)子片段。將純化后的Slug啟動(dòng)子片段與pMD19-TSimple載體連接，連接體系和轉(zhuǎn)化、篩選步驟與E-cadherin啟動(dòng)子連接時(shí)相同。挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系為：10×HBuffer2μL，BamHI1μL，HindIII1μL，質(zhì)粒DNA5μL，加無菌去離子水至總體積20μL。37℃酶切2h后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若出現(xiàn)與Slug啟動(dòng)子大小相符的條帶，則表明重組質(zhì)粒T-pSlug構(gòu)建成功。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司測(cè)序驗(yàn)證。將Slug啟動(dòng)子與RFP/YFP/BFP基因片段連接，構(gòu)建pSlug-RFP/YFP/BFP載體。用BamHI和HindIII雙酶切重組質(zhì)粒T-pSlug和含有RFP/YFP/BFP基因的載體，酶切后回收目的片段并進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選并鑒定陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保pSlug-RFP/YFP/BFP載體構(gòu)建正確。最后，將pSlug-RFP/YFP/BFP載體與慢病毒骨架質(zhì)粒pRRLSIN.cPPT.PGK/GFP.WPRE連接，構(gòu)建慢病毒表達(dá)質(zhì)粒Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP。酶切、連接、轉(zhuǎn)化及篩選鑒定步驟與構(gòu)建Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP時(shí)相同。經(jīng)過一系列的酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建出慢病毒表達(dá)質(zhì)粒Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP。3.3慢病毒的包裝與滴度測(cè)定3.3.1慢病毒包裝流程將構(gòu)建好的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒（Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP和Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP）與包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝。在轉(zhuǎn)染前，需對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇操作。從液氮罐中取出凍存的293T細(xì)胞，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕晃動(dòng)使其快速融化。將融化后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有適量完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、1%雙抗）的離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清。用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將其接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行傳代操作。吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入適量的0.25%胰蛋白酶消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2min，在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞開始變圓并脫離瓶壁時(shí)，立即加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清。用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并按照合適的比例（如1:3或1:4）將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充適量的培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。取適量的細(xì)胞懸液，與等體積的臺(tái)盼藍(lán)染液混合，充分混勻后，取一滴混合液滴加到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)?；罴?xì)胞不會(huì)被臺(tái)盼藍(lán)染色，呈現(xiàn)透明狀，而死細(xì)胞會(huì)被染成藍(lán)色。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，調(diào)整細(xì)胞密度，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入適量的細(xì)胞懸液，使細(xì)胞貼壁后所占面積達(dá)到孔底面積的70%-80%，將6孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育4-6h，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，首先制備質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的混合物。在無菌EP管中，加入適量的無血清Opti-MEM培養(yǎng)基，然后分別加入8μg慢病毒表達(dá)質(zhì)粒、4μg包裝質(zhì)粒psPAX2和4μg包裝質(zhì)粒pMD2.G，輕輕混勻。在另一無菌EP管中，加入相同體積的無血清Opti-MEM培養(yǎng)基，再加入適量的轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine2000），輕輕混勻，室溫靜置5min。將轉(zhuǎn)染試劑稀釋液逐滴加入到質(zhì)粒稀釋液中，邊滴加邊輕輕混勻，室溫放置20min，使DNA和轉(zhuǎn)染試劑充分結(jié)合形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕晃動(dòng)6孔板，使復(fù)合物均勻分布，將6孔板放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6-8h后，吸去6孔板中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除未結(jié)合的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。加入適量的新鮮完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，密切觀察細(xì)胞狀態(tài)，確保細(xì)胞生長(zhǎng)良好。培養(yǎng)48-72h后，收集含有慢病毒的細(xì)胞上清液，用于后續(xù)的慢病毒收集、純化和滴度測(cè)定。同時(shí)，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行凍存。吸去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次，加入適量的0.25%胰蛋白酶消化液，消化細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞變圓并脫離瓶壁時(shí)，加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清。用凍存液（90%胎牛血清+10%DMSO）重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中，每管1-2mL。將凍存管放入程序降溫盒中，先置于-80℃冰箱中過夜，然后轉(zhuǎn)移至液氮罐中長(zhǎng)期保存。3.3.2慢病毒的收集、純化與滴度測(cè)定在轉(zhuǎn)染48-72h后，收集含有慢病毒的細(xì)胞上清液。將細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。為了去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，將收集的上清液以3000r/min離心10min，取上清。然后使用0.45μm的濾膜對(duì)上清液進(jìn)行過濾，進(jìn)一步去除可能存在的細(xì)胞碎片和微生物。將過濾后的上清液進(jìn)行超速離心純化。將上清液分裝到超速離心管中，注意平衡，確保兩兩對(duì)應(yīng)離心管的重量相差不超過0.01g。將離心管放入超速離心機(jī)中，在4℃、30000r/min的條件下離心2h。離心結(jié)束后，小心取出離心管，可觀察到離心管底部一側(cè)壁上有白色的病毒沉淀。在生物安全柜中，打開離心管，用移液器小心吸掉上清，注意不要吸到病毒沉淀。每管加入40-100μL的PBS緩沖液，將病毒沉淀輕輕吹散重懸，使病毒充分溶解在PBS中。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，將病毒重懸液分裝到無菌EP管中，保存于-80℃冰箱備用。采用熒光計(jì)數(shù)法測(cè)定慢病毒滴度。將攜帶熒光報(bào)告基因（如GFP）的慢病毒感染靶細(xì)胞（如293T細(xì)胞）。在感染前，將293T細(xì)胞接種于24孔板中，每孔加入適量的細(xì)胞懸液，使細(xì)胞貼壁后所占面積達(dá)到孔底面積的50%-60%，將24孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育過夜。次日，取出24孔板，吸去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞1-2次。將不同稀釋度（如10?1、10?2、10?3、10??、10??）的慢病毒液加入到24孔板中，每孔加入適量的病毒液，同時(shí)設(shè)置未感染病毒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。將24孔板放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。感染48-72h后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染細(xì)胞中熒光陽性細(xì)胞的比例。吸去24孔板中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次。加入適量的胰蛋白酶消化液，消化細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞變圓并脫離孔壁時(shí)，加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，1000r/min離心5min，棄去上清。用PBS緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適范圍，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。通過流式細(xì)胞儀分析，統(tǒng)計(jì)不同稀釋度下熒光陽性細(xì)胞的比例。根據(jù)熒光陽性細(xì)胞的比例和病毒稀釋度，計(jì)算慢病毒的滴度。計(jì)算公式為：慢病毒滴度（TU/mL）=熒光陽性細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×病毒稀釋倍數(shù)×病毒液體積（mL）。例如，在10?3稀釋度下，接種1×10?個(gè)細(xì)胞，檢測(cè)到熒光陽性細(xì)胞數(shù)為500個(gè)，加入的病毒液體積為0.1mL，則慢病毒滴度=500/1×10?×103×10=5×10?TU/mL。3.4模型構(gòu)建結(jié)果驗(yàn)證3.4.1載體構(gòu)建的鑒定對(duì)構(gòu)建的慢病毒載體進(jìn)行酶切鑒定，以驗(yàn)證其結(jié)構(gòu)的正確性。取適量構(gòu)建好的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP和Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP，分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切。對(duì)于Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP，使用EcoRI和HindIII進(jìn)行雙酶切；對(duì)于Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP，使用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系為：10×HBuffer2μL，相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶各1μL，質(zhì)粒DNA5μL，加無菌去離子水至總體積20μL。37℃酶切2h后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，若Lv-pE-cad-RFP/YFP/BFP經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切后，在凝膠上出現(xiàn)與E-cadherin啟動(dòng)子和RFP/YFP/BFP基因片段大小相符的條帶，則表明酶切成功，且載體構(gòu)建正確。同理，若Lv-pSlug-RFP/YFP/BFP經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切后，出現(xiàn)與Slug啟動(dòng)子和RFP/YFP/BFP基因片段大小相符的條帶，也表明載體構(gòu)建成功。通過酶切鑒定，可以初步判斷載體的結(jié)構(gòu)是否正確，排除構(gòu)建過程中可能出現(xiàn)的錯(cuò)誤，如目的基因未正確插入、載體自連等問題。除了酶切鑒定，還進(jìn)行了PCR鑒定。以構(gòu)建的慢病毒載體為模板，分別使用針對(duì)E-cadherin啟動(dòng)子和Slug啟動(dòng)子的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：5×PrimeSTARMaxBuffer10μL，dNTPMixture（各2.5mM）8μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，PrimeSTARMaxDNAPolymerase1μL，模板DNA1μL，加無菌去離子水至總體積50μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃（針對(duì)E-cadherin啟動(dòng)子引物）或56℃（針對(duì)Slug啟動(dòng)子引物）退火30s，72℃延伸相應(yīng)時(shí)間（根據(jù)目的片段大小確定，E-cadherin啟動(dòng)子片段延伸2min，Slug啟動(dòng)子片段延伸1.5min），共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。若在凝膠上出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的特異性條帶，表明載體中含有正確的E-cadherin啟動(dòng)子或Slug啟動(dòng)子序列，進(jìn)一步驗(yàn)證了載體構(gòu)建的正確性。PCR鑒定可以快速、靈敏地檢測(cè)載體中目的基因的存在，為載體的質(zhì)量提供了有力的證據(jù)。為了確保載體中插入的E-cadherin啟動(dòng)子和Slug啟動(dòng)子序列的準(zhǔn)確性，將酶切和PCR鑒定正確的載體送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的人E-cadherin基因（NM_004360）和Slug基因（NM_003068）序列進(jìn)行比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示，構(gòu)建的慢病毒載體中E-cadherin啟動(dòng)子和Slug啟動(dòng)子序列與已知序列完全一致，沒有出現(xiàn)堿基突變、缺失或插入等情況。測(cè)序驗(yàn)證為載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性提供了最直接、最可靠的證據(jù)，保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。3.4.2慢病毒感染肝癌細(xì)胞的效果檢測(cè)將制備好的慢病毒（Lv-pE-cad-YFP和Lv-pSlug-YFP，這里以YFP熒光蛋白為例）感染肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5，以檢測(cè)慢病毒的感染效果。在感染前，將PLC/PRF/5細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入適量的細(xì)胞懸液，使細(xì)胞貼壁后所占面積達(dá)到孔底面積的50%-60%，將6孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育過夜。次日，取出6孔板，吸去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞1-2次。將不同感染復(fù)數(shù)（MOI）的慢病毒液加入到6孔板中，同時(shí)設(shè)置未感染病毒的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。每孔加入適量的病毒液后，再加入適量的新鮮完全培養(yǎng)基，將6孔板放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。感染48-72h后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染細(xì)胞中YFP的表達(dá)情況。吸去6孔板中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次。加入適量的胰蛋白酶消化液，消化細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞變圓并脫離孔壁時(shí)，加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，1000r/min離心5min，棄去上清。用PBS緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適范圍，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。通過流式細(xì)胞儀分析，統(tǒng)計(jì)不同MOI下YFP陽性細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示，隨著MOI的增加，YFP陽性細(xì)胞的比例逐漸升高。當(dāng)MOI為10時(shí)，YFP陽性細(xì)胞的比例達(dá)到約70%，表明慢病毒能夠有效地感染肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5，且感染效率較高。為了進(jìn)一步驗(yàn)證慢病毒感染肝癌細(xì)胞的效果，對(duì)感染后的細(xì)胞進(jìn)行分選，分選出YFP陰性和陽性的細(xì)胞。將流式細(xì)胞儀分選得到的YFP陰性和陽性的PLC/PRF/5細(xì)胞分別接種于新的培養(yǎng)皿中，加入適量的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時(shí)間后，使用qRT-PCR和Westernblotting檢測(cè)E-cadherin和Slug基因及蛋白的表達(dá)水平。對(duì)于qRT-PCR檢測(cè)，首先提取細(xì)胞總RNA。取適量的YFP陰性和陽性的PLC/PRF/5細(xì)胞，按照Trizol試劑說明書的步驟，加入適量Trizol試劑裂解細(xì)胞，充分混勻后，室溫靜置5min。隨后加入氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000r/min離心15min，取上層無色水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10min，4℃、12000r/min離心10min，可見管底出現(xiàn)白色絮狀沉淀，即為總RNA。棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀兩次，每次4℃、7500r/min離心5min。最后將沉淀晾干，加入適量的無RNase水溶解總RNA。使用核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA的濃度和純度，確保RNA質(zhì)量良好。以提取的總RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：5×PrimeScriptRTMasterMix2μL，RNA模板適量（根據(jù)RNA濃度調(diào)整，一般為500ng-1μg），加無RNase水至總體積10μL。反應(yīng)條件為：37℃15min，85℃5s。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，得到的cDNA可用于后續(xù)的qRT-PCR反應(yīng)。qRT-PCR反應(yīng)體系為：2×SYBR?PremixExTaqⅡ（TliRNaseHPlus）10μL，上、下游引物各1.0μL（10μmol/L），cDNA模板2.0μL，補(bǔ)dH?O至總體積20μL。反應(yīng)條件為：95℃30s，之后95℃5s，55℃30s，72℃30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸1min。以GAPDH為內(nèi)參照，結(jié)果分析采用2-△△Ct法計(jì)算。檢測(cè)結(jié)果顯示，YFP陽性的PLC/PRF/5細(xì)胞中E-cadherin基因的表達(dá)水平明顯低于YFP陰性細(xì)胞，而Slug基因的表達(dá)水平則明顯高于YFP陰性細(xì)胞。這表明慢病毒感染后，E-cadherin啟動(dòng)子和Slug啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光報(bào)告基因成功表達(dá)，且與EMT過程中E-cadherin和Slug的表達(dá)變化趨勢(shì)一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了慢病毒感染肝癌細(xì)胞的有效性。對(duì)于Westernblotting檢測(cè)，首先提取細(xì)胞總蛋白。取適量的YFP陰性和陽性的PLC/PRF/5細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗細(xì)胞2-3次，按每5×10?個(gè)細(xì)胞加150μLRIPA裂解液冰上裂解，并用移液器吹打混勻，冰上裂解30min。裂解完畢后，4℃、12000r/min離心20min，將上清轉(zhuǎn)移至另一新的EP管中備用。取10μL蛋白上清利用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，將剩余樣品加5×上樣緩沖液，混勻后100℃煮沸10min，于-20℃保存待用。將定量后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的分離膠濃度，將蛋白樣品加入到凝膠加樣孔中，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在濃縮膠中以80V的電壓進(jìn)行電泳，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，按照三明治模型將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜電壓為100V，時(shí)間為120min。轉(zhuǎn)膜完畢后，將PVDF膜在50g/L脫脂奶粉中搖床封閉1h，以防止非特異性結(jié)合。隨后將稀釋好的一抗（E-cadherin抗體、Slug抗體和內(nèi)參β-actin抗體）加到載好的PVDF膜上，4℃低溫孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。然后將稀釋好的二抗加到膜上，室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后使用化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。Westernblotting檢測(cè)結(jié)果顯示，YFP陽性的PLC/PRF/5細(xì)胞中E-cadherin蛋白的表達(dá)水平明顯低于YFP陰性細(xì)胞，而Slug蛋白的表達(dá)水平則明顯高于YFP陰性細(xì)胞。這與qRT-PCR的檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了慢病毒感染肝癌細(xì)胞后，能夠準(zhǔn)確反映EMT過程中E-cadherin和Slug蛋白的表達(dá)變化，表明成功構(gòu)建了肝癌細(xì)胞多熒光EMT指示模型。四、肝癌細(xì)胞多熒光EMT指示模型的功能初探4.1模型對(duì)EMT過程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)4.1.1TGF-β誘導(dǎo)EMT實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將構(gòu)建成功的肝癌細(xì)胞多熒光EMT指示模型用于TGF-β誘導(dǎo)的EMT實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置三組，分別為對(duì)照組、TGF-β低濃度處理組和TGF-β高濃度處理組。對(duì)照組加入等體積的PBS緩沖液，不進(jìn)行TGF-β處理；TGF-β低濃度處理組加入終濃度為5ng/mL的TGF-β1（購(gòu)自PeproTech公司）；TGF-β高濃度處理組加入終濃度為20ng/mL的TGF-β1。實(shí)驗(yàn)選用6孔板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每孔接種適量的肝癌細(xì)胞多熒光EMT指示模型細(xì)胞，使其在接種后能夠均勻分布并貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，達(dá)到約70%-80%的融合度時(shí)，進(jìn)行TGF-β處理。在處理前，先吸去6孔板中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后按照分組分別加入相應(yīng)的處理液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。在TGF-β處理后的0h、24h、48h、72h這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行樣本收集。對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取出相應(yīng)的6孔板，吸去孔中的培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次。收集細(xì)胞用于后續(xù)的熒光表達(dá)檢測(cè)和EMT相關(guān)標(biāo)志物的分析。在收集細(xì)胞時(shí)，使用胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清，用PBS緩沖液重懸細(xì)胞，用于熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)。同時(shí)，取一部分細(xì)胞用于提取RNA和蛋白質(zhì)，用于后續(xù)的qRT-PCR和Westernblotting檢測(cè)，以分析EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化。4.1.2熒光表達(dá)變化與EMT進(jìn)程的關(guān)聯(lián)分析在TGF-β處理后，通過熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞熒光表達(dá)的變化情況，并探討其與EMT進(jìn)程中上皮和間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)變化的對(duì)應(yīng)關(guān)系。在熒光顯微鏡下，對(duì)照組細(xì)胞在整個(gè)觀察過程中，E-cadherin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光蛋白（如YFP）呈現(xiàn)較強(qiáng)的熒光信號(hào)，主要分布在細(xì)胞之間的連接處，表明E-cadherin表達(dá)正常，細(xì)胞保持上皮細(xì)胞的形態(tài)和連接特性。而Slug啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光蛋白（如RFP）熒光信號(hào)較弱，幾乎不可見，說明Slug的表達(dá)水平較低。在TGF-β低濃度處理組，24h時(shí)，部分細(xì)胞的E-cadherin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光強(qiáng)度開始減弱，細(xì)胞間的熒光連接變得不連續(xù)；同時(shí)，Slug啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光蛋白開始出現(xiàn)微弱的熒光信號(hào)。隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)至48h和72h，E-cadherin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光進(jìn)一步減弱，細(xì)胞形態(tài)逐漸從上皮樣向間質(zhì)樣轉(zhuǎn)變，細(xì)胞變得更加細(xì)長(zhǎng)，失去極性；而Slug啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。在TGF-β高濃度處理組，變化更為明顯。24h時(shí)，大部分細(xì)胞的E-cadherin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光明顯減弱，細(xì)胞間連接幾乎消失；Slug啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。48h和72h時(shí)，細(xì)胞完全呈現(xiàn)間質(zhì)樣形態(tài)，E-cadherin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光幾乎消失，Slug啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光達(dá)到較強(qiáng)水平。通過流式細(xì)胞儀對(duì)不同處理組和時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞進(jìn)行熒光定量分析，結(jié)果與熒光顯微鏡觀察一致。對(duì)照組細(xì)胞中，E-cadherin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光陽性細(xì)胞比例始終較高，而Slug啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光陽性細(xì)胞比例很低。在TGF-β低濃度處理組，隨著處理時(shí)間的增加，E-cadherin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光陽性細(xì)胞比例逐漸下降，從0h時(shí)的約80%下降到72h時(shí)的約30%；而Slug啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光陽性細(xì)胞比例逐漸上升，從0h時(shí)的幾乎為0上升到72h時(shí)的約50%。在TGF-β高濃度處理組，E-cadherin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光陽性細(xì)胞比例下降更為迅速，72h時(shí)僅為約10%；Slug啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光陽性細(xì)胞比例在72h時(shí)達(dá)到約70%。將熒光表達(dá)變化與qRT-PCR和Westernblotting檢測(cè)的EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)變化進(jìn)行對(duì)比分析。qRT-PCR結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞中E-cadherin的mRNA表達(dá)水平較高，而Slug的mRNA表達(dá)水平較低。在TGF-β處理組，隨著處理時(shí)間的增加和TGF-β濃度的升高，E-cadherin的mRNA表達(dá)水平逐漸降低，Slug的mRNA表達(dá)水平逐漸升高。Westernblotting檢測(cè)結(jié)果也表明，對(duì)照組細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)豐富，而Slug蛋白表達(dá)較少。在TGF-β處理組，E-cadherin蛋白表達(dá)逐漸減少，Slug蛋白表達(dá)逐漸增多。這些結(jié)果表明，肝癌細(xì)胞多熒光EMT指示模型的熒光表達(dá)變化與EMT進(jìn)程中上皮和間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)變化具有良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。隨著EMT進(jìn)程的推進(jìn)，E-cadherin表達(dá)下降，其啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光減弱；Slug表達(dá)上升，其啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光增強(qiáng)。該模型能夠準(zhǔn)確地反映肝癌細(xì)胞EMT過程中相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)EMT過程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。四、肝癌細(xì)胞多熒光EMT指示模型的功能初探4.2基于模型的細(xì)胞遷移能力研究4.2.1Transwell遷移實(shí)驗(yàn)操作利用Transwell小室開展細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，以探究肝癌細(xì)胞多熒光EMT指示模型中熒光陽性和陰性細(xì)胞的遷移能力。實(shí)驗(yàn)前，準(zhǔn)備好24孔板及配套的Transwell小室，其聚碳酸酯膜孔徑為8μm。將Transwell小室小心放置于24孔板中，向上室加入100μL無血清培養(yǎng)基，向下室加入600μL含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，以此形成趨化因子梯度，模擬體內(nèi)細(xì)胞遷移的微環(huán)境。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育1-2h，使培養(yǎng)基達(dá)到平衡狀態(tài)。對(duì)分選得到的熒光陽性和陰性的肝癌細(xì)胞進(jìn)行處理。先用無菌PBS清洗細(xì)胞2-3次，去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。接著使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，當(dāng)在顯微鏡下觀察到細(xì)胞開始變圓并脫離培養(yǎng)瓶壁時(shí)，立即加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清。用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×10?/mL。向Transwell小室的上室加入100μL細(xì)胞懸液，確保細(xì)胞均勻分布在上室中，同時(shí)避免產(chǎn)生氣泡，以免影響細(xì)胞遷移。將24孔板放回37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中孵育24h，使細(xì)胞有足夠的時(shí)間遷移。在孵育過程中，細(xì)胞會(huì)受到下室中趨化因子的吸引，通過Transwell小室的聚碳酸酯膜上的小孔從上室遷移至下室。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室。用無菌PBS輕輕清洗上室3次，以去除未遷移的細(xì)胞。將Transwell小室浸泡在4%多聚甲醛固定液中，室溫固定15min，使遷移到下室膜表面的細(xì)胞固定。固定完畢后，用PBS清洗3次，每次5min。隨后，用0.1%結(jié)晶紫染液對(duì)下室膜表面的細(xì)胞進(jìn)行染色，室溫染色20min，使細(xì)胞著色，便于觀察和計(jì)數(shù)。染色結(jié)束后，用PBS再次清洗3次，以去除多余的染液。用棉簽輕輕擦去上室膜表面未遷移的細(xì)胞，注意操作要輕柔，避免損傷下室膜表面已遷移的細(xì)胞。將Transwell小室置于顯微鏡下，在200倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室膜表面的細(xì)胞數(shù)量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。4.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：熒光陽性與陰性細(xì)胞的遷移差異通過對(duì)Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)熒光陽性細(xì)胞的遷移能力明顯強(qiáng)于熒光陰性細(xì)胞。在顯微鏡下觀察，熒光陽性細(xì)胞遷移到下室膜表面的數(shù)量較多，細(xì)胞分布較為密集；而熒光陰性細(xì)胞遷移到下室膜表面的數(shù)量較少，細(xì)胞分布相對(duì)稀疏。對(duì)5個(gè)視野中遷移細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算平均值。結(jié)果顯示，熒光陽性細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)平均值為（125.6±10.5）個(gè)，而熒光陰性細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)平均值僅為（35.2±5.8）個(gè)。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，二者差異具有顯著性（P<0.01）。這一差異與EMT密切相關(guān)。在肝癌細(xì)胞多熒光EMT指示模型中，熒光陽性細(xì)胞是由E-cadherin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光蛋白表達(dá)減弱和Slug啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光蛋白表達(dá)增強(qiáng)所標(biāo)記，表明這些細(xì)胞發(fā)生了EMT。在EMT過程中，細(xì)胞發(fā)生了一系列生物學(xué)特性的改變。上皮細(xì)胞標(biāo)志性蛋白E-cadherin表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，細(xì)胞連接被破壞，使得細(xì)胞更容易從上皮組織中脫離出來。同時(shí)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如N-cadherin、Vimentin等表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞形態(tài)由上皮樣轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮位虺衫w維細(xì)胞樣，細(xì)胞骨架發(fā)生重構(gòu)，獲得了更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。這些變化使得熒光陽性細(xì)胞能夠更有效地響應(yīng)趨化因子的吸引，穿過Transwell小室的聚碳酸酯膜，遷移到下室。相比之下，熒光陰性細(xì)胞未發(fā)生明顯的EMT，細(xì)胞間仍保持著較強(qiáng)的黏附力，細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，遷移能力較弱。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了EMT在肝癌細(xì)胞遷移中的重要作用，也表明肝癌細(xì)胞多熒光EMT指示模型能夠有效地用于研究EMT與細(xì)胞遷移能力之間的關(guān)系，為深入探究肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.3模型在肝癌EMT機(jī)制研究中的潛在應(yīng)用4.3.1探索信號(hào)通路對(duì)EMT的調(diào)控作用在肝癌研究領(lǐng)域，深入探究信號(hào)通路對(duì)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的調(diào)控作用至關(guān)重要，而本研究構(gòu)建的肝癌細(xì)胞多熒光EMT指示模型為此提供了有力工具。以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）信號(hào)通路為例，其被公認(rèn)為是誘導(dǎo)EMT的關(guān)鍵通路之一。利用該模型進(jìn)行研究時(shí)，可設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)組。在實(shí)驗(yàn)組中，向肝癌細(xì)胞多熒光EMT指示模型細(xì)胞中加入不同濃