ICS67.050

CCSX04

34

安徽省地方標準

DB34/T3991—2021

禽蛋中替米考星殘留的測定高效液相色

譜法

Determinationoftilmicosinresiduesinegg-highperformanceliquidchromatography

2021-09-03發(fā)布2021-10-03實施

安徽省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB34/T3991—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。

本文件由安徽省獸藥飼料監(jiān)察所提出。

本文件由安徽省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。

本文件起草單位：安徽安豐堂動物藥業(yè)有限公司、安徽省獸藥飼料監(jiān)察所、利辛縣雙飛養(yǎng)殖專業(yè)合

作社、安徽省動物衛(wèi)生監(jiān)督所、安徽省動物疫病預防與控制中心、安徽省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所、桐城

市畜牧獸醫(yī)管理中心、宣州區(qū)畜牧獸醫(yī)管理局。

本文件主要起草人：張莉、劉紅云、張士卿、苗文萍、章天霞、蔡一杰、鄭舉、吳蕾、李琿、王雨

霜、劉文文、王群、馬瑞鈺、丁常宏、杜騰飛。

I

DB34/T3991—2021

禽蛋中替米考星殘留的測定高效液相色譜法

1范圍

本文件規(guī)定了禽蛋中替米考星殘留檢測的試樣制備及高效液相檢測方法。

本文件適用于禽蛋中替米考星的殘留測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3術語和定義

本文件沒有需要界定的術語和定義。

4原理

試樣中的替米考星加乙腈經(jīng)渦旋勻漿后離心取上清液，正己烷液液分配去脂，固相萃取柱凈化，旋

轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，經(jīng)色譜柱梯度洗脫分離，用紫外檢測器檢測，以保留時間進行定性，外標法定量。

5試劑和材料

5.1用水符合GB/T6682中一級用水的規(guī)定。

5.2甲醇：色譜純。

5.3乙腈：色譜純。

5.4正己烷：分析純。

5.5無水硫酸鈉：分析純。

5.6磷酸：分析純。

5.7二丁胺：分析純。

5.8氫氧化鈉：分析純。

5.9替米考星對照品：≥95.0％。

5.10固相萃取柱：HLB（6mL，200mg）或同等柱效。

5.11替米考星標準溶液的制備：取替米考星對照品25.0mg，精密稱定，置25mL容量瓶中，加乙

腈制成每1mL中含1mg的溶液，精密量取5mL，置25mL量瓶中，用磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，

制成0.2mg/mL的標準儲備液。在試驗中用磷酸溶液配置成不同濃度的標準工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

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DB34/T3991—2021

5.12磷酸溶液的配制：取水900mL，加磷酸5.71g，用12.5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至2.5

±0.1，加水至1000mL。

5.1312.5mol/L氫氧化鈉溶液的配制：稱取50g氫氧化鈉，溶于水，加水稀釋至100mL。

5.14乙腈飽和的正己烷的配制：取100mL的正己烷加入10mL的乙腈，充分振蕩混合后，上層溶液

為乙腈飽和的正己烷。

5.15磷酸二丁胺緩沖液：取二丁胺16.8mL，加磷酸溶液（1→10）70mL，邊加邊攪拌，放冷后，

用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5±0.1，加水至100mL。

6儀器和設備

6.1高效液相色譜儀(配有紫外檢測器或二級管陣列檢測器、柱溫箱)。

6.2分析天平：感量0.1mg、0.01mg。

6.3離心機：低溫冷凍離心機（≥6770G）。

6.4超聲波清洗機。

6.5渦旋混合機。

6.6微孔濾膜：孔徑0.45μm纖維素濾膜。

6.7旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

7試樣的制備

取待測新鮮的禽蛋去殼，充分攪拌，勻質(zhì)。于-18℃以下保存。

8分析步驟

8.1提取

稱取5g±0.05g試樣，置于50mL離心管中，用10mL乙腈勻漿5min，高速冷凍6770G離

心10min，移取上清液于50mL離心管中。離心管中的殘渣再用10mL乙腈重復提取，合并上清液。

在合并的上清液中加入無水硫酸鈉3.0g，乙腈飽和的正己烷20mL，渦旋1min，6770G離心10min，

棄去上層正己烷。取下層溶液備用。

8.2凈化

將HLB固相萃取柱分別用5mL甲醇和乙腈依次潤洗，加入提取液5mL，過柱，棄去淋洗液，用

5mL乙腈進行洗脫，收集洗脫液于茄形瓶中，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，濃縮液加入1.00mL磷酸溶

液溶解，過0.45μm濾膜后，轉(zhuǎn)移至2mL進樣瓶中，待測定。

8.3測定

8.3.1高效液相色譜條件

色譜柱：ODSC18(4.6mm×250mm，5μm)。

流動相：水—磷酸二丁胺緩沖液（975：25）為流動相A，乙腈為流動相B，按表1程序進行梯度洗

脫。

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流速：1.0mL/min。

柱溫：30℃。

檢測波長：280nm。

進樣量：10μL。

表1梯度洗脫程序

時間流動相A流動相B

（min）（％）（％）

08218

306040

328218

408218

8.3.2取試樣溶液、標準溶液上機測定，按外標法以峰面積定量，標準溶液及試樣溶液中替米考星峰

面積均應在儀器檢測的線性范圍內(nèi)（見附錄A）。

8.4空白實驗

在不含替米考星的試樣，采用完全相同的測定步驟進行測定（見附錄A）。

8.5結(jié)果的計算與表述

試料中替米考星殘留量（μg/kg）按公式(1)計算：

·········································································(1)

式中：

X——供試試樣中替米考星含量，單位為微克/每千克（μg/kg）；

C——經(jīng)標準曲線求得的試樣溶液中替米考星濃度，單位為微克/每毫升（μg/mL）；

m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）；

V——定容體積，單位為毫升（mL）

f——稀釋倍數(shù)

注：結(jié)果表示——平行測定結(jié)果用算術平均值表示，計算結(jié)果保留3位有效數(shù)字。

9檢測方法的靈敏度、準確度和精密度

9.1靈敏度

本方法檢出限為2μg/kg，定量限為20μg/kg。

9.2準確度

本方法在20μg/kg～100μg/kg添加濃度水平上的回收率為70％～110％。

9.3精密度

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本方法的批內(nèi)變異系數(shù)CV％≤10％，批間變異系數(shù)CV％≤15％。

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附錄A

（資料性）

空白樣品添加替米考星對照品溶液和空白樣品色譜圖

空白樣品添加替米考星對照品溶液和空白樣品色譜圖見圖A.1、圖A.2。

圖A.1空白樣品中添加1.0ng/mL替米考星色譜圖（峰