ICS67.080.01

CCSX10

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T2554—2022

發(fā)酵番茄渣中益生性乳酸菌的分離與鑒定

技術(shù)規(guī)程

Technicalregulationfortheisolationandidentificationof

probioticlacticacidbacteriaderivedfromfermentedtomatopomace

2022-04-25發(fā)布2022-05-25實(shí)施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T2554—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC19）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院、內(nèi)蒙古大學(xué)。

本文件主要起草人：杜瑞平、王瀟、特日格勒、張興夫、武晶晶、宋利文、云伏雨、張春華、羿靜、

康長清。

I

DB15/T2554—2022

發(fā)酵番茄渣中益生性乳酸菌的分離與鑒定技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了發(fā)酵番茄渣中益生性乳酸菌分離與鑒定的規(guī)范性引用文件、術(shù)語與定義、材料及操作

規(guī)程等技術(shù)要求與規(guī)范。

本文件適用于發(fā)酵番茄渣中益生性乳酸菌的分離與鑒定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB4789.35食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

益生性乳酸菌lacticacidbacteria(LAB）

能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸、無芽孢且具有益生性能的革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱。

發(fā)酵番茄渣tomatopomace

生產(chǎn)番茄醬(汁)后的番茄渣（主要由果皮、種子和少量的殘余果肉組成）經(jīng)微生物發(fā)酵后的產(chǎn)物。

序列比對sequencealignment

為確定兩個(gè)或多個(gè)序列之間的相似性或同源性，而將它們按照一定的規(guī)律排列，檢測序列之間的相

似性，從而發(fā)現(xiàn)生物序列中的功能、結(jié)構(gòu)和進(jìn)化信息的一種生物信息學(xué)方法。

進(jìn)化樹evolutionarytrees

通過系統(tǒng)發(fā)育分析所推斷出來的進(jìn)化關(guān)系一般用分枝圖表即進(jìn)化樹來描述，這個(gè)進(jìn)化樹就描述了

同一譜系的進(jìn)化關(guān)系，包括了分子進(jìn)化、物種進(jìn)化以及分子進(jìn)化和物種進(jìn)化的綜合。

4材料

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番茄渣來源

來自工廠的新鮮番茄渣。

發(fā)酵番茄渣的制備與保存

每個(gè)聚乙烯塑料袋中稱取100g番茄渣，用真空包裝機(jī)抽成真空并封口。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，于戶

外進(jìn)行為期30d、60d和90d的厭氧發(fā)酵，在第30d、60d和90d分別取樣，將樣品裝在無菌袋中，

放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室盡快進(jìn)行乳酸菌的分離。

5操作規(guī)程

菌株和細(xì)胞

5.1.1菌株

指示菌：致病性的大腸桿菌（EscherichiacoliATCC25922），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus

aureusATCC25923），購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

試驗(yàn)菌：從發(fā)酵番茄渣中分離出的乳酸菌。

5.1.2細(xì)胞

Caco-2細(xì)胞，購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

儀器設(shè)備

電子天平（感量0.01g），超純水系統(tǒng)，高壓蒸汽滅菌鍋（137℃，0.25MPa），超低溫冰箱（-

50℃～-86℃），恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱，厭氧培養(yǎng)箱，普通離心機(jī)，紫外分光光度計(jì)，渦旋振蕩儀，

倒置熒光顯微鏡（40x～640x），pH計(jì)，PCR儀，電泳儀，凝膠成像儀，低溫高速離心機(jī)（20000g，

8℃～10℃）。

試劑與耗材

5.3.1試劑

MRS瓊脂培養(yǎng)基，MRS肉湯，MEM培養(yǎng)液，腦心浸出液培養(yǎng)基，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，Agarose

GelDNAExtractionKit，EcoT14digestDNAMarker，DL2000DNAMarker，TaqDNA聚合酶，瓊脂

糖，胎牛血清，青鏈霉素雙抗，PBS緩沖液，胃蛋白酶，胰蛋白酶，膽鹽，甘油、過氧化氫、氯化鈉、

濃鹽酸、巰基乙酸鈉、丙酮酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、甲醇等均為分析純。

5.3.2耗材

T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，90mm培養(yǎng)皿，15mL/50mL離心管，500mL/250mL錐形瓶，0.22

μM濾膜，牛津杯，加樣器，棉拭子等。

5.3.3溶液配制

見附錄A。

乳酸菌的分離、純化和保藏

5.4.1乳酸菌的分離

2

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稱取10.0g發(fā)酵番茄渣加入放有90mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床中震蕩30min制備

菌懸液并進(jìn)行十倍梯度稀釋，稀釋液涂布于MRS平板上，37℃厭氧條件下培養(yǎng)48h。根據(jù)菌落的大小、

顏色、形狀及邊緣特征將不同的菌在MRS平板上進(jìn)行分離。

5.4.2純化與保藏

將已經(jīng)分離的菌株在MRS平板上反復(fù)劃線純化。將純化的單菌落接種于MRS肉湯中，37℃厭氧條

件下培養(yǎng)24h，將菌液與60%的無菌甘油以7：3的比例混勻，密封后放置在渦旋震蕩儀上震蕩混勻，-

80℃保存。

乳酸菌鑒定

5.5.1形態(tài)學(xué)鑒定

按GB4789.35的規(guī)定操作。

5.5.2分子學(xué)鑒定

DNA提取

取出-80℃凍存的乳酸菌菌株，室溫融化后用接種環(huán)挑取適量菌液，采用三區(qū)劃線法在MRS平板上

劃線進(jìn)行活化。用接種環(huán)挑取單菌落到MRS肉湯中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃厭氧培養(yǎng)18h用于DNA的提取，

方法參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書。

擴(kuò)增

提取出的DNA用于16SrDNA序列的擴(kuò)增。擴(kuò)增引物為細(xì)菌16SrDNA基因序列通用引物，上游引

物：27F5'-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3’；下游引物：1492R5'-TACCTTGTTACGACTT-3’。

PCR反應(yīng)體系如下（50μL）：TemplateDNA，2μL；dNTPmixture，4μL；Taq(5UμL-

12+-1

)，0.25μL；10×PCRbuffer(Mg-free)，5μL；MgCl2(25μmolL)，3μL；27F(10μ

-1-1

molL)，1μL；1492R(10μmolL)，1μL；ddH2O，33.75μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，共30個(gè)

循環(huán)；72℃10min。

測序

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，凝膠成像儀下觀察，可以看到1500bp左右的條帶。PCR產(chǎn)物回收參照Agarose

GelDNAExtractionKit說明書，回收產(chǎn)物送商業(yè)公司測序。

序列比對

利用Blast(/Blast.cgi)將待測菌株的16SrDNA序列與

Genbank中已知細(xì)菌16SrDNA序列進(jìn)行比對。將測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列導(dǎo)入到ClustalX1.83中進(jìn)

行校準(zhǔn)對齊，通過MEGA5.05將待測菌與標(biāo)準(zhǔn)菌的序列進(jìn)行對比，計(jì)算出進(jìn)化距離并用neighbor-joining

法建樹，BacillussubtilisNCDO1769作為外群，采用Bootstrap法，重復(fù)次數(shù)為1000。

益生性乳酸菌的篩選

5.6.1耐酸性測定

將凍存乳酸菌活化后接種于MRS肉湯中。取5mL菌液，1000g離心10min，棄上清。加入5mL無菌

生理鹽水混勻制成菌懸液。分別取1mL菌懸液與9mL人工胃液混勻，37℃培養(yǎng)，在0h、3h取樣，梯

3

DB15/T2554—2022

度稀釋涂板計(jì)數(shù)計(jì)算存活率，每種菌3個(gè)重復(fù)。存活率=3h的菌落數(shù)/0h的菌落數(shù)×100%，存活率大于

10%即認(rèn)定為可以耐受胃酸的環(huán)境。

5.6.2膽鹽耐受性測定

將凍存乳酸菌活化后挑單菌落接種于MRS肉湯中。將菌液按5%的接種量接種于含0.0%、0.3%、0.5%

和1.0%膽鹽的MRS-THIO培養(yǎng)基中。37℃厭氧培養(yǎng)24h，分別測定不同膽鹽濃度培養(yǎng)基的OD值來計(jì)算菌

株對膽鹽的耐受性。膽鹽的耐受性=含有不同濃度膽鹽的培養(yǎng)基的OD值/不含膽鹽培養(yǎng)基的OD值×100%，

存活率大于10%即認(rèn)定為具有膽鹽耐受性。

5.6.3乳酸菌對Caco-2細(xì)胞粘附能力的測定

Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)

.1復(fù)蘇培養(yǎng)

從液氮中取出Caco-2細(xì)胞凍存管，立即放入40℃的水浴中搖晃融化。將細(xì)胞懸液吸入裝有8mL培

養(yǎng)液的離心管中，300g離心8min，棄上清后加入12mL的新鮮培養(yǎng)液，用移液槍吹打均勻后加到培養(yǎng)

瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

.2傳代消化

待細(xì)胞長到80%～90%的時(shí)候進(jìn)行傳代。吸掉舊的培養(yǎng)液，用加了雙抗的PBS洗兩次，然后加入1

mL～2mL的胰酶，于37℃放置2min。顯微鏡觀察，大部分細(xì)胞變?yōu)閳A形后加血清終止消化，反復(fù)吹打

直到細(xì)胞完全脫落。300g離心8min，棄上清后將細(xì)胞分裝到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。培養(yǎng)好后消化制成細(xì)胞懸

液，加到放有蓋玻片的6孔板中(2mL/well)，待細(xì)胞貼壁后，吸掉舊的培養(yǎng)液，用不加雙抗的PBS洗2次

后用于粘附實(shí)驗(yàn)。

粘附能力的測定

將凍存的乳酸菌活化，挑取單菌落接入MRS肉湯中厭氧培養(yǎng)24h。1000g離心10min，用無菌的

PBS洗3次后，用MEM培養(yǎng)液懸浮至1.0×108CFU/mL，用于后續(xù)的粘附實(shí)驗(yàn)。

分別取1mL的菌液加入.2所述6孔板中37℃培養(yǎng)3h后終止，用無菌PBS洗5次，洗掉未粘附

的乳酸菌，室溫晾干后加甲醇固定30min，將蓋玻片進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察。每張蓋玻片隨機(jī)計(jì)

數(shù)50個(gè)細(xì)胞上粘附的乳酸菌數(shù)量，每組3個(gè)平行。每個(gè)細(xì)胞上粘附3個(gè)以上乳酸菌即認(rèn)定為具有粘附能力。

5.6.4抑菌能力的檢測

菌株活化培養(yǎng)

.1乳酸菌活化培養(yǎng)

將凍存乳酸菌活化后挑取單菌落接種于MRS肉湯中。37℃厭氧培養(yǎng)24h后，1000g離心10min后取

上清。

.2致病菌活化培養(yǎng)

將凍存于-80℃的Escherichiacoli和Staphylococcusaureus分別在固體LB培養(yǎng)基和腦心浸出液

培養(yǎng)基上劃線。37℃過夜后，挑取單菌落分別接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后備用。

抑菌能力檢測

4

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分別取100μLEscherichiacoli和Staphylococcusaureus菌液涂布于固體LB培養(yǎng)基和腦心浸出

液培養(yǎng)基上，然后將牛津杯放于平板中央，每種乳酸菌做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。在牛津杯的中央加100μL乳酸

菌液，37℃培養(yǎng)24h后測定每種菌抑菌圈的直徑（mm），結(jié)果用平均差±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對大腸桿菌的

抑菌圈直徑大于等于5.40±0.20即可認(rèn)定為具有抑菌能力，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于等于

15.50±0.10即可認(rèn)定為具有抑菌能力。

5

DB15/T2554—2022

A

A

附錄A

（規(guī)范性）

溶液配制

表A.1規(guī)定了溶液配制方法。

表A.1溶液配制

溶液名稱成分制備

氯化鈉2g

人工胃液胃蛋白酶3.5g1N鹽酸調(diào)pH至3.0，過濾除菌，4℃保存。

超純水1000mL

100mLMRS培養(yǎng)基

MRS-THIO培養(yǎng)基