DB51T8752009水稻稻瘟病菌對(duì)稻瘟靈抗藥性室內(nèi)測(cè)定技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水稻稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）對(duì)稻瘟靈（isoprothiolane）抗藥性室內(nèi)測(cè)定的技術(shù)方法，包括測(cè)定原理、試劑與材料、儀器設(shè)備、測(cè)定步驟、結(jié)果計(jì)算與判定等內(nèi)容。本標(biāo)準(zhǔn)適用于水稻稻瘟病菌對(duì)稻瘟靈的抗藥性水平監(jiān)測(cè)、抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及抗藥性機(jī)理研究。稻瘟靈是一種防治水稻稻瘟病的高效內(nèi)吸性殺菌劑，通過抑制病菌細(xì)胞膜磷脂生物合成而發(fā)揮殺菌作用。隨著稻瘟靈在水稻生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，稻瘟病菌對(duì)其產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)日益增加，建立標(biāo)準(zhǔn)化的抗藥性測(cè)定技術(shù)規(guī)程對(duì)于科學(xué)評(píng)價(jià)抗藥性發(fā)生水平、指導(dǎo)藥劑合理使用具有重要意義。本標(biāo)準(zhǔn)采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定稻瘟病菌對(duì)稻瘟靈的敏感性，通過計(jì)算抑制中濃度（EC50值）和抗性倍數(shù)來評(píng)價(jià)抗藥性水平。測(cè)定過程包括供試菌株的分離純化、含藥培養(yǎng)基的制備、接種培養(yǎng)、菌落直徑測(cè)量及數(shù)據(jù)處理等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，每個(gè)環(huán)節(jié)均需嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件以確保測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法NY/T1156.2農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)準(zhǔn)則殺菌劑第2部分：抑制病原真菌菌絲生長(zhǎng)試驗(yàn)平皿法NY/T1464.15農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則第15部分：殺菌劑防治水稻稻瘟病3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1稻瘟靈isoprothiolane化學(xué)名稱為1,3二硫戊環(huán)2亞基丙二酸二異丙酯，是一種有機(jī)硫類內(nèi)吸性殺菌劑，主要用于防治水稻稻瘟病。3.2敏感基線sensitivebaseline在未接觸稻瘟靈或接觸歷史較短的水稻稻瘟病菌群體中，對(duì)稻瘟靈的敏感性水平，通常以EC50值的平均值表示。3.3抗藥性resistance水稻稻瘟病菌在稻瘟靈選擇壓力下，其后代對(duì)稻瘟靈的敏感性顯著降低的現(xiàn)象。3.4抑制中濃度medianeffectiveconcentration（EC50）抑制稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)50%時(shí)所需的稻瘟靈濃度，單位為μg/mL。3.5抗性倍數(shù)resistancefactor抗性菌株的EC50值與敏感基線EC50值的比值，用于評(píng)價(jià)抗藥性水平。4測(cè)定原理本方法基于稻瘟靈對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用，在含有系列濃度稻瘟靈的培養(yǎng)基上接種供試菌株，通過測(cè)量菌落直徑計(jì)算抑制率，建立劑量反應(yīng)曲線，求出抑制中濃度（EC50值），并與敏感基線比較，評(píng)價(jià)抗藥性水平。該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定，適用于大批量菌株的抗藥性測(cè)定。5試劑與材料5.1供試藥劑稻瘟靈標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥95%，密封避光保存于4℃冰箱中。5.2培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，pH自然。121℃高壓滅菌20min。5.3供試菌株從田間水稻病株上分離純化的稻瘟病菌單孢菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定確認(rèn)。菌株保存于PDA斜面培養(yǎng)基，4℃冰箱中保存，每3個(gè)月轉(zhuǎn)接一次。5.4其他試劑無水乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，分析純；無菌蒸餾水，符合GB/T6682中三級(jí)水的要求。6儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱（25±1℃）、電子天平（感量0.0001g）、移液器（1001000μL）、培養(yǎng)皿（直徑90mm）、打孔器（直徑5mm）、游標(biāo)卡尺（精度0.02mm）、磁力攪拌器、pH計(jì)等。7測(cè)定步驟7.1藥劑母液配制準(zhǔn)確稱取稻瘟靈標(biāo)準(zhǔn)品0.1000g，用適量丙酮溶解，定容至10mL，配制成10000μg/mL的母液，4℃保存?zhèn)溆谩?.2含藥培養(yǎng)基制備將稻瘟靈母液用無菌蒸餾水稀釋成系列濃度梯度（通常為0、0.1、0.5、1、5、10、50、100μg/mL），取1mL藥液加入9mL熔化冷卻至45℃左右的PDA培養(yǎng)基中，充分混勻，倒入培養(yǎng)皿中，每皿15mL，凝固后備用。每個(gè)濃度設(shè)3次重復(fù)。7.3接種培養(yǎng)在預(yù)培養(yǎng)的菌落邊緣用打孔器打取直徑5mm的菌餅，菌絲面朝下接種于含藥培養(yǎng)基中央，25℃恒溫黑暗培養(yǎng)7天。7.4菌落直徑測(cè)量培養(yǎng)7天后，用游標(biāo)卡尺十字交叉測(cè)量菌落直徑，取平均值。減去菌餅直徑（5mm）即為實(shí)際生長(zhǎng)直徑。8結(jié)果計(jì)算與判定8.1抑制率計(jì)算抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%8.2EC50值計(jì)算采用幾率值分析法，將藥劑濃度轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值，抑制率轉(zhuǎn)換為幾率值，建立回歸方程，計(jì)算EC50值及其95%置信區(qū)間。8.3抗性水平判定根據(jù)抗性倍數(shù)（RF=抗性菌株EC50/敏感基線EC50）判定抗性水平：RF≤3：敏感3<RF≤10：低抗10<RF≤100：中抗RF>100：高抗9質(zhì)量控制9.1對(duì)照設(shè)置每次測(cè)定必須設(shè)置不含藥劑的空白對(duì)照和已知敏感菌株作為陽性對(duì)照，空白對(duì)照菌落直徑應(yīng)≥60mm，陽性對(duì)照EC50值應(yīng)在歷史數(shù)據(jù)范圍內(nèi)。9.2重復(fù)性要求同一菌株相同處理的3次重復(fù)間菌落直徑變異系數(shù)應(yīng)≤10%，否則需重新測(cè)定。9.3數(shù)據(jù)有效性判定劑量反應(yīng)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）應(yīng)≥0.90，否則試驗(yàn)數(shù)據(jù)無效，需重新進(jìn)行測(cè)定。10測(cè)定報(bào)告a)測(cè)定目的和依據(jù)；b)供試菌株信息（來源、分離時(shí)間、寄主品種等）；c)測(cè)定條件（溫度、培養(yǎng)基、藥劑批次等）；d)測(cè)定結(jié)果（菌落直徑、抑制率、EC50值、抗性倍數(shù)等）；e)抗性水平判定結(jié)果；f)測(cè)定人員、日期和單位。11注意事項(xiàng)11.1操作過程中應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，避免雜菌污染。11.2藥劑配制應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，操