DBS22吉林省衛(wèi)生廳IDBS22/016—2013本標準起草單位：長春市水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心。本標準主要起草人：閆先春、楊炳坤、楊立軍、王雅倩、修磊。DBS22/016—20131食品安全地方標準水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物(AOZ)的測定ELISA法本標準規(guī)定了水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物（3-amina-2-oxazolldinone,AOZ）的酶聯(lián)免疫測定方法。本標準適用于水產(chǎn)品的快速篩選檢測。本標準的檢出限為0.1μg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)則和試驗方法SC/T3016-2004水產(chǎn)品抽樣方法3原理利用ELISA抗原抗體的特異性反應，樣本中殘留的AOZ經(jīng)衍生化后和酶標板上預包被的偶聯(lián)抗原競爭呋喃唑酮代謝物的衍生物抗體，加入酶標二抗顯色后，樣本吸光值與其所含殘留物AOZ的含量成負相關，外標法定量。4試劑與材料除另有規(guī)定外，所用試劑均為分析純，試驗用水符合GB/T6682一級水的標準。4.1乙酸乙酯。4.2正己烷。4.3磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）。4.4濃鹽酸。4.5氫氧化鈉。4.6磷酸氫二鉀溶液（0.1moL/L）:稱取22.8g磷酸氫二鉀，1000mL水溶解混勻。4.71moL/L鹽酸溶液:量取8.3mL濃鹽酸加入水定容至100mL。4.81moL/L氫氧化鈉溶液:稱取4.0g氫氧化鈉加100mL水溶解混勻。4.9衍生化試劑（10mmoL/L向裝有15.1mg2-硝基苯甲醛的試劑瓶中加10mL甲醇溶解混勻。4.10試劑盒提供試劑包括：抗體預包被的96孔板，AOZ標準溶液、AOZ抗體工作液、底物顯色劑、酶標記物、反應終止液、濃縮復溶液、洗滌緩沖液。4.11刻度移液管：10mL。4.12洗耳球。4.13玻璃試管：10mL。2DBS22/016—20134.14聚苯乙烯離心管：2mL、50mL。5儀器與設備5.1酶標儀或酶聯(lián)免疫分光光度計(450nm)。5.2天平：感量0.01g。5.3洗板機。5.4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮氣吹干裝置。5.5均質(zhì)器。5.6振蕩器。5.7渦旋儀。5.8離心機（4000r/min）。5.9微量移液器：單道20μL～200μL、100μL～1000μL、多道250μL。6測定方法6.1制備與保存6.1.1抽樣：按SC/T3016-2004的方法進行。6.1.2樣品經(jīng)處理后，取可食部分（苗種取全身）100g，用均質(zhì)器搗碎，裝入樣品袋，標明標記，放入-18℃冰柜中冷凍保存。6.2提取、純化6.2.1稱取1.0±0.05g的均質(zhì)物（魚/蝦）至50mL聚苯乙烯離心管中，加入4mL水，0.5mL1mol/L鹽酸溶液（4.7）和100μL衍生化試劑（4.9充分振蕩2min；在60℃孵育3h；6.2.2分別加入5mL0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液（4.60.4mL1mol/L氫氧化鈉（見4.8）和5mL乙酸乙酯，劇烈振蕩30s；3000r/min，溫度20℃~25℃離心10min；6.2.3取出2.5mL上層有機相至10mL玻璃試管中，50℃~60℃水浴氮氣流下吹干；用1mL正己烷溶解干燥物，用1mL復溶液工作液（4.10）充分混合;高脂肪樣本，可加大正己烷用量，用3mL正己烷溶解干燥物。在室溫下（20℃~25℃)3000r/min離心10min；除去上層有機相，取50μL下層水相用于分析。6.3測定6.3.1將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20℃~25℃)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。6.3.2取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2℃~8℃。6.3.3將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。6.3.4加標準品/樣本和抗體工作液：加標準品/樣本50μL到對應的微孔中，然后加入抗體工作液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應30min。6.3.5洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液（4.10）250μL/孔，充分洗滌4～5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。DBS22/016—201336.3.6加酶標二抗：加入酶標二抗工作液100μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應30min，取出重復洗板步驟6.3.5。6.3.7顯色：先后加入兩種底物液各50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應15min。6.3.8測定：加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)，測定每孔OD值。7結(jié)果計算標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值除以空白樣品的吸光度值，再乘A0式中：E——-百分吸光度值，%；A——-標準液或樣品液吸光度值；A0——空白樣品吸光度值。以百分比吸光度值為縱坐標，以