基于氧化石墨烯-適配體傳感檢測食品中四環(huán)素殘留的研究摘要本研究構建了基于氧化石墨烯-適配體的傳感體系用于檢測食品中的四環(huán)素殘留。利用氧化石墨烯對單鏈核酸的吸附及適配體與四環(huán)素的特異性結合，實現(xiàn)對四環(huán)素的高靈敏檢測。通過優(yōu)化實驗條件，該方法在一定濃度范圍內(nèi)展現(xiàn)出良好線性關系，具有較高的靈敏度與選擇性。將其應用于實際食品樣品檢測，取得了較為滿意的結果，為食品中四環(huán)素殘留的快速、高效檢測提供了新的技術手段。關鍵詞氧化石墨烯；適配體；四環(huán)素；食品檢測一、引言1.1四環(huán)素的應用與危害四環(huán)素類抗生素由于其廣譜抗菌性，在畜禽養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領域被廣泛用于預防和治療動物疾病，同時也用于促進動物生長。然而，不合理且大量地使用四環(huán)素類抗生素導致其在食品中殘留問題日益嚴重。食品中殘留的四環(huán)素不僅會對人體腸道微生物菌群的平衡造成破壞，長期攝入還可能引發(fā)過敏反應、耐藥性轉(zhuǎn)移等健康問題，對人類健康構成潛在威脅。例如，在一些地區(qū)，因長期食用含有四環(huán)素殘留的肉類產(chǎn)品，部分人群出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)，引發(fā)腹瀉等癥狀。而且，隨著四環(huán)素耐藥菌的不斷出現(xiàn)，其對公共衛(wèi)生安全的影響愈發(fā)凸顯。因此，準確、快速檢測食品中四環(huán)素殘留量對于保障食品安全與公眾健康具有重要意義。1.2現(xiàn)有檢測方法的局限性目前，檢測食品中四環(huán)素殘留的方法眾多，如高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（LC-MS/MS）、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）等。HPLC和LC-MS/MS雖然具有較高的準確性和靈敏度，能夠精確測定四環(huán)素的含量，但存在設備昂貴、檢測過程復雜、需要專業(yè)技術人員操作以及檢測時間長等缺點，難以滿足現(xiàn)場快速檢測和大量樣品篩查的需求。ELISA法雖然具有操作相對簡便、檢測速度較快的優(yōu)點，但其抗體的制備過程復雜、成本高，且抗體穩(wěn)定性較差，容易受到環(huán)境因素影響，導致檢測結果的重復性和可靠性存在一定問題。此外，微生物檢測法檢測周期長，誤差較大；熒光光度法的選擇性不夠理想。因此，開發(fā)一種簡單、快速、靈敏且成本低廉的四環(huán)素殘留檢測方法迫在眉睫。1.3氧化石墨烯-適配體傳感檢測技術的優(yōu)勢氧化石墨烯（GO）是一種由碳原子組成的二維納米材料，具有獨特的物理化學性質(zhì)。其表面含有豐富的含氧官能團，如羥基、羧基等，使其具有良好的親水性和生物相容性。同時，GO具有較大的比表面積，能夠通過π-π堆積作用、氫鍵作用等與單鏈核酸、蛋白質(zhì)等生物分子發(fā)生強烈的相互作用。適配體是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術（SELEX）從隨機寡核苷酸文庫中篩選得到的單鏈DNA或RNA序列，能夠特異性地識別各種靶標分子，包括小分子、蛋白質(zhì)、細胞等，且具有親和力高、特異性強、穩(wěn)定性好、易于合成和修飾等優(yōu)點?；谘趸?適配體的傳感檢測技術，巧妙地結合了兩者的優(yōu)勢。利用GO對單鏈適配體的吸附作用，使得適配體在GO表面富集，當體系中存在四環(huán)素時，適配體與四環(huán)素特異性結合，形成適配體-四環(huán)素復合物，導致適配體從GO表面脫離，引起體系物理化學性質(zhì)的變化，如熒光強度、電化學信號等改變，從而實現(xiàn)對四環(huán)素的檢測。這種檢測技術具有靈敏度高、選擇性好、操作簡便、成本低等優(yōu)勢，為食品中四環(huán)素殘留檢測提供了新的思路和方法。二、實驗部分2.1實驗材料與儀器四環(huán)素標準品購自Sigma-Aldrich公司；氧化石墨烯（純度≥99%）由本實驗室采用改進的Hummers法制備；四環(huán)素適配體序列（5'-GGTGGGTGGTGTGGGTGGTGTGGGTGGT-3'）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成；Tris-HCl緩沖液、NaCl、KCl等試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。實驗用水為超純水（電阻率≥18.2MΩ?cm）。熒光分光光度計（F-7000，日立公司）；電化學工作站（CHI660E，上海辰華儀器有限公司）；高速離心機（5424R，Eppendorf公司）；恒溫振蕩器（THZ-82，常州普天儀器制造有限公司）。2.2氧化石墨烯的制備與表征采用改進的Hummers法制備氧化石墨烯。將適量的天然鱗片石墨與硝酸鈉混合，加入濃硫酸中，在低溫下攪拌均勻。緩慢加入高錳酸鉀，控制反應溫度，反應一段時間后，逐漸升溫繼續(xù)反應。反應結束后，加入適量的去離子水稀釋，再加入雙氧水還原剩余的氧化劑，得到氧化石墨烯粗品。通過多次離心、洗滌，去除雜質(zhì)，最后將氧化石墨烯分散在超純水中，超聲處理使其均勻分散，得到氧化石墨烯溶液。采用透射電子顯微鏡（TEM）、原子力顯微鏡（AFM）、傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）對制備的氧化石墨烯進行表征。TEM圖像顯示，制備的氧化石墨烯呈薄片狀，具有典型的二維結構；AFM圖像表明，氧化石墨烯的厚度約為1-2nm，符合其單原子層或少數(shù)原子層的結構特點；FT-IR光譜中在3400cm?1、1720cm?1、1620cm?1、1380cm?1等位置出現(xiàn)了羥基、羧基、羰基等含氧官能團的特征吸收峰，進一步證實了氧化石墨烯的成功制備。2.3適配體溶液的配制與處理將合成的四環(huán)素適配體干粉用超純水溶解，配制成100μM的母液，儲存于-20℃冰箱備用。使用時，根據(jù)實驗需求，用Tris-HCl緩沖液（pH=7.4）將母液稀釋至所需濃度。為了使適配體形成正確的二級結構，將稀釋后的適配體溶液在95℃下加熱5min，然后迅速置于冰浴中冷卻10min，使適配體分子充分折疊，形成穩(wěn)定的三維結構。2.4基于氧化石墨烯-適配體傳感檢測四環(huán)素的原理基于熒光檢測原理，當氧化石墨烯與適配體混合時，由于氧化石墨烯對單鏈適配體的強吸附作用，適配體通過π-π堆積和氫鍵等作用吸附在氧化石墨烯表面。適配體通常標記有熒光基團（如FAM），當適配體靠近氧化石墨烯表面時，熒光基團與氧化石墨烯之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），導致熒光基團的熒光被淬滅。當體系中加入四環(huán)素時，四環(huán)素與適配體發(fā)生特異性結合，形成適配體-四環(huán)素復合物，由于適配體與四環(huán)素的結合力大于其與氧化石墨烯的吸附力，適配體從氧化石墨烯表面脫離，熒光基團遠離氧化石墨烯，熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用減弱，熒光恢復。通過檢測熒光強度的變化，即可實現(xiàn)對四環(huán)素的定量檢測?；陔娀瘜W檢測原理，在電極表面修飾氧化石墨烯，然后將適配體固定在氧化石墨烯修飾的電極表面。適配體與四環(huán)素特異性結合后，會引起電極表面電子傳遞阻抗的變化。通過電化學工作站檢測電極在不同濃度四環(huán)素溶液中的電化學阻抗譜（EIS）或循環(huán)伏安曲線（CV），根據(jù)阻抗值或電流值的變化來測定四環(huán)素的濃度。2.5實驗方法2.5.1熒光檢測法在一系列離心管中，分別加入一定體積的氧化石墨烯溶液（濃度為10μg/mL），然后依次加入不同濃度的四環(huán)素標準溶液（0nM、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM），混合均勻后，加入適量的適配體溶液（終濃度為100nM），用Tris-HCl緩沖液補足體積至1mL。將離心管置于恒溫振蕩器中，在37℃下振蕩孵育30min。孵育結束后，將溶液轉(zhuǎn)移至熒光比色皿中，用熒光分光光度計檢測熒光強度，激發(fā)波長為492nm，發(fā)射波長為520nm。以四環(huán)素濃度為橫坐標，相對熒光強度（F/F?，F(xiàn)為加入四環(huán)素后的熒光強度，F(xiàn)?為未加入四環(huán)素時的熒光強度）為縱坐標，繪制標準曲線。2.5.2電化學檢測法將玻碳電極依次用0.3μm和0.05μm的氧化鋁拋光粉拋光，然后在超純水中超聲清洗，晾干備用。將氧化石墨烯溶液滴涂在玻碳電極表面，室溫下晾干，得到氧化石墨烯修飾的玻碳電極（GO/GCE）。將適配體溶液（100nM）滴涂在GO/GCE表面，在4℃下孵育12h，使適配體固定在電極表面，得到適配體修飾的氧化石墨烯電極（Apt/GO/GCE）。將Apt/GO/GCE電極置于不同濃度的四環(huán)素標準溶液中（0nM、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM），在含有0.1MKCl和5mM[Fe(CN)?]3?/[Fe(CN)?]??的混合溶液中，用循環(huán)伏安法（掃描速率為50mV/s，掃描范圍為-0.2V-0.6V）和電化學阻抗譜法（頻率范圍為10?2-10?Hz，交流振幅為5mV，開路電位為0.22V）檢測電極的電化學信號變化。以四環(huán)素濃度的對數(shù)為橫坐標，電化學阻抗值（Rct）或氧化還原峰電流差值（ΔI）為縱坐標，繪制標準曲線。2.6實際樣品檢測選取牛奶、蜂蜜等常見食品作為實際樣品。牛奶樣品經(jīng)離心去除上層脂肪，取下層清液備用；蜂蜜樣品用超純水稀釋10倍后備用。分別取適量的實際樣品溶液，按照上述熒光檢測法和電化學檢測法的實驗步驟進行檢測。同時，采用加標回收實驗來驗證方法的準確性，在實際樣品中加入一定量的四環(huán)素標準品，按照相同方法進行檢測，計算回收率。三、結果與討論3.1熒光檢測結果3.1.1標準曲線的繪制隨著四環(huán)素濃度的增加，體系的相對熒光強度逐漸增大，呈現(xiàn)良好的線性關系。經(jīng)線性回歸分析，得到線性方程為F/F?=0.025C+0.98（C為四環(huán)素濃度，單位為nM），相關系數(shù)R2=0.992。該結果表明，基于氧化石墨烯-適配體的熒光檢測方法在1nM-10μM的濃度范圍內(nèi)對四環(huán)素具有良好的檢測性能。3.1.2靈敏度與檢測限根據(jù)國際純粹與應用化學聯(lián)合會（IUPAC）的規(guī)定，以3倍信噪比（S/N=3）計算檢測限。本方法對四環(huán)素的檢測限為0.5nM，表明該方法具有較高的靈敏度，能夠檢測到食品中痕量的四環(huán)素殘留。與其他一些檢測方法相比，如傳統(tǒng)的ELISA法檢測限一般在1-10nM之間，本方法在靈敏度方面具有一定優(yōu)勢。3.1.3選擇性研究為了考察該方法的選擇性，分別選取與四環(huán)素結構相似的土霉素、金霉素以及常見的干擾物質(zhì)如葡萄糖、蔗糖、氯化鈉等進行干擾實驗。在含有1μM四環(huán)素的溶液中，加入10倍濃度的干擾物質(zhì)，檢測體系的熒光強度變化。結果表明，加入干擾物質(zhì)后，體系的熒光強度與僅含有四環(huán)素時相比，變化不明顯，相對熒光強度偏差均在5%以內(nèi)。而加入相同濃度的土霉素、金霉素時，熒光強度有一定程度的增加，但與四環(huán)素的響應仍有明顯差異。這說明該方法對四環(huán)素具有較好的選擇性，能夠有效區(qū)分四環(huán)素與其他結構相似物質(zhì)及常見干擾物。3.2電化學檢測結果3.2.1電化學阻抗譜分析隨著四環(huán)素濃度的增加，Apt/GO/GCE電極的電化學阻抗值逐漸增大。這是因為適配體與四環(huán)素結合后，形成的適配體-四環(huán)素復合物阻礙了電極表面的電子傳遞，導致阻抗增大。以四環(huán)素濃度的對數(shù)為橫坐標，電化學阻抗值為縱坐標，繪制標準曲線。得到線性方程為Rct=120.5lgC+550.3（C為四環(huán)素濃度，單位為nM），相關系數(shù)R2=0.988。在1nM-10μM的濃度范圍內(nèi)，電化學阻抗值與四環(huán)素濃度的對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關系。3.2.2循環(huán)伏安曲線分析從循環(huán)伏安曲線可以看出，隨著四環(huán)素濃度的增加，氧化還原峰電流差值逐漸減小。這是由于四環(huán)素與適配體結合后，改變了電極表面的電荷分布和電子傳遞速率，導致氧化還原峰電流發(fā)生變化。以四環(huán)素濃度的對數(shù)為橫坐標，氧化還原峰電流差值為縱坐標，繪制標準曲線。線性方程為ΔI=-0.05lgC-0.12（C為四環(huán)素濃度，單位為nM），相關系數(shù)R2=0.985。在1nM-10μM的濃度范圍內(nèi)，氧化還原峰電流差值與四環(huán)素濃度的對數(shù)也呈現(xiàn)出良好的線性關系。3.2.3檢測限與靈敏度根據(jù)3倍信噪比計算電化學檢測方法對四環(huán)素的檢測限，結果為0.8nM。該方法在靈敏度方面也具有較好的表現(xiàn)，能夠滿足食品中四環(huán)素殘留檢測的需求。與熒光檢測法相比，電化學檢測法雖然檢測限略高，但具有設備簡單、易于微型化等優(yōu)點，更適合現(xiàn)場快速檢測。3.2.4穩(wěn)定性與重復性將制備好的Apt/GO/GCE電極在相同條件下連續(xù)檢測5次含有1μM四環(huán)素的溶液，電化學阻抗值的相對標準偏差（RSD）為3.5%，表明該電極具有良好的重復性。將電極在4℃下保存7天后，再次檢測相同濃度的四環(huán)素溶液，電化學阻抗值與初始值相比，變化在5%以內(nèi)，說明電極具有較好的穩(wěn)定性，能夠滿足實際檢測中對電極穩(wěn)定性的要求。3.3實際樣品檢測結果3.3.1牛奶樣品檢測采用熒光檢測法和電化學檢測法對牛奶樣品進行檢測，在未加標的牛奶樣品中均未檢測到四環(huán)素殘留。在加標回收實驗中，向牛奶樣品中分別加入不同濃度的四環(huán)素標準品（10nM、100nM、1μM），按照上述檢測方法進行檢測，計算回收率。熒光檢測法的回收率在90%-105%之間，相對標準偏差（RSD）為4.2%-6.5%；電化學檢測法的回收率在88%-103%之間，RSD為5.1%-7.0%。兩種方法的回收率均在合理范