柱色譜基本操作實驗藥物分析教研室實驗?zāi)康?掌握柱色譜法的原理及一般操作技術(shù)2熟悉柱色譜法中干、濕法裝柱及上樣的注意事項3了解色譜法的種類一、色譜法簡介1903年俄國植物學(xué)家Tswett分離植物色素時采用的實驗方法:將植物色素的提取液從頂端注入裝有碳酸鈣的直立玻璃管，再加入石油醚使其自由流下，結(jié)果色素中各組份互相分離形成不同顏色的譜帶。茨維特一、色譜法簡介里夏德·庫恩（RichardKuhn）保羅·卡勒（PaulKarrer）1937年諾貝爾化學(xué)獎1938年諾貝爾化學(xué)獎維生素結(jié)構(gòu)一、色譜法簡介

色譜法亦稱色層法，層析法等，是分離，純化和鑒定有機化合物的重要方法之一，還可定量分析。

色譜法分類固定相、流動相的物理狀態(tài)操作形式分離原理液—固色譜法氣—固色譜法氣—液色譜法液—液色譜法柱色譜法（columnchromatography）薄層色譜法（TLC）紙色譜法（paperchromatography）氣相色譜（GC）高效液相色譜（HPLC）吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法排阻色譜操作形式柱色譜法（columnchromatography）二、柱色譜法原理混合物吸附劑(固定相)洗脫劑(流動相)柱色譜分離示意圖：二、柱色譜法原理吸附劑的性質(zhì)：均勻、表面積大、不反應(yīng)、吸附能力不同試樣化合物的結(jié)構(gòu)：化合物的吸附性和它們的極性成正比洗脫劑的極性：溶解度適中、不反應(yīng)、易獲取回收影響分離效果主要因素：吸附色譜三要素硅膠柱1、硅膠(silica

gel)它的吸附性來源于硅膠氧原子上未成鍵的電子對和可以形成氫鍵的羥基。它們可以與試樣和洗脫劑分子中的極性基團或不飽和鍵產(chǎn)生氫鍵締合而起吸附作用。三、吸附色譜三要素—吸附劑活性羥基在硅膠表面較小的孔穴中較多，水與硅膠表面的羥基形成水合硅醇，使其失去活性。因此需加熱除去水分。最佳活化條件為105℃—110℃，加熱30分鐘。如果將硅膠在200℃以上長時間加熱后，則硅原子上結(jié)合的羥基發(fā)生脫水而形成硅氧烷型，這種不含羥基的硅氧烷型的硅膠吸附性極差。200℃加熱硅膠，通常視為酸性吸附劑。一般用來分離一些酸性和中性有機物。如有機酸、萜類、氨基酸、甾類和一些甙類。但是，對某些酸性弱的試樣，在色層中有分解的危險。如在硅膠中拌入15%左右的硝酸銀，這種加硝酸銀的硅膠對有機物中不飽和鍵有特殊的吸附性，因此，常用它分離一些不飽和化合物。此外，對于堿性物質(zhì)可發(fā)生不可逆吸附。因此，對一些堿性物質(zhì)在使用硅膠進行層析時，有必要進行預(yù)實驗。三、吸附色譜三要素—吸附劑2、氧化鋁(alumina

)氧化鋁的吸附活性來源于鋁原子上未成鍵電子對。氧化鋁的活性與含水量有關(guān)，含水量越低，活性越大，吸附力越強。無水氧化鋁吸附活性特別強。根據(jù)氧化鋁的含水量可將氧化鋁的活性分為五級。三、吸附色譜三要素—吸附劑活性氧化鋁含水量（%）硅膠含水量（%）I00II35III815IV1025V1538三、吸附色譜三要素—吸附劑酸性氧化鋁(pH5~4)，適用于分離酸性化合物和對酸穩(wěn)定的中性化合物，如酚類物質(zhì)和某些氨基酸類等。中性氧化鋁(pH=7.

5)，適用與分離生物堿、揮發(fā)油、萜類、甾類、蒽醌以及在酸堿中不穩(wěn)定甙類、酯、內(nèi)酯等化合物。凡是能用酸性或堿性氧化鋁層析分離的物質(zhì)，中性氧化鋁也都適用。

堿性氧化鋁(pH9~10)

，適用于堿性，如生物堿和中性化合物的分離。

三、吸附色譜三要素—吸附劑聚酰胺的吸附性是由子分了中含有許多酰胺基，在水溶液中能與酚羥基發(fā)生氫鍵締合而吸附，因此，聚酰胺是分離酚性物質(zhì)和黃酮、蒽醌及其苷類最有效的吸附劑。要從聚酰胺柱上洗脫被吸附的酚性物質(zhì)，是用一種溶劑分子頂替被吸附的酚性化合物，溶劑這種解吸性質(zhì)的強弱，一般是按下列順序增強：水、乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、稀氨水或稀氫氧化鈉水液、甲酰胺。3、聚酰胺（polyamide）三、吸附色譜三要素—吸附劑洗脫過程:流動相與被分離分子競爭占據(jù)吸附劑表局面活性中心的過程。三、吸附色譜三要素—洗脫劑

2.溶劑(洗脫劑)在層析中，如采用氧化鋁或硅膠為吸附劑，則所用的溶劑應(yīng)先從極性低的(對吸附劑親和力小的)開始，以后逐漸增加極性大的溶劑。常用的流動相按其極性增強順序排列：石油醚<環(huán)己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烯<苯<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<乙酸甲酯<丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<吡啶<酸。三、吸附色譜三要素—洗脫劑在實際操作中，使用混合溶劑作為洗脫劑，一般要比單獨使用一種溶劑為洗脫劑的時候多些，因為混合溶劑往往能起到單一溶劑所不能起到的微妙分離效果，但在使用時要絕對避免用兩個極端洗脫力的混合劑，這是因為洗脫力強的溶劑發(fā)生溶劑化效應(yīng)，從而降低混合溶劑的作用，達不到理想的分離效果。三、吸附色譜三要素—洗脫劑一般選擇極性大的溶劑與極性小的溶劑進行不同比例混合作為洗脫劑層析時，如被分離的物質(zhì)含有羧基或氨基等極性強的官能團，容易發(fā)生色帶擴散和拖尾現(xiàn)象，為了防止這種現(xiàn)象達到有效分離：在分離含有羧基的試樣時，可加少量的醋酸；

在分離含有氨基試樣時，可加少量的氨水、吡啶、二已胺等溶劑，以控制它們的解離，消除拖尾，提高層析效能。

三、吸附色譜三要素—洗脫劑

3.試樣成分的性質(zhì)在給定的條件下，各個成分的分離情況，與被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)有關(guān)，對極性吸附劑而言，被分離物質(zhì)的極性越大，兩者吸附作用也越強。具有極性基團的化合物，其吸附能力按下列順序增加：三、吸附色譜三要素—試樣Cl-,Br,I<C=C<-OCH3<-CO2R<C=O,-CHO<-SH-<-NH2<-OH<-CO2H四、儀器與試劑1.儀器：玻璃色譜（層析）柱、錐形瓶、燒杯、量筒、玻璃漏斗、玻璃棒、膠頭滴管、蒸發(fā)皿、藥勺。2.試劑：柱層析硅膠（200-300目）、石油醚。3.樣品：油溶葉黃素（葉黃素、β-胡蘿卜素、植物油）。五、實驗方法裝柱加樣洗脫收集鑒定干法裝柱濕法裝柱洗脫溶劑組分熒光薄層鑒定干法加樣濕法加樣

柱色譜操作：五、實驗方法1.裝柱：（1）干法裝柱：稱取約25ml柱層析硅膠通過漏斗形成細流狀緩慢加入到柱內(nèi)，同時不斷輕輕敲打色譜柱身使硅膠填壓緊實、硅膠表面平整。色譜柱下端出口連上真空泵抽氣，關(guān)閉活塞，并從上端沿內(nèi)壁緩慢加入石油醚，打開活塞待硅膠剛好全部潤濕，立即關(guān)閉活塞。抜掉抽氣管，并從色譜柱上端沿內(nèi)壁緩慢加入石油醚，并保留約3cm高液面。（2）濕法裝柱：稱取約25ml柱層析硅膠置于燒杯中，加入約100ml石油醚浸潤，待溶脹后并攪拌均勻。接著通過漏斗倒入色譜柱中，再用少量石油醚洗滌燒杯，將殘留的硅膠全部轉(zhuǎn)移至色譜柱中。轉(zhuǎn)移完畢，打開下端活塞，不斷輕輕敲打色譜柱身，加壓使硅膠緊實，并保留約3cm高液面。

五、實驗方法2.加樣：（1）干法加樣：取一膠頭滴管尖端量的樣品，用少量約1ml石油醚溶劑使其全部溶解后，滴加在蒸發(fā)皿中3ml體積的柱層析硅膠上，再用藥勺攪拌均勻，殘留的樣品也要溶解滴加在硅膠上拌勻。待樣品攪拌揮盡溶劑，成粉狀后，通過漏斗均勻地加入到色譜柱中，再用少量石油醚洗滌蒸發(fā)皿上的殘留樣品并重復(fù)操作全部轉(zhuǎn)移至色譜柱中，盡量使樣品帶平整。接著打開活塞使溶劑液面邊緣降至硅膠表面后，沿內(nèi)壁緩慢加一滴管石油醚清洗內(nèi)壁，待溶劑液面邊緣降至硅膠表面后，關(guān)閉活塞，緩慢沿內(nèi)壁向其中加入石油醚約15cm高，打開活塞進行樣品化學(xué)成分的分離。五、實驗方法（2）濕法加樣：取一膠頭滴管尖端量的樣品，用少量約1ml石油醚溶劑使其全部溶解后，沿色譜柱內(nèi)壁緩慢加入，注意不要破壞硅膠表面的平整。打開活塞使樣品溶劑液面邊緣降至硅膠表面，關(guān)閉活塞，再用少量的石油醚洗滌殘留樣品，將殘留的樣品按上述操作步驟全部轉(zhuǎn)移至色譜柱中，再打開活塞使溶劑液邊緣面降至硅膠表面。繼續(xù)沿內(nèi)壁緩慢加一滴管石油醚清洗內(nèi)壁，待溶劑液面邊緣降至硅膠表面后，關(guān)閉活塞，緩慢沿內(nèi)壁向其中加入石油醚約15cm高，打開活塞進行樣品化學(xué)成分的分離。五、實驗方法實驗結(jié)果拍照附圖：拌樣結(jié)果照片干法裝柱結(jié)果照片干法上樣結(jié)果照片分離結(jié)果照片結(jié)果：分離結(jié)果現(xiàn)象。干法裝柱干法上樣注意事項裝柱時應(yīng)該注意吸附劑均勻，不能有氣泡，裂縫，溶劑不能流干，否則樣品可能順縫隙流動而不吸附，影響樣品的分離，應(yīng)用質(zhì)軟的物體如吸耳球等