IT/XXXXXXX—20XX前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義、縮略語 4原理 5試劑與溶液配制 6儀器和設(shè)備 7檢驗(yàn)程序 8系統(tǒng)適用性 9結(jié)果判定 T/XXXXXXX—20XX本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由深圳市藥品檢驗(yàn)研究院提出。本文件由深圳市中藥協(xié)會(huì)歸口。本文件起草單位：深圳市藥品檢驗(yàn)研究院、中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所、廣州中醫(yī)藥大學(xué)、長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)、華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司、深圳市和順本草藥業(yè)有限公司、廣州至信藥業(yè)股份有限公司、九信中藥集團(tuán)有限公司、深圳市華輝藥業(yè)有限公司本文件主要起草人：T/XXXXXXX—20XX1鹿茸中馴鹿源性成分檢測(cè)qPCR法本文件規(guī)定了鹿茸中馴鹿源性成分的實(shí)時(shí)熒光定性PCR檢測(cè)方法。本文件適用于馴鹿源性DNA成分的定性檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法T/CACM1027.2-2016中藥分子鑒定通則第2部分：中藥提取與中成藥《中華人民共和國(guó)藥典》（2025年四部）3術(shù)語和定義3.1實(shí)時(shí)熒光定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Qualitativereal-timepolymerasechainreaction：qPCR在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的積累，實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR進(jìn)程，并通過擴(kuò)增曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定性分析的方法。注：改寫GB/T19495.4-203.2Ct值cyclethreshold每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。[GB/T19495.5-2018,3.1.3]3.3陽性對(duì)照Positivecontrol使用對(duì)照樣品代替檢驗(yàn)樣品同法DNA提取、靶核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測(cè)過程，用于證明鑒定過程可獲得目標(biāo)核酸片段的操作。4原理提取測(cè)試樣品中的DNA，針對(duì)馴鹿物種特異性序列設(shè)計(jì)引物，通過特異性引物和標(biāo)記熒光物質(zhì)探針，對(duì)馴鹿源性的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的強(qiáng)弱判定，實(shí)現(xiàn)對(duì)鹿茸中馴鹿源性成分的定性分析。T/XXXXXXX—20XX25試劑和溶液配制除非另有說明，所有試劑均為分析純，試驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)定。5.1組織或血液基因組DNA提取試劑盒（離心柱法）或動(dòng)物成分相關(guān)DNA提取試劑盒采用組織或血液基因組DNA提取試劑盒（離心柱法）或動(dòng)物成分DNA提取試劑盒。5.21×TAE（三羥甲基氨基甲烷-冰醋酸-乙二胺四乙酸二鈉）電泳緩沖液取20mL50×TAE電泳緩沖液，加無菌超純水定容至1000mL。5.3實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，包括Taq酶、dNTPs、PCR體系緩沖液等，按試劑盒要求保存。5.4引物和探針馴鹿引物探針正向：TGCCCTAAGCTTACTAATCCGTGCT反向：AGAAAAGAGGGAGGGAGAAGTCAG探針：FAM-ATTGTAACCGCACATGCATTCGTAAT-MGB內(nèi)參引物探針正向:GACCGTGCAAAGGTAGCATAA反向:GTTAAAGCTCCATAGGGTCTTCTC探針：FAM-CTGTCTCTTACTTCCAAT-MGB按照引物說明書，用無菌超純水將上述引物溶解至10μmol·L-1，置4℃保存。6儀器和設(shè)備6.1實(shí)時(shí)熒光PCR儀激發(fā)/檢測(cè)波長(zhǎng)范圍350nm-750nm，可用SYBRGreenI染料和TaqMan探針。6.2高速臺(tái)式離心機(jī)離心力12000g以上。6.3生物安全柜或超凈工作臺(tái)6.4電子天平感量0.01g。6.5核酸檢測(cè)儀波長(zhǎng)范圍應(yīng)包含200nm～400nm，檢測(cè)樣品量至少應(yīng)為0.1μL，檢測(cè)精度應(yīng)不低于2ng·μL-1。6.6渦旋設(shè)備能渦旋1.5mL和2mL離心管。6.7連續(xù)可調(diào)微量移液槍T/XXXXXXX—20XX3應(yīng)包括0.1μL～2.5μL、0.5μL～10.0μL、10μL～100μL、100μL～1000μL規(guī)格，并包括配套的一次性吸頭。7檢測(cè)步驟7.1粉碎取測(cè)試樣品適量，置球磨粉碎儀中充分研磨粉碎。必要時(shí)取帶有外皮及皮茸部分的鹿茸片。7.2DNA提取取測(cè)試樣品粉末適量置離心管中，用組織或血液基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取DNA[加入緩沖液GA200μL，振蕩至徹底混勻；加入ProteinaseK溶液20μL，混勻，在56℃放置2小時(shí)，每小時(shí)顛倒混合樣品數(shù)次；加入緩沖液GB200μL,充分混勻，70℃放置10分鐘，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁水珠；加入200μL無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁水珠；將溶液和絮狀沉淀加到CB3吸附柱上，將吸附柱放入收集管中，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）30秒，倒掉廢液，將CB3吸附柱放回收集管中；加入已加入無水乙醇的緩沖液GD500μL，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）30秒，倒掉廢液，將CB3吸附柱放回收集管中；加入漂洗液PW600μL，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）30秒，倒掉廢液，將CB3吸附柱放回收集管中；再次加入漂洗液PW600μL，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）30秒，倒掉廢液，將CB3吸附柱放回收集管中；離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）2分鐘，倒掉廢液。將CB3吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。取出吸附柱，放入新的1.5mL離心管中；向吸附膜的中間部位懸空滴加100μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5min分鐘，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）2分鐘]，取洗脫液，作為供試品溶液，置-20℃保存?zhèn)溆谩７謩e另取鹿茸、馴鹿茸對(duì)照藥材各約20mg，同法制成對(duì)照藥材模板DNA溶液。7.3實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)7.3.1內(nèi)參基因檢測(cè)可先將試樣DNA進(jìn)行內(nèi)參基因的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，若檢測(cè)結(jié)果為陽性，表明提取的試樣DNA適宜進(jìn)行PCR檢測(cè)，可以進(jìn)行動(dòng)物內(nèi)源基因的檢測(cè)；若檢測(cè)結(jié)果為陰性，表明提取的DNA不適宜進(jìn)行PCR檢測(cè)，應(yīng)重新提取DNA。若重新檢測(cè)結(jié)果仍為陰性，則本方法不適用于該試樣檢測(cè)。7.3.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)在200μL離心管中進(jìn)行，反應(yīng)總體積為20μL，反應(yīng)體系包括2×熒光定量PCR酶混合液10μL，引物（10μmol/L）各0.2μL，模板1.0μL，無菌超純水8.52μL。將離心管置于實(shí)時(shí)熒光PCR儀，反應(yīng)參數(shù)為：50℃2min，95℃2min，后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)95℃10s，59℃1min。另取無菌超純水，同法上述模板DNA檢查PCR反應(yīng)操作，作為空白對(duì)照。7.4平行試驗(yàn)每種