質(zhì)粒載體PE-NANOG-UCOE-N185的設(shè)計(jì)與構(gòu)建 論文（設(shè)計(jì)）題目質(zhì)粒載體PE-NANOG-UCOE-N185的設(shè)計(jì)與構(gòu)建子課題題目摘要【目的】通過構(gòu)建PE-NANOG-UCOE-N185的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，為開展該載體其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)研究奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā渴紫龋肞CR技術(shù)擴(kuò)增包含U6啟動(dòng)子和shRNAN185基因的表達(dá)框，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將目的片段切膠純化回收后進(jìn)行末端平端化，再進(jìn)行純化。用MIU1酶在PE-NANOG-UCOE中間載體的MIU1位點(diǎn)進(jìn)行單酶切，并將線性化的PE-NANOG-UCOE質(zhì)粒進(jìn)行末端平端化和純化后與末端平端化和純化后的shRNAN185表達(dá)框進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后用菌落PCR篩選出陽性克隆,培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒PCR檢測和測序鑒定；最后對構(gòu)建好的PE-NANOG-UCOE-N185的哺乳動(dòng)物細(xì)胞載體進(jìn)行保存?！窘Y(jié)果】成功擴(kuò)增含人U6啟動(dòng)子和shRNA表達(dá)框的質(zhì)粒載體，并將該載體命名為PE-NANOG-UCOE-N185的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體?！窘Y(jié)論】PE-NANOG-UCOE-N185的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體被成功構(gòu)建，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：PE-NANOGUCOE質(zhì)粒載體構(gòu)建高效表達(dá)Abstract【objective】:TheexpressionvectorofPE-NANOG-UCOE-N185inmammaliancellswasconstructedtolayafoundationforitsexpressioninmammaliancells.【methods】:Firstly,theexpressionframecontainingU6promoterandshRNAN185genewasamplifiedbyPCR,andthePCRproductwasdetectedbyagarosegelelectrophoresis.TheMIU1siteofthePE-NANOG-UCOEintermediatevectorwasdigestedwithMIU1enzyme,andthelinearizedPE-NANOG-UCOEplasmidwasdigestedandpurifiedwiththeshRNAN185expressionbox.Aftertransformation,thepositivecloneswerescreenedbycolonyPCR,theplasmidswereculturedandextracted,andtheplasmidPCRwasdetectedandsequenced.Finally,themammaliancellvectorconstructedwithPE-NANOG-UCOE-N185waspreserved.【results】:TheplasmidvectorcontaininghumanU6promoterandshRNAexpressionframewassuccessfullyamplifiedandnamedasmammaliancellexpressionvectorPE-NANOG-UCOE-N185.【conclusion】：ThemammalianexpressionvectorofPE-NANOG-UCOE-N185wassuccessfullyconstructed,whichlaidthefoundationforfurtherexperiments.Keywords:PE-NANOGUCOEplasmidvectorconstructionhigh-efficiencyexpression目錄第一章前言 6第二章材料與方法 92.1PE-NANOG-UCOE、N185質(zhì)粒提取 92.1.1材料準(zhǔn)備 92.1.2實(shí)驗(yàn)步驟 92.2PCR技術(shù)擴(kuò)增含人U6啟動(dòng)子的shRNAN185基因的表達(dá)框 102.2.1材料準(zhǔn)備 102.2.2實(shí)驗(yàn)步驟 112.3載體的準(zhǔn)備 122.3.1材料準(zhǔn)備 122.3.2PE-NANOG-UCOEMIUI酶切 122.3.3酶切后平端化 122.4連接及載體構(gòu)建 132.4.1材料準(zhǔn)備 132.4.2實(shí)驗(yàn)步驟 13第三章結(jié)果與分析 163.1PE-NANOG-UCOE、N185質(zhì)粒提取的結(jié)果 163.2N185-F目的片段PCR擴(kuò)增、平端化的結(jié)果 163.2.1PCR克隆N185-F基因啟動(dòng)子結(jié)果 163.3PE-NANOG-UCOE載體準(zhǔn)備 173.3.1PE-NANOG-UCOEMIU1酶切鑒定電泳結(jié)果 173.3.2PE-NANOG-UCOE酶切產(chǎn)物末端平端化 173.4連接及載體構(gòu)建 183.4.1重組PE-NANOG-UCOE連接、轉(zhuǎn)化培養(yǎng)及菌落PCR篩選的結(jié)果 183.4.3PE-NANOG-UCOE載體及N185-F目的片段終濃度 203.4.4重組載體PE-NANOG-UCOE-N185質(zhì)粒DNA樣品測序結(jié)果 20第四章討論與結(jié)論 234.1討論 234.1.1N185-F基因啟動(dòng)子的克隆 234.1.2PE-NANOG-UCOE酶切、平端化 234.1.3PE-NANOG-UCOE與N185目的片段連接 234.1.4重組PE-NANOG-UCOEN185表達(dá)載體篩選及鑒定 244.2結(jié)論 24參考文獻(xiàn) 25謝辭 27第一章前言由于哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)具有非常完善的翻譯后處理和修飾蛋白質(zhì)的功能，重組蛋白的結(jié)構(gòu)更接近其自然結(jié)構(gòu)，且生理活性和理化性質(zhì)較為理想[1]。因此，它已成為21世紀(jì)生物制藥產(chǎn)業(yè)的主要發(fā)展方向。與大腸桿菌相比，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)水平較低，獲得高表達(dá)工程細(xì)胞株所需的時(shí)間長，大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)成本較高，導(dǎo)致哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物的成本較高[2]。外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的低表達(dá)一直是蛋白質(zhì)類藥物生產(chǎn)中的一個(gè)重要難題。隨著對基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)研究的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)，目的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)與整合目的基因染色體區(qū)的狀態(tài)、目的基因的拷貝數(shù)以及目的基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后加工修飾的效率有關(guān)。因此，可以從染色體整合位點(diǎn)的優(yōu)化、轉(zhuǎn)錄效率的提高和目的基因拷貝數(shù)的增加等方面考慮構(gòu)建高表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體[3]。目前造成轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率低的主要因素是轉(zhuǎn)錄沉默，而位置效應(yīng)又是引起轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的重要因素。目前造成轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率低的主要因素是轉(zhuǎn)錄沉默，這通常與CpG島的DNA序列甲基化以及組蛋白去乙?；@兩個(gè)因素有關(guān)[4]。首先，從當(dāng)前研究情況來看，啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島出現(xiàn)甲基化是導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因沉默的主要原因。因?yàn)樗拗魃镏械募谆D(zhuǎn)移酶在DNA半保留復(fù)制后會對新合成鏈的啟動(dòng)子區(qū)城進(jìn)行甲基化修飾，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶殘基上，使得DNA甲基化[5]，造成基因啟動(dòng)子及其附近區(qū)城的染色質(zhì)凝縮成非活性的結(jié)構(gòu)，改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象，阻礙DNA與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而降低基因的轉(zhuǎn)錄水平或抑制基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而造成基因沉默[6]。其次，對染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，基因發(fā)生沉默時(shí)，核心組蛋白的氨基端尾巴被共價(jià)修飾，進(jìn)而產(chǎn)生多重生物學(xué)效應(yīng)以致于影響基因的表達(dá)調(diào)控。共價(jià)修飾主要表現(xiàn)為組蛋白乙?；?去乙?；?。機(jī)體通過利用組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活躍DNA與組蛋白之間的相互作用，減少染色質(zhì)對DNA的限制，改變核小體的構(gòu)象，重塑染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而增加轉(zhuǎn)錄因子與DNA的親和能力，提高外源基因的轉(zhuǎn)錄效率。通常乙?；腿ヒ阴；g的平衡控制著染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)形態(tài)，進(jìn)而影響到外源基因的調(diào)控表達(dá)[7]。位置效應(yīng)是由于染色體畸變改變了一個(gè)基因與其鄰近基因或與其鄰近染色質(zhì)的位置關(guān)系，從而使它的表型效應(yīng)也發(fā)生變化的現(xiàn)象。它可分為兩大類：穩(wěn)定型和花斑型，花斑型效應(yīng)的表型改變是不穩(wěn)定的，關(guān)于花斑位置效應(yīng)的產(chǎn)生機(jī)制，直接的證據(jù)來自于1935年Dubinin和Sidorov以及Panshin兩個(gè)獨(dú)立的工作(Dubininetal.,1935;Panshin,1935)，這兩個(gè)工作由于原來位于常染色質(zhì)上的基因通過染色體畸變等過程移動(dòng)到與異染色質(zhì)相近的區(qū)域，或者原來異染色質(zhì)的一段序列被轉(zhuǎn)移到常染色質(zhì)區(qū)域時(shí)，異染色質(zhì)附近的常染色質(zhì)基因出現(xiàn)花斑效應(yīng)。也就是說花斑效應(yīng)出現(xiàn)的條件是常染色質(zhì)基因被移動(dòng)到異染色質(zhì)的接口處，通過花斑位置效應(yīng)的機(jī)制，我們可以得出，染色體結(jié)構(gòu)的不同是位置效應(yīng)出現(xiàn)的一個(gè)重要原因。同時(shí)，位置效應(yīng)也是引起轉(zhuǎn)錄水平基因沉默的重要因素[8]?；虻霓D(zhuǎn)錄與核小體有關(guān)，但是核小體并不是一個(gè)簡單的靜止的單位，它受到各種因素的調(diào)節(jié)而呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)的特征，核小體的這種結(jié)構(gòu)特征影響著從激活因子的結(jié)合到前轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的延伸這一系列復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄過程。同時(shí)，蛋白質(zhì)復(fù)合物體可通過ATP水解作用影響組蛋白與DNA的相互作用，使染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)重塑，相應(yīng)的結(jié)果包括形成DNAloop,使核小體滑動(dòng)，從而改變了核小體DNA對轉(zhuǎn)錄因子的親和力，從而影響基因的表達(dá)[9]。目前，克服位置效應(yīng)主要有兩種策略。第一種是在外源基因的兩端引入某些轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，開放插入?yún)^(qū)域的異染色質(zhì)或阻止其對插入基因的影響，Ley等[10]發(fā)現(xiàn)使用人MAR1-68可以提高外源基因表達(dá)的3．1倍。但是當(dāng)外源基因拷貝數(shù)過高時(shí)，MAR對基因沉默的抑制作用會大大降低;第二種是利用同源重組使外源基因定點(diǎn)整合進(jìn)入轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，提高目的基因的轉(zhuǎn)錄水平。泛染色體開放元件(UCOE)來自于異質(zhì)核糖核蛋白A2B1/的看家基因,是由一個(gè)延展的無甲基化的CpG島和雙向啟動(dòng)子組成[10]，具有染色質(zhì)重塑的功能。當(dāng)它作為調(diào)控元件連接在啟動(dòng)子的上游時(shí)能夠防止轉(zhuǎn)錄沉默，使轉(zhuǎn)錄的目的基因不受“位置效應(yīng)”的影響,從而使目的蛋白在細(xì)胞中高表達(dá)[11]。saRNAN185的UCOE哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，可以使轉(zhuǎn)錄的目的基因不受位置效應(yīng)的影響，我們嘗試將RNA激活效應(yīng)運(yùn)用到載體構(gòu)建中，嘗試構(gòu)建PE-NANOG-UCOE-N185的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，使載體能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)。如今，用于重組蛋白藥物生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)主要包括原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)[12]。當(dāng)含有復(fù)雜的二硫鍵或翻譯后修飾的靶蛋白不能使用其他表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)時(shí)，此時(shí)哺乳動(dòng)物細(xì)胞就可表達(dá)外源蛋白[13]。RNA激活是一種獨(dú)特的小分子非編碼RNA(ncRNA)對基因表達(dá)的正向調(diào)控機(jī)制。2006年Li等在研究針對基因啟動(dòng)子DNA序列的小雙鏈RNA(dsRNA)分子對基因表達(dá)的調(diào)控過程中,發(fā)現(xiàn)特定序列的dsRNA可以特異性地將某些沉默或低表達(dá)基因激活,其將這個(gè)現(xiàn)象稱之為RNA激活,具有激活功能的dsRNA分子稱之為小激活RNA(saRNA)[14]。通過研究發(fā)現(xiàn)，saRNA主要在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控中起作用,并且是在啟動(dòng)子區(qū)發(fā)揮作用，saRNA主要通過在基因啟動(dòng)子區(qū)的特異性結(jié)合來激活基因的轉(zhuǎn)錄,具有靶點(diǎn)依賴性的特征。saRNA激活基因的根本機(jī)制是由于核小體重新定位導(dǎo)致啟動(dòng)子上核小體組織結(jié)構(gòu)改變,進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的激活[15]。但是由于saＲNA僅有21bp，易于化學(xué)合成，且RNAa具有廣泛的適用性，具有巨大的潛在應(yīng)用轉(zhuǎn)化前景，對于ＲNAa的研究也日益受到關(guān)注[16]。因?yàn)橐坏┪覀冋莆樟薘NAa的技術(shù)，利用RNAa激活抑癌基因等特異性基因的表達(dá)，除了可以用來治療腫瘤性疾病外,還可以利用該機(jī)制來誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化,或激活某一個(gè)功能性基因表達(dá)治療遺傳或代謝性疾病,充分利用小分子ncRNA的對基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制為人類謀福。我們以基因表達(dá)調(diào)控理論為依據(jù),構(gòu)建了一個(gè)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能高效表達(dá)外源基因啟動(dòng)子序列的shRNA表達(dá)載框PE-NANOG-UCOE。該表達(dá)框含有U6啟動(dòng)子，shRNA的編碼研究的內(nèi)容基因以及相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄終止信號和polyA尾。第二章材料與方法2.1PE-NANOG-UCOE、N185質(zhì)粒提取2.1.1材料準(zhǔn)備卡那霉素、安芐霉素購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，LB培養(yǎng)基試劑購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，離心機(jī)（centrifuge5415D），超速低溫離心機(jī)（5475R）2.1.2實(shí)驗(yàn)步驟①挑取N185甘油菌于加有氨芐霉素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12－16h，PE-NANOG-UCOE甘油菌則挑取于加有卡那霉素的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12-16h。②分別挑取N185和PE-NANOG-UCOE單菌落，置于5μL的液體培養(yǎng)基中，N185細(xì)菌培養(yǎng)液中再加5μL氨芐霉素母液，PE－NANOG-UCOE細(xì)菌培養(yǎng)液中再加5μL卡那霉素母液，于搖床上37℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為300rpm，培養(yǎng)時(shí)間為12－16h。③利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA．試劑盒提取質(zhì)粒DNA的步驟：柱平衡：向吸附柱CP3中加入500μl的平衡液BL，12,000rpm（-13，400xg）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；取1－5ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺式離心機(jī)，12,000（-13，400xg）離心1mim，盡量吸出上清。向留有菌體沉淀的離心管中加入250μl溶液PI，使用移液器或渦輪振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀；向離心管中加入250μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6~8次使菌體充分裂解；向離心管中加入350μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6~8次，充分混勻，此時(shí)將出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12,000rpm（-13，400xg）離心10min：將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，注意不要吸出沉淀，12,000rpm（-13400xg）離心30－60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3重新放回收集管中;重復(fù)步驟上一步驟；向吸附柱CP3中加入600μl的漂洗液PW，12,000rpm（-13400xg）離心30－60sec，倒掉收集管中的度液，將吸附柱CP3重新放回收集管中，重復(fù)步驟上一步驟：將吸附柱CP3放入收集管中，12,000pm（-13，400xg）離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，開蓋放置5min：將吸附柱CP3放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50－100μl洗脫液EB，室溫放置2min，12,000rpm（-13，400xg）離心2min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。2.2PCR技術(shù)擴(kuò)增含人U6啟動(dòng)子的shRNAN185基因的表達(dá)框2.2.1材料準(zhǔn)備無菌水來源于實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備，1.2％的瓊脂糖凝膠，PCR儀，膠回收試劑盒購自南晨綠生物科技有限公司，離心機(jī)（centrifuge5415D），超速低溫離心機(jī)（5475R）2.2.1.1PE-NANOG-UCOE質(zhì)粒PE-NANOG-UCOE質(zhì)粒是一種理想的質(zhì)粒類型，屬于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，U6是啟動(dòng)子，具有較高的拷貝數(shù)，卡那霉素抗性；PE-NANOG-UCOE表達(dá)載體中含有綠色熒光蛋白，由于位于NANOG下游的EGFP基因編碼，在真核細(xì)胞中高表達(dá)，并與目的基因形成融合蛋白。利用PE-NANOG-UCOE質(zhì)粒的特性，將連接酶切后的載體片段和目的片段，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，用卡那霉素進(jìn)行初步篩選后，再用菌落PCR法和酶切鑒定法進(jìn)行進(jìn)一步篩選，最后進(jìn)行測序驗(yàn)證真核表達(dá)載體中NANOG啟動(dòng)子啟動(dòng)標(biāo)記基因綠色熒光蛋白基因的表達(dá)。2.2.1.2含U6－N185表達(dá)框的目的片段U6啟動(dòng)子基因，從人的基因組上通過PCR擴(kuò)增所得，主要用于小RNA的表達(dá)，U6啟動(dòng)子基因序列片段大約長度600bp，序列如下：AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTTTACATCAGGTTGTTTTTCTGTTTTTACATCAGGTTGTTTTTCTGTTTGGTTTTTTTTTTACACCACGTTTATACGCCGGTGCACGGTTTACCA通過NCBI數(shù)據(jù)庫查找人U6基因啟動(dòng)子的DNA序列信息，并設(shè)計(jì)兩對引物，送去上海生工進(jìn)行引物合成。引物信息如下：表1引物及酶切位點(diǎn)引物引物序列及酶切點(diǎn)（5’-3’）引物正向序列N185-FCATACCGCACCTGTAAGGTAAGAGATTTTCAAGAGAAATCTCTTACCTTACAGGTGCTTTTTGGGTG引物反向序列U6下游引物TTCCACTACGTGCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAG2.2.2實(shí)驗(yàn)步驟2.2.2.1shRNAN185表達(dá)框PCR擴(kuò)增(8管)PCR反應(yīng)體系20μL：SaRNA模板：0.5μl、引物clone：1μl、ddw:8.5μl、Taq酶：10μlPCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s,57℃退火40s,72℃延伸40s,擴(kuò)增28個(gè)循環(huán);20℃保存。2.2.2.21.2％瓊脂糖凝膠電泳PCR擴(kuò)増后，配1.2％瓊脂糖凝膠，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，觀察電泳檢測圖，判斷目的片段是否擴(kuò)增成功，擴(kuò)增成功后在進(jìn)行大量擴(kuò)增，大量擴(kuò)增后在紫外燈照射下切割含有目的片段條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段膠回收。2.2.2.3切膠回收根據(jù)電泳條帶將約600bp的條帶切膠回收：①在紫外燈下，用干凈的刀片切下需要回收的DNA條帶，將切塊置于已稱重的1.5ml離心管中稱重；②每10㎎凝膠中加入10μlMembranceBinding后置于水浴鍋中50~60℃，至凝膠完全溶化；③移液至吸附柱中，吸附柱置于集液管中；④將凝膠溶解液到吸附柱中，室溫靜置2~3min;⑤離心機(jī)轉(zhuǎn)速16,000ram/min，舍棄集液管中的液體；⑥加700μlMembranceWashSolution，離心16,000×g/min，棄集液管中液體；⑦重復(fù)步驟⑥；⑧棄集液管中液體，離心1min；⑨將吸附柱移至1.5ml離心管中；⑩加入50μlNaclease-Freewater到吸附柱中，室溫靜置1min，離心1min棄吸附柱，DNA貯藏于4℃或﹣20℃以備電泳驗(yàn)證。2.3載體的準(zhǔn)備2.3.1材料準(zhǔn)備無菌水來源于實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備，膠回收試劑盒購自南晨綠生物科技有限公司，離心機(jī)（centrifuge5415D），超速低溫離心機(jī)（5475R），MIUI酶購自云南澤浩商貿(mào)有限公司，DNA

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Kit，Kit，Alkaline

Phosphatase（EcoliC75）購自昆明豐科生物科技有限公司。2.3.2PE-NANOG-UCOEMIUI酶切PE-NANOG-UCOEMIU1酶切體系30uL：PE－NANOG-UCOE：8.5μL；MIU1酶:1μL;10xfastdingesBuffer:2μL;ddw：18.5μL反應(yīng)條件及時(shí)問：37℃，5min，70℃，5min，后純化（方法同上）。2.3.3酶切后平端化平端化反應(yīng)體系10μL共三管：酶切后PE-NANOG-UCOE:8μL；10×Buffer:1μL;反應(yīng)條件及時(shí)間：70℃，5min；37℃，1min后加入T4DNAPolymerase1μL；37℃，5min后純化。（方法同上）PE－NANOG-UCOE表達(dá)載體單酶圖2.4連接及載體構(gòu)建2.4.1材料準(zhǔn)備平端化后N185目的片段，平端化后PE－UCOE載體，水浴鍋，PCR儀，實(shí)驗(yàn)室自制的感受態(tài)細(xì)胞，固、液體培養(yǎng)基（含卡那青霉素）。質(zhì)粒提取試劑盒，1.2％的瓊脂糖凝膠，高壓滅菌后牙簽，高壓滅菌后槍頭，移液槍。2.4.2實(shí)驗(yàn)步驟2.4.2.1平端化后N185目的片段，平端化后PE-NANOG-UCOE載體連接將平端化后N185目的片段，平端化后PE-NANOG-UCOE載體進(jìn)行連接連接體系（10μl）：2xProLigation-FreeMasterMix:5μl；PE-NANOG-UCOE:50ng;N185:30ng；ddw:upto10μl反應(yīng)條件：50。C,15min反應(yīng)試劑克隆反應(yīng)加入量對照反應(yīng)加入量2*ProLigation-Free全克隆預(yù)混合液5μL5μL線性化載體50ng50ng插入目的片段3:1摩爾比插入目的片段127.5ng無無酶水加至10μL加至10μL2.4.2.2轉(zhuǎn)化1）感受態(tài)細(xì)胞的制備：=1\*GB3①將大腸桿菌接種在試管中按37度培養(yǎng)3h②測吸光度，選取最接近0.3的按1:20轉(zhuǎn)在三角瓶中（體積100μl）③培養(yǎng)1h測吸光度，至A550=0.48左右④分別分裝在50ml的藍(lán)蓋離心管中，零下20度冰浴7min，4度離心8min⑤加40mlTfbl懸浮細(xì)胞（Tfbl先冰浴冷）=6\*GB3⑥重懸細(xì)胞于4mlTfb2,置于冰上15min⑦分裝于15ml的離心管中，保于－80℃2）將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞①連接產(chǎn)物待100ulTop10感受態(tài)細(xì)胞剛解凍時(shí)加入輕彈混勻冰浴30min。②至于42℃恒溫45s后冰浴3min（期間不可搖動(dòng)）③向離心管中加入150μl37℃預(yù)熱不含抗生素的液體培養(yǎng)基，150rpm,37℃振蕩培養(yǎng)1h(使質(zhì)粒上的相關(guān)抗性標(biāo)記基因表達(dá))④離心后棄少量上清后，混勻后涂布于有Canr+LB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。2.4.2.3重組PE-NANOG-UCOE菌落PCR篩選用牙簽挑取單克隆菌落進(jìn)行劃線，37℃條件下過夜培養(yǎng)后，進(jìn)行菌落PCR。PCR反應(yīng)體系10μl:引物1Screen正向：0.5μl;引物2Screen反向：0.5μL；TapPremix酶:5μL；ddw:4μL，菌落PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s,40℃退火30s,72℃延伸40s,擴(kuò)增28個(gè)循環(huán);20℃保存。2.4.2.4重組PE-NANOG-UCOEN185載體質(zhì)粒提取挑取篩選出的長度約為600bp的菌落適量，置于5μl的液體培養(yǎng)基中，再加5μl卡那霉素母液于搖床上37℃，300rpm培養(yǎng)12-16h。并利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA。（提取質(zhì)粒方法同上）2.4.2.5重組PE-NANOG-UCOEN185載體質(zhì)粒鑒定、測序?qū)⑻崛≠|(zhì)粒進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳圖判斷質(zhì)粒提取情況后進(jìn)行質(zhì)粒PCR。PCR反應(yīng)體系10ul：引物1shRNA正向:0.5μL；引物2shRNA反向0.5μL；ddw：3.7μL；TapPremix酶:5μL；質(zhì)粒：0.3μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s,61℃，退火30s,72℃,40s,擴(kuò)增28個(gè)循環(huán);16℃保存。電泳測序鑒定。測序?qū)Ρ瘸晒Φ闹亟M載體以菌種和質(zhì)粒DNA兩種形式保存于-80℃。第三章結(jié)果與分析3.1PE-NANOG-UCOE、N185質(zhì)粒提取的結(jié)果挑取PE-NANOG-UCOE和N185甘油菌培養(yǎng)后再挑取單菌落培養(yǎng)，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，提取質(zhì)粒后根據(jù)檢測電泳，從電泳圖中可以看出質(zhì)粒濃度相對較高，質(zhì)粒提取成功，但質(zhì)粒具體濃度還有待下步實(shí)驗(yàn)使用專業(yè)儀器測得。質(zhì)粒提取電泳檢測如下圖1泳道M：Marker2000bp泳道1、2：N185質(zhì)粒檢測電泳圖泳道3、4：PE-NANOG-UCOE載體質(zhì)粒檢測電泳圖圖1：N185質(zhì)粒和PE-NANOG-UCOE載體質(zhì)粒檢測電泳圖3.2N185-F目的片段PCR擴(kuò)增、平端化的結(jié)果3.2.1PCR克隆N185-F基因啟動(dòng)子結(jié)果我們采用PCR技術(shù)克隆N185-F目的片段，經(jīng)電泳初步鑒定將擴(kuò)增片段與2000bpMarker對比，N185目的片段的序列大小約為600bp，與公布的序列基本一致，并且目的片段條帶清噺，沒有雜帶，說明PCR擴(kuò)增體系及程序是正確的，所以可以進(jìn)行大量擴(kuò)增，擴(kuò)增檢測結(jié)果如圖2圖2：N185-F目的片段擴(kuò)增檢測電泳圖泳道M：Marker2000bp泳道1：N185-F目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物3.3PE-NANOG-UCOE載體準(zhǔn)備3.3.1PE-NANOG-UCOEMIU1酶切鑒定電泳結(jié)果用MIU1酶對PE-NANOG-UCOE載體進(jìn)行酶切，根據(jù)電泳圖看出酶切是成功的，質(zhì)粒已經(jīng)被切開，可繼續(xù)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，酶切后電泳檢測圖如下圖3：PE-NANOG-UCOE載體MIU1酶切電泳圖泳道M：Marker2000bp泳道1：PE-NANOG-UCOE載體MIU1酶切產(chǎn)物3.3.2PE-NANOG-UCOE酶切產(chǎn)物末端平端化將PE-NANOG-UCOE載體酶切后進(jìn)行末端平端化后膠回收再電泳檢測，如圖4圖4：MIU1酶切后平端化產(chǎn)物電泳圖泳道Marker：Marker2000bp泳道1：PE-NANOG-UCOE載體MIU1酶切后平端化產(chǎn)物3.4連接及載體構(gòu)建3.4.1重組PE-NANOG-UCOE連接、轉(zhuǎn)化培養(yǎng)及菌落PCR篩選的結(jié)果N185-F目的片段平端化后與PE-NANOG-UCOE克隆載體酶切、平端化后連接、轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后篩選，培養(yǎng)后平板上長出大量菌落，且都為單菌落，說明轉(zhuǎn)化效率較高，涂布也較均勻。如圖5，將培養(yǎng)出來的菌落進(jìn)行菌落PCR篩選，可看出凝膠上大部分樣品為陽性，初步判斷載體構(gòu)建結(jié)果相對樂觀，具體結(jié)果有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，菌落PCR電泳檢測如圖6圖5：轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后平板圖圖6：克隆載體菌落PCR電泳圖泳道M：Marker2000bp泳道1～12:1、2、3、4、7、9是陽性菌落；5、6、8、10-12是陰性菌落3.4.2重組PE-NANOG-UCOE-N185載體質(zhì)粒提取鑒定3.4.2.1重組PE-NANOG-UCOE-N185載體質(zhì)粒提取電泳檢測從陽性克隆中挑取三個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取后進(jìn)行電泳檢測，從電泳圖中可以看出質(zhì)粒濃度相對較高，質(zhì)粒提取成功。如圖7圖7：陽性菌落質(zhì)粒提取電泳圖泳道M：Marker2000bp泳道1、2：構(gòu)建質(zhì)粒檢測片段大?。?900bp）3.4.2.2重組PE-NANOG-UCOE-N185載體質(zhì)粒PCR電泳檢測將提取的質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒PCR初步鑒定，從質(zhì)粒PCR電泳檢測圖看出所提質(zhì)粒再經(jīng)過PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)目的條帶，且條帶清晰，沒有雜帶，初步判斷重組載體構(gòu)建成功，電泳圖如圖8圖8：陽性菌落質(zhì)粒PCR檢測電泳圖泳道M：Marker2000bp泳道1～6:提出的質(zhì)粒PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)目的條帶3.4.3PE-NANOG-UCOE載體及N185-F目的片段終濃度PE-NANOG-UCOE載體MIUI酶切、平端化和N185-F目的片段平端化后測最終濃度，根據(jù)所測得的濃度可知目的片段與載體在處理前的濃度都相對高，可以用于實(shí)驗(yàn)。處理后的濃度稍低，但仍可用于連接轉(zhuǎn)化，測得濃度如下表2表2PE-NANOG-UCOE(ug/ml)N185-F目的片段(ug/ml)處理前365.21ug/ml286.5ug/ml處理后38.51ug/ml19.65ug/ml3.4.4重組載體PE-NANOG-UCOE-N185質(zhì)粒DNA樣品測序結(jié)果將重組載體PE-NANOG-UCOE-N185質(zhì)粒DNA樣品送去測序，從所得峰圖可看出，在前50個(gè)堿基，峰圖稍顯雜亂，這屬于正?，F(xiàn)象，峰圖整體清晰且有序，顯示表達(dá)載體構(gòu)建成功。重組克隆載體插入片段測序峰圖如圖9A:B:C:圖9(A、B、C)：重組克隆載體質(zhì)粒DNA測序峰圖圖10(A、B、C)：：重組克隆載體質(zhì)粒DNA測序序列對比A-1圖11(A-1)：重組克隆載體質(zhì)粒DNA測序峰圖圖12(A-1)：重組克隆載體質(zhì)粒DNA測序序列對比第四章討論與結(jié)論4.1討論4.1.1N185-F基因啟動(dòng)子的克隆根據(jù)電泳結(jié)果可以看出N185-F基因啟動(dòng)子的克隆是成功的，與理論大小（600bp）相近，N185-F目的片段擴(kuò)增后要進(jìn)行膠回收，后續(xù)還會進(jìn)行純化處理。為獲得濃度較高的目的片段，我們將擴(kuò)增數(shù)量從最初的20uL/管回收四管,變成20uL/管回收8管。膠回收后測得濃度為12.65ug/ml。我們采用的是無縫clone對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，，其引物設(shè)計(jì)及目的DNA片段的擴(kuò)增，與常規(guī)PCR法是相同的。唯一的差異在于載體末端和引物末端應(yīng)具有15-20個(gè)同源堿基，由此得到的PCR產(chǎn)物兩端便分別帶上了15-20個(gè)與載體序列同源性的堿基。通過相關(guān)酶試劑處理，同時(shí)除去載體與目的DNA上同源片段的雙鏈中的一條鏈，這樣載體和目的DNA兩端就露出了能夠互補(bǔ)配對的序列，依靠同源序列堿基間的配對能使載體和目的DNA較為緊密的連在一起而無需酶聯(lián)，直接用于轉(zhuǎn)化。從而提高了轉(zhuǎn)化的效率。4.1.2PE-NANOG-UCOE酶切、平端化為保證酶切質(zhì)量，根據(jù)MIU1酶試劑使用說明，反應(yīng)體系為30uL，DNA使用量為2ug，以及質(zhì)粒提取后的濃度：128.46ug/ml，從而確定酶切體系。在平端化過程中，同樣為了保證PE-NANOG-UCOE載體質(zhì)量與純度，提高后續(xù)連接效率。平端化體系為10uL，我們做了三管，反應(yīng)后集于一管純化，純化后的產(chǎn)物均用于平端化。最后測得酶切、平端化后PE-NANOG-UCOE濃度為13.42ug/ml。4.1.3PE-NANOG-UCOE與N185目的片段連接連接體系的確定基于測得的平端化后N185目的片段濃度和酶切、平端化后PE-NANOG-UOOE濃度。根據(jù)ProLigation-FreeMasterMix試劑盒使用說明及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，連接時(shí)載體的使用量為50~100ng，載體與目的片段的摩爾比為1:3時(shí)連接效率相對較高。由此計(jì)算可得目的片段N185的用量為127.5ng,以上所得的PE-NANOG-UCOE與N185的濃度剛好符合這個(gè)用量比。ProLigationFreeCloningKit全克隆試劑盒可以將多個(gè)DNA片段步組裝到載體中。DNA片段可以通過15-25bp的同源片段無縫連接，無需受到有無互補(bǔ)的限制酶切割位點(diǎn)限制。因此，我們使用這種簡單且適用性廣的方法快速高效的完成一些具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的克隆。4.1.4重組PE-NANOG-UCOEN185表達(dá)載體篩選及鑒定根據(jù)菌落PCR篩選電泳及質(zhì)粒PCR初步確定PE-NANOG-UCOE-N185表達(dá)載體構(gòu)建成功，送去測序后獲得的測序結(jié)果，進(jìn)行對比分析，再次證明該實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)是切實(shí)可行的，成功構(gòu)建PE-NANOG-UCOEN185表達(dá)載體。4.2結(jié)論我們實(shí)驗(yàn)中通過UCOE和激活RNA對同一啟動(dòng)子進(jìn)行聯(lián)合作用，能有效防止基因沉默，提高構(gòu)建載體的高效表達(dá)。通過PCR技術(shù)獲得了含人U6啟動(dòng)子和shRNAN185基因的表達(dá)框，對PE-NANOG-UCOE表達(dá)載體進(jìn)行MIU1單酶切、平端化后成功與無縫clone處理過的含人U6啟動(dòng)子和shRNAN185基因的表達(dá)框連接，構(gòu)建了重組載體PE-NANOG-UCOE-N185，所構(gòu)建的載體具體功能及用途有待下一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)參考文獻(xiàn)[1]謝寶明,魏圓圓,喬自林,于國偉,李向茸,馮玉萍,令世鑫,馬忠仁,柏家林.哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源基因常用病毒載體的研究進(jìn)展[J].西北民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2015,36(01):59-63.[2]柏家林.哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].西北民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2013,34(01):43-51.[3]張國強(qiáng),劉志剛,俞煒源.哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2005,(1):56-59.DOI:10.3969/j.issn.1009-0002.2005.01.019[4]高會貞.豬順式作用元件UCOE的篩選與功能鑒定[D].河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.[5]HydeSC,PringleIA,AbdullahS,etal.CpG-freeplasmidsconferreducedinflammationandsustainedpulmonarygeneexpression[J].Naturebiotechnology,2008,(5):549-551.[6]

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silencing

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