ICS65.020

CCSB05

DB22

吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB22/T3455—2023

分蘗洋蔥中洋蔥黃矮病毒檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光

PCR法

Detectionofonionyellowdwarfvirusbyreal-timePCRonShallot

2023-02-27發(fā)布2023-03-27實(shí)施

吉林省市場(chǎng)監(jiān)督管理廳發(fā)布

DB22/T3455—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》和GB/T

20001.4—2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)規(guī)則第4部分：化學(xué)分析方法》的規(guī)定起草。

請(qǐng)注意本文件中的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由吉林省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。

本文件起草單位：吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

本文件主要起草人：李小宇、張春雨、王海鵬、王永志、蘇穎、李建平、張金花、楊陽(yáng)、于紅。

I

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分蘗洋蔥中洋蔥黃矮病毒檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法

警告─使用本標(biāo)準(zhǔn)的人員應(yīng)有正規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。本標(biāo)準(zhǔn)并未指出所有可能的安全問(wèn)題。

使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧⒈ＷC符合國(guó)家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。

1范圍

本文件描述了分蘗洋蔥中洋蔥黃矮病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。

本文件適用于分蘗洋蔥中洋蔥黃矮病毒的檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)中文的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件的必不可少的條款。其中，注日期的引用文

件，僅注日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用

于本文件。

GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB/T28067甘蔗黃葉病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法

3術(shù)語(yǔ)和定義

GB/T28067界定的術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

4原理

比對(duì)洋蔥黃矮病毒外殼蛋白基因，設(shè)計(jì)一對(duì)僅在洋蔥黃矮病毒外殼蛋白基因間保守的特異性引物。

提取分蘗洋蔥總RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板，利用Taq酶進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR

擴(kuò)增反應(yīng)（采用SYBRGreenⅠ熒光染料方法）。SYBRGreenⅠ是一種具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料，能

夠與雙鏈DNA小溝區(qū)域結(jié)合。游離狀態(tài)的SYBRGreenⅠ只發(fā)出微弱的熒光，當(dāng)與雙鏈DNA結(jié)合后，

熒光強(qiáng)度會(huì)顯著增加，而且熒光強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。

5試劑或材料

5.1試劑

5.1.1水：符合GB/T6682-2008中一級(jí)水的要求。

5.1.2Trizol核酸提取試劑盒。

5.1.3反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

5.1.4實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒。

5.1.5DEPC（焦炭酸二乙酯DiethyPyrocarbonate）。

5.1.6三氯甲烷。

1

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5.1.7異丙醇。

5.1.8無(wú)水乙醇。

5.1.9DEPC處理的水。

5.1.10DEPC處理的75%乙醇：無(wú)水乙醇（含量≥99.8%）與DEPC處理的水按3︰1的體積比配置。

5.2引物

5.2.1引物序列

上游引物：5′-GCACGTTACGCATTCGACTT-3′

下游引物：5′-GCCTTCATCTGCATGTGTG-3′

5.2.2引物配制

引物用水稀釋成10μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6儀器設(shè)備

6.1實(shí)時(shí)熒光PCR儀。

6.2核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。

6.3電子天平：感量0.01g。

6.4高速冷凍離心機(jī)：離心力12000g以上。

6.5微量移液器：0.1μL～2.5μL，2μL～20μL，20μL～200μL，100μL～1000μL。

6.6恒溫水浴鍋。

6.7冰箱：4℃，-20℃，-80℃。

6.8離心管：DEPC處理，1.5mL。

6.9實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)管：DEPC處理，200μL。

7樣品

7.1對(duì)照樣品

7.1.1陽(yáng)性樣品

用已知含有洋蔥黃矮病毒的新鮮管狀葉作為陽(yáng)性樣品。

7.1.2陰性樣品

用已知不含有洋蔥黃矮病毒的新鮮管狀葉作為陰性樣品。

7.2試樣

采集新鮮管狀葉為宜，也可采集地下鱗莖。裝入密封袋，置于冰盒中，4℃保存不超過(guò)12h，也可

-80℃長(zhǎng)期保存。

8操作步驟

8.1RNA提取

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8.1.1離心管、藥匙等經(jīng)液氮預(yù)冷。

8.1.2稱取0.1g樣品液氮充分研磨（檢測(cè)鱗莖時(shí)，選擇中部層取樣。），轉(zhuǎn)入0.1%DEPC（焦碳酸

二乙酯）處理的1.5mL離心管中，立即加1mLTrizol試劑，混勻，室溫裂解5min。

8.1.3加200μL氯仿，充分搖晃混勻15s，室溫靜置2min～3min，4℃12000r/min離心15min，

取上層溶液轉(zhuǎn)入新的DEPC處理的1.5mL離心管中。

8.1.4加0.5mL異丙醇，混勻，室溫靜置10min，4℃12000r/min離心10min，棄上清。

8.1.5加1mLDEPC處理的75%乙醇，渦旋震蕩1min，4℃12000r/min離心5min，棄上清。

8.1.6離心管開(kāi)蓋晾5min～10min至管壁和管蓋無(wú)液體，加入40μLDEPC水，混勻溶解，直接進(jìn)

行下步操作或-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

8.1.7用核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA濃度。

8.2反轉(zhuǎn)錄

8.2.1利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，反應(yīng)體系見(jiàn)表1、表2。

表1反應(yīng)體系-1

體積

試劑

μL

隨機(jī)的6核苷酸引物1

dNTP混合溶液(10mmol/L)1

模板RNA2.5

rnasefreeddH2O5.5

表2反應(yīng)體系-2

體積

試劑

μL

上述變性后反應(yīng)液10

5×PrimeScriptⅡBuffer4

rnaseinhibitor(40U/μL)0.5

primeScriptⅡRTase(200U/μL)1

rnasefreeddH2O4.5

8.2.2反應(yīng)程序

8.2.2.1反應(yīng)體系-1，65℃溫浴5min，冰浴冷卻備用。

8.2.2.2反應(yīng)體系-2，30℃10min后42℃1h。

8.3實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)

8.3.1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系

見(jiàn)表3。

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表3反應(yīng)體系

試劑劑量終濃度

μL

2×MagicSYBRMixtrue101×

上游引物（10μM）0.60.3μM

下游引物（10μM）0.60.3μM

cDNA210ng～200ng

ddH2O補(bǔ)齊至20

8.3.2反應(yīng)