病理學(xué)實驗操作標(biāo)準(zhǔn)流程一、引言病理學(xué)實驗通過對組織標(biāo)本的規(guī)范化處理、染色及形態(tài)學(xué)觀察，為疾病診斷、科研探索提供核心依據(jù)。規(guī)范的操作流程是確保實驗結(jié)果準(zhǔn)確可重復(fù)、保障人員安全的關(guān)鍵。本流程結(jié)合臨床病理實踐與科研需求，從標(biāo)本接收至結(jié)果歸檔，梳理各環(huán)節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)操作要點。二、標(biāo)本接收與預(yù)處理臨床或科研標(biāo)本送達實驗室后，需第一時間核對標(biāo)本編號、類型、來源信息（如患者姓名縮寫、送檢科室、臨床診斷等），并記錄接收時間、標(biāo)本狀態(tài)（如是否新鮮、有無自溶、固定液是否足量）。若為新鮮組織標(biāo)本（如手術(shù)切除、穿刺活檢），需在離體后30分鐘內(nèi)置于足量固定液（推薦10%中性福爾馬林，體積為標(biāo)本的5~10倍）中，避免組織自溶或腐??；若需后續(xù)分子檢測，應(yīng)預(yù)留部分新鮮組織于RNA-later或液氮中保存。若為固定后標(biāo)本，需檢查固定液是否渾濁、組織是否漂?。ㄌ崾竟潭ú怀浞郑?，必要時更換固定液并延長固定時間（如大體積臟器標(biāo)本需固定24~48小時）。三、組織固定固定是通過化學(xué)試劑（如甲醛、乙醇）使組織蛋白變性，維持細胞形態(tài)與抗原活性的關(guān)鍵步驟。（一）固定液選擇常規(guī)病理診斷首選10%中性福爾馬林（甲醛終濃度3.6%~4.0%），兼具良好組織穿透性與抗原保存效果；特殊需求（如冰凍切片、酶活性檢測）可選用乙醇、丙酮等，但需注意乙醇易使組織收縮，丙酮毒性較強。（二）操作要點1.固定容器需耐腐蝕、帶蓋，避免組織與空氣接觸；2.固定時間依組織類型調(diào)整：穿刺標(biāo)本（直徑<0.5cm）固定4~6小時，臟器標(biāo)本（如肝、腎）固定12~24小時，避免固定不足（細胞結(jié)構(gòu)模糊）或過度（抗原失活、染色效果差）；3.操作時佩戴丁腈手套、護目鏡，在通風(fēng)櫥內(nèi)處理，防止甲醛揮發(fā)損傷呼吸道與皮膚。四、脫水、透明與浸蠟（一）梯度脫水通過逐步提高乙醇濃度，去除組織內(nèi)水分，為后續(xù)浸蠟做準(zhǔn)備。脫水程序：70%乙醇（1~2小時）→80%乙醇（1~2小時）→90%乙醇（1~2小時）→95%乙醇（1~2小時）→100%乙醇Ⅰ（1~2小時）→100%乙醇Ⅱ（1~2小時）。注意事項：小組織（如穿刺標(biāo)本）可縮短脫水時間（每級1小時），避免脫水過度導(dǎo)致組織脆硬；乙醇需定期更換，防止脫水能力下降。（二）透明處理用二甲苯（或環(huán)保型透明劑，如Histo-Clear）置換乙醇，使組織達到石蠟可滲透的狀態(tài)。透明程序：二甲苯Ⅰ（15~30分鐘）→二甲苯Ⅱ（15~30分鐘）；安全操作：全程在通風(fēng)櫥內(nèi)進行，佩戴活性炭口罩，避免二甲苯蒸氣吸入；透明時間不宜過長，否則組織易脆裂。（三）浸蠟與包埋通過石蠟滲透替代組織內(nèi)透明劑，使組織獲得支撐力，便于切片。浸蠟程序：軟蠟（熔點52~54℃）浸蠟1~2小時→硬蠟（熔點56~58℃）浸蠟2~4小時（大組織適當(dāng)延長）；包埋操作：將浸蠟后的組織置于包埋盒中央，調(diào)整方位（如皮膚標(biāo)本需顯示表皮-真皮結(jié)構(gòu)），倒入熔化的硬蠟，待石蠟?zāi)毯?，用刀片修整包埋塊邊緣，確保組織暴露面平整。五、切片與貼片（一）切片制備使用輪轉(zhuǎn)式切片機，將包埋塊切成連續(xù)薄片（厚度3~5μm）。操作要點：1.安裝新刀片（或用磨刀石修整舊刀片），調(diào)整刀架角度（通常12°~15°），確保切片平整；2.勻速轉(zhuǎn)動切片機手柄，避免用力過猛導(dǎo)致組織碎裂；3.若出現(xiàn)“顫痕”（切片上的波紋），需檢查刀片是否鋒利、包埋塊是否凍結(jié)（可將包埋塊置于-20℃冰箱預(yù)冷10分鐘）。（二）貼片與烤片將切片貼于經(jīng)APES（多聚賴氨酸）處理的載玻片上，經(jīng)烤片使切片與玻片緊密結(jié)合。貼片：將切片漂浮于40~45℃水浴鍋中展平（水溫過高易使組織細胞收縮，過低則切片褶皺），用載玻片撈取切片，確保組織位于玻片中央；烤片：將載玻片置于60~65℃烤箱中烘烤1~2小時，去除切片內(nèi)水分與殘留二甲苯，增強黏附力。六、染色（以HE染色為例）HE染色通過蘇木精（染細胞核）與伊紅（染細胞質(zhì)、間質(zhì)）的對比染色，清晰顯示組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。（一）脫蠟與復(fù)水脫蠟：二甲苯Ⅰ（10分鐘）→二甲苯Ⅱ（10分鐘）（徹底去除石蠟，否則影響染色）；復(fù)水：100%乙醇（5分鐘）→95%乙醇（3分鐘）→90%乙醇（3分鐘）→80%乙醇（3分鐘）→70%乙醇（3分鐘）→蒸餾水（5分鐘）。（二）蘇木精染色染色：將切片浸入蘇木精染液（Harris蘇木精或Mayer蘇木精）3~5分鐘（時間依組織類型調(diào)整，如淋巴結(jié)需縮短至2分鐘，心肌組織可延長至5分鐘）；分化：用1%鹽酸乙醇（體積分數(shù)）分化1~3秒，顯微鏡下觀察細胞核呈深藍色、細胞質(zhì)無色后，立即用蒸餾水沖洗；返藍：浸入0.5%氨水（或自來水）中1~2分鐘，使細胞核藍化，增強對比。（三）伊紅染色染色：浸入伊紅染液（0.5%~1%水溶性伊紅）1~2分鐘，使細胞質(zhì)、膠原纖維呈粉紅色；脫水與透明：95%乙醇（1分鐘）→100%乙醇Ⅰ（1分鐘）→100%乙醇Ⅱ（1分鐘）→二甲苯Ⅰ（1分鐘）→二甲苯Ⅱ（1分鐘）（脫水不徹底會導(dǎo)致切片模糊，透明過度則組織脆裂）。七、封片與歸檔（一）封片滴加適量中性樹膠（或合成封片膠）于切片中央，覆蓋蓋玻片（避免氣泡），輕壓使樹膠均勻分布，室溫晾干。（二）歸檔與保存記錄標(biāo)本信息（編號、來源、診斷結(jié)果）、染色日期、操作者，將玻片編號后存入玻片柜；保存環(huán)境：干燥、避光、室溫（20~25℃），避免高溫、潮濕導(dǎo)致切片褪色或脫片。八、質(zhì)量控制與安全防護（一）質(zhì)量控制要點固定環(huán)節(jié)：定期檢測福爾馬林濃度（通過比重計或滴定法），確保有效固定；脫水環(huán)節(jié)：觀察乙醇顏色，渾濁時及時更換；染色環(huán)節(jié)：設(shè)置陽性對照（如已知正常組織切片），確保蘇木精核染清晰、伊紅質(zhì)染鮮艷，無背景污染。（二）安全防護規(guī)范化學(xué)試劑防護：甲醛、二甲苯操作時必須在通風(fēng)櫥內(nèi)，佩戴丁腈手套、護目鏡、活性炭口罩；廢棄物處理：甲醛廢液、二甲苯廢液單獨收集，交由專業(yè)機構(gòu)處理；組織廢棄物（如包埋修塊的石蠟屑）按醫(yī)療廢物處理；設(shè)備維護：切片機、烤箱等定期清潔、校準(zhǔn)，刀片用后消毒（75%乙醇浸泡），避免交叉污染