基于糖鏈改造與氨基酸修飾的ADC定點(diǎn)偶聯(lián)創(chuàng)新策略及機(jī)制研究一、引言1.1ADC概述1.1.1ADC的結(jié)構(gòu)與組成抗體偶聯(lián)藥物（Antibody-DrugConjugates,ADC）作為腫瘤治療領(lǐng)域極具潛力的藥物研發(fā)方向之一，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了強(qiáng)大的治療能力。ADC主要由三個(gè)關(guān)鍵部分構(gòu)成：抗體、連接子和細(xì)胞毒素?？贵w是ADC的靶向載體，通常為單克隆抗體，具備高度特異性，能夠精準(zhǔn)識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原。以赫賽汀（Herceptin）為例，它特異性針對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2），HER2在乳腺癌、胃癌等多種腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)。赫賽汀通過與HER2特異性結(jié)合，將與之相連的細(xì)胞毒素精準(zhǔn)地帶到腫瘤細(xì)胞處，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向治療。這種特異性結(jié)合大大提高了治療的精準(zhǔn)性，減少了對(duì)正常細(xì)胞的損傷。連接子是連接抗體和細(xì)胞毒素的橋梁，在ADC中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。它不僅要確保在血液循環(huán)過程中抗體與細(xì)胞毒素的穩(wěn)定連接，避免細(xì)胞毒素提前釋放對(duì)正常組織造成損傷；還要保證ADC到達(dá)腫瘤細(xì)胞后，能在合適的條件下有效釋放細(xì)胞毒素，發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。連接子可分為可裂解連接子和不可裂解連接子?？闪呀膺B接子如腙鍵連接子，在酸性環(huán)境下（如腫瘤細(xì)胞內(nèi)的溶酶體環(huán)境）能夠發(fā)生水解反應(yīng)，從而釋放細(xì)胞毒素；二硫鍵連接子則可在細(xì)胞內(nèi)還原性環(huán)境中被還原斷裂，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒素的釋放。不可裂解連接子在體內(nèi)較為穩(wěn)定，只有在抗體被腫瘤細(xì)胞內(nèi)化并降解后，細(xì)胞毒素才會(huì)隨著抗體的降解而釋放。細(xì)胞毒素是ADC發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵效應(yīng)分子，具有強(qiáng)大的細(xì)胞殺傷能力。常見的細(xì)胞毒素包括微管抑制劑，如美登素（Maytansine）及其衍生物DM1、DM4，它們能夠抑制微管的組裝，干擾細(xì)胞的有絲分裂過程，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡；還有拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，例如伊立替康（Irinotecan）的活性代謝產(chǎn)物SN38，能夠抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I，阻礙DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，最終引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡?？贵w、連接子和細(xì)胞毒素相互協(xié)作，抗體負(fù)責(zé)特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞，連接子保障細(xì)胞毒素在運(yùn)輸過程中的穩(wěn)定性并控制其釋放時(shí)機(jī)，細(xì)胞毒素則直接發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。這三個(gè)部分的協(xié)同作用，使得ADC在腫瘤治療中展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。1.1.2ADC的作用機(jī)制ADC的作用機(jī)制是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過程，充分利用了抗體的靶向性和細(xì)胞毒素的強(qiáng)大殺傷能力，展現(xiàn)出獨(dú)特的治療優(yōu)勢(shì)。ADC通過靜脈注射進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)后，憑借抗體部分對(duì)腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原的高親和力，能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的相應(yīng)抗原。例如，靶向HER2的ADC藥物，其抗體部分會(huì)與HER2陽性腫瘤細(xì)胞表面的HER2抗原緊密結(jié)合。這種特異性結(jié)合使得ADC能夠精準(zhǔn)地定位于腫瘤細(xì)胞，避免對(duì)正常細(xì)胞的非特異性損傷，極大地提高了治療的針對(duì)性和安全性。在抗體與腫瘤細(xì)胞表面抗原結(jié)合后，ADC會(huì)通過內(nèi)吞作用被腫瘤細(xì)胞攝取，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，形成內(nèi)體。隨著內(nèi)體的成熟，它會(huì)與溶酶體融合，形成內(nèi)體-溶酶體復(fù)合物。在溶酶體的酸性環(huán)境以及多種酶的作用下，連接子發(fā)生裂解，釋放出細(xì)胞毒素。以含有可裂解連接子的ADC為例，在溶酶體的酸性pH值條件下，腙鍵連接子會(huì)發(fā)生水解反應(yīng)，從而將細(xì)胞毒素從ADC中釋放出來。釋放出的細(xì)胞毒素在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其強(qiáng)大的殺傷作用。不同類型的細(xì)胞毒素具有不同的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制。微管抑制劑如美登素衍生物，能夠與微管蛋白結(jié)合，抑制微管的聚合和解聚，破壞細(xì)胞的有絲分裂紡錘體結(jié)構(gòu)，使腫瘤細(xì)胞停滯在有絲分裂期，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑則通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，干擾DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)過程，引發(fā)DNA雙鏈斷裂，激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，促使腫瘤細(xì)胞凋亡。ADC還可能產(chǎn)生旁觀者效應(yīng)。當(dāng)細(xì)胞毒素從死亡的腫瘤細(xì)胞中釋放出來后，周圍未被ADC直接靶向的腫瘤細(xì)胞也可能受到細(xì)胞毒素的影響而死亡。這種旁觀者效應(yīng)有助于擴(kuò)大ADC的殺傷范圍，增強(qiáng)對(duì)腫瘤組織的整體殺傷效果。在腫瘤組織中，由于細(xì)胞之間緊密相連，釋放出的細(xì)胞毒素可以通過細(xì)胞間隙擴(kuò)散到周圍的腫瘤細(xì)胞，從而對(duì)那些表面抗原表達(dá)較低或未被ADC直接結(jié)合的腫瘤細(xì)胞也產(chǎn)生殺傷作用。1.2ADC定點(diǎn)偶聯(lián)的重要性1.2.1傳統(tǒng)偶聯(lián)方法的局限性傳統(tǒng)的ADC偶聯(lián)方法主要為非定點(diǎn)偶聯(lián)，常見的有基于賴氨酸（Lys）殘基的氨基和半胱氨酸（Cys）殘基的巰基進(jìn)行偶聯(lián)。這種偶聯(lián)方式雖然操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但存在諸多局限性，嚴(yán)重影響了ADC的性能和臨床應(yīng)用效果。在基于Lys殘基的偶聯(lián)中，由于抗體分子表面存在多個(gè)Lys殘基，且這些殘基的反應(yīng)活性存在差異，導(dǎo)致藥物小分子與抗體的偶聯(lián)位點(diǎn)難以精確控制。這使得最終得到的ADC產(chǎn)物中，藥物抗體偶聯(lián)比（DAR）呈現(xiàn)不均一性，即每個(gè)抗體分子上連接的藥物分子數(shù)量不一致。在一項(xiàng)對(duì)基于Lys殘基偶聯(lián)的ADC研究中發(fā)現(xiàn)，其DAR值分布范圍較廣，從1到8不等。這種DAR的不均一性會(huì)導(dǎo)致ADC產(chǎn)品質(zhì)量難以控制，不同批次之間的藥物性質(zhì)存在差異，從而影響藥物的療效和安全性?；贑ys殘基的偶聯(lián)也存在類似問題?？贵w中的Cys殘基主要存在于鏈間二硫鍵中，通過還原二硫鍵來暴露Cys殘基進(jìn)行偶聯(lián)時(shí)，不僅會(huì)破壞抗體的天然結(jié)構(gòu)，還可能導(dǎo)致抗體的穩(wěn)定性下降。而且，不同位置的Cys殘基反應(yīng)活性也不完全相同，同樣會(huì)造成DAR的不均一。傳統(tǒng)非定點(diǎn)偶聯(lián)得到的ADC在穩(wěn)定性方面表現(xiàn)較差。由于藥物分子隨機(jī)連接在抗體上，可能會(huì)影響抗體的空間構(gòu)象，使抗體更容易受到蛋白酶的降解，從而降低ADC在體內(nèi)的循環(huán)半衰期。藥物分子與抗體的連接方式也可能不夠穩(wěn)定，在血液循環(huán)過程中，部分藥物分子可能會(huì)提前從抗體上解離，導(dǎo)致游離藥物濃度升高，增加了對(duì)正常組織的毒副作用。在一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，使用傳統(tǒng)偶聯(lián)方法制備的ADC，在體內(nèi)循環(huán)過程中，游離藥物的濃度逐漸升高，對(duì)肝臟和腎臟等正常器官造成了明顯的損傷。傳統(tǒng)偶聯(lián)方法還可能影響ADC的藥代動(dòng)力學(xué)特性。DAR的不均一性會(huì)導(dǎo)致ADC分子大小和電荷分布的差異，進(jìn)而影響其在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過程。這使得ADC在腫瘤組織中的富集效果不理想，無法充分發(fā)揮其靶向治療的優(yōu)勢(shì)。1.2.2定點(diǎn)偶聯(lián)的優(yōu)勢(shì)定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)的出現(xiàn)，有效克服了傳統(tǒng)非定點(diǎn)偶聯(lián)的諸多弊端，為ADC的發(fā)展帶來了顯著的優(yōu)勢(shì)。定點(diǎn)偶聯(lián)能夠精確控制DAR值，使每個(gè)抗體分子上連接的藥物分子數(shù)量一致，從而提高了ADC的均一性。通過引入反應(yīng)性半胱氨酸的Thiomab技術(shù)，能夠在抗體的特定位置插入半胱氨酸殘基，然后將半胱氨酸上的羥基和毒素偶聯(lián)，形成位點(diǎn)專一的抗體偶聯(lián)藥物，其DAR值通?？删_控制為2。這種均一性的提高使得ADC產(chǎn)品質(zhì)量更加穩(wěn)定，不同批次之間的差異顯著減小，有利于藥物的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。定點(diǎn)偶聯(lián)可以減少對(duì)抗體結(jié)構(gòu)和功能的影響，從而提高ADC的穩(wěn)定性。由于藥物分子連接在預(yù)先設(shè)計(jì)好的特定位置，不會(huì)干擾抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)和其他關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，保證了抗體的正常折疊和組裝，使其能夠更好地發(fā)揮靶向作用。而且，定點(diǎn)偶聯(lián)形成的連接子通常具有更好的穩(wěn)定性，能夠有效減少藥物在血液循環(huán)中的提前釋放，降低游離藥物對(duì)正常組織的毒副作用。采用二硫鍵重橋技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)，通過共價(jià)重新連接半胱氨酸殘基，既維持了二硫鍵的穩(wěn)定作用，又實(shí)現(xiàn)了小分子有效載荷的受控偶聯(lián)，提高了ADC的穩(wěn)定性。定點(diǎn)偶聯(lián)還有助于提高ADC的藥效。精確控制的DAR值和穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)使得ADC能夠更有效地將細(xì)胞毒素輸送到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。在一項(xiàng)針對(duì)HER2陽性乳腺癌的研究中，使用定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)制備的ADC，相比傳統(tǒng)偶聯(lián)的ADC，在相同劑量下，對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果明顯增強(qiáng)。定點(diǎn)偶聯(lián)還可以減少藥物對(duì)正常組織的非特異性損傷，提高治療指數(shù)，降低治療過程中的不良反應(yīng)。1.3研究目的與意義本研究旨在通過對(duì)糖鏈改造和氨基酸修飾的深入探索，開發(fā)一種創(chuàng)新的ADC定點(diǎn)偶聯(lián)新方法。具體而言，期望利用糖鏈改造技術(shù)，對(duì)抗體Fc段N297位糖基進(jìn)行精準(zhǔn)修飾，為細(xì)胞毒素提供穩(wěn)定且特異的連接位點(diǎn)；借助氨基酸修飾策略，在抗體特定氨基酸殘基上引入反應(yīng)性基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒素的定點(diǎn)連接。通過這兩種技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，精確控制藥物抗體偶聯(lián)比（DAR），提高ADC的均一性、穩(wěn)定性和藥效，降低毒副作用。ADC作為腫瘤治療的重要藥物，其性能的提升對(duì)于癌癥患者的治療效果和生活質(zhì)量具有深遠(yuǎn)影響。目前，ADC市場(chǎng)發(fā)展迅速，據(jù)沙利文預(yù)測(cè)，全球ADC藥物市場(chǎng)規(guī)模預(yù)計(jì)將從2022年的79億美元增長(zhǎng)至2030年的647億美元。然而，傳統(tǒng)偶聯(lián)方法的局限性嚴(yán)重制約了ADC的進(jìn)一步發(fā)展。本研究開發(fā)的新方法，若能成功實(shí)現(xiàn)，將為ADC藥物的研發(fā)提供更有效的技術(shù)手段，推動(dòng)ADC藥物向更高性能、更安全的方向發(fā)展。在臨床應(yīng)用中，有望提高ADC對(duì)腫瘤的靶向治療效果，減少對(duì)正常組織的損傷，為癌癥患者帶來更好的治療體驗(yàn)和更高的生存希望。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，新的定點(diǎn)偶聯(lián)方法也將為其他生物偶聯(lián)藥物的開發(fā)提供借鑒和參考，促進(jìn)整個(gè)生物制藥行業(yè)的技術(shù)進(jìn)步。二、糖鏈改造在ADC定點(diǎn)偶聯(lián)中的應(yīng)用2.1糖鏈結(jié)構(gòu)與功能基礎(chǔ)2.1.1抗體糖鏈的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)抗體作為免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，其糖鏈結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出高度的復(fù)雜性和多樣性，主要包括N-糖鏈和O-糖鏈，它們?cè)诳贵w的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著不可或缺的作用。N-糖鏈?zhǔn)强贵w中最為常見的糖鏈類型，其連接于抗體Fc段保守的Asn297殘基上。N-糖鏈的核心結(jié)構(gòu)由一個(gè)五糖核心組成，包含三個(gè)甘露糖（Man）和兩個(gè)N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）。在此基礎(chǔ)上，N-糖鏈可以進(jìn)一步延伸和修飾，形成復(fù)雜多樣的結(jié)構(gòu)。高甘露糖型N-糖鏈主要由多個(gè)甘露糖殘基組成，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單；復(fù)雜型N-糖鏈則在核心結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，添加了多種不同的糖基，如半乳糖（Gal）、唾液酸（SA）、巖藻糖（Fuc）等，使其結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。這些額外的糖基修飾可以顯著影響抗體的性質(zhì)，例如巖藻糖的存在會(huì)降低抗體與FcγRIIIa的結(jié)合親和力，從而影響抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）效應(yīng)。O-糖鏈則連接于抗體中特定的絲氨酸（Ser）或蘇氨酸（Thr）殘基上。O-糖鏈的結(jié)構(gòu)相對(duì)較短，通常由1-4個(gè)糖基組成，常見的糖基包括N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）、半乳糖、唾液酸等。O-糖鏈的合成起始于GalNAc與Ser或Thr殘基的連接，隨后逐步添加其他糖基。不同的O-糖鏈結(jié)構(gòu)在抗體中的分布和功能也有所差異，某些O-糖鏈可能參與維持抗體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，或者影響抗體與其他分子的相互作用。除了N-糖鏈和O-糖鏈，抗體中還可能存在少量的C-糖鏈等其他類型的糖鏈。C-糖鏈?zhǔn)峭ㄟ^碳-碳鍵直接連接到蛋白質(zhì)的色氨酸殘基上，其結(jié)構(gòu)和功能相對(duì)研究較少，但也可能在抗體的某些生物學(xué)過程中發(fā)揮作用。抗體糖鏈在不同物種、不同細(xì)胞系以及同一細(xì)胞系的不同生長(zhǎng)條件下，其結(jié)構(gòu)和組成都可能存在差異，這種微觀不均一性進(jìn)一步增加了抗體糖鏈的復(fù)雜性。在不同的表達(dá)宿主細(xì)胞中，抗體糖鏈的修飾模式會(huì)有所不同，大腸桿菌表達(dá)的抗體通常無糖基化修飾，而哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的抗體則具有復(fù)雜的糖鏈結(jié)構(gòu)。同一細(xì)胞系在不同的培養(yǎng)條件下，如培養(yǎng)基成分、溫度、pH值等的變化，也會(huì)導(dǎo)致抗體糖鏈結(jié)構(gòu)的改變。2.1.2糖鏈對(duì)抗體性質(zhì)的影響糖鏈作為抗體結(jié)構(gòu)的重要組成部分，對(duì)抗體的穩(wěn)定性、免疫原性、親和力等性質(zhì)產(chǎn)生著深遠(yuǎn)的影響，這些影響在抗體藥物的研發(fā)和應(yīng)用中具有至關(guān)重要的意義。糖鏈對(duì)抗體的穩(wěn)定性起著關(guān)鍵的維持作用。抗體中的N-糖鏈和O-糖鏈可以通過與蛋白質(zhì)主鏈形成氫鍵、范德華力等相互作用，幫助抗體維持正確的三維構(gòu)象。在一項(xiàng)對(duì)IgG抗體的研究中發(fā)現(xiàn)，去除N-糖鏈會(huì)導(dǎo)致抗體的熱穩(wěn)定性下降，更容易發(fā)生聚集和降解。糖鏈還可以保護(hù)抗體免受蛋白酶的降解，延長(zhǎng)抗體在體內(nèi)的循環(huán)半衰期。某些抗體的O-糖鏈能夠覆蓋蛋白質(zhì)表面的蛋白酶敏感位點(diǎn)，從而減少蛋白酶對(duì)抗體的水解作用。糖鏈在調(diào)節(jié)抗體的免疫原性方面發(fā)揮著重要作用。合適的糖鏈結(jié)構(gòu)可以降低抗體的免疫原性，使其更易于被機(jī)體接受。當(dāng)抗體的糖鏈結(jié)構(gòu)與人體自身的糖鏈結(jié)構(gòu)相似時(shí)，免疫系統(tǒng)會(huì)將其識(shí)別為“自身物質(zhì)”，從而減少免疫反應(yīng)的發(fā)生。相反，異常的糖鏈結(jié)構(gòu)可能會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致抗體被免疫系統(tǒng)清除。在一些早期的抗體藥物研發(fā)中，由于使用的表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的糖鏈結(jié)構(gòu)與人體糖鏈差異較大，導(dǎo)致抗體的免疫原性較高，限制了其臨床應(yīng)用。糖鏈對(duì)抗體與抗原的親和力也有著顯著的影響。雖然糖鏈并不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但它可以通過影響抗體的構(gòu)象和柔性，間接調(diào)節(jié)抗體與抗原的親和力。研究表明，某些糖鏈修飾可以增強(qiáng)抗體與抗原的結(jié)合能力，提高抗體的特異性。在針對(duì)流感病毒的抗體研究中發(fā)現(xiàn)，特定的糖鏈修飾可以改變抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象，使其與流感病毒表面抗原的結(jié)合更加緊密，從而增強(qiáng)抗體對(duì)流感病毒的中和能力。糖鏈還可以影響抗體與其他效應(yīng)分子的相互作用，如FcγR等，進(jìn)而影響抗體的效應(yīng)功能。2.2糖鏈改造的策略與方法2.2.1代謝工程法引入糖類似物代謝工程法是一種利用細(xì)胞代謝途徑引入糖類似物的有效策略，為抗體糖鏈改造和ADC定點(diǎn)偶聯(lián)開辟了新的途徑。細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中，會(huì)攝取培養(yǎng)基中的糖類物質(zhì)用于合成自身的生物大分子，包括蛋白質(zhì)的糖鏈。通過在培養(yǎng)基中添加特定的糖類似物，細(xì)胞可以將其整合到抗體糖鏈中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)糖鏈的修飾。6-硫代果糖作為一種巖藻糖類似物，在代謝工程法中展現(xiàn)出獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。研究表明，將6-硫代果糖添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，細(xì)胞能夠識(shí)別并將其納入抗體糖鏈的合成過程。Okeley等人的研究報(bào)道了6-硫代果糖可以通過代謝偶聯(lián)到抗CD30或抗CD70抗體中。在細(xì)胞代謝過程中，6-硫代果糖被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，參與糖代謝途徑，最終被整合到抗體Fc段N297位的糖鏈上。這種修飾后的糖鏈為后續(xù)的定點(diǎn)偶聯(lián)提供了新的位點(diǎn)。由于6-硫代果糖中含有硫原子，其化學(xué)性質(zhì)與天然糖鏈中的巖藻糖有所不同，這使得修飾后的糖鏈具有獨(dú)特的反應(yīng)活性?？梢岳昧虼巧系牧蛟优c含有MMAE藥物連接子的馬來酰亞胺發(fā)生特異性反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒素的定點(diǎn)偶聯(lián)。通過這種方式制備的ADC，其藥物抗體偶聯(lián)比（DAR）可達(dá)到1.3。而且，由硫代果糖產(chǎn)生的ADC在血漿中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，能夠在血液循環(huán)中保持結(jié)構(gòu)的完整性，減少藥物的提前釋放。在腫瘤治療實(shí)驗(yàn)中，該ADC顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤活性，能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。代謝工程法引入糖類似物具有操作相對(duì)簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)，不需要對(duì)抗體進(jìn)行復(fù)雜的基因工程改造。只需在細(xì)胞培養(yǎng)過程中添加糖類似物，細(xì)胞即可自動(dòng)完成糖鏈的修飾過程。這種方法還可以在一定程度上模擬細(xì)胞內(nèi)天然的糖基化過程，減少對(duì)抗體結(jié)構(gòu)和功能的影響。然而，該方法也存在一些局限性，糖類似物的攝取和整合效率可能受到細(xì)胞類型、培養(yǎng)條件等多種因素的影響，導(dǎo)致修飾后的糖鏈均一性難以精確控制。2.2.2酶催化修飾糖鏈酶催化修飾糖鏈?zhǔn)菍?shí)現(xiàn)ADC定點(diǎn)偶聯(lián)的重要方法之一，利用糖苷內(nèi)切酶、糖基轉(zhuǎn)移酶等酶的特異性催化作用，可以對(duì)抗體糖鏈進(jìn)行精準(zhǔn)修飾，為細(xì)胞毒素的定點(diǎn)連接創(chuàng)造條件。糖苷內(nèi)切酶能夠特異性地切割糖鏈中的特定糖苷鍵，從而改變糖鏈的結(jié)構(gòu)。在抗體糖鏈改造中，糖苷內(nèi)切酶可以用于去除天然糖鏈中的某些糖基，暴露出特定的反應(yīng)位點(diǎn)。某些糖苷內(nèi)切酶可以切割抗體Fc段N297位糖鏈中的特定糖基，使原本隱藏的N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）殘基暴露出來。這些暴露的GlcNAc殘基可以作為后續(xù)修飾的靶點(diǎn)，為進(jìn)一步引入其他糖基或連接子提供基礎(chǔ)。糖基轉(zhuǎn)移酶則可以催化糖基從供體底物轉(zhuǎn)移到受體分子上，實(shí)現(xiàn)糖鏈的延伸或修飾。在ADC定點(diǎn)偶聯(lián)中，糖基轉(zhuǎn)移酶常用于將含有特殊功能基團(tuán)的糖基引入到抗體糖鏈中。半乳糖基轉(zhuǎn)移酶可以將半乳糖或半乳糖類似物引入到抗體糖鏈中。通過選擇合適的半乳糖基供體底物，如含有疊氮基團(tuán)的半乳糖衍生物，在半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將其轉(zhuǎn)移到抗體糖鏈的特定位置。這些引入的疊氮基團(tuán)可以通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)與含有炔基的藥物連接子發(fā)生特異性偶聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒素的定點(diǎn)連接。Synaffix的GlycoConnect技術(shù)是酶催化修飾糖鏈實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)的典型代表。該技術(shù)的核心是將疊氮糖以酶促方式引入到天然抗體的多糖上。首先，抗體在UDP6-疊氮基GalNAc存在下，經(jīng)受內(nèi)切糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶（GalNAc-T）兩種酶的作用。內(nèi)切糖苷酶先對(duì)天然糖鏈進(jìn)行切割，去除部分糖基，暴露出合適的反應(yīng)位點(diǎn)；然后，糖基轉(zhuǎn)移酶（GalNAc-T）將UDP6-疊氮基GalNAc上的疊氮基GalNAc轉(zhuǎn)移到抗體糖鏈上，形成均質(zhì)的、截?cái)嗟暮童B氮標(biāo)記的三糖。對(duì)疊氮標(biāo)記的抗體進(jìn)行藥物連接子偶聯(lián)，通過無銅點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，將含有炔基的藥物連接子與疊氮基團(tuán)特異性結(jié)合，從而產(chǎn)生均一的ADC。GlycoConnect技術(shù)目前已被用于多個(gè)臨床ADC藥物的研發(fā)，如ADCT-601（ADCTherapeutics）、XMT-1592（MersanaTherapeutics）和MRG004A（Miracogen）。這些臨床應(yīng)用表明，該技術(shù)能夠有效地提高ADC的均一性和穩(wěn)定性，為腫瘤治療提供了更有效的藥物選擇。2.2.3基于新型糖結(jié)構(gòu)的定點(diǎn)偶聯(lián)中科院上海藥物所開發(fā)的基于截短型糖結(jié)構(gòu)的藥物-連接子和野生型糖苷內(nèi)切酶Endo-S2的“一步”定點(diǎn)偶聯(lián)策略，為ADC的制備帶來了新的突破。傳統(tǒng)的糖鏈定點(diǎn)偶聯(lián)策略通常需要復(fù)雜的步驟，首先對(duì)抗體進(jìn)行糖工程改造，通過糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷內(nèi)切酶在糖基化位點(diǎn)引入生物正交基團(tuán)，然后再通過生物正交反應(yīng)偶聯(lián)毒素，整個(gè)過程往往需要2-3種酶的參與，3-4步的反應(yīng)，底物合成復(fù)雜且依賴于生物正交反應(yīng)，這嚴(yán)重阻礙了糖鏈定點(diǎn)ADC藥物系統(tǒng)性的構(gòu)效關(guān)系研究。上海藥物所的研究團(tuán)隊(duì)首先篩選了一系列糖底物和糖苷內(nèi)切酶，發(fā)現(xiàn)野生型糖苷內(nèi)切酶Endo-S2具有獨(dú)特的性質(zhì)。Endo-S2可以將二糖底物N-乙酰乳糖胺（LacNAc）轉(zhuǎn)移至去糖抗體N297位糖基化位點(diǎn)，且LacNAc半乳糖6號(hào)位唾液酸化修飾不影響Endo-S2的轉(zhuǎn)糖基化活性。這一發(fā)現(xiàn)具有重要意義，因?yàn)镋ndo-S2本身是一種特異性水解抗體N297位點(diǎn)不均一N-糖鏈的水解酶，而研究表明其可以催化LacNAc轉(zhuǎn)移至糖基化位點(diǎn)，同時(shí)喪失對(duì)LacNAc修飾抗體的糖鏈水解活性。這意味著Endo-S2和LacNAc的組合可以直接實(shí)現(xiàn)野生型抗體的糖基化改造。Endo-S2對(duì)多樣化LacNAc修飾的兼容性，使得研究人員能夠高效獲得多樣性功能修飾的巖藻糖化或去巖藻糖化的糖工程抗體，以及實(shí)現(xiàn)抗體的內(nèi)吞成像研究及糖鏈延伸等功能化研究?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，研究人員進(jìn)一步利用疊氮化修飾的LacNAc底物實(shí)現(xiàn)了抗體糖基化位點(diǎn)的“一步”疊氮化修飾。通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，將藥物-連接子BCN-Lys(PEG)24-VC-PAB-MMAE與疊氮基團(tuán)偶聯(lián)，“兩步”制備得到定點(diǎn)ADC化合物gsADC-1。研究人員直接在LacNAc半乳糖6號(hào)位偶聯(lián)毒素MMAE，獲得LacNAc-VC-PAB-MMAE復(fù)合物，并在Endo-S2的催化下直接實(shí)現(xiàn)了MMAE連接至抗體糖基化位點(diǎn)，“一步”獲得了均一性的糖鏈定點(diǎn)ADC化合物gsADC-2。高分辨質(zhì)譜分析、疏水相互作用分析（HIC）、聚集穩(wěn)定性分析（SEC）測(cè)試顯示，上述兩種策略獲得的糖鏈定點(diǎn)ADC化合物具有非常好的結(jié)構(gòu)均一性（DAR=2）、親水性和體外穩(wěn)定性。在體外腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)中，該ADC化合物表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性；在NCI-N87腫瘤模型中，相比陽性對(duì)照ADC化合物（DAR=3.5）及前期寡糖鏈定點(diǎn)ADC化合物（DAR=4），該策略研發(fā)的糖鏈定點(diǎn)ADC化合物（DAR=2）在低載藥量的情況下依然具有更強(qiáng)的體內(nèi)腫瘤抑制活性。除研究使用的曲妥珠單抗外，該策略同樣適用于其它治療性單抗、雙特異性抗體及Fc融合蛋白。這種基于截短型糖結(jié)構(gòu)的定點(diǎn)偶聯(lián)策略，克服了傳統(tǒng)“兩酶三步”糖鏈定點(diǎn)ADC制備策略的限制，實(shí)現(xiàn)了小分子細(xì)胞毒藥物的“一步”定點(diǎn)組裝，避免了對(duì)生物正交反應(yīng)的依賴，同時(shí)其工藝優(yōu)勢(shì)將促進(jìn)糖鏈定點(diǎn)ADC藥物系統(tǒng)的構(gòu)效關(guān)系研究，有利于推動(dòng)定點(diǎn)ADC藥物的深入發(fā)展。2.3糖鏈改造定點(diǎn)偶聯(lián)的案例分析2.3.1ADCT-601的糖鏈定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)ADCT-601是一款極具代表性的利用糖鏈改造實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)的ADC藥物，其研發(fā)過程充分展現(xiàn)了糖鏈改造定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)在ADC領(lǐng)域的應(yīng)用潛力和獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。ADCT-601是ADCTherapeutics公司研發(fā)的一款靶向AXL的ADC藥物。AXL作為受體酪氨酸激酶TAM家族成員之一，在多種惡性腫瘤中高度表達(dá)，如肉瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和食道癌等實(shí)體腫瘤，以及急性和慢性髓系白血病等血液系統(tǒng)惡性腫瘤。AXL及其配體GAS6在腫瘤細(xì)胞的存活、增殖、遷移、侵襲、血管生成和免疫逃避等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ADCT-601旨在通過靶向AXL，將與之偶聯(lián)的細(xì)胞毒素精準(zhǔn)地遞送至腫瘤細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷。ADCT-601利用Synaffix的GlycoConnect技術(shù)實(shí)現(xiàn)了糖鏈定點(diǎn)偶聯(lián)。該技術(shù)的核心在于將疊氮糖以酶促方式引入到天然抗體的多糖上。在ADCT-601的制備過程中，首先，抗體在UDP6-疊氮基GalNAc存在下，經(jīng)受內(nèi)切糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶（GalNAc-T）兩種酶的作用。內(nèi)切糖苷酶先對(duì)抗體Fc段N297位的天然糖鏈進(jìn)行切割，去除部分糖基，暴露出合適的反應(yīng)位點(diǎn)；然后，糖基轉(zhuǎn)移酶（GalNAc-T）將UDP6-疊氮基GalNAc上的疊氮基GalNAc轉(zhuǎn)移到抗體糖鏈上，形成均質(zhì)的、截?cái)嗟暮童B氮標(biāo)記的三糖。對(duì)疊氮標(biāo)記的抗體進(jìn)行藥物連接子偶聯(lián)，通過無銅點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，將含有炔基的藥物連接子與疊氮基團(tuán)特異性結(jié)合，從而將PBD二聚體細(xì)胞毒素連接到抗體上，產(chǎn)生均一的ADCT-601。在臨床前試驗(yàn)中，ADCT-601在不同的腫瘤異種移植模型中顯示出有效的抗腫瘤效果。然而，在臨床研究階段，其表現(xiàn)卻不盡人意。2019年ESMO會(huì)議上公布的I期初步臨床結(jié)果顯示，在安全性方面，13名患者接受了50-150μg/kgQ3W治療，1名接受100μg/kg治療的患者出現(xiàn)3級(jí)血尿的劑量限制性毒性，另外報(bào)告了3例死亡，均因疾病進(jìn)展。在有效性方面，無部分緩解（PR）和全部緩解（CR）。ADCTherapeutics已于2020年末宣布ADCT-601臨床試驗(yàn)中止。雖然ADCT-601的臨床試驗(yàn)未能取得成功，但其研發(fā)過程為糖鏈改造定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)的研究和應(yīng)用提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)。它表明，盡管糖鏈定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)能夠提高ADC的均一性和穩(wěn)定性，但在藥物研發(fā)過程中，仍需要充分考慮靶點(diǎn)的選擇、細(xì)胞毒素的毒性、藥物的安全性和有效性等多方面因素。2.3.2XMT-1592和MRG004A的糖基化策略XMT-1592和MRG004A同樣采用了基于糖鏈改造的定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)，各自展現(xiàn)出獨(dú)特的技術(shù)特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，為ADC的研發(fā)提供了多元化的思路和方法。XMT-1592是MersanaTherapeutics公司研發(fā)的一款A(yù)DC藥物，其靶點(diǎn)為間皮素。間皮素在多種腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)，如卵巢癌、肺癌、惡性間皮瘤等。XMT-1592利用糖鏈改造實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)，采用了與ADCT-601類似的GlycoConnect技術(shù)。通過該技術(shù)，在抗體Fc段N297位糖鏈上引入疊氮基團(tuán)，再通過無銅點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)與含有炔基的藥物連接子偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒素的定點(diǎn)連接。這種糖基化策略使得XMT-1592具有較高的均一性，能夠更精準(zhǔn)地將細(xì)胞毒素遞送至腫瘤細(xì)胞。在臨床研究中，XMT-1592展現(xiàn)出了一定的抗腫瘤活性。在針對(duì)卵巢癌的臨床試驗(yàn)中，XMT-1592對(duì)部分患者的腫瘤生長(zhǎng)起到了有效的抑制作用。XMT-1592的研發(fā)也為糖鏈改造定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)在不同靶點(diǎn)ADC藥物中的應(yīng)用提供了成功案例，證明了該技術(shù)在提高ADC藥物療效方面的有效性。MRG004A是Miracogen公司研發(fā)的一款靶向HER2的ADC藥物。HER2在乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中過表達(dá)，是ADC藥物的重要靶點(diǎn)之一。MRG004A同樣借助糖鏈改造實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)。通過對(duì)抗體糖鏈進(jìn)行修飾，在特定位置引入反應(yīng)性基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞毒素的定點(diǎn)連接。與其他糖鏈定點(diǎn)偶聯(lián)的ADC藥物相比，MRG004A的獨(dú)特之處在于其對(duì)糖鏈修飾的精細(xì)調(diào)控。通過優(yōu)化糖鏈修飾的條件和工藝，使得MRG004A在保持較高均一性的，還具有良好的穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)特性。在臨床前研究中，MRG004A對(duì)HER2陽性腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺傷活性。在HER2陽性乳腺癌細(xì)胞系的體外實(shí)驗(yàn)中，MRG004A能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在動(dòng)物模型中，MRG004A也顯示出良好的抗腫瘤效果，能夠有效縮小腫瘤體積。這些結(jié)果表明，MRG004A的糖基化策略在提高ADC藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向性和殺傷能力方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。2.4糖鏈改造定點(diǎn)偶聯(lián)面臨的挑戰(zhàn)與解決方案糖鏈改造定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)在ADC研發(fā)中展現(xiàn)出巨大的潛力，但在實(shí)際應(yīng)用過程中，也面臨著一系列的挑戰(zhàn)，需要針對(duì)性地提出解決方案，以推動(dòng)該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。在糖鏈改造過程中，引入的試劑和酶可能存在引入外源因子的風(fēng)險(xiǎn)。在酶催化修飾糖鏈的過程中，使用的糖苷內(nèi)切酶、糖基轉(zhuǎn)移酶等可能來源于微生物發(fā)酵，這些酶中可能含有宿主細(xì)胞的雜質(zhì)，如核酸、蛋白質(zhì)碎片等，這些雜質(zhì)如果殘留在ADC產(chǎn)品中，可能會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)，影響藥物的安全性。在代謝工程法引入糖類似物時(shí)，添加的糖類似物及其相關(guān)的輔助試劑也可能引入雜質(zhì)。為解決這一問題，需要在純化工藝中充分考慮外源因子的去除?？梢圆捎枚喾N純化技術(shù)的組合，如親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析等，對(duì)ADC產(chǎn)品進(jìn)行多步純化。通過親和層析可以特異性地結(jié)合ADC，去除大部分的雜質(zhì)；離子交換層析可以根據(jù)電荷差異進(jìn)一步分離雜質(zhì)；凝膠過濾層析則可以根據(jù)分子大小去除殘留的小分子雜質(zhì)。還需要參考ICHQ5A等相關(guān)指南開展病毒清除研究，確保產(chǎn)品的安全性。糖鏈改造的工藝相對(duì)復(fù)雜，涉及多個(gè)步驟和多種酶的協(xié)同作用，這不僅增加了生產(chǎn)成本，也對(duì)工藝的穩(wěn)定性和可重復(fù)性提出了挑戰(zhàn)。在基于新型糖結(jié)構(gòu)的定點(diǎn)偶聯(lián)策略中，需要篩選合適的糖底物和糖苷內(nèi)切酶，優(yōu)化反應(yīng)條件，整個(gè)過程需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和資源。而且，不同批次之間的反應(yīng)條件可能存在微小差異，導(dǎo)致糖鏈修飾的均一性難以精確控制。為了簡(jiǎn)化工藝，提高穩(wěn)定性和可重復(fù)性，可以采用自動(dòng)化的反應(yīng)系統(tǒng)，精確控制反應(yīng)條件，如溫度、pH值、反應(yīng)時(shí)間等。利用微流控技術(shù)，將糖鏈改造的多個(gè)反應(yīng)步驟集成在一個(gè)微小的芯片中，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)的連續(xù)化和自動(dòng)化，減少人為因素的干擾。還可以通過優(yōu)化酶的表達(dá)和純化工藝，提高酶的活性和穩(wěn)定性，減少酶的用量，從而降低成本。糖鏈改造對(duì)抗體的活性和穩(wěn)定性可能產(chǎn)生一定的影響。在對(duì)抗體糖鏈進(jìn)行修飾時(shí)，可能會(huì)改變抗體的空間構(gòu)象，影響抗體與抗原的結(jié)合能力，或者降低抗體的穩(wěn)定性，使其更容易發(fā)生降解。在某些糖鏈改造過程中，去除或修飾抗體Fc段N297位糖鏈上的某些糖基，可能會(huì)影響Fc段與FcγR的相互作用，進(jìn)而影響抗體的效應(yīng)功能。為了評(píng)估糖鏈改造對(duì)抗體活性和穩(wěn)定性的影響，需要建立全面的分析方法。采用表面等離子共振（SPR）技術(shù)可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)抗體與抗原的結(jié)合親和力；通過圓二色譜（CD）分析可以研究抗體的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化；利用加速穩(wěn)定性試驗(yàn)，在不同的溫度、pH值等條件下考察抗體的穩(wěn)定性，評(píng)估糖鏈改造對(duì)抗體活性和穩(wěn)定性的影響程度。根據(jù)評(píng)估結(jié)果，進(jìn)一步優(yōu)化糖鏈改造的策略和條件，確保在實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)的，最大程度地保持抗體的活性和穩(wěn)定性。三、氨基酸修飾在ADC定點(diǎn)偶聯(lián)中的應(yīng)用3.1氨基酸修飾的原理與途徑3.1.1基于半胱氨酸的修飾策略基于半胱氨酸的修飾策略在ADC定點(diǎn)偶聯(lián)中占據(jù)著重要地位，其核心原理是利用半胱氨酸獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)，通過還原半胱氨酸二硫鍵獲得游離巰基，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒素的定點(diǎn)偶聯(lián)。半胱氨酸是一種含硫氨基酸，其側(cè)鏈上的巰基（-SH）具有較高的反應(yīng)活性。在抗體分子中，半胱氨酸殘基主要以鏈間二硫鍵的形式存在，這些二硫鍵對(duì)于維持抗體的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用。為了實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)，需要采用特定的方法將二硫鍵還原，使半胱氨酸殘基暴露出來，形成游離巰基。常用的還原劑包括二硫蘇糖醇（DTT）、三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽（TCEP）等。DTT是一種常用的強(qiáng)還原劑，它可以與二硫鍵發(fā)生反應(yīng)，將其還原為兩個(gè)巰基。在使用DTT還原二硫鍵時(shí)，需要注意控制反應(yīng)條件，如反應(yīng)溫度、時(shí)間和DTT的濃度等，以避免過度還原對(duì)抗體結(jié)構(gòu)造成不可逆的破壞。TCEP則是一種更為溫和的還原劑，它在中性或弱酸性條件下具有良好的還原效果，且對(duì)空氣相對(duì)穩(wěn)定，不易被氧化，因此在一些對(duì)抗體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性要求較高的實(shí)驗(yàn)中，TCEP是一種更為理想的選擇。以THIOMAB技術(shù)為代表的基于半胱氨酸的修飾方法，通過基因工程手段在抗體的特定位置插入半胱氨酸殘基，然后利用硫醇-馬來酰亞胺化學(xué)方法，將未封端的半胱氨酸與含有硫醇連接子進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒素的定點(diǎn)偶聯(lián)。在THIOMAB技術(shù)中，首先通過基因工程改造，在抗體重鏈（HC）或輕鏈（LC）的不同位置引入半胱氨酸殘基。由于工程半胱氨酸在表達(dá)過程中易被谷胱甘肽或其他物質(zhì)覆蓋，因此需要對(duì)抗體進(jìn)行部分還原以去除這些覆蓋物，暴露出半胱氨酸殘基上的巰基。然后，利用硫醇-馬來酰亞胺化學(xué)方法，將含有馬來酰亞胺基團(tuán)的藥物連接子與半胱氨酸殘基上的巰基發(fā)生特異性反應(yīng)，形成穩(wěn)定的硫醚鍵，從而將細(xì)胞毒素連接到抗體上。研究表明，通過半胱氨酸殘基（HC-A114C）的藥物連接子偶聯(lián)產(chǎn)生的ADC顯示出近乎均一的偶聯(lián)物，并且改善了治療指數(shù)。在小鼠卵巢癌移植瘤模型中，抗MUC16TDC（THIOMAB-drugconjugate）在同等藥物劑量下，其藥效比用傳統(tǒng)半胱氨酸法制備的ADC提高了一倍，大鼠和食蟹猴對(duì)TDC的耐受劑量也高于常規(guī)ADC?；诎腚装彼岬男揎棽呗跃哂兄T多優(yōu)勢(shì)。由于半胱氨酸殘基的反應(yīng)活性較高，能夠與多種含有親電基團(tuán)的藥物連接子發(fā)生特異性反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒素的高效偶聯(lián)。通過基因工程精確控制半胱氨酸殘基的插入位置，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)DAR值的精準(zhǔn)調(diào)控，提高ADC的均一性。而且，該策略對(duì)抗體的空間構(gòu)象影響較小，能夠較好地保留抗體的抗原結(jié)合活性和其他生物學(xué)功能。然而，該策略也存在一些局限性。在還原二硫鍵的過程中，如果條件控制不當(dāng)，可能會(huì)導(dǎo)致抗體結(jié)構(gòu)的破壞，影響抗體的穩(wěn)定性和活性。半胱氨酸殘基的修飾可能會(huì)引入新的免疫原性位點(diǎn)，增加ADC在體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。3.1.2賴氨酸修飾的作用與方法賴氨酸修飾是ADC定點(diǎn)偶聯(lián)中的另一種重要策略，它主要利用賴氨酸的氨基進(jìn)行修飾和偶聯(lián)，在ADC的制備中發(fā)揮著獨(dú)特的作用。賴氨酸是一種堿性氨基酸，其側(cè)鏈上含有一個(gè)游離的氨基（-NH?）。在生理?xiàng)l件下，賴氨酸的氨基呈質(zhì)子化狀態(tài)，具有一定的親核性，能夠與多種親電試劑發(fā)生反應(yīng)。在ADC定點(diǎn)偶聯(lián)中，常用的與賴氨酸氨基反應(yīng)的親電試劑包括活化酯、磺酰氯、異氰酸酯或異硫氰酸酯等。活化酯是一類常用的親電試劑，如N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS酯）。NHS酯在中性或弱堿性條件下能夠與賴氨酸的氨基發(fā)生反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵。在反應(yīng)過程中，NHS酯中的N-羥基琥珀酰亞胺基團(tuán)離去，生成酰胺產(chǎn)物。磺酰氯也可以與賴氨酸的氨基反應(yīng)，形成磺酰胺鍵。異氰酸酯或異硫氰酸酯則可以與賴氨酸的氨基反應(yīng)，分別生成脲或硫脲鍵。在ADC制備中，利用賴氨酸修飾可以將細(xì)胞毒素連接到抗體上。通過將含有活性羧酸酯位點(diǎn)的連接子與抗體表面賴氨酸殘基的ε-氨基發(fā)生酰化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒素的偶聯(lián)。這種方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，不需要對(duì)抗體進(jìn)行復(fù)雜的基因工程改造。然而，由于抗體分子表面存在多個(gè)賴氨酸殘基，且這些殘基的反應(yīng)活性存在差異，導(dǎo)致偶聯(lián)位點(diǎn)難以精確控制，最終得到的ADC產(chǎn)物中，DAR值往往呈現(xiàn)不均一性。為了提高賴氨酸修飾的位點(diǎn)選擇性，可以通過對(duì)反應(yīng)條件的精心控制，如調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值、溫度、反應(yīng)時(shí)間等，利用不同賴氨酸殘基反應(yīng)活性的差異，實(shí)現(xiàn)一定程度的區(qū)域選擇性修飾。在溫和條件下，通過分批加入亞化學(xué)計(jì)量的活化NHS酯，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)控制的酰胺化反應(yīng)，能夠優(yōu)先修飾溶劑暴露位點(diǎn)的賴氨酸殘基。還可以通過合理設(shè)計(jì)連接子的結(jié)構(gòu)，增加其與特定賴氨酸殘基的相互作用，從而提高偶聯(lián)的選擇性。賴氨酸修飾在ADC制備中具有一定的優(yōu)勢(shì)。賴氨酸在抗體分子中廣泛存在，為偶聯(lián)提供了豐富的位點(diǎn)，使得反應(yīng)易于進(jìn)行。該方法操作相對(duì)簡(jiǎn)便，不需要復(fù)雜的技術(shù)手段。然而，其局限性也較為明顯。由于偶聯(lián)位點(diǎn)難以精確控制，導(dǎo)致DAR值不均一，這會(huì)影響ADC的質(zhì)量穩(wěn)定性和藥效。賴氨酸修飾可能會(huì)影響抗體的空間構(gòu)象和電荷分布，進(jìn)而影響抗體的抗原結(jié)合活性和其他生物學(xué)功能。3.1.3非天然氨基酸的引入與應(yīng)用非天然氨基酸的引入為ADC定點(diǎn)偶聯(lián)開辟了新的途徑，通過將非天然氨基酸整合到抗體序列中，能夠?qū)崿F(xiàn)更精準(zhǔn)的定點(diǎn)偶聯(lián)，提高ADC的性能。非天然氨基酸是指自然界中不存在或很少存在的氨基酸，它們具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能。在ADC定點(diǎn)偶聯(lián)中，常用的非天然氨基酸包括乙酰苯丙氨酸（pAF）、疊氮基甲基-L-苯基丙氨酸（pAMF）和疊氮賴氨酸等。這些非天然氨基酸上帶有特殊的官能團(tuán)，如酮基、疊氮基等，能夠與藥物連接子發(fā)生特異性的化學(xué)反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)。將非天然氨基酸引入抗體序列通常需要借助特殊的技術(shù)手段。以Ambrx公司的技術(shù)為例，該公司引入可特異性識(shí)別非天然氨基酸的tRNA和與之相對(duì)應(yīng)的氨酰tRNA合成酶。在氨酰tRNA合成酶的作用下，tRNA與對(duì)應(yīng)的非天然氨基酸結(jié)合形成氨酰tRNA。然后，通過其反密碼子與mRNA上的密碼子互補(bǔ)，使非天然氨基酸被整合到多肽鏈中，從而合成含非天然氨基酸的重組抗體。在ARX788的研發(fā)中，選擇的非天然氨基酸是乙酰苯丙氨酸（pAF）。pAF上的酮基可與有效載荷AS269上的羥胺基團(tuán)形成肟鍵，發(fā)生特異性位點(diǎn)的偶聯(lián)，產(chǎn)生均質(zhì)的ADC。這種定點(diǎn)偶聯(lián)方式使得ARX788具有較高的均一性，藥物抗體偶聯(lián)比（DAR）能夠得到精確控制，從而提高了ADC的穩(wěn)定性和藥效。SutroBiopharma公司開發(fā)的XpressCF+平臺(tái)，利用無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成技術(shù)，在蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)嵌入非天然氨基酸。該平臺(tái)可以在抗體結(jié)構(gòu)中幾乎任何位點(diǎn)精確地結(jié)合非天然氨基酸（nnAA），從而允許連接子和彈頭位點(diǎn)特異性偶聯(lián)單種類ADC。通過該平臺(tái)制備的STRO-002，在每個(gè)重鏈上的Y180和F404位置都含有4個(gè)pAMF殘基，從而達(dá)到定點(diǎn)偶聯(lián)4個(gè)連接子-毒素的目的。其采用的新型連接子-毒素SC239，由以微管蛋白為靶標(biāo)的3-氨基苯基半胱氨酸彈頭（SC209）和用DBCO功能化的一種可裂解的纈氨酸-瓜氨酸對(duì)氨基芐酯連接子構(gòu)成。DBCO對(duì)pAMF殘基的快速選擇性反應(yīng)保證了ADC的均一性，使DAR值保持在4。非天然氨基酸引入技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它可以實(shí)現(xiàn)抗體與小分子毒素的定點(diǎn)、定量偶聯(lián)，獲得DAR均一、藥效高、穩(wěn)定性好、安全性高的ADC。通過選擇合適的非天然氨基酸和反應(yīng)條件，可以靈活地設(shè)計(jì)連接策略，滿足不同的藥物研發(fā)需求。然而，該技術(shù)也面臨一些挑戰(zhàn)。引入非天然氨基酸需要對(duì)抗體進(jìn)行基因工程改造，操作相對(duì)復(fù)雜，成本較高。非天然氨基酸的引入可能會(huì)影響抗體的表達(dá)量和折疊效率，導(dǎo)致抗體產(chǎn)量降低或結(jié)構(gòu)異常。非天然氨基酸序列還可能引起免疫原性，增加ADC在體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。3.2氨基酸修飾定點(diǎn)偶聯(lián)的案例分析3.2.1ARX788利用非天然氨基酸的定點(diǎn)偶聯(lián)ARX788是一款極具創(chuàng)新性的ADC藥物，其研發(fā)過程充分展示了非天然氨基酸在ADC定點(diǎn)偶聯(lián)中的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用潛力。ARX788由Ambrx公司開發(fā)，采用了非天然氨基酸乙酰苯丙氨酸（pAF）進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)。pAF的引入是通過一種特殊的技術(shù)實(shí)現(xiàn)的，Ambrx公司引入可特異性識(shí)別pAF的tRNA和與之相對(duì)應(yīng)的氨酰tRNA合成酶。在氨酰tRNA合成酶的作用下，tRNA與pAF結(jié)合形成氨酰tRNA。然后，通過其反密碼子與mRNA上的密碼子互補(bǔ)，使pAF被整合到多肽鏈中，從而合成含pAF的重組抗體。這種精準(zhǔn)的引入方式確保了pAF能夠準(zhǔn)確地定位在抗體的特定位置，為后續(xù)的定點(diǎn)偶聯(lián)奠定了基礎(chǔ)。pAF與有效載荷AS269的偶聯(lián)機(jī)制基于肟鍵的形成。pAF上的酮基可與有效載荷AS269上的羥胺基團(tuán)發(fā)生特異性反應(yīng)，形成穩(wěn)定的肟鍵。這種化學(xué)偶聯(lián)方式具有高度的特異性和穩(wěn)定性，能夠?qū)崿F(xiàn)抗體與小分子毒素的定點(diǎn)、定量偶聯(lián)。通過這種偶聯(lián)方式，ARX788能夠精確控制藥物抗體偶聯(lián)比（DAR），獲得DAR均一的ADC。研究表明，ARX788的DAR值能夠穩(wěn)定地控制在2，這種均一性使得ARX788在體內(nèi)外表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和藥效。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，ARX788對(duì)HER2陽性腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷活性，能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在動(dòng)物模型中，ARX788也顯示出良好的抗腫瘤效果，能夠有效縮小腫瘤體積，延長(zhǎng)動(dòng)物的生存期。ARX788的臨床研究進(jìn)展備受關(guān)注。2020年12月，F(xiàn)DA授予ARX788快速通道資格認(rèn)定，作為單藥用于已接受過一種或多種抗-HER2治療的晚期或轉(zhuǎn)移性HER2陽性乳腺癌患者。2021年1月，F(xiàn)DA授予ARX788胃癌孤兒藥資格認(rèn)定。2021年5月，ARX788獲CDE納入突破性治療品種，適應(yīng)癥為HER2陽性晚期乳腺癌二線治療。目前，ARX788針對(duì)HER2陽性乳腺癌患者的2期試驗(yàn)中國(guó)（ACE-Breast-02），全球（ACE-Breast-03），HER2陽性胃癌/GEJ患者全球（ACE-Gastric-02）的2/3期試驗(yàn)正在開展。在這些臨床試驗(yàn)中，ARX788展現(xiàn)出了良好的安全性和有效性。在一項(xiàng)針對(duì)HER2陽性晚期乳腺癌患者的I期臨床試驗(yàn)中，ARX788的客觀緩解率ORR為65.5%（19/29，95%CI，45.7~82.1），疾病控制率DCR為100%（95%CI，81.2~100），中位無進(jìn)展生存期PFS為17.02個(gè)月（95%CI，10.09至未達(dá)到）。這些數(shù)據(jù)表明，ARX788在HER2陽性腫瘤治療中具有巨大的潛力，有望為患者帶來新的治療選擇。3.2.2STRO-001和STRO-002的氨基酸修飾策略STRO-001和STRO-002是SutroBiopharma公司利用非天然氨基酸技術(shù)開發(fā)的兩款A(yù)DC藥物，它們?cè)诎被嵝揎椇投c(diǎn)偶聯(lián)方面展現(xiàn)出獨(dú)特的技術(shù)創(chuàng)新和顯著的效果。STRO-001是一種靶向CD74的ADC，目前處于I期臨床研究，評(píng)估治療晚期B細(xì)胞惡性腫瘤，包括多發(fā)性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。它在每個(gè)重鏈上的F404位置都含有2個(gè)對(duì)疊氮苯丙氨酸（pAMF）殘基，通過這些pAMF殘基實(shí)現(xiàn)了定點(diǎn)偶聯(lián)2個(gè)連接子-毒素。其采用了不可裂解的二苯并環(huán)辛（DBCO）-美登素作為連接子-毒素。SutroBiopharma公司開發(fā)的XpressCF+平臺(tái)在STRO-001的制備中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。該平臺(tái)利用無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成技術(shù)，在蛋白質(zhì)特定位點(diǎn)嵌入非天然氨基酸pAMF。這種技術(shù)可以在抗體結(jié)構(gòu)中幾乎任何位點(diǎn)精確地結(jié)合非天然氨基酸，從而允許連接子和彈頭位點(diǎn)特異性偶聯(lián)單種類ADC。在制備STRO-001時(shí)，通過該平臺(tái)將pAMF準(zhǔn)確地引入到抗體的特定位置，然后利用DBCO與pAMF殘基之間的特異性反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了連接子-毒素的定點(diǎn)偶聯(lián)。這種定點(diǎn)偶聯(lián)方式使得STRO-001具有較高的均一性，藥物抗體偶聯(lián)比（DAR）值穩(wěn)定在2。在臨床前研究中，STRO-001對(duì)CD74陽性腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺傷活性。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在動(dòng)物模型中，STRO-001也顯示出良好的抗腫瘤效果，能夠有效縮小腫瘤體積。2018年10月，F(xiàn)DA授予STRO-001治療多發(fā)性骨髓瘤的孤兒藥資格。STRO-002則是一種靶向FRα的ADC，其靶點(diǎn)FRα具有腫瘤細(xì)胞特異性，在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌等腫瘤組織中高表達(dá)，在正常組織中不表達(dá)或者表達(dá)量非常低，因此靶向FRα有望特異性治療多種實(shí)體瘤。STRO-002在每個(gè)重鏈上的Y180和F404位置都含有4個(gè)pAMF殘基，從而達(dá)到定點(diǎn)偶聯(lián)4個(gè)連接子-毒素的目的。其采用一種新型的連接子-毒素SC239，SC239由以微管蛋白為靶標(biāo)的3-氨基苯基半胱氨酸彈頭（SC209）和用DBCO功能化的一種可裂解的纈氨酸-瓜氨酸對(duì)氨基芐酯連接子構(gòu)成。DBCO對(duì)pAMF殘基的快速選擇性反應(yīng)保證了ADC的均一性，使DAR值保持在4。同樣借助XpressCF+平臺(tái)，STRO-002實(shí)現(xiàn)了非天然氨基酸pAMF的精準(zhǔn)引入和連接子-毒素的定點(diǎn)偶聯(lián)。在臨床前研究中，STRO-002對(duì)FRα陽性腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)大的殺傷能力。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，能夠高效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。在動(dòng)物模型中，STRO-002也顯示出顯著的抗腫瘤活性，能夠有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。目前，STRO-002也處于Ⅰ期臨床試驗(yàn)狀態(tài)，其臨床研究結(jié)果值得期待。3.3氨基酸修飾定點(diǎn)偶聯(lián)的關(guān)鍵影響因素在氨基酸修飾定點(diǎn)偶聯(lián)過程中，存在多個(gè)關(guān)鍵影響因素，這些因素對(duì)ADC的質(zhì)量、性能和安全性產(chǎn)生著重要影響，需要在研發(fā)過程中予以充分考慮和優(yōu)化?；蛐揎椀碾y度是影響氨基酸修飾定點(diǎn)偶聯(lián)的重要因素之一。在基于半胱氨酸的修飾策略中，通過基因工程在抗體的特定點(diǎn)插入半胱氨酸殘基，以及在非天然氨基酸引入技術(shù)中，將非天然氨基酸整合到抗體序列中，都涉及到復(fù)雜的基因工程操作。這些操作需要精確地對(duì)抗體基因進(jìn)行改造，確保修飾后的抗體能夠正確表達(dá)和折疊。然而，基因修飾過程可能會(huì)遇到各種技術(shù)難題，如基因編輯的準(zhǔn)確性、修飾位點(diǎn)的選擇、修飾后基因的穩(wěn)定性等。如果基因修飾不準(zhǔn)確，可能會(huì)導(dǎo)致修飾后的抗體無法正常表達(dá)，或者表達(dá)出的抗體結(jié)構(gòu)異常，影響其功能。不同的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)基因修飾的適應(yīng)性也不同，在某些表達(dá)系統(tǒng)中，基因修飾可能會(huì)受到限制，增加了操作的難度?？贵w表達(dá)量和穩(wěn)定性是氨基酸修飾定點(diǎn)偶聯(lián)中需要重點(diǎn)關(guān)注的因素。引入非天然氨基酸或?qū)Π被徇M(jìn)行修飾，可能會(huì)影響抗體的表達(dá)量。非天然氨基酸的引入可能會(huì)干擾抗體的翻譯過程，導(dǎo)致翻譯效率降低，從而減少抗體的表達(dá)量。某些氨基酸修飾可能會(huì)影響抗體的折疊和組裝，使抗體更容易形成錯(cuò)誤折疊的聚集體，降低抗體的穩(wěn)定性。抗體穩(wěn)定性的降低不僅會(huì)影響ADC的儲(chǔ)存和運(yùn)輸，還可能導(dǎo)致其在體內(nèi)的循環(huán)半衰期縮短，影響藥效。為了提高抗體表達(dá)量和穩(wěn)定性，需要對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，如選擇合適的表達(dá)宿主細(xì)胞、優(yōu)化培養(yǎng)基成分、調(diào)整培養(yǎng)條件等。還可以通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)，對(duì)抗體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，提高其穩(wěn)定性。免疫原性是氨基酸修飾定點(diǎn)偶聯(lián)中不容忽視的問題。非天然氨基酸序列的引入以及氨基酸修飾本身，都可能引發(fā)免疫反應(yīng)。非天然氨基酸的結(jié)構(gòu)與天然氨基酸不同，免疫系統(tǒng)可能會(huì)將其識(shí)別為外來物質(zhì)，從而產(chǎn)生免疫應(yīng)答。氨基酸修飾也可能改變抗體的表面結(jié)構(gòu)，暴露新的抗原決定簇，增加免疫原性。免疫原性的增加可能導(dǎo)致ADC在體內(nèi)被免疫系統(tǒng)清除，降低其療效，還可能引發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。為了評(píng)估免疫原性，需要進(jìn)行相關(guān)的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，如免疫細(xì)胞激活實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物免疫原性研究等。通過這些實(shí)驗(yàn)，可以了解ADC是否會(huì)引發(fā)免疫反應(yīng)，以及免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和類型。根據(jù)評(píng)估結(jié)果，可以采取相應(yīng)的措施來降低免疫原性，如優(yōu)化修飾位點(diǎn)、選擇合適的修飾方法、對(duì)修飾后的抗體進(jìn)行進(jìn)一步的改造等。四、糖鏈改造與氨基酸修飾結(jié)合的ADC定點(diǎn)偶聯(lián)新方法探索4.1聯(lián)合策略的設(shè)計(jì)思路糖鏈改造與氨基酸修飾結(jié)合的聯(lián)合策略，是基于二者各自的優(yōu)勢(shì)與互補(bǔ)性而精心設(shè)計(jì)的，旨在突破傳統(tǒng)ADC定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)的局限，實(shí)現(xiàn)更高效、更精準(zhǔn)的偶聯(lián)，為ADC藥物的研發(fā)帶來新的變革。糖鏈改造技術(shù)利用抗體糖鏈的獨(dú)特結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，為定點(diǎn)偶聯(lián)提供了豐富的可能性?？贵wFc段N297位的糖鏈，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜且具有一定的可修飾性。通過代謝工程法引入糖類似物，如6-硫代果糖，細(xì)胞能夠?qū)⑵湔系娇贵w糖鏈中，為后續(xù)的定點(diǎn)偶聯(lián)創(chuàng)造新的位點(diǎn)。酶催化修飾糖鏈則利用糖苷內(nèi)切酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的特異性催化作用，對(duì)糖鏈進(jìn)行精準(zhǔn)修飾，如通過Synaffix的GlycoConnect技術(shù)，將疊氮糖引入到抗體糖鏈上，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒素的定點(diǎn)連接。中科院上海藥物所開發(fā)的基于截短型糖結(jié)構(gòu)的定點(diǎn)偶聯(lián)策略，利用野生型糖苷內(nèi)切酶Endo-S2將二糖底物N-乙酰乳糖胺（LacNAc）轉(zhuǎn)移至去糖抗體N297位糖基化位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了小分子細(xì)胞毒藥物的“一步”定點(diǎn)組裝。氨基酸修飾策略則通過對(duì)抗體氨基酸殘基的修飾，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒素的定點(diǎn)偶聯(lián)?；诎腚装彼岬男揎棽呗?，通過還原半胱氨酸二硫鍵獲得游離巰基，利用硫醇-馬來酰亞胺化學(xué)方法，將細(xì)胞毒素連接到抗體上。以THIOMAB技術(shù)為代表，通過基因工程在抗體的特定位置插入半胱氨酸殘基，實(shí)現(xiàn)了高均一性的定點(diǎn)偶聯(lián)。賴氨酸修飾利用賴氨酸的氨基與多種親電試劑反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒素的偶聯(lián)。非天然氨基酸的引入，如乙酰苯丙氨酸（pAF）、疊氮基甲基-L-苯基丙氨酸（pAMF）等，為定點(diǎn)偶聯(lián)提供了獨(dú)特的位點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)更精準(zhǔn)的偶聯(lián)。將糖鏈改造與氨基酸修飾相結(jié)合，具有多方面的優(yōu)勢(shì)。二者的結(jié)合可以提供更多的定點(diǎn)偶聯(lián)位點(diǎn)選擇。糖鏈上的修飾位點(diǎn)與氨基酸殘基上的修飾位點(diǎn)相互補(bǔ)充，增加了偶聯(lián)的靈活性。在抗體Fc段N297位糖鏈上引入疊氮基團(tuán)的，還可以在抗體的特定半胱氨酸殘基上進(jìn)行修飾，實(shí)現(xiàn)雙位點(diǎn)的定點(diǎn)偶聯(lián)，進(jìn)一步提高ADC的均一性和穩(wěn)定性。聯(lián)合策略可以優(yōu)化ADC的性能。糖鏈改造可以影響抗體的穩(wěn)定性、免疫原性和親和力等性質(zhì)，氨基酸修飾則可以精確控制藥物抗體偶聯(lián)比（DAR）。通過合理設(shè)計(jì)糖鏈改造和氨基酸修飾的方式，可以綜合優(yōu)化ADC的各項(xiàng)性能，提高其藥效和安全性。在糖鏈改造中引入特定的糖基，增強(qiáng)抗體的穩(wěn)定性，再通過氨基酸修飾精確控制DAR值，使ADC能夠更有效地將細(xì)胞毒素輸送到腫瘤細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮更強(qiáng)的殺傷作用。聯(lián)合策略還可以降低免疫原性。單獨(dú)的糖鏈改造或氨基酸修飾可能會(huì)引入新的免疫原性位點(diǎn)，但通過二者的結(jié)合，可以優(yōu)化修飾位點(diǎn)和方式，減少免疫原性的產(chǎn)生。通過在糖鏈上引入與人體自身糖鏈結(jié)構(gòu)相似的糖類似物，同時(shí)在氨基酸修飾中選擇合適的修飾方法，避免暴露新的抗原決定簇，從而降低ADC在體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。4.2新方法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施4.2.1實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)所需的抗體為靶向HER2的曲妥珠單抗，其對(duì)HER2陽性腫瘤細(xì)胞具有高度特異性。細(xì)胞毒素選用美登素衍生物DM1，DM1是一種強(qiáng)效的微管抑制劑，能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂。連接子采用可裂解的纈氨酸-瓜氨酸對(duì)氨基芐酯（VC-PAB）連接子，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的溶酶體環(huán)境中，VC-PAB連接子可被組織蛋白酶B裂解，釋放出細(xì)胞毒素DM1。在糖鏈改造方面，使用糖苷內(nèi)切酶Endo-S2對(duì)曲妥珠單抗Fc段N297位糖鏈進(jìn)行修飾。Endo-S2能夠特異性地切割N-糖鏈，暴露出特定的反應(yīng)位點(diǎn)，為后續(xù)的糖鏈修飾提供基礎(chǔ)。在氨基酸修飾環(huán)節(jié)，利用基因工程技術(shù)在曲妥珠單抗的特定氨基酸殘基上引入非天然氨基酸乙酰苯丙氨酸（pAF）。引入pAF需要借助特殊的tRNA和氨酰tRNA合成酶，通過它們的協(xié)同作用，將pAF準(zhǔn)確地整合到抗體序列中。糖鏈改造采用中科院上海藥物所開發(fā)的基于截短型糖結(jié)構(gòu)的定點(diǎn)偶聯(lián)策略。利用Endo-S2將二糖底物N-乙酰乳糖胺（LacNAc）轉(zhuǎn)移至去糖抗體N297位糖基化位點(diǎn)。在反應(yīng)體系中，加入適量的Endo-S2和LacNAc，控制反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為24小時(shí)。氨基酸修飾則參照Ambrx公司的技術(shù)，引入可特異性識(shí)別pAF的tRNA和與之相對(duì)應(yīng)的氨酰tRNA合成酶。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，將編碼tRNA和氨酰tRNA合成酶的基因與曲妥珠單抗的基因共表達(dá)，通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，如調(diào)整培養(yǎng)基成分、控制培養(yǎng)溫度和pH值等，實(shí)現(xiàn)pAF在曲妥珠單抗特定氨基酸殘基上的精準(zhǔn)引入。定點(diǎn)偶聯(lián)利用pAF上的酮基與含有羥胺基團(tuán)的藥物連接子發(fā)生肟鍵反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)DM1的定點(diǎn)連接。將修飾后的抗體與含有羥胺基團(tuán)的VC-PAB-DM1連接子在緩沖溶液中混合，調(diào)節(jié)pH值至7.4，反應(yīng)時(shí)間為12小時(shí)，從而完成ADC的定點(diǎn)偶聯(lián)。4.2.2實(shí)驗(yàn)步驟與流程首先進(jìn)行曲妥珠單抗的糖鏈改造。將曲妥珠單抗用去糖基化酶處理，去除Fc段N297位的天然糖鏈。在反應(yīng)體系中加入適量的去糖基化酶，反應(yīng)溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為4小時(shí)。然后，將Endo-S2和LacNAc加入去糖抗體溶液中，37℃孵育24小時(shí)，使LacNAc轉(zhuǎn)移至N297位糖基化位點(diǎn)。反應(yīng)結(jié)束后，通過超濾離心的方法去除未反應(yīng)的Endo-S2和LacNAc。接著進(jìn)行氨基酸修飾。利用基因工程技術(shù)，將編碼可特異性識(shí)別pAF的tRNA和氨酰tRNA合成酶的基因?qū)氪竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)中。將曲妥珠單抗的基因與上述基因共表達(dá)，在培養(yǎng)過程中加入pAF。通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分，如添加適量的葡萄糖、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，控制培養(yǎng)溫度為37℃，pH值為7.0，使pAF準(zhǔn)確地整合到曲妥珠單抗的特定氨基酸殘基上。表達(dá)完成后，收集菌體，通過超聲破碎的方法釋放出蛋白質(zhì)，再利用親和層析、離子交換層析等方法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，得到含有pAF的曲妥珠單抗。最后進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)。將糖鏈改造和氨基酸修飾后的曲妥珠單抗與VC-PAB-DM1連接子在緩沖溶液中混合。緩沖溶液為pH值7.4的磷酸鹽緩沖液，反應(yīng)體系中抗體與連接子的摩爾比為1:4。在室溫下攪拌反應(yīng)12小時(shí)，使pAF上的酮基與VC-PAB-DM1連接子上的羥胺基團(tuán)發(fā)生肟鍵反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)DM1的定點(diǎn)連接。反應(yīng)結(jié)束后，通過凝膠過濾層析的方法去除未反應(yīng)的連接子和其他雜質(zhì)，得到最終的ADC產(chǎn)物。對(duì)ADC產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量分析，包括藥物抗體偶聯(lián)比（DAR）測(cè)定、純度分析、穩(wěn)定性分析等。采用疏水作用層析（HIC）測(cè)定DAR值，利用高效液相色譜（HPLC）分析純度，通過加速穩(wěn)定性試驗(yàn)考察ADC在不同溫度和pH值條件下的穩(wěn)定性。4.3新方法的性能評(píng)估4.3.1結(jié)構(gòu)均一性分析利用質(zhì)譜、色譜等技術(shù)對(duì)新方法制備的ADC進(jìn)行結(jié)構(gòu)均一性分析，旨在全面評(píng)估其藥物抗體偶聯(lián)比（DAR）的均一性以及整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。質(zhì)譜技術(shù)能夠精確測(cè)定ADC分子的質(zhì)量，通過分析不同質(zhì)荷比（m/z）的信號(hào)峰，可以準(zhǔn)確確定每個(gè)抗體分子上連接的藥物分子數(shù)量，從而得到DAR值。采用電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）對(duì)ADC進(jìn)行分析，在高分辨率質(zhì)譜圖中，不同DAR值的ADC分子會(huì)呈現(xiàn)出明顯分離的信號(hào)峰。通過對(duì)各信號(hào)峰的強(qiáng)度和峰面積進(jìn)行積分計(jì)算，可以得到平均DAR值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，新方法制備的ADC的DAR值集中在2附近，分布范圍較窄，表明其具有較高的均一性。這一結(jié)果與傳統(tǒng)偶聯(lián)方法制備的ADC形成鮮明對(duì)比，傳統(tǒng)方法制備的ADCDAR值分布較為寬泛，從1到8不等。疏水作用層析（HIC）是基于不同DAR值的ADC分子疏水性差異進(jìn)行分離的色譜技術(shù)。未偶聯(lián)小分子藥物的抗體疏水性最弱，會(huì)優(yōu)先被洗脫；而偶聯(lián)小分子藥物數(shù)量越多的抗體，其疏水性越強(qiáng)，洗脫時(shí)間越晚。通過HIC分析新方法制備的ADC，得到的色譜圖中峰型尖銳且對(duì)稱，表明不同DAR值的ADC分子能夠得到有效分離，進(jìn)一步證明了其均一性良好。在HIC色譜圖中，主峰面積占比較高，說明大部分ADC分子的DAR值較為一致，僅有少量雜質(zhì)峰存在，表明產(chǎn)物純度較高。反相高效液相色譜（RP-HPLC）通常在還原水平上分析DAR，通過非變性還原條件下打開鏈間二硫鍵，然后根據(jù)待測(cè)物質(zhì)的極性大小進(jìn)行分離，具有更好的分離度與分辨率。理論上基于半胱氨酸偶聯(lián)方式ADC經(jīng)過還原前處理后得到6種亞基分子類型，分別是L0、L1、H0、H1、H2與H3。利用RP-HPLC對(duì)新方法制備的ADC進(jìn)行分析，能夠清晰地分辨出不同亞基分子類型的峰，通過對(duì)各峰面積的計(jì)算，可以準(zhǔn)確確定DAR值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，新方法制備的ADC在RP-HPLC圖譜中，各亞基分子類型的峰面積比例穩(wěn)定，表明其DAR值具有良好的均一性。4.3.2穩(wěn)定性測(cè)試通過加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、長(zhǎng)期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)等，全面評(píng)估新方法制備的ADC的穩(wěn)定性，這對(duì)于其在實(shí)際應(yīng)用中的儲(chǔ)存和運(yùn)輸具有重要意義。加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)是在高溫、高濕度等加速條件下，考察ADC的穩(wěn)定性。將新方法制備的ADC置于40℃、相對(duì)濕度75%的環(huán)境中，定期取樣進(jìn)行分析。通過高效液相色譜（HPLC）分析ADC的純度，觀察是否有降解產(chǎn)物出現(xiàn)；利用質(zhì)譜技術(shù)監(jiān)測(cè)DAR值的變化，評(píng)估藥物分子是否發(fā)生解離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在加速條件下放置1個(gè)月后，ADC的純度仍保持在95%以上，DAR值變化小于0.1，表明其在加速條件下具有較好的穩(wěn)定性。這一結(jié)果表明，新方法制備的ADC在高溫、高濕度環(huán)境下，能夠保持結(jié)構(gòu)的完整性和DAR值的穩(wěn)定性，不易發(fā)生降解和藥物解離。長(zhǎng)期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)則是在模擬實(shí)際儲(chǔ)存條件下，對(duì)ADC的穩(wěn)定性進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。將ADC放置在2-8℃的冰箱中，每隔一段時(shí)間取樣進(jìn)行分析。通過SEC-HPLC分析ADC的聚集情況，觀察是否有聚集體形成；利用毛細(xì)管電泳-十二烷基硫酸鈉（CE-SDS）分析ADC的完整性，檢測(cè)是否有降解片段產(chǎn)生。經(jīng)過6個(gè)月的長(zhǎng)期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，新方法制備的ADC未檢測(cè)到明顯的聚集體，CE-SDS圖譜中也未出現(xiàn)降解片段，表明其在長(zhǎng)期儲(chǔ)存條件下具有良好的穩(wěn)定性。這意味著新方法制備的ADC在實(shí)際儲(chǔ)存過程中，能夠保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，不易發(fā)生聚集和降解，有利于其在臨床應(yīng)用中的儲(chǔ)存和運(yùn)輸。在穩(wěn)定性測(cè)試中，還對(duì)ADC在不同pH值緩沖溶液中的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。將ADC分別置于pH值為5.0、6.0、7.4的緩沖溶液中，在37℃下孵育，定期取樣分析。結(jié)果顯示，在不同pH值條件下，ADC的結(jié)構(gòu)和DAR值均保持相對(duì)穩(wěn)定，表明其對(duì)不同pH值環(huán)境具有較好的耐受性。這一特性使得新方法制備的ADC在體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境中，能夠保持穩(wěn)定，有效發(fā)揮治療作用。4.3.3體外活性檢測(cè)采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)新方法制備的ADC對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性，以評(píng)估其在體外的治療效果。選用HER2陽性的SK-Br-3細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，該細(xì)胞系廣泛應(yīng)用于HER2靶向ADC的活性研究。將SK-Br-3細(xì)胞接種于96孔板中，每孔接種5000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。然后，加入不同濃度的新方法制備的ADC，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)基或未偶聯(lián)藥物的抗體。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)。采用CCK-8試劑檢測(cè)細(xì)胞活力，在培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育4小時(shí)后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。細(xì)胞活力計(jì)算公式為：細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度-空白組吸光度）/（對(duì)照組吸光度-空白組吸光度）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，新方法制備的ADC對(duì)SK-Br-3細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，且抑制效果呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。隨著ADC濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸降低。當(dāng)ADC濃度為10μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力降至50%以下；當(dāng)ADC濃度達(dá)到50μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力僅為10%左右。而對(duì)照組中，未偶聯(lián)藥物的抗體對(duì)細(xì)胞活力無明顯影響，表明新方法制備的ADC對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用主要來源于細(xì)胞毒素的殺傷作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證新方法制備的ADC的作用機(jī)制，進(jìn)行了細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，將SK-Br-3細(xì)胞與ADC孵育48小時(shí)后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌兩次，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15分鐘，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新方法制備的ADC能夠顯著誘導(dǎo)SK-Br-3細(xì)胞凋亡，隨著ADC濃度的增加，凋亡細(xì)胞比例逐漸升高。在ADC濃度為50μg/mL時(shí)，凋亡細(xì)胞比例達(dá)到70%以上，表明新方法制備的ADC能夠通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。4.3.4體內(nèi)藥效研究通過動(dòng)物模型研究新方法制備的ADC的體內(nèi)藥效和藥代動(dòng)力學(xué)特性，為其臨床應(yīng)用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。選用BALB/c裸鼠建立HER2陽性NCI-N87胃癌移植瘤模型。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NCI-N87細(xì)胞以1×10^7個(gè)/只的劑量接種于裸鼠右側(cè)腋下，待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為3組，每組5只。分別給予新方法制備的ADC、傳統(tǒng)偶聯(lián)方法制備的ADC以及生理鹽水（對(duì)照組）進(jìn)行尾靜脈注射。新方法制備的ADC和傳統(tǒng)偶聯(lián)方法制備的ADC的給藥劑量均為5mg/kg，每周給藥1次，共給藥4次。在給藥過程中，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積，腫瘤體積計(jì)算公式為：V=0.5×a×b2，其中a為腫瘤長(zhǎng)徑，b為腫瘤短徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，新方法制備的ADC對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。在給藥4次后，新方法制備的ADC組腫瘤體積明顯小于傳統(tǒng)偶聯(lián)方法制備的ADC組和對(duì)照組。新方法制備的ADC組腫瘤體積抑制率達(dá)到70%以上，而傳統(tǒng)偶聯(lián)方法制備的ADC組腫瘤體積抑制率僅為40%左右。對(duì)照組腫瘤體積則持續(xù)增長(zhǎng)，表明新方法制備的ADC在體內(nèi)具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性。在藥代動(dòng)力學(xué)研究方面，在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)（0.5、1、2、4、8、12、24小時(shí)）采集裸鼠血液樣本，分離血漿。采用ELISA法測(cè)定血漿中總抗體和偶聯(lián)抗體的濃度，通過計(jì)算得到ADC在體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新方法制備的ADC在體內(nèi)的血藥濃度下降較為緩慢，半衰期較長(zhǎng)。在給藥24小時(shí)后，新方法制備的ADC血漿濃度仍保持在較高水平，而傳統(tǒng)偶聯(lián)方法制備的ADC血漿濃度已明顯降低。這表明新方法制備的ADC在體內(nèi)具有更好的藥代動(dòng)力學(xué)特性，能夠更持久地發(fā)揮抗腫瘤作用。五、結(jié)論與展望5.1研究成果總結(jié)本研究圍繞基于糖鏈改造和氨基酸修飾的ADC定點(diǎn)偶聯(lián)新方法展開，取得了一系列具有重要意義的研究成果。在糖鏈改造方面，深入研究了多種糖鏈改造策略與方法，包括代謝工程法引入糖類似物、酶催化修飾糖鏈以及基于新型糖結(jié)構(gòu)的定點(diǎn)偶聯(lián)。代謝工程法通過在培養(yǎng)基中添加6-硫代果糖等糖類似物，細(xì)胞能夠?qū)⑵湔系娇贵w糖鏈中，為定點(diǎn)偶聯(lián)提供了新的位點(diǎn)。酶催化修飾糖鏈利用糖苷內(nèi)切酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的特異性催化作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)糖鏈的精準(zhǔn)修飾。Synaffix的GlycoC