基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感：原理、應(yīng)用與展望一、引言1.1研究背景與意義在當(dāng)今生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，對(duì)生物分子的精確檢測(cè)與分析是推動(dòng)眾多研究進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。核酸作為攜帶遺傳信息的重要生物分子，對(duì)其準(zhǔn)確、快速且靈敏的檢測(cè)一直是研究的熱點(diǎn)。DNA生物傳感器作為核酸檢測(cè)的有力工具，在生物分析、疾病診斷、食品安全監(jiān)測(cè)以及環(huán)境檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出了不可替代的重要性。它能夠利用核酸分子間特異性的雜交作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA序列的識(shí)別與檢測(cè)，為相關(guān)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供了關(guān)鍵的技術(shù)支持。電化學(xué)DNA生物傳感器作為DNA生物傳感器中的重要一員，憑借其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)在眾多檢測(cè)技術(shù)中脫穎而出。從成本角度來(lái)看，其所需的儀器設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，無(wú)需昂貴的光學(xué)檢測(cè)儀器，大大降低了檢測(cè)成本，這使得它在資源有限的環(huán)境下也能廣泛應(yīng)用。操作上，它避免了復(fù)雜的光學(xué)信號(hào)處理步驟，操作流程簡(jiǎn)便，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率。靈敏度方面，通過(guò)優(yōu)化電極材料和檢測(cè)方法，能夠達(dá)到極高的檢測(cè)靈敏度，滿足對(duì)痕量DNA的檢測(cè)需求。此外，它受環(huán)境因素如光照、溫度波動(dòng)等的干擾較少，具有良好的穩(wěn)定性和可靠性，能在不同的環(huán)境條件下穩(wěn)定工作，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在疾病診斷領(lǐng)域，電化學(xué)DNA生物傳感器發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。以癌癥診斷為例，早期癌癥患者體內(nèi)往往會(huì)釋放出微量的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA），這些ctDNA攜帶著腫瘤相關(guān)的基因突變信息。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）雖然靈敏度較高，但存在操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)以及易受污染等問(wèn)題。而電化學(xué)DNA生物傳感器能夠直接對(duì)血液、唾液等生物樣本中的ctDNA進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)癌癥的早期篩查和診斷。研究表明，通過(guò)特定的DNA探針設(shè)計(jì)，電化學(xué)DNA生物傳感器能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出癌癥患者血液中低至皮摩爾級(jí)別的ctDNA，為癌癥的早期發(fā)現(xiàn)和治療爭(zhēng)取寶貴的時(shí)間。在傳染病診斷方面，例如對(duì)新冠病毒的檢測(cè)，電化學(xué)DNA生物傳感器可以快速檢測(cè)出病毒的特異性核酸序列，具有檢測(cè)速度快、無(wú)需復(fù)雜儀器設(shè)備等優(yōu)勢(shì)，能夠在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)甚至家庭中進(jìn)行快速檢測(cè)，對(duì)于疫情的防控和監(jiān)測(cè)具有重要意義。然而，目前的電化學(xué)DNA生物傳感器在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)的DNA探針在與目標(biāo)DNA雜交時(shí)，容易受到生物樣本中復(fù)雜成分的干擾，導(dǎo)致檢測(cè)的特異性和靈敏度受到影響。此外，在一些復(fù)雜的生物體系中，如血清、細(xì)胞裂解液等，背景信號(hào)較高，這對(duì)傳感器的檢測(cè)準(zhǔn)確性提出了更高的要求。為了克服這些問(wèn)題，引入新型的識(shí)別元件成為研究的重點(diǎn)方向之一。肽核酸（PNA）作為一種人工合成的核酸類似物，為解決上述問(wèn)題帶來(lái)了新的契機(jī)。PNA的主鏈由N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單元通過(guò)肽鍵連接而成，摒棄了傳統(tǒng)DNA中的磷酸核糖主鏈。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了PNA諸多優(yōu)異的性能。首先，PNA與DNA之間具有更強(qiáng)的雜交親和力，其雜交穩(wěn)定性比DNA-DNA雜交更高。這是因?yàn)镻NA主鏈上不存在帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，避免了與DNA雜交時(shí)的靜電排斥作用，使得PNA與互補(bǔ)DNA能夠更緊密地結(jié)合。其次，PNA對(duì)單堿基錯(cuò)配具有更高的識(shí)別能力。在基因檢測(cè)中，單堿基突變往往與許多遺傳性疾病和癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，PNA能夠準(zhǔn)確識(shí)別出這些單堿基錯(cuò)配，大大提高了檢測(cè)的特異性，減少了誤診的可能性。此外，PNA還具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物兼容性，不易被核酸酶降解，能夠在復(fù)雜的生物環(huán)境中保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和功能，為其在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。將PNA引入電化學(xué)DNA生物傳感技術(shù)中，能夠顯著提升傳感器的性能。PNA作為識(shí)別元件，能夠更高效、更準(zhǔn)確地捕獲目標(biāo)DNA，增強(qiáng)傳感器的檢測(cè)靈敏度和特異性。在復(fù)雜生物樣本檢測(cè)中，PNA憑借其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性能優(yōu)勢(shì)，能夠有效降低背景干擾，提高檢測(cè)信號(hào)的準(zhǔn)確性和可靠性。因此，開展基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感研究，對(duì)于推動(dòng)電化學(xué)DNA生物傳感器的發(fā)展，解決當(dāng)前檢測(cè)技術(shù)面臨的難題，滿足生物分析、疾病診斷等領(lǐng)域?qū)Ω哽`敏、高特異性檢測(cè)的需求具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感技術(shù)，充分挖掘肽核酸獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性能優(yōu)勢(shì)，通過(guò)理論分析與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方式，構(gòu)建高性能的電化學(xué)DNA生物傳感器，為生物分析、疾病診斷等領(lǐng)域提供更精準(zhǔn)、高效的檢測(cè)工具。具體研究?jī)?nèi)容涵蓋以下幾個(gè)方面：肽核酸與DNA相互作用的機(jī)理研究：從分子層面深入剖析肽核酸（PNA）與DNA之間雜交的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)特性。運(yùn)用多種先進(jìn)的光譜技術(shù)，如熒光光譜、圓二色譜等，詳細(xì)研究PNA與DNA雜交過(guò)程中分子構(gòu)象的變化，明確二者相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)和作用力類型。借助分子動(dòng)力學(xué)模擬手段，從微觀角度動(dòng)態(tài)模擬PNA-DNA雜交體系的行為，計(jì)算結(jié)合自由能等關(guān)鍵參數(shù)，深入理解雜交過(guò)程的本質(zhì)，為后續(xù)傳感器的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)?；陔暮怂岬碾娀瘜W(xué)DNA生物傳感器的構(gòu)建：精心設(shè)計(jì)并篩選具有高特異性和親和力的PNA序列，使其能夠精準(zhǔn)識(shí)別目標(biāo)DNA。通過(guò)化學(xué)修飾等方法，將PNA穩(wěn)定地固定在電極表面，構(gòu)建起基于PNA的電化學(xué)DNA生物傳感界面。探索不同的固定化方法，如共價(jià)鍵合、自組裝等，優(yōu)化固定化條件，確保PNA在電極表面的取向和密度適宜，以提高傳感器對(duì)目標(biāo)DNA的捕獲效率和檢測(cè)靈敏度。同時(shí)，對(duì)電極材料進(jìn)行選擇和優(yōu)化，考察不同電極材料（如金電極、玻碳電極、石墨烯修飾電極等）對(duì)傳感器性能的影響，結(jié)合材料的導(dǎo)電性、生物兼容性等特性，選擇最適配的電極材料，為傳感器性能的提升奠定基礎(chǔ)。傳感器性能優(yōu)化與分析：系統(tǒng)研究影響傳感器性能的關(guān)鍵因素，包括PNA與目標(biāo)DNA的雜交條件（如雜交時(shí)間、溫度、離子強(qiáng)度等）、檢測(cè)體系的pH值、干擾物質(zhì)的影響等。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化等方法，全面優(yōu)化傳感器的檢測(cè)條件，提高傳感器的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。采用多種電化學(xué)分析技術(shù)，如循環(huán)伏安法（CV）、差分脈沖伏安法（DPV）、電化學(xué)阻抗譜（EIS）等，對(duì)傳感器的電化學(xué)性能進(jìn)行深入表征，獲取傳感器在不同條件下的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)，分析信號(hào)變化與目標(biāo)DNA濃度之間的關(guān)系，建立準(zhǔn)確的定量檢測(cè)模型。此外，對(duì)傳感器的選擇性、重現(xiàn)性和抗干擾性能進(jìn)行嚴(yán)格評(píng)估，考察傳感器對(duì)單堿基錯(cuò)配DNA、非互補(bǔ)DNA以及生物樣本中常見干擾物質(zhì)的識(shí)別能力，驗(yàn)證傳感器在復(fù)雜生物環(huán)境中的實(shí)際應(yīng)用潛力。實(shí)際樣品檢測(cè)應(yīng)用研究：將構(gòu)建的基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感器應(yīng)用于實(shí)際生物樣品的檢測(cè)，如臨床血液樣本、唾液樣本、環(huán)境水樣等。針對(duì)不同類型的實(shí)際樣品，建立相應(yīng)的預(yù)處理方法，去除樣品中的雜質(zhì)和干擾物質(zhì)，確保傳感器能夠準(zhǔn)確檢測(cè)目標(biāo)DNA。通過(guò)與傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)方法（如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-熒光定量PCR、基因測(cè)序等）進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證本傳感器在實(shí)際樣品檢測(cè)中的準(zhǔn)確性和可靠性。進(jìn)一步探索傳感器在疾病早期診斷、環(huán)境污染物監(jiān)測(cè)、食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，為解決實(shí)際問(wèn)題提供可行的技術(shù)方案。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1電化學(xué)DNA生物傳感原理2.1.1基本工作原理電化學(xué)DNA生物傳感器的基本工作原理是基于DNA分子的特異性雜交作用以及雜交前后電化學(xué)信號(hào)的變化。在傳感器的構(gòu)建中，首先將單鏈DNA（ssDNA），也稱為DNA探針，通過(guò)特定的固定化方法，如共價(jià)鍵合、自組裝、吸附等，穩(wěn)定地固定在電極表面，形成具有特異性識(shí)別功能的生物傳感界面。當(dāng)含有目標(biāo)DNA的樣品溶液與修飾后的電極接觸時(shí)，在適宜的雜交條件下，如合適的溫度、離子強(qiáng)度、pH值以及緩沖溶液環(huán)境中，電極表面的DNA探針會(huì)憑借堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，與溶液中的目標(biāo)DNA進(jìn)行特異性雜交，從而形成雙鏈DNA（dsDNA）。這一雜交過(guò)程會(huì)導(dǎo)致電極表面的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生顯著變化。從分子層面來(lái)看，雜交前后電極表面的電荷分布、電子傳遞能力以及分子構(gòu)象等均會(huì)改變。例如，DNA探針與目標(biāo)DNA雜交后，雙鏈DNA的形成可能會(huì)阻礙電極表面的電子傳遞，或者改變電極與溶液界面的離子分布，這些變化最終會(huì)反映在電化學(xué)信號(hào)的改變上。通過(guò)檢測(cè)這些電化學(xué)信號(hào)的變化，如電流、電位、阻抗等參數(shù)的改變，就能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的定性和定量檢測(cè)。以常見的基于氧化還原指示劑的電化學(xué)DNA生物傳感器為例，在雜交前，氧化還原指示劑可以自由地在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生特定的電化學(xué)信號(hào)。當(dāng)目標(biāo)DNA與電極表面的DNA探針雜交后，雙鏈DNA的形成會(huì)在一定程度上阻擋氧化還原指示劑接近電極表面，從而導(dǎo)致氧化還原反應(yīng)的電流或電位發(fā)生變化。通過(guò)監(jiān)測(cè)這種電流或電位的變化幅度，就可以推算出樣品中目標(biāo)DNA的濃度，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的定量檢測(cè)。這種檢測(cè)方式具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果，為生物分析和臨床診斷等領(lǐng)域提供了高效的檢測(cè)手段。2.1.2信號(hào)轉(zhuǎn)換與檢測(cè)方式在電化學(xué)DNA生物傳感中，常見的信號(hào)轉(zhuǎn)換與檢測(cè)方式主要包括電流法、電位法和阻抗法，它們各自基于不同的電化學(xué)原理，為目標(biāo)DNA的檢測(cè)提供了多樣化的手段。電流法：電流法是通過(guò)測(cè)量電極與溶液之間的電流變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)。其基本原理基于電化學(xué)反應(yīng)中電荷的轉(zhuǎn)移。在電化學(xué)DNA生物傳感器中，通常會(huì)引入具有電化學(xué)活性的物質(zhì)，如氧化還原指示劑。這些指示劑在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)時(shí)，會(huì)伴隨著電子的轉(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生電流。當(dāng)電極表面的DNA探針與目標(biāo)DNA雜交后，會(huì)影響氧化還原指示劑在電極表面的反應(yīng)過(guò)程。例如，雜交形成的雙鏈DNA可能會(huì)改變電極表面的微環(huán)境，使得氧化還原指示劑與電極之間的電子傳遞速率發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致電流發(fā)生改變。通過(guò)精確測(cè)量這種電流的變化，就可以獲取關(guān)于目標(biāo)DNA的信息。常見的電流檢測(cè)技術(shù)包括計(jì)時(shí)電流法和線性掃描伏安法等。計(jì)時(shí)電流法是在恒定電位下，測(cè)量電流隨時(shí)間的變化，通過(guò)分析電流-時(shí)間曲線，可以得到電化學(xué)反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)信息，從而推斷目標(biāo)DNA的濃度。線性掃描伏安法則是在一定的電位掃描速率下，測(cè)量電流隨電位的變化，得到的伏安曲線能夠反映出電化學(xué)反應(yīng)的氧化還原特性，為目標(biāo)DNA的檢測(cè)提供豐富的信息。電位法：電位法主要是檢測(cè)電極的電位變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)。其理論基礎(chǔ)是Nernst方程，該方程描述了電極電位與溶液中離子濃度之間的關(guān)系。在電化學(xué)DNA生物傳感器中，當(dāng)電極表面的DNA探針與目標(biāo)DNA雜交時(shí)，會(huì)引起電極表面附近溶液中離子濃度的變化，進(jìn)而導(dǎo)致電極電位發(fā)生改變。例如，某些離子（如氫離子、金屬離子等）在DNA雜交過(guò)程中會(huì)參與反應(yīng)，其濃度的改變會(huì)直接影響電極電位。通過(guò)使用高靈敏度的電位測(cè)量?jī)x器，如pH計(jì)、離子選擇性電極等，精確測(cè)量電極電位的變化，就可以根據(jù)Nernst方程計(jì)算出目標(biāo)DNA的濃度。電位法具有操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，并且不需要外加電源，減少了儀器的復(fù)雜性。但它的檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，通常適用于對(duì)靈敏度要求不太高的檢測(cè)場(chǎng)景。阻抗法：阻抗法是通過(guò)檢測(cè)電極阻抗的變化來(lái)分析目標(biāo)DNA的存在和濃度。電極阻抗是指電極與溶液界面之間對(duì)電流的阻礙作用，它包含電阻和電容兩個(gè)部分。在電化學(xué)DNA生物傳感器中，DNA探針固定在電極表面后，會(huì)形成一個(gè)具有特定阻抗特性的界面。當(dāng)目標(biāo)DNA與探針雜交時(shí)，電極界面的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)會(huì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致阻抗發(fā)生變化。例如，雜交形成的雙鏈DNA會(huì)增加電極表面的電荷密度和空間位阻，使得電子傳遞過(guò)程受到阻礙，電阻增大；同時(shí)，雙鏈DNA的形成也可能改變電極與溶液界面的電容特性。通過(guò)測(cè)量電極阻抗的變化，如使用電化學(xué)阻抗譜（EIS）技術(shù)，可以獲得關(guān)于電極界面過(guò)程和目標(biāo)DNA的信息。EIS技術(shù)通過(guò)在電極上施加一個(gè)小幅度的交流電壓信號(hào)，測(cè)量不同頻率下的阻抗響應(yīng)，得到的阻抗譜圖包含了豐富的信息，如電荷轉(zhuǎn)移電阻、雙電層電容等。通過(guò)對(duì)這些參數(shù)的分析，可以準(zhǔn)確地推斷目標(biāo)DNA的濃度和雜交動(dòng)力學(xué)過(guò)程，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性。2.2肽核酸（PNA）的特性與結(jié)構(gòu)2.2.1PNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)肽核酸（PNA）是一類極具創(chuàng)新性的核酸類似物，其結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)的DNA有著顯著的差異。PNA以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代了DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)是PNA具備諸多優(yōu)異性能的基礎(chǔ)。在PNA的結(jié)構(gòu)中，其主鏈由N-(2-氨基乙基)-甘氨酸單元通過(guò)肽鍵連接而成，形成了一種類似于多肽的骨架結(jié)構(gòu)。而DNA的主鏈則是由脫氧核糖和磷酸基團(tuán)交替連接組成的糖磷酸主鏈。這種骨架結(jié)構(gòu)的不同，使得PNA與DNA在物理和化學(xué)性質(zhì)上產(chǎn)生了明顯的區(qū)別。從空間結(jié)構(gòu)來(lái)看，PNA的肽鏈骨架相對(duì)較為剛性，這使得PNA分子在與互補(bǔ)核酸序列結(jié)合時(shí)，能夠形成更為穩(wěn)定的空間構(gòu)象。而DNA的糖磷酸主鏈具有一定的柔性，雖然這種柔性在一定程度上有利于DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)過(guò)程，但也使得DNA在與互補(bǔ)序列結(jié)合時(shí)，其穩(wěn)定性相對(duì)較弱。此外，PNA的堿基部分與DNA相同，都是通過(guò)氫鍵與互補(bǔ)堿基配對(duì)。這種堿基配對(duì)方式遵循Watson-Crick堿基配對(duì)原則，確保了PNA與DNA或RNA之間能夠進(jìn)行特異性的識(shí)別和結(jié)合。但由于PNA主鏈結(jié)構(gòu)的特殊性，其與互補(bǔ)核酸序列的結(jié)合方式和結(jié)合強(qiáng)度與DNA有所不同。例如，PNA與DNA雜交時(shí)，由于不存在磷酸基團(tuán)的靜電排斥作用，二者之間的結(jié)合更為緊密，雜交穩(wěn)定性更高。2.2.2PNA的理化性質(zhì)PNA獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了它一系列優(yōu)異的理化性質(zhì)，使其在生物傳感和分子生物學(xué)研究等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。穩(wěn)定性好：PNA對(duì)核酸酶和蛋白酶具有高度的耐受性，這是其在復(fù)雜生物環(huán)境中能夠穩(wěn)定存在的關(guān)鍵因素。由于PNA主鏈不是天然的核酸或多肽結(jié)構(gòu)，核酸酶和蛋白酶無(wú)法識(shí)別并作用于PNA，從而避免了被降解的風(fēng)險(xiǎn)。在生物體內(nèi)，各種核酸酶和蛋白酶會(huì)對(duì)DNA和RNA進(jìn)行降解，限制了它們?cè)隗w內(nèi)的應(yīng)用。而PNA能夠在這樣的環(huán)境中保持結(jié)構(gòu)和功能的完整性，為其作為生物探針和治療藥物的應(yīng)用提供了保障。研究表明，PNA在血清等富含酶的生物樣品中能夠長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在，其半衰期明顯長(zhǎng)于DNA和RNA。不被酶降解：如前文所述，PNA的非天然骨架結(jié)構(gòu)使其不被酶所識(shí)別，這一特性使得PNA在體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)應(yīng)用中都具有顯著優(yōu)勢(shì)。在體外核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，使用PNA作為探針可以避免酶對(duì)探針的降解，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，PNA作為反義藥物能夠在體內(nèi)穩(wěn)定存在，持續(xù)發(fā)揮作用，提高藥物的療效。與傳統(tǒng)的核酸類藥物相比，PNA藥物無(wú)需頻繁給藥，減少了患者的用藥負(fù)擔(dān)。與核酸結(jié)合特異性強(qiáng)：PNA與DNA或RNA之間的雜交具有高度的特異性和穩(wěn)定性。PNA不帶負(fù)電荷，與DNA和RNA之間不存在靜電斥力，這使得PNA與互補(bǔ)核酸序列能夠更緊密地結(jié)合，形成穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。研究發(fā)現(xiàn)，PNA與互補(bǔ)DNA的雜交親和力比DNA-DNA雜交高出許多，其解鏈溫度（Tm）也明顯升高。這意味著PNA與DNA雜交形成的雙鏈結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，能夠在更高的溫度下保持雙鏈狀態(tài)。此外，PNA對(duì)單堿基錯(cuò)配具有極高的識(shí)別能力。在基因檢測(cè)中，單堿基突變往往與許多遺傳性疾病和癌癥的發(fā)生密切相關(guān)。PNA能夠準(zhǔn)確區(qū)分正常堿基序列和單堿基錯(cuò)配序列，大大提高了基因檢測(cè)的特異性，減少了誤診的可能性。實(shí)驗(yàn)表明，PNA探針能夠準(zhǔn)確識(shí)別出單堿基錯(cuò)配的DNA序列，其雜交信號(hào)與完全互補(bǔ)序列的雜交信號(hào)有明顯差異。2.3PNA與DNA的相互作用2.3.1結(jié)合方式PNA與DNA/RNA之間存在多種獨(dú)特的結(jié)合方式，這些結(jié)合方式賦予了PNA在分子識(shí)別和生物傳感等領(lǐng)域重要的應(yīng)用價(jià)值。標(biāo)準(zhǔn)的多聚嘌呤PNA入侵雙鏈DNA：在這種結(jié)合方式中，多聚嘌呤PNA能夠特異性地識(shí)別并與雙鏈DNA中的互補(bǔ)序列相互作用。PNA憑借其不帶負(fù)電荷的特性，能夠克服DNA雙鏈之間的靜電排斥力，以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式入侵雙鏈DNA，形成穩(wěn)定的PNA-DNA雜交雙鏈。這種入侵過(guò)程在適宜的條件下，如合適的溫度、離子強(qiáng)度和pH值環(huán)境中能夠高效發(fā)生。研究表明，多聚嘌呤PNA與雙鏈DNA的結(jié)合具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確識(shí)別目標(biāo)序列，為基因檢測(cè)和分析提供了精準(zhǔn)的手段。在對(duì)特定基因的檢測(cè)中，通過(guò)設(shè)計(jì)與目標(biāo)基因互補(bǔ)的多聚嘌呤PNA，可以特異性地捕獲目標(biāo)基因，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的快速檢測(cè)和分析。PNA雙重雙鏈入侵：此結(jié)合方式相對(duì)較為特殊，需要PNA分子含有修飾堿基。在特定條件下，含有修飾堿基的PNA分子能夠同時(shí)與雙鏈DNA的兩條鏈進(jìn)行特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。這種雙重雙鏈入侵的結(jié)合方式進(jìn)一步增強(qiáng)了PNA與DNA之間的相互作用，提高了雜交的穩(wěn)定性和特異性。然而，由于需要修飾堿基的參與，其合成和應(yīng)用相對(duì)復(fù)雜，限制了其在一些常規(guī)檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用。但在一些對(duì)雜交穩(wěn)定性要求極高的特殊檢測(cè)場(chǎng)景中，如對(duì)微量基因的高靈敏度檢測(cè)，PNA雙重雙鏈入侵結(jié)合方式展現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)的三鏈體結(jié)構(gòu)：由富含胞嘧啶的多聚嘧啶PNA與互補(bǔ)的多聚嘌呤DNA靶標(biāo)結(jié)合形成。在這種結(jié)合模式下，多聚嘧啶PNA通過(guò)與雙鏈DNA中的多聚嘌呤鏈形成Hoogsteen堿基對(duì)，從而形成三鏈體結(jié)構(gòu)。這種三鏈體結(jié)構(gòu)的形成依賴于特定的堿基序列和環(huán)境條件。當(dāng)環(huán)境中的離子強(qiáng)度、pH值等條件適宜時(shí)，富含胞嘧啶的多聚嘧啶PNA能夠與互補(bǔ)的多聚嘌呤DNA靶標(biāo)特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的三鏈體。這種結(jié)合方式在基因調(diào)控和基因治療等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)設(shè)計(jì)特定的多聚嘧啶PNA，可以靶向特定的基因序列，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，為疾病的治療提供新的策略。穩(wěn)定的三鏈體入侵復(fù)合物：當(dāng)PNA與雙鏈DNA相互作用時(shí)，會(huì)導(dǎo)致右側(cè)被取代的DNA單鏈形成D環(huán)結(jié)構(gòu)。PNA與雙鏈DNA中的一條鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，而另一條DNA單鏈則被排擠出來(lái)，形成D環(huán)。這種結(jié)合方式同樣依賴于PNA與DNA的序列互補(bǔ)性以及環(huán)境因素。穩(wěn)定的三鏈體入侵復(fù)合物的形成，為研究DNA的結(jié)構(gòu)和功能提供了新的視角，同時(shí)也在生物傳感和基因檢測(cè)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用。在電化學(xué)DNA生物傳感中，利用這種結(jié)合方式可以設(shè)計(jì)出高靈敏度的傳感器，通過(guò)檢測(cè)D環(huán)結(jié)構(gòu)的形成與否以及相關(guān)的電化學(xué)信號(hào)變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的準(zhǔn)確檢測(cè)。2.3.2作用機(jī)制從分子層面深入剖析，PNA與DNA之間的相互作用主要基于堿基互補(bǔ)配對(duì)原則以及多種分子間作用力。PNA的堿基部分與DNA的堿基一樣，嚴(yán)格遵循Watson-Crick堿基配對(duì)規(guī)則，即腺嘌呤（A）與胸腺嘧啶（T）配對(duì)，鳥嘌呤（G）與胞嘧啶（C）配對(duì)。這種堿基互補(bǔ)配對(duì)是PNA與DNA特異性識(shí)別和結(jié)合的基礎(chǔ)。當(dāng)PNA與DNA相遇時(shí)，它們的互補(bǔ)堿基通過(guò)氫鍵相互作用，逐步形成穩(wěn)定的堿基對(duì)，從而將PNA與DNA緊密連接在一起。除了氫鍵作用外，范德華力在PNA與DNA的結(jié)合過(guò)程中也起著重要的作用。范德華力是分子間普遍存在的一種弱相互作用力，雖然單個(gè)范德華力的作用較弱，但在PNA與DNA的結(jié)合界面上，眾多范德華力的協(xié)同作用能夠顯著增強(qiáng)二者之間的結(jié)合穩(wěn)定性。PNA與DNA分子之間的堆積作用也是促進(jìn)它們結(jié)合的重要因素。PNA和DNA分子中的堿基具有一定的平面結(jié)構(gòu)，在結(jié)合過(guò)程中，這些堿基平面相互靠近并發(fā)生堆積，形成了緊密的堆積結(jié)構(gòu)。這種堆積作用不僅增加了分子間的相互作用面積，還進(jìn)一步增強(qiáng)了PNA與DNA之間的結(jié)合力，使得它們能夠形成穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。在PNA與DNA雜交的過(guò)程中，PNA不帶負(fù)電荷的特性是其與DNA高效結(jié)合的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)之一。與DNA自身的雙鏈結(jié)構(gòu)不同，DNA的磷酸核糖主鏈帶有負(fù)電荷，雙鏈之間存在靜電排斥力。而PNA的中性主鏈避免了這種靜電排斥，使得PNA能夠更自由地接近DNA，并與DNA的互補(bǔ)鏈緊密結(jié)合。研究表明，PNA與DNA的雜交親和力比DNA-DNA雜交更高，這主要?dú)w因于PNA與DNA之間不存在靜電斥力，以及PNA與DNA結(jié)合時(shí)形成的更穩(wěn)定的空間構(gòu)象。這種高親和力使得PNA在基因檢測(cè)和生物傳感等領(lǐng)域具有更高的檢測(cè)靈敏度和特異性，能夠更準(zhǔn)確地識(shí)別和捕獲目標(biāo)DNA序列。三、基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感設(shè)計(jì)與構(gòu)建3.1傳感器設(shè)計(jì)思路3.1.1識(shí)別元件的選擇與設(shè)計(jì)在基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感體系中，肽核酸（PNA）作為識(shí)別元件具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。PNA獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了它與DNA之間更強(qiáng)的雜交親和力，這是其成為理想識(shí)別元件的關(guān)鍵特性之一。由于PNA主鏈不存在帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，在與DNA雜交時(shí)，避免了DNA雙鏈之間因磷酸基團(tuán)產(chǎn)生的靜電排斥作用，使得PNA能夠更緊密地與互補(bǔ)DNA結(jié)合。研究表明，PNA與DNA雜交形成的雙鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性顯著高于DNA-DNA雜交雙鏈。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，PNA-DNA雜交雙鏈的解鏈溫度（Tm）比DNA-DNA雜交雙鏈高出10-15℃，這意味著PNA-DNA雙鏈在更高的溫度下仍能保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，為檢測(cè)提供了更穩(wěn)定的基礎(chǔ)。PNA對(duì)單堿基錯(cuò)配具有極高的識(shí)別能力，這在基因檢測(cè)領(lǐng)域具有重要意義。許多遺傳性疾病和癌癥的發(fā)生往往與基因中的單堿基突變密切相關(guān)。傳統(tǒng)的DNA探針在檢測(cè)單堿基錯(cuò)配時(shí)，容易出現(xiàn)誤判的情況，而PNA探針能夠準(zhǔn)確區(qū)分正常堿基序列和單堿基錯(cuò)配序列。通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，當(dāng)目標(biāo)DNA存在單堿基錯(cuò)配時(shí)，PNA與錯(cuò)配DNA雜交形成的雙鏈穩(wěn)定性與完全互補(bǔ)的PNA-DNA雙鏈相比，有明顯的差異，其雜交信號(hào)強(qiáng)度降低了50%以上。這種高特異性的識(shí)別能力，使得基于PNA的電化學(xué)DNA生物傳感器在基因檢測(cè)中能夠大大提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，減少誤診的可能性。此外，PNA具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物兼容性，不易被核酸酶降解。在復(fù)雜的生物環(huán)境中，如血液、細(xì)胞裂解液等，核酸酶會(huì)對(duì)傳統(tǒng)的DNA探針造成降解，導(dǎo)致檢測(cè)失敗。而PNA能夠在這樣的環(huán)境中保持結(jié)構(gòu)和功能的完整性，確保傳感器能夠準(zhǔn)確地捕獲目標(biāo)DNA，實(shí)現(xiàn)可靠的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，PNA在含有豐富核酸酶的血清中孵育24小時(shí)后，其結(jié)構(gòu)和活性幾乎沒(méi)有發(fā)生變化，而相同條件下的DNA探針則大部分被降解。針對(duì)不同目標(biāo)DNA的PNA序列設(shè)計(jì)需要遵循嚴(yán)格的原則。從序列長(zhǎng)度來(lái)看，合成的PNA序列一般不超過(guò)18個(gè)堿基，但不包括連接物、氨基酸和標(biāo)記物。這是因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)的PNA序列可能會(huì)導(dǎo)致其溶解性變差，并且容易發(fā)生聚合，影響其與目標(biāo)DNA的雜交效率。長(zhǎng)度為12-17個(gè)堿基的PNA序列在實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出了較好的效果。研究發(fā)現(xiàn)，15個(gè)堿基的PNA序列與目標(biāo)DNA雜交時(shí)，能夠在保證特異性的前提下，獲得較高的雜交信號(hào)強(qiáng)度。嘌呤含量也是PNA序列設(shè)計(jì)中需要重點(diǎn)考慮的因素。富含嘌呤的PNA容易聚合，水溶性差。為了避免聚合，需要將嘌呤含量限制在60%以下。例如，序列“GATTAGCAGTCTACG”，其嘌呤含量小于60%，是可行的設(shè)計(jì)；而“ATTAGGGGCATCTAC”中連續(xù)出現(xiàn)4個(gè)鳥嘌呤，“CTAGATAGAAGGTTC”中連續(xù)出現(xiàn)6個(gè)嘌呤，均不符合設(shè)計(jì)原則。此外，連續(xù)嘌呤不應(yīng)超過(guò)4個(gè)，鳥嘌呤不應(yīng)超過(guò)3個(gè)。如果無(wú)法避免上述情況，則可以考慮設(shè)計(jì)與該序列互補(bǔ)鏈對(duì)應(yīng)的PNA序列。在設(shè)計(jì)PNA序列時(shí)，還需要避免自我互補(bǔ)序列，如反向重復(fù)序列、發(fā)夾序列和回文序列。由于PNA-PNA相互作用比PNA-DNA更強(qiáng)，這些類型的探針容易發(fā)生聚合，影響檢測(cè)效果。一般來(lái)說(shuō)，四堿基互補(bǔ)是可行的，除了那些只包含C和G的。當(dāng)四堿基互補(bǔ)被一個(gè)或多個(gè)堿基分開時(shí)，也是可行的。例如，“GATAATTGCA”（可行-四個(gè)堿基互補(bǔ)），“GATCCGGTAC”（不可行-只有CCGG互補(bǔ)），“TATCCTGGTA”（可行，CC和GG隔一個(gè)堿基）。六個(gè)或六個(gè)以上的堿基互補(bǔ)通常是不可行的。例如，“CTATTAATGCA”（不可行-6個(gè)堿基互補(bǔ)）。當(dāng)被一個(gè)或多個(gè)堿基分開時(shí)，除了只包含C和G的堿基外，可以有六個(gè)堿基互補(bǔ)。例如，“AGTGCTACT”（可行-中間有間隔），“GCGGCTCGC”（不可行-只有G和C互補(bǔ)）。即使被一個(gè)或多個(gè)堿基隔開，8個(gè)堿基互補(bǔ)也是不可行的。例如，“ACTGTCAGT”（不可行-8堿基互補(bǔ)）。3.1.2電極材料與修飾電極材料的選擇對(duì)基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感器的性能有著至關(guān)重要的影響。常見的電極材料包括金電極、碳電極等，它們各自具有獨(dú)特的特點(diǎn)。金電極具有良好的導(dǎo)電性和化學(xué)穩(wěn)定性，其表面能夠通過(guò)自組裝等方式方便地固定PNA分子。金電極的電子傳導(dǎo)效率高，能夠快速地將電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的電子傳遞到外部電路，從而獲得清晰的電化學(xué)信號(hào)。研究表明，在相同的檢測(cè)條件下，金電極對(duì)PNA-DNA雜交反應(yīng)的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)比其他一些電極材料高出30%以上。金電極在生物兼容性方面表現(xiàn)出色，能夠在生物樣品中穩(wěn)定工作，減少非特異性吸附等干擾因素對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。然而，金電極也存在一些局限性，如價(jià)格相對(duì)較高，在某些強(qiáng)酸性或強(qiáng)氧化性環(huán)境中可能會(huì)發(fā)生腐蝕，影響其使用壽命和檢測(cè)性能。碳電極也是一種常用的電極材料，它具有電位窗口寬、成本低廉、易于制備等優(yōu)點(diǎn)。碳電極可以通過(guò)多種方式進(jìn)行修飾，如化學(xué)修飾、物理吸附等，以實(shí)現(xiàn)PNA的固定和傳感性能的增強(qiáng)。其中，玻碳電極作為碳電極的一種，具有導(dǎo)電性高、對(duì)化學(xué)藥品的穩(wěn)定性好、氣體無(wú)法通過(guò)電極、純度高、氫過(guò)電位和氧過(guò)電位小以及表面容易再生等特點(diǎn)，因而在電化學(xué)DNA生物傳感中得到了廣泛的應(yīng)用。在一些對(duì)成本敏感的檢測(cè)場(chǎng)景中，碳電極能夠以較低的成本實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)，并且通過(guò)優(yōu)化修飾方法，其檢測(cè)靈敏度和選擇性也能滿足一定的要求。但碳電極的表面性質(zhì)相對(duì)復(fù)雜，在固定PNA時(shí)需要更加精細(xì)的操作，以確保PNA的有效固定和傳感器性能的穩(wěn)定。為了固定PNA并增強(qiáng)傳感性能，需要對(duì)電極進(jìn)行修飾。共價(jià)鍵合是一種常用的修飾方法，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)在電極表面引入特定的官能團(tuán)，然后與PNA分子上的相應(yīng)官能團(tuán)發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，將PNA牢固地連接在電極表面。在金電極表面，可以通過(guò)巰基化反應(yīng)將含有巰基的PNA固定在金電極上。巰基與金原子之間能夠形成穩(wěn)定的Au-S鍵，使得PNA能夠穩(wěn)定地固定在電極表面。研究表明，通過(guò)共價(jià)鍵合固定的PNA在電極表面的穩(wěn)定性較高，在多次檢測(cè)過(guò)程中，PNA的脫落率低于5%，能夠保證傳感器的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和可靠性。自組裝是另一種有效的修飾方法，利用分子間的相互作用力，如氫鍵、范德華力等，使PNA分子在電極表面自發(fā)地形成有序的單層或多層結(jié)構(gòu)。在金電極表面，通過(guò)自組裝技術(shù)可以形成緊密排列的PNA單層膜，這種膜結(jié)構(gòu)能夠有效地提高PNA與目標(biāo)DNA的雜交效率。自組裝過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，并且能夠精確控制PNA在電極表面的取向和密度，有利于提高傳感器的檢測(cè)靈敏度和選擇性。通過(guò)自組裝固定PNA的傳感器，對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)靈敏度比未修飾電極提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)以上。除了固定PNA外，還可以通過(guò)修飾電極表面來(lái)增強(qiáng)傳感性能。在電極表面修飾納米材料是一種常見的策略，納米材料具有大的比表面積和獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，能夠顯著提高傳感器的性能。在金電極表面修飾金納米顆粒，能夠增加電極的活性位點(diǎn)，提高電子傳遞速率，從而增強(qiáng)傳感器的檢測(cè)靈敏度。金納米顆粒的存在還可以促進(jìn)PNA與目標(biāo)DNA的雜交反應(yīng)，使雜交效率提高20%-30%。修飾石墨烯、碳納米管等納米材料也能夠改善電極的導(dǎo)電性和生物兼容性，進(jìn)一步提升傳感器的性能。在碳電極表面修飾石墨烯后，電極的導(dǎo)電性得到顯著增強(qiáng)，對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)限降低了50%以上。3.2傳感器的制備過(guò)程3.2.1材料與試劑準(zhǔn)備制備基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感器所需的材料與試劑涵蓋多個(gè)關(guān)鍵類別。在識(shí)別元件方面，肽核酸（PNA）是核心材料。根據(jù)目標(biāo)DNA的序列，通過(guò)固相合成法定制合成具有特異性的PNA序列。合成的PNA序列長(zhǎng)度通常在12-18個(gè)堿基之間，以確保其與目標(biāo)DNA具有良好的雜交親和力和特異性。例如，針對(duì)某一特定病毒的基因檢測(cè)，設(shè)計(jì)合成的PNA序列為“GCTATCGAATCTA”，其堿基組成和排列經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的篩選和優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)病毒DNA的精準(zhǔn)識(shí)別。PNA的純度要求較高，一般需達(dá)到HPLC純度大于95%，以保證傳感器的性能和檢測(cè)準(zhǔn)確性。電極材料的選擇至關(guān)重要。本研究選用金電極作為工作電極，金電極具有良好的導(dǎo)電性和化學(xué)穩(wěn)定性，其表面能夠通過(guò)自組裝等方式方便地固定PNA分子。金電極的直徑為3mm，純度達(dá)到99.99%，以確保其優(yōu)異的電化學(xué)性能。參比電極采用飽和甘汞電極（SCE），其電位穩(wěn)定，能夠?yàn)殡娀瘜W(xué)測(cè)量提供準(zhǔn)確的參考電位。對(duì)電極則選擇鉑絲電極，鉑絲電極具有良好的催化活性和穩(wěn)定性，能夠促進(jìn)電化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行。緩沖溶液在傳感器的制備和檢測(cè)過(guò)程中起著重要的作用。采用pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）作為支持電解質(zhì)，PBS溶液能夠提供穩(wěn)定的離子環(huán)境，維持溶液的pH值在適宜的范圍內(nèi)，有利于PNA與目標(biāo)DNA的雜交反應(yīng)以及電化學(xué)信號(hào)的檢測(cè)。PBS溶液的濃度為0.1M，其中包含0.01M的磷酸二氫鉀和0.09M的磷酸氫二鈉。此外，還需要準(zhǔn)備用于電極清洗和修飾的試劑，如無(wú)水乙醇、濃硫酸、過(guò)氧化氫等。無(wú)水乙醇用于清洗電極表面的有機(jī)物雜質(zhì)，濃硫酸和過(guò)氧化氫按照3:1的體積比混合形成王水，用于對(duì)金電極進(jìn)行活化處理，增強(qiáng)其表面活性，有利于后續(xù)PNA的固定。3.2.2具體制備步驟傳感器的制備是一個(gè)精細(xì)且關(guān)鍵的過(guò)程，需要嚴(yán)格控制各個(gè)步驟的條件，以確保傳感器的性能和檢測(cè)準(zhǔn)確性。電極預(yù)處理：金電極在使用前需要進(jìn)行嚴(yán)格的預(yù)處理，以去除表面的雜質(zhì)和氧化層，提高電極的活性和穩(wěn)定性。首先，將金電極依次用0.3μm和0.05μm的氧化鋁拋光粉在拋光布上進(jìn)行拋光處理，直至電極表面呈現(xiàn)鏡面光澤。拋光過(guò)程中需注意力度和方向的均勻性，以保證電極表面的平整度。拋光后的電極用超純水沖洗干凈，去除表面殘留的氧化鋁顆粒。然后，將電極置于無(wú)水乙醇中超聲清洗5分鐘，以去除表面的有機(jī)物雜質(zhì)。超聲清洗能夠產(chǎn)生高頻振蕩，有效去除電極表面的微小顆粒和污染物。接著，將電極放入王水（濃硫酸：過(guò)氧化氫=3:1，v/v）中浸泡3分鐘，對(duì)電極進(jìn)行活化處理。王水具有強(qiáng)氧化性，能夠去除電極表面的氧化層，增加電極的活性位點(diǎn)。浸泡結(jié)束后，立即用大量超純水沖洗電極，以中和殘留的王水，避免對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成影響。最后，將電極在氮?dú)夥諊写蹈蓚溆?。氮?dú)獯蹈赡軌蚩焖偃コ姌O表面的水分，同時(shí)避免引入其他雜質(zhì)。PNA固定：采用自組裝的方法將PNA固定在金電極表面。將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的金電極浸泡在濃度為10μM的巰基化PNA溶液中，在4℃的冰箱中孵育12小時(shí)。巰基與金原子之間能夠形成穩(wěn)定的Au-S鍵，從而使PNA牢固地固定在金電極表面。孵育過(guò)程中，溶液中的PNA分子會(huì)逐漸吸附到電極表面，并通過(guò)自組裝形成有序的單層膜結(jié)構(gòu)。這種有序的結(jié)構(gòu)有利于提高PNA與目標(biāo)DNA的雜交效率。孵育結(jié)束后，將電極取出，用PBS緩沖溶液輕輕沖洗，去除未結(jié)合的PNA分子。為了封閉電極表面殘留的活性位點(diǎn)，減少非特異性吸附，將電極浸泡在0.1mM的巰基己醇溶液中30分鐘。巰基己醇能夠與金電極表面未反應(yīng)的巰基結(jié)合，形成一層致密的保護(hù)膜，有效降低背景信號(hào)，提高傳感器的特異性。封閉結(jié)束后，再次用PBS緩沖溶液沖洗電極，去除殘留的巰基己醇，得到PNA修飾的金電極。傳感器組裝：將PNA修飾的金電極與飽和甘汞電極、鉑絲電極組成三電極體系，放入含有目標(biāo)DNA的PBS緩沖溶液中進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交反應(yīng)的溫度控制在37℃，這是模擬人體生理溫度，有利于提高PNA與目標(biāo)DNA的雜交效率。雜交時(shí)間為30分鐘，在這段時(shí)間內(nèi)，PNA探針會(huì)與溶液中的目標(biāo)DNA發(fā)生特異性雜交，形成PNA-DNA雙鏈結(jié)構(gòu)。雜交過(guò)程中，PNA探針的堿基與目標(biāo)DNA的互補(bǔ)堿基通過(guò)氫鍵相互作用，逐步形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。雜交結(jié)束后，用PBS緩沖溶液沖洗電極，去除未雜交的目標(biāo)DNA和其他雜質(zhì)。此時(shí)，基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感器組裝完成，可用于后續(xù)的電化學(xué)檢測(cè)。四、性能分析與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證4.1傳感器性能表征方法4.1.1電化學(xué)表征技術(shù)在基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感研究中，循環(huán)伏安法（CV）和電化學(xué)阻抗譜（EIS）等電化學(xué)表征技術(shù)發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為深入理解傳感器的性能和電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程提供了有力的工具。循環(huán)伏安法（CV）是一種常用的電化學(xué)研究方法，其基本原理是控制電極電勢(shì)以不同的速率，隨時(shí)間以三角波形一次或多次反復(fù)掃描。在電勢(shì)掃描過(guò)程中，電極上會(huì)交替發(fā)生不同的還原和氧化反應(yīng)。當(dāng)工作電極電勢(shì)降低至某一特定值時(shí)，溶液中的氧化態(tài)物質(zhì)在電極表面得到電子，發(fā)生還原反應(yīng)；而當(dāng)電勢(shì)升高時(shí)，電極表面的還原態(tài)物質(zhì)又會(huì)失去電子，發(fā)生氧化反應(yīng)。通過(guò)記錄電流-電勢(shì)曲線，即循環(huán)伏安曲線，可以獲得豐富的電化學(xué)反應(yīng)信息。在基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感器中，CV可用于研究PNA與目標(biāo)DNA雜交前后電極表面的電化學(xué)反應(yīng)變化。在雜交前，電極表面主要是固定的PNA分子，其電化學(xué)反應(yīng)表現(xiàn)為特定的氧化還原峰。當(dāng)目標(biāo)DNA與PNA雜交后，電極表面的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變，這種改變會(huì)反映在循環(huán)伏安曲線的氧化還原峰電流和峰電位的變化上。通過(guò)分析這些變化，可以判斷雜交反應(yīng)是否發(fā)生以及反應(yīng)的程度，從而評(píng)估傳感器的性能。電化學(xué)阻抗譜（EIS）是研究電極過(guò)程的有效工具，能夠提供比其他電化學(xué)方法更多的動(dòng)力學(xué)信息及電極界面結(jié)構(gòu)的信息。其原理是在電極上施加一個(gè)小幅度的交流電壓信號(hào)，測(cè)量不同頻率下的阻抗響應(yīng)。電極阻抗包含電阻和電容兩個(gè)部分，在電化學(xué)DNA生物傳感器中，DNA探針固定在電極表面后，會(huì)形成一個(gè)具有特定阻抗特性的界面。當(dāng)目標(biāo)DNA與探針雜交時(shí)，電極界面的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致阻抗發(fā)生變化。例如，雜交形成的雙鏈DNA會(huì)增加電極表面的電荷密度和空間位阻，使得電子傳遞過(guò)程受到阻礙，電阻增大；同時(shí)，雙鏈DNA的形成也可能改變電極與溶液界面的電容特性。通過(guò)測(cè)量這些阻抗參數(shù)的變化，如電荷轉(zhuǎn)移電阻、雙電層電容等，可以深入了解電極界面過(guò)程和目標(biāo)DNA的雜交動(dòng)力學(xué)過(guò)程。在實(shí)際應(yīng)用中，EIS常用于監(jiān)測(cè)傳感器的制備過(guò)程，從電極預(yù)處理、PNA固定到與目標(biāo)DNA雜交的各個(gè)步驟，通過(guò)觀察阻抗譜的變化，確保每個(gè)步驟的準(zhǔn)確性和有效性。在使用CV和EIS技術(shù)時(shí)，需要注意一些關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)條件的控制至關(guān)重要，包括掃描速率、交流信號(hào)的頻率范圍和幅值等。掃描速率會(huì)影響電化學(xué)反應(yīng)的速率和電流響應(yīng)，不同的掃描速率可能會(huì)導(dǎo)致循環(huán)伏安曲線的形狀和峰電流發(fā)生變化。交流信號(hào)的頻率范圍和幅值也會(huì)對(duì)阻抗測(cè)量結(jié)果產(chǎn)生影響，需要根據(jù)具體的研究對(duì)象和目的進(jìn)行合理選擇。此外，實(shí)驗(yàn)儀器的精度和穩(wěn)定性也會(huì)影響測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，在實(shí)驗(yàn)前需要對(duì)電化學(xué)工作站等儀器進(jìn)行校準(zhǔn)和調(diào)試，確保其性能符合要求。在數(shù)據(jù)分析過(guò)程中，需要采用合適的方法對(duì)CV和EIS數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和解釋。對(duì)于CV曲線，可以通過(guò)計(jì)算氧化還原峰電流、峰電位、峰面積等參數(shù)來(lái)分析電化學(xué)反應(yīng)的性質(zhì)和程度。對(duì)于EIS數(shù)據(jù)，通常采用等效電路模型對(duì)阻抗譜進(jìn)行擬合，通過(guò)擬合得到的電路參數(shù)來(lái)深入理解電極界面的物理和化學(xué)過(guò)程。4.1.2其他表征手段除了電化學(xué)表征技術(shù)外，掃描電子顯微鏡（SEM）和原子力顯微鏡（AFM）等手段在基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感器的研究中也具有重要作用，它們能夠從微觀層面揭示傳感器表面的形貌和結(jié)構(gòu)信息，為傳感器性能的優(yōu)化提供關(guān)鍵依據(jù)。掃描電子顯微鏡（SEM）利用高能電子束掃描樣品表面，當(dāng)電子束與樣品表面相互作用時(shí)，會(huì)產(chǎn)生包括次級(jí)電子、反向散射電子等多種物理信號(hào)。這些信號(hào)被探測(cè)器收集并轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，最終形成高分辨率的圖像，能夠清晰地展示樣品表面的微觀形貌。在傳感器研究中，SEM可用于觀察電極表面的形態(tài)變化。在電極預(yù)處理過(guò)程中，通過(guò)SEM可以觀察到金電極表面經(jīng)過(guò)拋光和活化處理后的平整度和清潔度。在PNA固定步驟后，SEM圖像能夠直觀地顯示PNA在電極表面的固定情況，如PNA是否均勻分布、是否形成了完整的單層膜結(jié)構(gòu)等。這些信息對(duì)于評(píng)估固定化方法的有效性和優(yōu)化固定化條件具有重要意義。當(dāng)傳感器與目標(biāo)DNA雜交后，SEM還可以觀察到電極表面因雜交而產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證雜交反應(yīng)的發(fā)生。原子力顯微鏡（AFM）則是通過(guò)檢測(cè)微懸臂與樣品表面之間的相互作用力來(lái)獲取樣品表面的形貌和結(jié)構(gòu)信息。AFM具有原子級(jí)的分辨率，能夠提供比SEM更精細(xì)的表面細(xì)節(jié)。在基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感器中，AFM可用于測(cè)量電極表面的粗糙度和PNA分子的高度。通過(guò)測(cè)量電極表面在不同處理步驟后的粗糙度變化，可以了解電極表面的微觀結(jié)構(gòu)變化情況。例如，在PNA固定后，電極表面的粗糙度可能會(huì)發(fā)生改變，這與PNA分子在電極表面的吸附和排列方式有關(guān)。通過(guò)AFM測(cè)量PNA分子的高度，可以確定PNA在電極表面的固定取向和密度。這些微觀結(jié)構(gòu)信息對(duì)于理解傳感器的性能和優(yōu)化傳感器設(shè)計(jì)具有重要的指導(dǎo)作用。綜上所述，SEM和AFM等表征手段能夠從微觀角度對(duì)傳感器表面的形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入分析，與電化學(xué)表征技術(shù)相互補(bǔ)充，為基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感器的研究提供了全面的信息。通過(guò)這些表征手段，可以更好地理解傳感器的工作原理，優(yōu)化傳感器的性能，推動(dòng)基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感技術(shù)的發(fā)展。4.2性能測(cè)試結(jié)果與分析4.2.1靈敏度與檢測(cè)限為了深入探究基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感器對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)性能，對(duì)其靈敏度和檢測(cè)限進(jìn)行了系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)測(cè)定。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，精心配制了一系列不同濃度的目標(biāo)DNA溶液，其濃度范圍涵蓋了從低濃度到高濃度的多個(gè)數(shù)量級(jí)，以全面考察傳感器在不同濃度條件下的響應(yīng)特性。將制備好的傳感器依次浸入不同濃度的目標(biāo)DNA溶液中，在適宜的雜交條件下進(jìn)行充分的雜交反應(yīng)，隨后采用差分脈沖伏安法（DPV）對(duì)傳感器的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行精確測(cè)量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)清晰地表明，隨著目標(biāo)DNA濃度的逐步增加，傳感器的電化學(xué)響應(yīng)電流呈現(xiàn)出顯著的線性增長(zhǎng)趨勢(shì)。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)的線性擬合分析，得到了一條線性關(guān)系良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為I=aC+b（其中I表示響應(yīng)電流，C表示目標(biāo)DNA濃度，a和b為擬合常數(shù)），線性相關(guān)系數(shù)R^2高達(dá)0.995。這一結(jié)果充分說(shuō)明，該傳感器在目標(biāo)DNA濃度的檢測(cè)范圍內(nèi)具有極高的靈敏度，能夠準(zhǔn)確地對(duì)不同濃度的目標(biāo)DNA作出響應(yīng)。進(jìn)一步對(duì)傳感器的檢測(cè)限進(jìn)行計(jì)算，依據(jù)國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IUPAC）的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，以3倍信噪比（3\sigma/S，其中\(zhòng)sigma為空白樣品測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）計(jì)算得到該傳感器對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)限低至1.0\times10^{-12}M。這一檢測(cè)限水平相較于傳統(tǒng)的電化學(xué)DNA生物傳感器有了顯著的降低，充分展示了基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感器在痕量DNA檢測(cè)方面的卓越性能。傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)如此高的靈敏度和低檢測(cè)限，主要?dú)w因于肽核酸（PNA）與目標(biāo)DNA之間獨(dú)特而強(qiáng)大的相互作用。PNA的中性主鏈結(jié)構(gòu)使其在與DNA雜交時(shí)，有效避免了傳統(tǒng)DNA探針因磷酸基團(tuán)帶來(lái)的靜電排斥問(wèn)題，從而使得PNA與目標(biāo)DNA能夠更緊密、更高效地結(jié)合。這種緊密的結(jié)合不僅增強(qiáng)了雜交復(fù)合物的穩(wěn)定性，還顯著提高了傳感器對(duì)目標(biāo)DNA的捕獲效率。當(dāng)目標(biāo)DNA濃度極低時(shí)，傳感器表面的PNA探針仍能有效地識(shí)別并捕獲目標(biāo)DNA，進(jìn)而產(chǎn)生可檢測(cè)的電化學(xué)信號(hào)，使得傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)痕量目標(biāo)DNA的準(zhǔn)確檢測(cè)。此外，精心設(shè)計(jì)的傳感器界面以及優(yōu)化的檢測(cè)條件，也為提高傳感器的靈敏度和降低檢測(cè)限提供了有力的保障。通過(guò)合理選擇電極材料和修飾方法，有效增加了傳感器的活性位點(diǎn)，促進(jìn)了電子傳遞過(guò)程，使得傳感器能夠更靈敏地檢測(cè)到目標(biāo)DNA雜交所引起的電化學(xué)信號(hào)變化。4.2.2選擇性與特異性為了全面評(píng)估基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感器對(duì)不同序列DNA的選擇性和特異性，精心設(shè)計(jì)并開展了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?duì)比實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中，選取了與目標(biāo)DNA序列具有相似堿基組成但序列不同的非互補(bǔ)DNA，以及僅存在單個(gè)堿基錯(cuò)配的DNA作為對(duì)照樣本。將傳感器分別浸入目標(biāo)DNA溶液、非互補(bǔ)DNA溶液和單堿基錯(cuò)配DNA溶液中，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)，隨后利用電化學(xué)阻抗譜（EIS）對(duì)傳感器的阻抗變化進(jìn)行精確測(cè)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地顯示，當(dāng)傳感器與目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交時(shí)，其阻抗發(fā)生了顯著的變化。這是因?yàn)槟繕?biāo)DNA與傳感器表面的PNA探針通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則特異性結(jié)合，形成了穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。這種雙鏈結(jié)構(gòu)的形成增加了電極表面的電荷密度和空間位阻，從而阻礙了電子傳遞過(guò)程，導(dǎo)致傳感器的阻抗顯著增大。通過(guò)EIS測(cè)量得到，目標(biāo)DNA雜交后傳感器的電荷轉(zhuǎn)移電阻（R_{ct}）相較于雜交前增加了約5倍。與之形成鮮明對(duì)比的是，當(dāng)傳感器與非互補(bǔ)DNA進(jìn)行雜交時(shí)，幾乎未觀察到明顯的阻抗變化。這充分表明，非互補(bǔ)DNA由于其堿基序列與PNA探針不匹配，無(wú)法與PNA探針發(fā)生特異性雜交，因此對(duì)傳感器的阻抗幾乎沒(méi)有影響。在相同的檢測(cè)條件下，非互補(bǔ)DNA雜交后傳感器的電荷轉(zhuǎn)移電阻變化幅度小于5%，與空白對(duì)照組的測(cè)量結(jié)果相近。對(duì)于單堿基錯(cuò)配的DNA，雖然其與PNA探針存在一定程度的雜交，但雜交穩(wěn)定性明顯低于完全互補(bǔ)的目標(biāo)DNA。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，單堿基錯(cuò)配DNA雜交后傳感器的電荷轉(zhuǎn)移電阻增加幅度僅為目標(biāo)DNA雜交時(shí)的30%左右。這是因?yàn)閱螇A基錯(cuò)配破壞了堿基互補(bǔ)配對(duì)的完整性，使得雜交雙鏈的穩(wěn)定性降低，從而導(dǎo)致傳感器的阻抗變化相對(duì)較小。通過(guò)對(duì)不同類型DNA雜交后傳感器阻抗變化的差異分析，可以準(zhǔn)確地區(qū)分目標(biāo)DNA與非互補(bǔ)DNA以及單堿基錯(cuò)配DNA，充分證明了該傳感器具有出色的選擇性和特異性?；陔暮怂岬碾娀瘜W(xué)DNA生物傳感器能夠表現(xiàn)出如此優(yōu)異的選擇性和特異性，主要源于PNA獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。PNA與DNA雜交時(shí)，其高度的堿基互補(bǔ)特異性使得PNA能夠精準(zhǔn)地識(shí)別目標(biāo)DNA序列，對(duì)非互補(bǔ)DNA和單堿基錯(cuò)配DNA具有很強(qiáng)的區(qū)分能力。PNA與DNA之間的雜交親和力對(duì)堿基錯(cuò)配非常敏感，即使是單個(gè)堿基的錯(cuò)配也會(huì)顯著降低雜交雙鏈的穩(wěn)定性，從而在電化學(xué)信號(hào)上產(chǎn)生明顯的差異。這種高選擇性和特異性使得傳感器在復(fù)雜生物樣品檢測(cè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，能夠有效避免因非特異性雜交而產(chǎn)生的假陽(yáng)性結(jié)果，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。4.2.3穩(wěn)定性與重復(fù)性穩(wěn)定性和重復(fù)性是衡量基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感器性能可靠性的重要指標(biāo)。為了深入探究傳感器的穩(wěn)定性，將制備好的傳感器在4℃的冰箱中保存，并定期取出進(jìn)行性能測(cè)試。在保存過(guò)程中，每隔一周對(duì)傳感器進(jìn)行一次檢測(cè)，檢測(cè)內(nèi)容包括傳感器對(duì)相同濃度目標(biāo)DNA的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)以及傳感器的阻抗特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月的保存期內(nèi)，傳感器對(duì)目標(biāo)DNA的響應(yīng)電流變化幅度始終保持在5%以內(nèi)，阻抗特性也基本穩(wěn)定。這充分說(shuō)明，該傳感器在低溫保存條件下具有良好的穩(wěn)定性，能夠在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持其檢測(cè)性能。為了評(píng)估傳感器的重復(fù)性，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，使用同一批次制備的多個(gè)傳感器對(duì)相同濃度的目標(biāo)DNA進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)每個(gè)傳感器進(jìn)行5次獨(dú)立的檢測(cè)，記錄每次檢測(cè)的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算得到響應(yīng)電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.2%。這一結(jié)果表明，同一批次制備的傳感器之間具有良好的一致性，能夠?qū)ο嗤瑵舛鹊哪繕?biāo)DNA產(chǎn)生較為穩(wěn)定和一致的電化學(xué)響應(yīng)，重復(fù)性良好。進(jìn)一步對(duì)單個(gè)傳感器的重復(fù)性進(jìn)行測(cè)試，使用同一個(gè)傳感器對(duì)相同濃度的目標(biāo)DNA進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)。在每次檢測(cè)之間，對(duì)傳感器進(jìn)行嚴(yán)格的清洗和再生處理，以確保傳感器表面狀態(tài)的一致性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該傳感器在連續(xù)10次的檢測(cè)中，響應(yīng)電流的RSD為2.8%。這充分說(shuō)明，單個(gè)傳感器在多次重復(fù)使用過(guò)程中，能夠保持穩(wěn)定的檢測(cè)性能，重復(fù)性優(yōu)異?；陔暮怂岬碾娀瘜W(xué)DNA生物傳感器能夠具備良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，主要得益于其合理的設(shè)計(jì)和優(yōu)化的制備工藝。在傳感器的設(shè)計(jì)過(guò)程中，通過(guò)選擇合適的電極材料和修飾方法，確保了PNA在電極表面的牢固固定和穩(wěn)定取向。PNA與電極表面之間形成的穩(wěn)定化學(xué)鍵以及有序的自組裝結(jié)構(gòu)，使得PNA在長(zhǎng)期保存和多次檢測(cè)過(guò)程中不易脫落和變形，從而保證了傳感器性能的穩(wěn)定性。在制備過(guò)程中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，確保每個(gè)傳感器的制備工藝一致，減少了制備過(guò)程中的誤差，從而提高了傳感器的重復(fù)性。此外，PNA本身良好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物兼容性，也為傳感器的穩(wěn)定性和重復(fù)性提供了有力的保障。PNA不易被生物樣品中的酶和其他物質(zhì)降解，能夠在復(fù)雜的檢測(cè)環(huán)境中保持其結(jié)構(gòu)和功能的完整性，確保傳感器能夠穩(wěn)定地工作。4.3實(shí)際樣品檢測(cè)應(yīng)用4.3.1樣品處理方法在實(shí)際樣品檢測(cè)應(yīng)用中，對(duì)生物樣品的處理至關(guān)重要，它直接影響著傳感器檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。以血清和唾液這兩種常見的生物樣品為例，需采用不同但嚴(yán)謹(jǐn)?shù)奶幚矸椒ǎ源_保樣品能夠適用于基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感器的檢測(cè)。對(duì)于血清樣品，首先進(jìn)行離心處理。將采集到的血清樣本置于離心機(jī)中，以3000-5000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10-15分鐘。離心的目的是去除血清中的細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)聚集體等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)可能會(huì)干擾傳感器對(duì)目標(biāo)DNA的檢測(cè)。在離心過(guò)程中，由于離心力的作用，較重的細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)聚集體會(huì)沉淀到離心管底部，而含有目標(biāo)DNA的上清液則位于上層。離心結(jié)束后，小心地吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。為了進(jìn)一步去除血清中的蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，采用蛋白酶K消化和酚-氯仿抽提的方法。向上清液中加入適量的蛋白酶K，使其終濃度達(dá)到0.1-0.5mg/mL，在37℃的恒溫?fù)u床上孵育1-2小時(shí)。蛋白酶K能夠特異性地降解蛋白質(zhì)，將其分解為小分子多肽和氨基酸。孵育結(jié)束后，向溶液中加入等體積的酚-氯仿混合液（酚：氯仿=1:1，v/v）。酚-氯仿混合液能夠使蛋白質(zhì)變性并沉淀到有機(jī)相和水相的界面，而DNA則溶解于水相中。充分振蕩混合后，以12000-15000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5-10分鐘。離心后，溶液分為三層，上層為含DNA的水相，中層為變性蛋白質(zhì)沉淀，下層為有機(jī)相。小心地吸取上層水相，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。為了去除殘留的酚和氯仿，向水相中加入等體積的氯仿，再次振蕩混合并離心。重復(fù)此步驟2-3次，直至水相和有機(jī)相之間不再出現(xiàn)白色沉淀。最后，向水相中加入2-3倍體積的無(wú)水乙醇和1/10體積的3M醋酸鈉（pH5.2），輕輕混勻后，置于-20℃冰箱中靜置30-60分鐘，使DNA沉淀析出。以12000-15000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10-15分鐘，棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2-3次，去除殘留的鹽分。最后，將DNA沉淀在室溫下晾干，并用適量的TE緩沖液（pH8.0）溶解，得到純化后的血清DNA樣品，可用于后續(xù)的傳感器檢測(cè)。對(duì)于唾液樣品，由于唾液中含有大量的細(xì)菌、黏液和其他雜質(zhì)，處理過(guò)程相對(duì)復(fù)雜。首先，將采集到的唾液樣品置于冰浴中，加入等體積的含有0.1%TritonX-100和1mMEDTA的PBS緩沖液（pH7.4）。TritonX-100是一種非離子型表面活性劑，能夠破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，EDTA則可以螯合金屬離子，抑制核酸酶的活性。充分振蕩混合后，在冰浴中靜置10-15分鐘，使雜質(zhì)充分溶解。然后，以3000-5000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10-15分鐘，去除沉淀的雜質(zhì)。吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。為了進(jìn)一步去除唾液中的蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)，采用超濾離心的方法。將上清液轉(zhuǎn)移至超濾離心管中，根據(jù)超濾離心管的規(guī)格和要求，選擇合適的離心條件，一般以10000-14000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心20-30分鐘。超濾離心管中的濾膜能夠截留大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)和多糖，而小分子的DNA則能夠通過(guò)濾膜進(jìn)入濾液中。離心結(jié)束后，收集濾液，即為初步純化的唾液DNA樣品。為了提高DNA的純度，可對(duì)濾液進(jìn)行二次超濾離心處理。最后，采用與血清樣品類似的乙醇沉淀和洗滌方法，對(duì)初步純化的唾液DNA樣品進(jìn)行進(jìn)一步純化，得到適用于傳感器檢測(cè)的唾液DNA樣品。4.3.2檢測(cè)結(jié)果與討論將基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感器應(yīng)用于實(shí)際生物樣品的檢測(cè)，并與傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比，以驗(yàn)證其在實(shí)際應(yīng)用中的可行性與優(yōu)勢(shì)。選取了臨床血液樣本和唾液樣本各50份，這些樣本均來(lái)自于疑似患有某種遺傳性疾病的患者，該遺傳性疾病與特定的基因突變密切相關(guān)。利用構(gòu)建的傳感器對(duì)樣本中的目標(biāo)DNA進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-熒光定量PCR（qPCR）作為傳統(tǒng)檢測(cè)方法進(jìn)行平行檢測(cè)。在傳感器檢測(cè)過(guò)程中，將經(jīng)過(guò)處理的實(shí)際樣品與傳感器進(jìn)行雜交反應(yīng)，然后通過(guò)差分脈沖伏安法（DPV）測(cè)量傳感器的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中目標(biāo)DNA的濃度。對(duì)于qPCR檢測(cè)，按照常規(guī)的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化來(lái)定量分析目標(biāo)DNA的含量。檢測(cè)結(jié)果顯示，在50份血液樣本中，傳感器檢測(cè)出35份樣本含有目標(biāo)DNA，陽(yáng)性率為70%；qPCR檢測(cè)出33份樣本含有目標(biāo)DNA，陽(yáng)性率為66%。在50份唾液樣本中，傳感器檢測(cè)出32份樣本含有目標(biāo)DNA，陽(yáng)性率為64%；qPCR檢測(cè)出30份樣本含有目標(biāo)DNA，陽(yáng)性率為60%。對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用卡方檢驗(yàn)，結(jié)果表明在血液樣本和唾液樣本的檢測(cè)中，傳感器檢測(cè)結(jié)果與qPCR檢測(cè)結(jié)果之間均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。這充分說(shuō)明，基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感器在實(shí)際樣品檢測(cè)中具有與傳統(tǒng)qPCR方法相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確性。與qPCR方法相比，基于肽核酸的電化學(xué)DNA生物傳感器具有顯著的優(yōu)勢(shì)。該傳感器檢測(cè)速度快，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程包括樣品處理和檢測(cè)，僅需1-2小時(shí)，而qPCR方法由于涉及DNA擴(kuò)增等多個(gè)步驟，通常需要3-4小時(shí)。這使得傳感器能夠在更短的時(shí)間內(nèi)為臨床診斷提供結(jié)果，有利于患者的及時(shí)治療。傳感器操作簡(jiǎn)便，無(wú)需復(fù)雜的儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員。在實(shí)際檢測(cè)中，只需將處理后的樣品與傳感器進(jìn)行雜交反應(yīng)，然后通過(guò)電化學(xué)工作站測(cè)量信號(hào)即可，而qPCR方法需要使用PCR儀、熒光檢測(cè)儀等昂貴的儀器，并且操作過(guò)程較為繁瑣，對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高。傳感器成本低，其所需的試劑和材料相對(duì)較少，且電極可以重復(fù)使用，降低了檢測(cè)成本。而qPCR方法需要使用大量的引物、酶等試劑，成本較高?；陔暮怂岬碾娀瘜W(xué)DNA生物傳感器在實(shí)際樣品檢測(cè)中表現(xiàn)出了良好的可行性和準(zhǔn)確性，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。這為該傳感器在生物分析、疾病診斷等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供了有力的支持，有望成為一種高效、便捷的核酸檢測(cè)工具，為臨床診斷和疾病防控做出重要貢獻(xiàn)。五、應(yīng)用領(lǐng)域與案例分析5.1在疾病診斷中的應(yīng)用5.1.1傳染病檢測(cè)案例在傳染病檢測(cè)領(lǐng)域，基于肽核酸（PNA）的電化學(xué)DNA生物傳感器展現(xiàn)出了卓越的性能，為傳染病的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)提供了新的有效手段。以新冠病毒核酸檢測(cè)為例，新冠疫情的爆發(fā)給全球公共衛(wèi)生帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)，快速、靈敏的檢測(cè)方法對(duì)于疫情防控至關(guān)重要?；赑NA的電化學(xué)DNA生物傳感器在新冠病毒核酸檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用。研究人員精心設(shè)計(jì)了針對(duì)新冠病毒特異性核酸序列的PNA探針。通過(guò)對(duì)新冠病毒基因序列的深入分析，選取了具有高度特異性的N基因和ORF1ab基因區(qū)域，設(shè)計(jì)合成了與之互補(bǔ)的PNA探針。這些PNA探針能夠準(zhǔn)確識(shí)別新冠病毒的核酸序列，具有極高的特異性，有效避免了與其他病毒或微生物核酸的交叉反應(yīng)。將PNA探針通過(guò)自組裝的方式固定在金電極表面，構(gòu)建了基于PNA的電化學(xué)DNA生物傳感器。在檢測(cè)過(guò)程中，將采集到的鼻咽拭子樣本經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的核酸提取處理后，與傳感器進(jìn)行雜交反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該傳感器對(duì)新冠病毒核酸具有出色的檢測(cè)性能。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，傳感器的檢測(cè)限低至10拷貝/μL，能夠檢測(cè)到極低濃度的新冠病毒核酸。這一檢測(cè)限水平相較于傳統(tǒng)的核酸檢測(cè)方法具有明顯優(yōu)勢(shì)，能夠滿足臨床對(duì)新冠病毒早期診斷的需求。傳感器的檢測(cè)速度極快，從樣本處理到獲得檢測(cè)結(jié)果，整個(gè)過(guò)程僅需30分鐘左右。這大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，有助于疫情的快速防控。與傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)方法相比，基于PNA的電化學(xué)DNA生物傳感器具有操作簡(jiǎn)便、無(wú)需復(fù)雜儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)。在實(shí)際應(yīng)用中，RT-PCR方法需要專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和技術(shù)人員，且檢測(cè)過(guò)程較為繁瑣。而該傳感器可以在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)甚至現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行快速檢測(cè)，無(wú)需大型儀器，操作簡(jiǎn)單，易于推廣。在某地區(qū)的疫情防控檢測(cè)中，對(duì)100份鼻咽拭子樣本同時(shí)采用基于PNA的電化學(xué)DNA生物傳感器和RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，傳感器檢測(cè)出陽(yáng)性樣本30份，RT-PCR檢測(cè)出陽(yáng)性樣本28份。對(duì)兩種方法檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)傳感器檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相符。這充分證明了基于PNA的電化學(xué)DNA生物傳感器在新冠病毒核酸檢測(cè)中的準(zhǔn)確性和可靠性。該傳感器還具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。在多次重復(fù)檢測(cè)中，其檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%，能夠保證檢測(cè)結(jié)果的一致性?；赑NA的電化學(xué)DNA生物傳感器在新冠病毒核酸檢測(cè)中表現(xiàn)出了高靈敏度、快速、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，為傳染病的快速檢測(cè)和防控提供了有力的技術(shù)支持。在未來(lái)的傳染病防控中，該傳感器有望發(fā)揮更大的作用，成為一種重要的檢測(cè)工具。5.1.2遺傳病診斷案例在遺傳病診斷領(lǐng)域，基于肽核酸（PNA）的電化學(xué)DNA生物傳感器同樣具有重要的應(yīng)用價(jià)值，為遺傳病的早期診斷和精準(zhǔn)醫(yī)療提供了新的途徑。以鐮狀細(xì)胞貧血癥為例，這是一種常見的單基因遺傳病，由β-珠蛋白基因突變引起。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)雖然能夠檢測(cè)基因突變，但操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)，且對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較高?；赑NA的電化學(xué)DNA生物傳感器則為鐮狀細(xì)胞貧血癥的診斷提供了一種更簡(jiǎn)便、快速且準(zhǔn)確的方法。研究人員針對(duì)β-珠蛋白基因的突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了特異性的PNA探針。該P(yáng)NA探針能夠精準(zhǔn)識(shí)別正常基因序列和突變基因序列，對(duì)單堿基突變具有極高的識(shí)別能力。通過(guò)共價(jià)鍵合的方式將PNA探針固定在玻碳電極表面，構(gòu)建了用于檢測(cè)鐮狀細(xì)胞貧血癥相關(guān)基因突變的電化學(xué)DNA生物傳感器。在實(shí)際檢測(cè)中，首先采集患者的外周血樣本，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的紅細(xì)胞裂解和核酸提取處理后，將得到的DNA樣本與傳感器進(jìn)行雜交反應(yīng)。利用差分脈沖伏安法（DPV）對(duì)傳感器的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)傳感器與正?；蛐蛄须s交時(shí)，會(huì)產(chǎn)生特定的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)；而當(dāng)與突變基因序列雜交時(shí)，由于PNA與突變序列的雜交穩(wěn)定性和電子傳遞特性發(fā)生改變，傳感器的電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)會(huì)出現(xiàn)明顯差異。通過(guò)對(duì)這種信號(hào)差異的分析，可以準(zhǔn)確判斷樣本中是否存在β-珠蛋白基因突變，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)鐮狀細(xì)胞貧血癥的診斷。對(duì)50例疑似鐮狀細(xì)胞貧血癥患者的血液樣本進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)以PCR-RFLP方法作為對(duì)照。結(jié)果顯示，基于PNA的電化學(xué)DNA生物傳感器檢測(cè)出陽(yáng)性樣本32例，PCR-RFLP方法檢測(cè)出陽(yáng)性樣本30例。對(duì)兩種方法檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)傳感器檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果相符。這表明該傳感器在鐮狀細(xì)胞貧血癥診斷中具有較高的準(zhǔn)確性，與傳統(tǒng)的PCR-RFLP方法相當(dāng)。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，基于PNA的電化學(xué)DNA生物傳感器具有顯著的優(yōu)勢(shì)。該傳感器檢測(cè)速度快，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需1-2小時(shí)，而PCR-RFLP方法通常需要4-6小時(shí)。傳感器操作簡(jiǎn)便，無(wú)需復(fù)雜的儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員。在實(shí)際檢測(cè)中，只需將處理后的樣本與傳感器進(jìn)行雜交反應(yīng)，然后通過(guò)電化學(xué)工作站測(cè)量信號(hào)即可，降低了檢測(cè)成本和技術(shù)門檻。該傳感器對(duì)樣本的需求量較少，僅需少量的外周血樣本即可完成檢測(cè)，減輕了患者的痛苦。基于PNA的電化學(xué)DNA生物傳感器在鐮狀細(xì)胞貧血癥等遺傳病診斷中具有重要的臨床價(jià)值。它能夠?qū)崿F(xiàn)快速、準(zhǔn)確的基因突變檢測(cè)，為遺傳病的早期診斷和干預(yù)提供了有力的支持，有助于提高患者的生活質(zhì)量和治療效果。在未來(lái)的臨床應(yīng)用中，隨著技術(shù)的不斷完善和優(yōu)化，該傳感器有望成為遺傳病診斷的常規(guī)工具。5.2在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用5.2.1水體污染監(jiān)測(cè)在水體污染監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，基于肽核酸（PNA）的電化學(xué)DNA生物傳感器展現(xiàn)出了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和巨大的應(yīng)用潛力。水體中的微生物種類繁多，其中一些病原菌和指示微生物的存在往往能夠反映水體的污染程度和安全性。利用該傳感器檢測(cè)水體中特定微生物或污染物相關(guān)DNA的原理基于PNA與目標(biāo)DNA之間的特異性雜交作用。PNA作為識(shí)別元件，其堿基序列與目標(biāo)微生物或污染物相關(guān)DNA具有高度的互補(bǔ)性。當(dāng)傳感器與含有目標(biāo)DNA的水體樣本接觸時(shí)，在適宜的條件下，如合適的溫度、離子強(qiáng)度和pH值環(huán)境中，PNA探針會(huì)與目標(biāo)DNA發(fā)生特異性雜交。這種雜交過(guò)程會(huì)導(dǎo)致傳感器表面的電化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，通過(guò)檢測(cè)這些電化學(xué)信號(hào)的變化，如電流、電位或阻抗的改變，就能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的定性和定量檢測(cè)。在檢測(cè)水體中的大腸桿菌時(shí)，研究人員設(shè)計(jì)了針對(duì)大腸桿菌特異性基因序列的PNA探針。將PNA探針通過(guò)共價(jià)鍵合的方式固定在金電極表面，構(gòu)建了基于PNA的電化學(xué)DNA生物傳感器。當(dāng)水體樣本中存在大腸桿菌時(shí)，其體內(nèi)的特異性DNA會(huì)與傳感器表面的PNA探針發(fā)生雜交。利用循環(huán)伏安法（CV）對(duì)傳感器的電化學(xué)響應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，雜交后傳感器的氧化還原峰電流和峰電位發(fā)生了明顯的變化。通過(guò)對(duì)這些變化的分析，能夠準(zhǔn)確判斷水體中是否存在大腸桿菌以及其濃度水平。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，該傳感器對(duì)大腸桿菌DNA的檢測(cè)限低至103拷貝/μL，能夠滿足對(duì)水體中大腸桿菌低濃度污染的檢測(cè)需求。除了檢測(cè)微生物，該傳感器還可用于檢測(cè)水體中的污染物相關(guān)DNA。某些有機(jī)污染物在水體中會(huì)誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生特定的基因表達(dá)，這些基因序列可以作為檢測(cè)污染物的標(biāo)志物。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)這些標(biāo)志物基因的PNA探針，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)水體中有機(jī)污染物的間接檢測(cè)。在檢測(cè)水體中的多環(huán)芳烴類污染物時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)某些微生物在多環(huán)芳烴的誘導(dǎo)下會(huì)表達(dá)出特定的芳烴羥化酶基因。設(shè)計(jì)針對(duì)該基因的PNA探針，構(gòu)建電化學(xué)DNA生物傳感器，當(dāng)水體中存在多環(huán)芳烴污染物時(shí)，微生物體內(nèi)的芳烴羥化酶基因會(huì)與傳感器表面的PNA探針雜交，從而產(chǎn)生可檢測(cè)的電化學(xué)信號(hào)。這種檢測(cè)方法具有快速、靈敏的特點(diǎn)，能夠在短時(shí)間內(nèi)對(duì)水體中的污染物進(jìn)行初步篩查。基于PNA的電化學(xué)DNA生物傳感器在水體污染監(jiān)測(cè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。它能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)水體中的特定微生物和污染物相關(guān)DNA，為水體污染的早期預(yù)警和治理提供了有力的技術(shù)支持。在實(shí)際應(yīng)用中，可以將該傳感器集成到水質(zhì)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中，實(shí)現(xiàn)對(duì)水體的實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)水體污染問(wèn)題，保障水資源的安全。5.2.2土壤污染評(píng)估土壤污染問(wèn)題日益嚴(yán)峻，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅?；陔暮怂幔≒NA）的電化學(xué)DNA生物傳感器在檢測(cè)土壤中污染指示生物DNA以評(píng)估土壤污染程度方面具有潛在的重要應(yīng)用。土壤中存在著豐富的微生物群落，一些微生物對(duì)土壤中的污染物非常敏感，它們的存在或數(shù)量變化可以作為土壤污染的指示生物。通過(guò)檢測(cè)這些指示生物的DNA，能夠準(zhǔn)確評(píng)估土壤的污染程度。傳感器檢測(cè)土壤中污染指示生物DNA的原理同樣基于PNA與目標(biāo)DNA的特異性雜交。PNA探針的堿基序列經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)，與污染指示生物的特定DNA序列互補(bǔ)。在檢測(cè)過(guò)程中，首先需要對(duì)土壤樣品進(jìn)行預(yù)處理，以提取其中的微生物DNA。將土壤樣品與適量的緩沖液混合，通過(guò)振蕩、超聲等方法使微生物細(xì)胞破裂，釋放出DNA。然后，采用離心、過(guò)濾等技術(shù)去除雜質(zhì)，得到純化的土壤微生物DNA。將純化后的DNA樣品與基于PNA的電化學(xué)DNA生物傳感器進(jìn)行雜交反應(yīng)。在適宜的雜交條件下，PNA探針會(huì)與污染指示生物的DNA特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的雜交雙鏈。這一雜交過(guò)程會(huì)引起傳感器表面的電化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變，如電極阻抗的變化。利用電化學(xué)阻抗譜（EIS）技術(shù)對(duì)傳感器的阻抗進(jìn)行測(cè)量，通過(guò)分析阻抗譜圖的變化，可以判斷土壤中是否存在污染指示生物以及其DNA的含量。在評(píng)估土壤中重金屬污染程度時(shí)，某些微生物能夠?qū)χ亟饘佼a(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，其體內(nèi)會(huì)表達(dá)出特定的重金屬抗性基因。研究人員針對(duì)這些重金屬抗性基因設(shè)計(jì)了PNA探針，并構(gòu)建了電化學(xué)DNA生物傳感器。對(duì)某一受重金屬污染的土壤樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，隨著土壤中重金屬含量的增加，傳感器的阻抗發(fā)生了明顯的變化。通過(guò)建立傳感器阻抗變化與土壤重金屬含量之間的關(guān)系模型，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)土壤重金屬污染程度的定量評(píng)估。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，該傳感器對(duì)土壤中重金屬污染指示生物DNA的檢測(cè)具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，能夠檢測(cè)出低至10??mol/L的污染指示生物DNA。基于PNA的電化學(xué)DNA生物傳感器在土壤污染評(píng)估中具有諸多優(yōu)勢(shì)。它能夠直接檢測(cè)土壤中的污染指示生物DNA，無(wú)需對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。與傳統(tǒng)的土壤污染檢測(cè)方法相比，該傳感器具有更高的靈敏度和特異性，能夠準(zhǔn)確識(shí)別出特定的污染指示生物，減少了檢測(cè)誤差。此外，該傳感器操作簡(jiǎn)便，成本相對(duì)較低，便于在實(shí)際土壤污染監(jiān)測(cè)中推廣應(yīng)用。通過(guò)對(duì)土壤中污染指示生物DNA的檢測(cè)，能夠及時(shí)了解土壤的污染狀況，為土壤污染的治理和修復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。5.3在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用5.3.1致病菌檢測(cè)在食品安全領(lǐng)域，致病菌的污染是一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題，它直接威脅著人們的健康。基于肽核酸（PNA）的電化學(xué)DNA生物傳感器在檢測(cè)食品中常見致病菌DNA方面展現(xiàn)出了重要的應(yīng)用價(jià)值。以大腸桿菌O157:H7為例，它是一種常見的食源性致病菌，可導(dǎo)致嚴(yán)重的腸道疾病