基于膠體金免疫層析技術(shù)的旋毛蟲(chóng)快速檢測(cè)試紙條研制與性能評(píng)估一、引言1.1研究背景與意義旋毛蟲(chóng)（Trichinellaspiralis）是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)殖業(yè)和人類(lèi)健康的寄生蟲(chóng)，其引發(fā)的旋毛蟲(chóng)病是一種重要的人畜共患寄生蟲(chóng)病。當(dāng)人或動(dòng)物攝入含有旋毛蟲(chóng)活幼蟲(chóng)包囊的肉類(lèi)后，幼蟲(chóng)在腸道內(nèi)脫囊而出，發(fā)育為成蟲(chóng)，成蟲(chóng)交配后產(chǎn)生的新生幼蟲(chóng)又會(huì)隨血液循環(huán)侵入橫紋肌，形成具有感染性的幼蟲(chóng)包囊，從而完成整個(gè)生活史。在養(yǎng)殖業(yè)中，豬、犬、貓等家畜感染旋毛蟲(chóng)的情況較為常見(jiàn)。一旦家畜感染，不僅會(huì)影響其生長(zhǎng)發(fā)育、降低肉品質(zhì)量，導(dǎo)致養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益受損，嚴(yán)重時(shí)還可能造成家畜死亡。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)，在一些旋毛蟲(chóng)病流行較為嚴(yán)重的地區(qū)，豬的感染率可達(dá)10%-30%，這給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，感染旋毛蟲(chóng)的家畜作為傳染源，也增加了人類(lèi)感染旋毛蟲(chóng)病的風(fēng)險(xiǎn)。旋毛蟲(chóng)病對(duì)人類(lèi)健康的威脅更為嚴(yán)重。人體感染旋毛蟲(chóng)后，早期可出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等胃腸道癥狀，隨著病情發(fā)展，幼蟲(chóng)移行至肌肉，會(huì)引發(fā)發(fā)熱、肌肉疼痛、乏力、水腫等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。在重度感染的情況下，還可能累及心臟、肺臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等重要器官，導(dǎo)致心肌炎、肺炎、腦炎等嚴(yán)重并發(fā)癥，甚至危及生命。例如，在某些因食用未煮熟的感染旋毛蟲(chóng)豬肉而引發(fā)的群體性旋毛蟲(chóng)病事件中，部分患者出現(xiàn)了嚴(yán)重的并發(fā)癥，病死率高達(dá)5%-10%。目前，針對(duì)旋毛蟲(chóng)的檢測(cè)方法眾多，如傳統(tǒng)的顯微鏡檢查法，需將肌肉組織制成薄片后在顯微鏡下查找幼蟲(chóng)，但該方法操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，且對(duì)檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)要求較高，漏檢率也相對(duì)較高；傳統(tǒng)PCR技術(shù)雖靈敏度較高，但對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和操作技術(shù)要求嚴(yán)格，且易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果；ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）雖具有一定的特異性和靈敏度，但檢測(cè)過(guò)程較為復(fù)雜，需要專(zhuān)業(yè)的儀器設(shè)備和技術(shù)人員，不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。這些傳統(tǒng)檢測(cè)方法存在時(shí)間耗費(fèi)長(zhǎng)、操作復(fù)雜、靈敏度有限和特異性不高等缺點(diǎn)，無(wú)法滿足實(shí)際生產(chǎn)和公共衛(wèi)生檢測(cè)對(duì)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確檢測(cè)旋毛蟲(chóng)的需求。因此，開(kāi)發(fā)一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、高效且靈敏的檢測(cè)方法迫在眉睫。免疫金標(biāo)單克隆抗體試紙條技術(shù)作為一種新型的免疫檢測(cè)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、快速、無(wú)需特殊儀器設(shè)備、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)，在病原體檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。本研究旨在研制旋毛蟲(chóng)免疫金標(biāo)單克隆抗體試紙條，為旋毛蟲(chóng)的快速檢測(cè)提供一種新的有效手段，這對(duì)于及時(shí)發(fā)現(xiàn)旋毛蟲(chóng)感染、防控旋毛蟲(chóng)病在養(yǎng)殖業(yè)中的傳播、保障動(dòng)物源性食品安全以及維護(hù)人類(lèi)健康都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀旋毛蟲(chóng)病的檢測(cè)技術(shù)研究歷經(jīng)了漫長(zhǎng)的發(fā)展過(guò)程，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者在此領(lǐng)域進(jìn)行了大量探索，不斷推動(dòng)檢測(cè)技術(shù)的革新與進(jìn)步。早期，顯微鏡檢查法是檢測(cè)旋毛蟲(chóng)的主要手段。1835年，倫敦醫(yī)學(xué)生Paget首次從人體中發(fā)現(xiàn)旋毛蟲(chóng)，此后顯微鏡檢查法逐漸成為檢測(cè)旋毛蟲(chóng)的常規(guī)方法。該方法通過(guò)將肌肉組織制成薄片，在顯微鏡下直接查找旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)。如我國(guó)在肉品檢驗(yàn)中，常從每頭豬橫膈膜肌腳各取一小塊肉樣，先肉眼觀察，再剪取24個(gè)小肉粒壓片后鏡檢。這種方法雖操作相對(duì)簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，但存在諸多局限性。由于旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)在肌肉組織中的分布并不均勻，檢測(cè)時(shí)容易出現(xiàn)漏檢情況，尤其是在旋毛蟲(chóng)感染早期，幼蟲(chóng)數(shù)量較少時(shí)，漏檢率更高。而且，該方法對(duì)檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)要求極高，需要檢測(cè)人員能夠準(zhǔn)確識(shí)別旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)的形態(tài)特征，不同檢測(cè)人員之間的檢測(cè)結(jié)果可能存在較大差異，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定限制。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)逐漸興起。其中，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是應(yīng)用較為廣泛的一種免疫學(xué)檢測(cè)方法。1971年，Ruitenberg和Saunders率先將ELISA用于豬旋毛蟲(chóng)病的診斷。此后，ELISA技術(shù)不斷改進(jìn)和完善。我國(guó)學(xué)者許威光等在1988年改良了抗原的制備方法，獲得了旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)排泄分泌抗原（ES抗原），改變了以往使用粗抗原的狀況，大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，用這種ES抗原建立的診斷方法，檢出率約在95％以上，基本消除了假陰性結(jié)果，此項(xiàng)研究成果已被列入國(guó)家檢疫規(guī)程。ELISA技術(shù)利用抗原-抗體的特異性結(jié)合原理，通過(guò)酶標(biāo)記物催化底物顯色來(lái)檢測(cè)樣品中的旋毛蟲(chóng)抗體或抗原，具有較高的靈敏度和特異性。然而，該技術(shù)檢測(cè)過(guò)程較為繁瑣，需要經(jīng)過(guò)包被、封閉、加樣、孵育、洗滌、顯色等多個(gè)步驟，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，一般需要數(shù)小時(shí)甚至更長(zhǎng)時(shí)間。而且，ELISA檢測(cè)需要專(zhuān)業(yè)的儀器設(shè)備，如酶標(biāo)儀等，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作人員的技術(shù)水平要求也較高，這限制了其在基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的應(yīng)用。免疫熒光抗體技術(shù)（IFAT）也是一種重要的免疫學(xué)檢測(cè)方法。它以熒光素標(biāo)記抗體，與待檢樣品中的抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察，根據(jù)熒光的出現(xiàn)與否來(lái)判斷樣品中是否存在旋毛蟲(chóng)抗原。IFAT具有較高的特異性和靈敏度，能夠快速檢測(cè)出旋毛蟲(chóng)感染。但該方法同樣需要專(zhuān)業(yè)的熒光顯微鏡設(shè)備，且操作過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)要求較高，同時(shí)熒光標(biāo)記物的保存和使用也有一定的條件限制，在實(shí)際推廣應(yīng)用中存在一定困難。Westernblot檢測(cè)技術(shù)則是將蛋白質(zhì)電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相膜上，再用特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)。該技術(shù)能夠?qū)πx(chóng)抗原進(jìn)行分離和鑒定，具有較高的特異性和分辨率，可用于檢測(cè)旋毛蟲(chóng)的特異性抗體或抗原，常用于科研和對(duì)其他檢測(cè)方法結(jié)果的驗(yàn)證。不過(guò)，Westernblot檢測(cè)操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，需要專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員和設(shè)備，成本較高，難以在大規(guī)模檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中應(yīng)用。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)，為旋毛蟲(chóng)檢測(cè)帶來(lái)了新的突破。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)技術(shù)通過(guò)對(duì)旋毛蟲(chóng)特定基因序列進(jìn)行擴(kuò)增和定量分析，能夠快速、靈敏地檢測(cè)出旋毛蟲(chóng)DNA，可在早期感染階段檢測(cè)到病原體。該技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)πx(chóng)感染進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。但PCR技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和操作環(huán)境要求嚴(yán)格，需要專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)室和技術(shù)人員，且易受到樣本中雜質(zhì)、抑制劑等因素的影響，導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，同時(shí)檢測(cè)成本也相對(duì)較高，限制了其在基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，免疫金標(biāo)單克隆抗體試紙條技術(shù)作為一種新型的免疫檢測(cè)技術(shù)，受到了廣泛關(guān)注。該技術(shù)以膠體金作為標(biāo)記物，利用單克隆抗體的高特異性和親和性，與待檢樣品中的抗原結(jié)合，通過(guò)膠體金的顯色反應(yīng)來(lái)判斷檢測(cè)結(jié)果。免疫金標(biāo)單克隆抗體試紙條具有操作簡(jiǎn)便、快速、無(wú)需特殊儀器設(shè)備、結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)，只需將待檢樣品滴加到試紙條上，在數(shù)分鐘內(nèi)即可觀察到檢測(cè)結(jié)果，非常適合基層和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。目前，國(guó)內(nèi)外已有部分關(guān)于旋毛蟲(chóng)免疫金標(biāo)單克隆抗體試紙條研制的報(bào)道，但這些試紙條在靈敏度、特異性和穩(wěn)定性等方面仍存在一些問(wèn)題，需要進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)。國(guó)外在旋毛蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)研究方面起步較早，投入了大量的人力和物力，取得了一系列重要成果。例如，美國(guó)、歐洲等國(guó)家和地區(qū)在傳統(tǒng)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，不斷探索新的檢測(cè)技術(shù)和方法，在分子生物學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)等領(lǐng)域處于領(lǐng)先地位。他們研發(fā)的一些先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)和設(shè)備，如自動(dòng)化的ELISA檢測(cè)系統(tǒng)、高靈敏度的PCR檢測(cè)試劑盒等，在旋毛蟲(chóng)病的診斷和防控中發(fā)揮了重要作用。但這些先進(jìn)技術(shù)和設(shè)備往往成本較高，對(duì)操作人員的技術(shù)要求也很高，在發(fā)展中國(guó)家的推廣應(yīng)用受到一定限制。國(guó)內(nèi)在旋毛蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)研究方面也取得了顯著進(jìn)展。眾多科研機(jī)構(gòu)和高校圍繞旋毛蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)展開(kāi)了深入研究，在傳統(tǒng)檢測(cè)方法的改進(jìn)和新型檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)方面都取得了不少成果。例如，在ELISA技術(shù)的改進(jìn)、單克隆抗體的制備、免疫金標(biāo)試紙條的研制等方面都有創(chuàng)新性的研究報(bào)道。但與國(guó)外先進(jìn)水平相比，國(guó)內(nèi)在檢測(cè)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)業(yè)化方面還存在一定差距，部分先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)和設(shè)備仍依賴(lài)進(jìn)口，自主研發(fā)的檢測(cè)產(chǎn)品在質(zhì)量和性能上還有待進(jìn)一步提高。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在成功研制出一種高效、準(zhǔn)確的旋毛蟲(chóng)免疫金標(biāo)單克隆抗體試紙條，實(shí)現(xiàn)對(duì)旋毛蟲(chóng)的快速、靈敏檢測(cè)。具體而言，通過(guò)對(duì)旋毛蟲(chóng)抗原的篩選與優(yōu)化，獲得具有高特異性和免疫原性的抗原；利用先進(jìn)的單克隆抗體制備技術(shù)，制備出高親和力、高特異性的單克隆抗體；并將其與膠體金標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，開(kāi)發(fā)出性能優(yōu)良的免疫金標(biāo)單克隆抗體試紙條。同時(shí)，對(duì)試紙條的性能進(jìn)行全面評(píng)估，包括靈敏度、特異性、穩(wěn)定性等指標(biāo)，確保其能夠滿足實(shí)際檢測(cè)需求，為旋毛蟲(chóng)病的防控提供有力的技術(shù)支持。在技術(shù)創(chuàng)新方面，本研究采用納米免疫技術(shù)制備單克隆抗體，相較于傳統(tǒng)方法，納米免疫技術(shù)能夠更有效地激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)免疫應(yīng)答，從而獲得親和力和特異性更高的單克隆抗體。這種技術(shù)的應(yīng)用有望提高試紙條的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性，減少假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。此外，在試紙條的制備過(guò)程中，本研究將引入微流控技術(shù)，通過(guò)對(duì)微流控芯片的設(shè)計(jì)和優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)樣品的快速處理和檢測(cè)，進(jìn)一步縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率。微流控技術(shù)具有體積小、分析速度快、樣品和試劑用量少等優(yōu)點(diǎn)，能夠使試紙條的操作更加簡(jiǎn)便，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。在應(yīng)用創(chuàng)新方面，本研究研制的試紙條不僅可用于肉類(lèi)食品中旋毛蟲(chóng)的檢測(cè)，保障食品安全，還將拓展其在養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)對(duì)家畜旋毛蟲(chóng)感染的早期篩查應(yīng)用。傳統(tǒng)檢測(cè)方法難以在養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行快速檢測(cè)，而本試紙條操作簡(jiǎn)便，無(wú)需專(zhuān)業(yè)儀器設(shè)備，養(yǎng)殖人員可自行操作，及時(shí)發(fā)現(xiàn)家畜感染情況，采取相應(yīng)的防控措施，有效降低旋毛蟲(chóng)病在養(yǎng)殖群體中的傳播風(fēng)險(xiǎn)，減少經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，本試紙條還可應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查，通過(guò)對(duì)不同地區(qū)、不同宿主的大量樣本檢測(cè)，快速了解旋毛蟲(chóng)的感染分布情況，為制定科學(xué)合理的防控策略提供數(shù)據(jù)依據(jù)，這在以往的旋毛蟲(chóng)檢測(cè)研究中是較少涉及的全面應(yīng)用設(shè)想。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1旋毛蟲(chóng)生物學(xué)特性旋毛蟲(chóng)（Trichinellaspiralis）屬于線形動(dòng)物門(mén)線蟲(chóng)綱毛形科毛形屬，是一種重要的人畜共患寄生蟲(chóng)，其生物學(xué)特性獨(dú)特，對(duì)宿主的健康產(chǎn)生嚴(yán)重影響。從形態(tài)上看，旋毛蟲(chóng)成蟲(chóng)微小，呈線狀，外觀上蟲(chóng)體后端稍粗。雄蟲(chóng)相對(duì)較小，大小約為1.4-1.6×0.04-0.05mm，其尾端具一對(duì)鐘狀交配附器，無(wú)交合刺，交配時(shí)泄殖腔可以翻出；雌蟲(chóng)體型稍大，約為3-4×0.06mm，卵巢位于體后部，輸卵管短窄，子宮較長(zhǎng)，前段內(nèi)含未分裂的卵細(xì)胞，后段則含幼蟲(chóng)，愈近陰道處的幼蟲(chóng)發(fā)育愈成熟，自陰門(mén)產(chǎn)生的新生幼蟲(chóng)大小僅124×6μm。幼蟲(chóng)自陰門(mén)產(chǎn)出后，會(huì)寄生在宿主橫紋肌細(xì)胞內(nèi)，長(zhǎng)約1毫米，在肌肉中卷曲形成梭形囊包，囊包大小約為0.25-0.5×0.21-0.42mm，一個(gè)囊包內(nèi)通常含1-2條卷曲的幼蟲(chóng)，個(gè)別情況下也有6-7條。這種特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，使其能夠在宿主體內(nèi)特定部位寄生并完成生活史。旋毛蟲(chóng)的生活史較為復(fù)雜且特殊。在寄生人體的線蟲(chóng)中，它是唯一一種成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)同時(shí)寄生于一個(gè)宿主內(nèi)的寄生蟲(chóng)。成蟲(chóng)主要寄生于小腸，尤其集中在十二指腸和空腸上段；幼蟲(chóng)則寄生在同一宿主的橫紋肌細(xì)胞內(nèi)。整個(gè)生活史沒(méi)有外界的自由生活階段，但必須要更換宿主才能完成。當(dāng)人或動(dòng)物宿主攝入含有活旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)囊包的肉類(lèi)后，在胃液和腸液的消化作用下，數(shù)小時(shí)內(nèi)幼蟲(chóng)就會(huì)在十二指腸及空腸上段從囊包中逸出，并迅速鉆入腸粘膜內(nèi)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的發(fā)育后再返回腸腔。在感染后的48小時(shí)內(nèi)，幼蟲(chóng)會(huì)經(jīng)歷4次蛻皮，隨后發(fā)育為成蟲(chóng)。雌雄成蟲(chóng)交配后，雌蟲(chóng)會(huì)重新侵入腸粘膜內(nèi)，甚至有些還會(huì)在腹腔或腸系膜淋巴結(jié)處寄生。受精后的雌蟲(chóng)，其子宮內(nèi)的蟲(chóng)卵逐漸發(fā)育為幼蟲(chóng)，并向陰道外移動(dòng)。通常在感染后的第5-7天，雌蟲(chóng)便開(kāi)始產(chǎn)出幼蟲(chóng)，排蚴期可持續(xù)4-16周甚至更長(zhǎng)時(shí)間，在此期間，每一條雌蟲(chóng)大約可產(chǎn)幼蟲(chóng)1500條。成蟲(chóng)一般存活1-2個(gè)月，少數(shù)可存活3-4個(gè)月。大多數(shù)產(chǎn)于腸粘膜內(nèi)的新生幼蟲(chóng)，會(huì)侵入局部淋巴管或靜脈，隨淋巴和血循環(huán)到達(dá)宿主的各個(gè)器官、組織，但只有到達(dá)橫紋肌內(nèi)的幼蟲(chóng)才能繼續(xù)發(fā)育。幼蟲(chóng)偏好侵入活動(dòng)較多、血液供應(yīng)豐富的肌肉，如膈肌、舌肌、咬肌、咽喉肌、胸肌、肋間肌及腓腸肌等部位。幼蟲(chóng)穿破微血管，進(jìn)入肌細(xì)胞內(nèi)寄生，大約在感染后1個(gè)月，幼蟲(chóng)周?chē)鷷?huì)形成纖維性囊壁，并且不斷增厚，此時(shí)肌組織內(nèi)含有的幼蟲(chóng)囊包就具備了對(duì)新宿主的感染力。旋毛蟲(chóng)的致病機(jī)制主要與幼蟲(chóng)的移行和寄生過(guò)程密切相關(guān)。旋毛蟲(chóng)的主要致病階段是幼蟲(chóng)，其致病作用與食入幼蟲(chóng)囊包的數(shù)量、活力和侵犯部位以及人體對(duì)旋毛蟲(chóng)的免疫力等諸多因素有關(guān)。在幼蟲(chóng)侵入期，即腸型期，病程約為1周。此階段幼蟲(chóng)在小腸內(nèi)脫囊并鉆入腸黏膜發(fā)育為成蟲(chóng)，主要病變部位在十二指腸和空腸。腸道會(huì)出現(xiàn)廣泛性炎癥，表現(xiàn)為充血、水腫、出血，甚至形成淺表潰瘍，患者會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等急性胃腸道癥狀，同時(shí)可伴有厭食、乏力、低熱等全身反應(yīng)。進(jìn)入幼蟲(chóng)移行與寄生期，也就是肌型期，病程約為2-8周。新生幼蟲(chóng)隨淋巴、血循環(huán)移行至全身各組織器官以及侵入橫紋肌內(nèi)發(fā)育，這一階段會(huì)引發(fā)急性全身性血管炎、肌細(xì)胞變性壞死崩解以及全身免疫病理反應(yīng)。全身性肌痛是本病最為突出的癥狀，患者還可能因心肌炎、心力衰竭、敗血癥或并發(fā)肺炎、腦炎而死亡。最后在囊包形成期，即恢復(fù)期，囊包形成及受損肌細(xì)胞開(kāi)始修復(fù)，全身癥狀逐漸減輕或消失，但肌痛癥狀仍可持續(xù)數(shù)月。2.2免疫金標(biāo)技術(shù)原理免疫金標(biāo)技術(shù)，作為現(xiàn)代免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)，其核心在于巧妙運(yùn)用了膠體金獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)以及抗原抗體之間高度特異性的結(jié)合反應(yīng)。膠體金，本質(zhì)上是金鹽在諸如檸檬酸三鈉等還原劑的作用下，被還原而形成的金顆粒懸液。這些金顆粒具備獨(dú)特的納米級(jí)尺寸，通常粒徑在1-100nm之間，正是這種納米尺度賦予了膠體金一系列特殊的性質(zhì)。從光學(xué)特性來(lái)看，膠體金在可見(jiàn)光范圍內(nèi)呈現(xiàn)出特征性的紅色，這是由于金顆粒的表面等離子體共振效應(yīng)，當(dāng)光線照射時(shí)，金顆粒能夠與光發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，從而產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的吸收和散射，使其呈現(xiàn)出鮮艷的紅色。而且，膠體金的顏色會(huì)隨著金顆粒粒徑的變化而改變，粒徑越小，顏色越偏向橙黃色；粒徑越大，則顏色越趨近于紫紅色，這種對(duì)粒徑敏感的顏色變化特性為其在檢測(cè)中的應(yīng)用提供了直觀的信號(hào)指示。在化學(xué)性質(zhì)方面，膠體金表面帶有一定的電荷，通過(guò)靜電作用能夠吸附蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子，且在吸附過(guò)程中，生物大分子的活性基本不受影響，這使得膠體金成為了理想的生物分子標(biāo)記物。例如，當(dāng)抗體與膠體金結(jié)合形成免疫金復(fù)合物時(shí)，抗體依然能夠保持其與抗原特異性結(jié)合的能力，同時(shí)膠體金又為這種結(jié)合反應(yīng)提供了可視化的標(biāo)記。免疫金標(biāo)技術(shù)在抗原抗體檢測(cè)中的作用機(jī)制基于抗原抗體的特異性識(shí)別與結(jié)合。當(dāng)含有待檢抗原的樣品與固定有特異性抗體的免疫金標(biāo)試紙條接觸時(shí)，抗原會(huì)首先與試紙條上的抗體發(fā)生特異性結(jié)合。以檢測(cè)旋毛蟲(chóng)抗原為例，旋毛蟲(chóng)抗原上的特定抗原表位會(huì)與試紙條上預(yù)先包被的抗旋毛蟲(chóng)單克隆抗體精準(zhǔn)識(shí)別并結(jié)合。由于免疫金復(fù)合物中的抗體與抗原具有高度特異性，所以只有當(dāng)樣品中存在目標(biāo)抗原時(shí)，免疫金復(fù)合物才會(huì)被捕獲并聚集在特定區(qū)域。隨著抗原抗體反應(yīng)的進(jìn)行，免疫金復(fù)合物在該區(qū)域不斷累積，金顆粒之間的距離逐漸減小，從而引發(fā)膠體金的聚集現(xiàn)象。這種聚集會(huì)導(dǎo)致金顆粒表面等離子體共振特性發(fā)生改變，宏觀上表現(xiàn)為顏色的明顯變化，通常是出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的紅色條帶，以此來(lái)直觀地指示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。若樣品中不存在目標(biāo)抗原，則不會(huì)發(fā)生抗原抗體的特異性結(jié)合，也就不會(huì)出現(xiàn)免疫金復(fù)合物的聚集和顏色變化，試紙條相應(yīng)區(qū)域保持無(wú)色，指示檢測(cè)結(jié)果為陰性。這種基于抗原抗體特異性結(jié)合和膠體金顯色反應(yīng)的檢測(cè)機(jī)制，使得免疫金標(biāo)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果直觀等顯著優(yōu)點(diǎn)，在病原體檢測(cè)、疾病診斷等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。2.3單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域的一項(xiàng)關(guān)鍵創(chuàng)新，其核心原理基于細(xì)胞融合與篩選機(jī)制，能夠產(chǎn)生高度特異性和均一性的抗體，為生物醫(yī)學(xué)研究、疾病診斷與治療帶來(lái)了革命性的變化。從原理層面剖析，B淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下，能夠分化、增殖形成具有針對(duì)這種抗原分泌特異性抗體的能力。然而，B細(xì)胞的這種能力和量是有限的，不可能持續(xù)分化增殖下去，因此產(chǎn)生免疫球蛋白的能力也是極其微小的。單克隆抗體技術(shù)通過(guò)將這種B細(xì)胞與非分泌型的骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞，再進(jìn)一步克隆化。這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞既具有瘤的無(wú)限生長(zhǎng)的能力，又具有產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞的能力，將這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)或注入小鼠體內(nèi)即可獲得大量的高效價(jià)、單一的特異性抗體。在實(shí)際制備過(guò)程中，有著嚴(yán)格且精細(xì)的操作流程。首先是免疫動(dòng)物，一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，使用目的抗原對(duì)其進(jìn)行免疫注射，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細(xì)胞?？乖ㄟ^(guò)血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細(xì)胞。隨后進(jìn)行細(xì)胞融合，采用眼球摘除放血法處死小鼠，無(wú)菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細(xì)胞懸液。將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。接下來(lái)是選擇性培養(yǎng)，目的是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡；未融合的淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長(zhǎng)期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細(xì)胞能增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。然后是雜交瘤陽(yáng)性克隆的篩選與克隆化，在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定單克隆抗體的細(xì)胞，通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)，采用免疫學(xué)方法，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類(lèi)型、亞類(lèi)、特異性、親和力、識(shí)別抗原的表位及其分子量后，及時(shí)進(jìn)行凍存。最后是單克隆抗體的制備，大量制備主要采用動(dòng)物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。體內(nèi)誘生法是取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石蠟或降脂烷進(jìn)行預(yù)處理，1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體，約1-2周，可見(jiàn)小鼠腹部膨大，用注射器抽取腹水，即可獲得單克隆抗體；體外培養(yǎng)法是將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體，但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。單克隆抗體在檢測(cè)領(lǐng)域具有諸多顯著優(yōu)勢(shì)。其高度特異性使得它能夠精準(zhǔn)識(shí)別目標(biāo)抗原的特定表位，有效減少非特異性結(jié)合帶來(lái)的干擾，極大地提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。例如，在旋毛蟲(chóng)檢測(cè)中，單克隆抗體可以特異性地與旋毛蟲(chóng)抗原結(jié)合，避免與其他類(lèi)似病原體或雜質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)，從而降低假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)概率。而且單克隆抗體的理化性狀高度均一，在檢測(cè)過(guò)程中能夠提供穩(wěn)定、可靠的檢測(cè)信號(hào)，保證了檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性和一致性。無(wú)論在不同批次的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，還是在不同實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行檢測(cè)，單克隆抗體都能保持相對(duì)穩(wěn)定的性能，使得檢測(cè)結(jié)果具有可比性。此外，單克隆抗體來(lái)源相對(duì)容易，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增，可以大量制備，滿足大規(guī)模檢測(cè)的需求。與傳統(tǒng)的多克隆抗體制備相比，單克隆抗體制備過(guò)程更加可控，能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量高純度的抗體，為檢測(cè)試劑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了有力保障。三、材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1蟲(chóng)種與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)選用的旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)種為豫株豬源旋毛蟲(chóng)，引自河南省疾病預(yù)防控制中心，并在本實(shí)驗(yàn)室用小白鼠進(jìn)行傳代保種，以維持蟲(chóng)種的活性和穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括體重18-22g的雌性昆明小鼠以及體重150-200g的SD大鼠，雌雄均有，均購(gòu)自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在實(shí)驗(yàn)前，將小鼠和大鼠分別飼養(yǎng)于專(zhuān)門(mén)的動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在22±2℃，相對(duì)濕度保持在50%-60%，并提供充足的食物和清潔飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和使用嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理和福利原則，確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物的健康和生存質(zhì)量。3.1.2主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：用于提取旋毛蟲(chóng)抗原的各類(lèi)化學(xué)試劑，如Tris-HCl緩沖液、氯化鈉、蛋白酶抑制劑等；用于單克隆抗體制備的試劑，如弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、聚乙二醇（PEG）、次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-胸腺嘧啶核苷（HAT）培養(yǎng)基、次黃嘌呤-胸腺嘧啶核苷（HT）培養(yǎng)基等；用于免疫金標(biāo)試紙條制備的試劑，如氯金酸、檸檬酸三鈉、牛血清白蛋白（BSA）、羊抗鼠IgG抗體等；用于抗體效價(jià)檢測(cè)和蛋白鑒定的試劑，如酶標(biāo)羊抗鼠IgG抗體、3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物顯色液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）相關(guān)試劑、硝酸纖維素膜、PVDF膜等。主要儀器設(shè)備有：高速冷凍離心機(jī)，用于細(xì)胞和蛋白的分離與離心；CO?培養(yǎng)箱，為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的環(huán)境；酶標(biāo)儀，用于檢測(cè)抗體效價(jià)和抗原含量；電泳儀和電泳槽，用于SDS-PAGE電泳和Westernblot轉(zhuǎn)膜；恒溫?fù)u床，用于抗原抗體反應(yīng)過(guò)程中的振蕩孵育；超聲破碎儀，用于抗原的提取和制備；冷凍干燥機(jī)，用于試劑的凍干保存；微量移液器和八道移液器，用于試劑的準(zhǔn)確吸取和添加；精密電子天平，用于試劑的稱(chēng)量；純水儀，制備實(shí)驗(yàn)所需的超純水。這些試劑和儀器均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)和校準(zhǔn)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1旋毛蟲(chóng)抗原的提取與純化旋毛蟲(chóng)抗原的提取與純化是本研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其質(zhì)量直接影響后續(xù)單克隆抗體的制備以及試紙條的性能。本實(shí)驗(yàn)采用改良的機(jī)械分離結(jié)合酶消化法提取旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)。具體步驟如下：將感染旋毛蟲(chóng)45天的小鼠頸椎脫臼處死后，取其全部骨骼肌，剪碎至約1mm3大小的肉塊。將剪碎的肌肉組織放入含有0.5%胃蛋白酶（用0.1mol/L鹽酸配制）的消化液中，肌肉組織與消化液的比例為1:5（g/mL），置于37℃恒溫水浴搖床中，以150r/min的速度振蕩消化2-3小時(shí)，直至肌肉組織完全消化。消化結(jié)束后，將消化液通過(guò)4層紗布過(guò)濾，去除未消化的組織殘?jiān)?。濾液經(jīng)3000r/min離心10分鐘，棄去上清液，沉淀用無(wú)菌生理鹽水洗滌3-4次，每次洗滌后均以3000r/min離心10分鐘，以去除雜質(zhì)和殘留的消化液。最后，將收集到的純凈肌幼蟲(chóng)用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整濃度至1×10?條/mL，備用。對(duì)于提取得到的旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)，采用凍融-超聲破碎法進(jìn)行抗原制備。將含有肌幼蟲(chóng)的生理鹽水懸液置于-80℃冰箱冷凍2小時(shí)，然后取出置于37℃水浴中快速融化，如此反復(fù)凍融3次。凍融處理后，將樣品轉(zhuǎn)移至超聲破碎儀中，進(jìn)行超聲破碎。超聲條件設(shè)置為：功率200W，工作時(shí)間3秒，間歇時(shí)間5秒，總超聲時(shí)間10分鐘。超聲破碎過(guò)程中，將樣品置于冰浴中，以防止溫度過(guò)高導(dǎo)致蛋白變性。超聲破碎結(jié)束后，將樣品于12000r/min離心30分鐘，取上清液，即為旋毛蟲(chóng)粗抗原。為了獲得高純度的旋毛蟲(chóng)抗原，采用親和層析法對(duì)粗抗原進(jìn)行純化。選用ProteinA親和層析柱，先用PBS（pH7.4）平衡層析柱，流速為1mL/min，直至基線平穩(wěn)。將旋毛蟲(chóng)粗抗原以0.5mL/min的流速上樣到層析柱中，使抗原與ProteinA充分結(jié)合。上樣結(jié)束后，用PBS沖洗層析柱，去除未結(jié)合的雜質(zhì)，直至流出液的OD???值小于0.05。然后用0.1mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液（pH2.5）洗脫結(jié)合在層析柱上的抗原，流速為1mL/min，收集洗脫液。立即用1mol/LTris-HCl緩沖液（pH9.0）中和洗脫液，以防止抗原變性。將純化后的抗原通過(guò)超濾濃縮管進(jìn)行濃縮，并用PBS透析過(guò)夜，去除其中的鹽分和小分子雜質(zhì)。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和Westernblot對(duì)純化后的旋毛蟲(chóng)抗原進(jìn)行鑒定。SDS-PAGE采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣量為10μg，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker作為分子量參照。電泳條件為：濃縮膠80V，電泳30分鐘，分離膠120V，電泳90分鐘。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色1小時(shí)，然后用脫色液（甲醇：冰醋酸：水=45:10:45）脫色至背景清晰，觀察抗原蛋白條帶的分布情況。Westernblot實(shí)驗(yàn)中，將SDS-PAGE分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)移條件為：250mA，轉(zhuǎn)移90分鐘。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，將PVDF膜與鼠抗旋毛蟲(chóng)陽(yáng)性血清（1:1000稀釋?zhuān)┰?℃孵育過(guò)夜。次日，用PBST（PBS+0.1%Tween-20）洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜與HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋?zhuān)┰谑覝胤跤?小時(shí)。再次用PBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。如果在相應(yīng)分子量位置出現(xiàn)特異性條帶，且與預(yù)期分子量相符，則表明純化后的抗原具有良好的免疫活性和特異性。3.2.2單克隆抗體的制備與鑒定本實(shí)驗(yàn)利用納米免疫技術(shù)制備旋毛蟲(chóng)單克隆抗體，該技術(shù)相較于傳統(tǒng)免疫方法，能夠顯著增強(qiáng)抗原的免疫原性，提高單克隆抗體的制備效率和質(zhì)量。納米免疫技術(shù)是將抗原與納米材料結(jié)合，利用納米材料獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)，如高比表面積、良好的生物相容性等，促進(jìn)抗原的攝取和呈遞，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。在本研究中，選用納米金顆粒作為載體，將旋毛蟲(chóng)純化抗原與納米金顆粒偶聯(lián)，制備納米免疫復(fù)合物。具體制備流程如下：首先，制備納米金顆粒。采用檸檬酸三鈉還原法制備粒徑約為20nm的納米金顆粒。在100mL超純水中加入0.1g氯金酸，加熱至沸騰，迅速加入1%檸檬酸三鈉溶液3mL，繼續(xù)煮沸15-20分鐘，直至溶液顏色由淺黃色變?yōu)榫萍t色，停止加熱，冷卻至室溫，得到納米金顆粒溶液。通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)納米金顆粒的吸收峰，在520nm左右出現(xiàn)特征吸收峰，表明納米金顆粒制備成功。然后，將旋毛蟲(chóng)純化抗原與納米金顆粒偶聯(lián)。取適量納米金顆粒溶液，用0.1mol/LK?CO?調(diào)節(jié)pH值至8.2。按照抗原與納米金顆粒質(zhì)量比為1:10的比例，將旋毛蟲(chóng)純化抗原緩慢加入到納米金顆粒溶液中，室溫?cái)嚢?小時(shí)，使抗原與納米金顆粒充分結(jié)合。加入10%牛血清白蛋白（BSA）溶液至終濃度為1%，繼續(xù)攪拌30分鐘，以封閉納米金顆粒表面未結(jié)合的位點(diǎn)。將偶聯(lián)后的溶液于12000r/min離心30分鐘，棄去上清液，沉淀用適量PBS重懸，得到納米免疫復(fù)合物。免疫動(dòng)物時(shí)，選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，將納米免疫復(fù)合物與弗氏完全佐劑等體積混合，充分乳化后，采用多點(diǎn)皮下注射的方式免疫小鼠，每只小鼠免疫劑量為100μg納米免疫復(fù)合物。首次免疫后，間隔2周，用納米免疫復(fù)合物與弗氏不完全佐劑等體積混合乳化后進(jìn)行第二次免疫，免疫劑量同首次。第二次免疫后2周，采用尾靜脈注射的方式進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量為50μg納米免疫復(fù)合物，不加佐劑。加強(qiáng)免疫后3天，眼球取血，分離血清，采用間接ELISA法檢測(cè)血清抗體效價(jià)。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到1:10000以上時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞融合。細(xì)胞融合采用聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)法。將免疫小鼠拉頸處死，無(wú)菌取出脾臟，用PBS沖洗3次，去除血液。將脾臟置于平皿中，用鑷子輕輕擠壓，制成脾細(xì)胞懸液。將脾細(xì)胞懸液通過(guò)200目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，去除組織塊。將過(guò)濾后的脾細(xì)胞懸液于400g離心10分鐘，棄去上清液，沉淀用PBS洗滌2次。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓瘤細(xì)胞SP2/0，與脾細(xì)胞按照1:5的比例混合于50mL離心管中，加入適量PBS，輕輕混勻，400g離心10分鐘，棄去上清液。在離心管中加入1mL預(yù)熱至37℃的50%PEG（分子量為4000）溶液，邊加邊輕輕攪拌，作用1分鐘。然后緩慢加入5mL預(yù)熱至37℃的不完全培養(yǎng)基，邊加邊攪拌，作用5分鐘，以終止PEG的作用。再加入適量不完全培養(yǎng)基，400g離心10分鐘，棄去上清液。沉淀用HAT培養(yǎng)基重懸，將細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-10天后，可見(jiàn)雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。采用有限稀釋法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，以獲得單克隆雜交瘤細(xì)胞。具體操作如下：將雜交瘤細(xì)胞懸液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)姑靠准?xì)胞數(shù)分別為10、5、1個(gè)，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，加入HT培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至孔底面積的50%-70%時(shí)，采用間接ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中的抗體效價(jià)。選取抗體效價(jià)高、特異性好的單克隆雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。對(duì)制備得到的單克隆抗體進(jìn)行純化，采用辛酸-飽和硫酸銨法結(jié)合ProteinG親和層析柱進(jìn)行純化。首先，將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液用0.45μm濾膜過(guò)濾，去除細(xì)胞碎片。在攪拌條件下，向過(guò)濾后的上清液中緩慢加入辛酸，使辛酸終濃度為0.06mol/L，調(diào)節(jié)pH值至4.8，4℃攪拌1小時(shí)。然后，4℃、10000r/min離心30分鐘，取上清液。向上清液中緩慢加入飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨終濃度達(dá)到50%飽和度，4℃攪拌1小時(shí)。4℃、10000r/min離心30分鐘，棄去上清液，沉淀用適量PBS重懸。將重懸后的溶液通過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾，然后上樣到ProteinG親和層析柱中。用PBS平衡層析柱，流速為1mL/min，直至基線平穩(wěn)。用0.1mol/L檸檬酸緩沖液（pH3.0）洗脫結(jié)合在層析柱上的單克隆抗體，流速為1mL/min，收集洗脫液。立即用1mol/LTris-HCl緩沖液（pH9.0）中和洗脫液，以防止抗體變性。將純化后的單克隆抗體通過(guò)超濾濃縮管進(jìn)行濃縮，并用PBS透析過(guò)夜，去除其中的鹽分和小分子雜質(zhì)。采用間接ELISA法測(cè)定單克隆抗體的效價(jià)。將旋毛蟲(chóng)純化抗原用包被緩沖液（0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6）稀釋至1μg/mL，每孔100μL，加入到96孔酶標(biāo)板中，4℃包被過(guò)夜。次日，棄去包被液，用PBST洗滌3次，每次3分鐘。每孔加入200μL5%脫脂奶粉，37℃封閉2小時(shí)。棄去封閉液，用PBST洗滌3次，每次3分鐘。將純化后的單克隆抗體用PBST進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)瑥?:100開(kāi)始，每孔加入100μL，37℃孵育1小時(shí)。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌3次，每次3分鐘。每孔加入100μLHRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋?zhuān)?7℃孵育1小時(shí)。棄去孔內(nèi)液體，用PBST洗滌3次，每次3分鐘。每孔加入100μLTMB底物顯色液，37℃避光顯色15分鐘。加入50μL2mol/LH?SO?終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值。以吸光度值大于陰性對(duì)照2.1倍的最高稀釋度作為單克隆抗體的效價(jià)。采用SDS-PAGE和Westernblot對(duì)單克隆抗體的特異性進(jìn)行鑒定。SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)中，將純化后的單克隆抗體進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，上樣量為10μg，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker作為分子量參照。電泳條件同抗原鑒定部分。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色1小時(shí)，然后用脫色液脫色至背景清晰，觀察抗體蛋白條帶的分布情況。Westernblot實(shí)驗(yàn)中，將SDS-PAGE分離后的抗體蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)移條件同抗原鑒定部分。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉2小時(shí)。封閉后，將PVDF膜與旋毛蟲(chóng)純化抗原（1μg/mL）在4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜與HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:5000稀釋?zhuān)┰谑覝胤跤?小時(shí)。再次用PBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。如果在相應(yīng)分子量位置出現(xiàn)特異性條帶，且與預(yù)期分子量相符，則表明單克隆抗體具有良好的特異性。3.2.3免疫金標(biāo)試紙條的制備免疫金標(biāo)試紙條的制備是實(shí)現(xiàn)旋毛蟲(chóng)快速檢測(cè)的關(guān)鍵步驟，其制備過(guò)程包括抗體固定、樣品處理和試紙條組裝等環(huán)節(jié)，每個(gè)環(huán)節(jié)都對(duì)試紙條的性能有著重要影響。在抗體固定環(huán)節(jié)，選用硝酸纖維素膜（NC膜）作為固相載體，將單克隆抗體固定在NC膜上，形成檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線）。首先，對(duì)NC膜進(jìn)行預(yù)處理，將NC膜浸泡在含有0.05%吐溫-20的PBS（pH7.4）中，室溫浸泡30分鐘，然后用去離子水沖洗3次，每次5分鐘，以去除NC膜表面的雜質(zhì)和可能存在的干擾物質(zhì)。將純化后的單克隆抗體用包被緩沖液（0.01mol/LPBS，pH7.4）稀釋至1mg/mL，作為檢測(cè)抗體；將羊抗鼠IgG抗體用包被緩沖液稀釋至1mg/mL，作為質(zhì)控抗體。采用劃膜儀將檢測(cè)抗體和質(zhì)控抗體分別劃在NC膜上，檢測(cè)抗體劃在T線位置，質(zhì)控抗體劃在C線位置，劃線量均為1μL/cm，然后將NC膜置于37℃烘箱中干燥2小時(shí)，使抗體牢固地結(jié)合在NC膜上。對(duì)于樣品處理，若是檢測(cè)肉類(lèi)樣品中的旋毛蟲(chóng)，將待檢肉類(lèi)樣品剪碎，取1g放入研缽中，加入5mL含有0.1%TritonX-100的PBS（pH7.4），充分研磨勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，8000r/min離心10分鐘，取上清液作為檢測(cè)樣品。若檢測(cè)血清樣品，直接使用新鮮采集的血清作為檢測(cè)樣品；若檢測(cè)其他液體樣品，如養(yǎng)殖環(huán)境水樣等，取10mL水樣，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，取濾液作為檢測(cè)樣品。試紙條組裝時(shí)，依次將樣品墊、金標(biāo)墊、NC膜和吸水紙粘貼在PVC底板上。樣品墊采用玻璃纖維膜，使用前將其浸泡在含有1%BSA、0.05%吐溫-20和0.02%疊氮鈉的PBS（pH7.4）中，室溫浸泡1小時(shí)，然后于37℃烘箱中干燥2小時(shí)。金標(biāo)墊為玻璃纖維膜，將制備好的膠體金標(biāo)記單克隆抗體用金標(biāo)抗體稀釋液（含有1%BSA、0.05%吐溫-20、0.02%疊氮鈉和5%蔗糖的PBS，pH7.4）稀釋至適當(dāng)濃度，均勻噴涂在金標(biāo)墊上，每平方厘米噴涂量為1μL，然后于37℃烘箱中干燥2小時(shí)。將干燥后的NC膜粘貼在PVC底板的中間位置，使T線和C線位于PVC底板的上方。在NC膜的一端粘貼樣品墊，使樣品墊與NC膜有1-2mm的重疊；在NC膜的另一端粘貼吸水紙，使吸水紙與NC膜有1-2mm的重疊。將組裝好的試紙條用裁條機(jī)切成4mm寬的小條，裝入塑料卡殼中，即得到免疫金標(biāo)試紙條。3.2.4試紙條性能評(píng)價(jià)方法為了確保免疫金標(biāo)試紙條能夠準(zhǔn)確、可靠地檢測(cè)旋毛蟲(chóng)，需要對(duì)其性能進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，包括優(yōu)化檢測(cè)條件以及測(cè)試靈敏度、特異性、穩(wěn)定性等關(guān)鍵指標(biāo)。在優(yōu)化試紙條檢測(cè)條件方面，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取金標(biāo)抗體稀釋度、樣品孵育時(shí)間、檢測(cè)溫度三個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置三個(gè)水平，具體水平設(shè)置如下：金標(biāo)抗體稀釋度分別為1:50、1:100、1:200；樣品孵育時(shí)間分別為5分鐘、10分鐘、15分鐘；檢測(cè)溫度分別為20℃、25℃、37℃。以已知濃度的旋毛蟲(chóng)陽(yáng)性樣品和陰性樣品為檢測(cè)對(duì)象，每個(gè)組合重復(fù)檢測(cè)3次，以檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)極差分析和方差分析確定最佳檢測(cè)條件。靈敏度測(cè)試時(shí)，將旋毛蟲(chóng)抗原用PBS（pH7.4）進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)苽涑刹煌瑵舛鹊目乖瓨?biāo)準(zhǔn)品，濃度范圍為100ng/mL-0.01ng/mL。用制備好的免疫金標(biāo)試紙條對(duì)不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)5次。記錄試紙條出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果（T線和C線均顯色）的最低抗原濃度，該濃度即為試紙條的檢測(cè)下限，也就是靈敏度。特異性測(cè)試中，選取與旋毛蟲(chóng)形態(tài)或抗原結(jié)構(gòu)相似的其他寄生蟲(chóng)抗原，如蛔蟲(chóng)抗原、鉤蟲(chóng)抗原、四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1抗原與抗體的制備結(jié)果通過(guò)改良的機(jī)械分離結(jié)合酶消化法成功提取了旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)，再經(jīng)凍融-超聲破碎法和親和層析法獲得了純化的旋毛蟲(chóng)抗原。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化后的抗原在電泳凝膠上呈現(xiàn)出清晰、單一的條帶，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，其純度達(dá)到了95%以上。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker對(duì)比，確定該抗原的分子量約為35kDa，與預(yù)期的旋毛蟲(chóng)特異性抗原分子量相符。Westernblot結(jié)果表明，純化后的抗原能夠與鼠抗旋毛蟲(chóng)陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，在相應(yīng)分子量位置出現(xiàn)明顯的特異性條帶，這充分證明了該抗原具有良好的免疫活性和特異性，能夠作為后續(xù)單克隆抗體制備的優(yōu)質(zhì)抗原。利用納米免疫技術(shù)成功制備了旋毛蟲(chóng)單克隆抗體。通過(guò)間接ELISA法測(cè)定，該單克隆抗體的效價(jià)高達(dá)1:64000。具體測(cè)定過(guò)程中，以不同稀釋度的單克隆抗體與旋毛蟲(chóng)純化抗原進(jìn)行反應(yīng)，當(dāng)抗體稀釋至1:64000時(shí)，其在酶標(biāo)儀上測(cè)定的450nm處吸光度值仍大于陰性對(duì)照2.1倍，表明此時(shí)抗體仍能與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，且具有較強(qiáng)的反應(yīng)信號(hào)，體現(xiàn)了該單克隆抗體的高效價(jià)特性。SDS-PAGE和Westernblot鑒定結(jié)果顯示，該單克隆抗體能夠特異性地與旋毛蟲(chóng)純化抗原結(jié)合，在相應(yīng)分子量位置出現(xiàn)特異性條帶，且與其他非旋毛蟲(chóng)抗原無(wú)交叉反應(yīng)，表明制備的單克隆抗體具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確識(shí)別旋毛蟲(chóng)抗原的特定表位，為后續(xù)免疫金標(biāo)試紙條的制備提供了可靠的抗體來(lái)源。4.2試紙條制備效果制備完成的免疫金標(biāo)試紙條外觀整齊、平整，各組成部分粘貼牢固，無(wú)氣泡、褶皺或脫落現(xiàn)象。試紙條整體呈長(zhǎng)條狀，寬度為4mm，長(zhǎng)度根據(jù)PVC底板的尺寸設(shè)定為6cm，便于手持操作和結(jié)果觀察。從結(jié)構(gòu)上看，試紙條由樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜（NC膜）和吸水紙依次粘貼在PVC底板上組成。樣品墊位于試紙條的一端，為玻璃纖維膜材質(zhì)，其作用是使樣品均勻分散并快速滲透到金標(biāo)墊；金標(biāo)墊緊挨著樣品墊，同樣采用玻璃纖維膜，上面均勻噴涂有膠體金標(biāo)記的單克隆抗體，用于與樣品中的抗原發(fā)生特異性結(jié)合；NC膜處于試紙條的中間位置，是檢測(cè)的核心區(qū)域，上面劃有檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線），檢測(cè)線固定有用于檢測(cè)旋毛蟲(chóng)抗原的單克隆抗體，質(zhì)控線固定有羊抗鼠IgG抗體，用于判斷試紙條的有效性；吸水紙位于試紙條的另一端，能夠吸收多余的液體，保證檢測(cè)過(guò)程的順利進(jìn)行。在抗體固定效果評(píng)估方面，通過(guò)對(duì)NC膜上T線和C線的抗體固定情況進(jìn)行檢測(cè)分析。采用免疫印跡法，將固定有抗體的NC膜剪取小段，與旋毛蟲(chóng)抗原和羊抗鼠IgG抗體分別進(jìn)行反應(yīng)，然后用相應(yīng)的酶標(biāo)二抗進(jìn)行顯色。結(jié)果顯示，T線和C線在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中均出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，表明單克隆抗體和羊抗鼠IgG抗體已成功固定在NC膜上，且保持了良好的免疫活性，能夠與相應(yīng)的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。此外，對(duì)固定抗體后的NC膜進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試，將其放置在不同溫度（4℃、25℃、37℃）和濕度條件下（相對(duì)濕度30%、50%、70%）保存一段時(shí)間后，再次進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。結(jié)果表明，在4℃和25℃、相對(duì)濕度30%-50%的條件下保存1個(gè)月，T線和C線的抗體活性基本無(wú)明顯變化；在37℃、相對(duì)濕度70%的條件下保存2周后，抗體活性略有下降，但仍能與相應(yīng)抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合，說(shuō)明抗體在NC膜上的固定具有較好的穩(wěn)定性。對(duì)于樣品處理效果，以肉類(lèi)樣品為例進(jìn)行評(píng)估。將已知感染旋毛蟲(chóng)的豬肉樣品按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行處理，制備成檢測(cè)樣品。通過(guò)對(duì)比不同處理方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)采用本研究中加入0.1%TritonX-100的PBS研磨勻漿并離心的處理方法，能夠有效地提取出樣品中的旋毛蟲(chóng)抗原，且雜質(zhì)較少，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾小。采用該方法處理的樣品，在試紙條檢測(cè)中，陽(yáng)性樣品的T線和C線均能清晰顯色，且顏色強(qiáng)度與樣品中旋毛蟲(chóng)抗原的濃度呈正相關(guān)；陰性樣品僅C線顯色，T線無(wú)明顯顏色變化，表明樣品處理方法能夠滿足試紙條檢測(cè)的要求，有效地提取出目標(biāo)抗原，同時(shí)避免了雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。4.3試紙條性能測(cè)試結(jié)果通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)試紙條檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，極差分析和方差分析結(jié)果表明，最佳檢測(cè)條件為：金標(biāo)抗體稀釋度1:100，此稀釋度下，抗體與抗原能夠充分結(jié)合，既保證了檢測(cè)的靈敏度，又避免了因抗體濃度過(guò)高或過(guò)低導(dǎo)致的非特異性結(jié)合或信號(hào)過(guò)弱問(wèn)題；樣品孵育時(shí)間10分鐘，在該時(shí)間內(nèi)，抗原抗體反應(yīng)達(dá)到較為充分的程度，能夠產(chǎn)生明顯且穩(wěn)定的檢測(cè)信號(hào)；檢測(cè)溫度25℃，此溫度接近人體常溫，有利于維持抗原抗體的活性和反應(yīng)的進(jìn)行。在該最佳條件下，試紙條檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性最佳，陽(yáng)性樣品的T線和C線顯色清晰，顏色強(qiáng)度適中且穩(wěn)定，陰性樣品僅C線顯色，無(wú)T線假陽(yáng)性情況出現(xiàn)。在靈敏度測(cè)試中，將旋毛蟲(chóng)抗原用PBS（pH7.4）進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)苽涑刹煌瑵舛鹊目乖瓨?biāo)準(zhǔn)品，用免疫金標(biāo)試紙條對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，試紙條能夠檢測(cè)到的最低抗原濃度為0.1ng/mL，即該試紙條的靈敏度為0.1ng/mL。當(dāng)抗原濃度高于0.1ng/mL時(shí)，試紙條的T線和C線均能清晰顯色，且隨著抗原濃度的升高，T線顏色逐漸加深；當(dāng)抗原濃度低于0.1ng/mL時(shí)，T線不顯色，僅C線顯色，表明試紙條具有較高的靈敏度，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)到低濃度的旋毛蟲(chóng)抗原。特異性測(cè)試選取了與旋毛蟲(chóng)形態(tài)或抗原結(jié)構(gòu)相似的其他寄生蟲(chóng)抗原，如蛔蟲(chóng)抗原、鉤蟲(chóng)抗原、弓形蟲(chóng)抗原、囊蟲(chóng)抗原等，以及正常豬血清、牛血清、羊血清等作為對(duì)照。用試紙條分別對(duì)這些抗原和血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，試紙條僅對(duì)旋毛蟲(chóng)抗原呈陽(yáng)性反應(yīng)，T線和C線均顯色；而對(duì)其他寄生蟲(chóng)抗原及正常血清均呈陰性反應(yīng)，僅C線顯色，T線無(wú)明顯顏色變化。這表明該試紙條具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確識(shí)別旋毛蟲(chóng)抗原，與其他寄生蟲(chóng)抗原及正常動(dòng)物血清無(wú)交叉反應(yīng)，有效避免了假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。穩(wěn)定性測(cè)試從不同時(shí)間和不同條件兩個(gè)維度進(jìn)行。在不同時(shí)間穩(wěn)定性測(cè)試中，將制備好的試紙條分別在4℃、25℃和37℃條件下保存，每隔一段時(shí)間（1周、2周、1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月）取出進(jìn)行檢測(cè)，以已知陽(yáng)性和陰性樣品作為檢測(cè)對(duì)象。結(jié)果顯示，在4℃條件下保存3個(gè)月，試紙條的檢測(cè)結(jié)果與初始檢測(cè)結(jié)果一致，陽(yáng)性樣品T線和C線顯色清晰，陰性樣品僅C線顯色；在25℃條件下保存2個(gè)月內(nèi)，試紙條檢測(cè)性能穩(wěn)定，但保存3個(gè)月時(shí)，部分試紙條的T線顏色略有變淺；在37℃條件下保存1個(gè)月內(nèi)，試紙條檢測(cè)結(jié)果基本穩(wěn)定，超過(guò)1個(gè)月后，T線顯色明顯變淺，甚至出現(xiàn)部分試紙條T線不顯色的情況。在不同條件穩(wěn)定性測(cè)試中，將試紙條置于高溫高濕（溫度37℃，相對(duì)濕度80%）、低溫低濕（溫度4℃，相對(duì)濕度30%）和常溫常濕（溫度25℃，相對(duì)濕度50%）等不同環(huán)境條件下保存1周后進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，在常溫常濕條件下，試紙條檢測(cè)結(jié)果不受影響；在低溫低濕條件下，試紙條檢測(cè)性能略有下降，但仍能準(zhǔn)確檢測(cè)；在高溫高濕條件下，試紙條的檢測(cè)性能受到較大影響，出現(xiàn)部分假陰性結(jié)果。綜合來(lái)看，該試紙條在4℃和25℃條件下保存具有較好的穩(wěn)定性，在實(shí)際應(yīng)用中，建議將試紙條保存在4℃條件下，以確保其檢測(cè)性能的穩(wěn)定性和可靠性。五、分析與討論5.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析在抗原制備方面，通過(guò)改良的機(jī)械分離結(jié)合酶消化法成功提取旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)，并利用凍融-超聲破碎法和親和層析法獲得高純度抗原。SDS-PAGE和Westernblot鑒定結(jié)果表明，該抗原純度高、免疫活性和特異性良好。這得益于改良提取方法的高效性，機(jī)械分離初步去除雜質(zhì)，酶消化能更充分地釋放幼蟲(chóng)，凍融-超聲破碎使抗原充分暴露，親和層析則有效去除了雜蛋白。但在提取過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)肌肉組織的剪碎程度對(duì)消化效果有較大影響，剪碎不充分會(huì)導(dǎo)致消化不完全，影響幼蟲(chóng)的提取量。同時(shí)，親和層析柱的選擇和使用條件也至關(guān)重要，不同品牌和型號(hào)的層析柱對(duì)純化效果有差異，在實(shí)驗(yàn)中需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行優(yōu)化。單克隆抗體制備采用納米免疫技術(shù)，成功獲得高效價(jià)、高特異性的單克隆抗體。納米免疫技術(shù)利用納米金顆粒作為載體，增強(qiáng)了抗原的免疫原性，促進(jìn)了機(jī)體的免疫應(yīng)答。在細(xì)胞融合過(guò)程中，骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比例、PEG的作用時(shí)間和濃度等因素對(duì)融合效果有顯著影響。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞比例為1:5時(shí)，融合率較高且雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；PEG作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，影響雜交瘤細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)。在單克隆抗體的純化過(guò)程中，辛酸-飽和硫酸銨法結(jié)合ProteinG親和層析柱的方法能夠有效去除雜質(zhì)，提高抗體純度，但操作過(guò)程較為繁瑣，需要嚴(yán)格控制各步驟的條件，如辛酸的添加量、硫酸銨的飽和度以及層析柱的洗脫條件等。免疫金標(biāo)試紙條的制備過(guò)程中，抗體固定、樣品處理和試紙條組裝等環(huán)節(jié)都對(duì)試紙條性能有重要影響。在抗體固定時(shí)，NC膜的預(yù)處理和抗體的稀釋度、劃線量都會(huì)影響抗體的固定效果和免疫活性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)含有0.05%吐溫-20的PBS預(yù)處理的NC膜，抗體固定效果更好，且在檢測(cè)中能有效減少非特異性結(jié)合。樣品處理方法對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要，不同類(lèi)型的樣品需要采用不同的處理方法。如肉類(lèi)樣品，加入0.1%TritonX-100的PBS研磨勻漿并離心的處理方法，能有效提取抗原并減少雜質(zhì)干擾，但對(duì)于其他類(lèi)型的樣品，該方法可能并不適用，需要進(jìn)一步探索優(yōu)化。試紙條組裝過(guò)程中，各組件的粘貼順序、重疊程度以及干燥條件等都會(huì)影響試紙條的性能。例如，樣品墊與NC膜、吸水紙與NC膜的重疊部分如果過(guò)寬或過(guò)窄，會(huì)影響液體的流動(dòng)和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；干燥溫度和時(shí)間不合適，可能導(dǎo)致抗體失活或試紙條變形。在試紙條性能測(cè)試中，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了檢測(cè)條件，確定了最佳檢測(cè)條件為金標(biāo)抗體稀釋度1:100、樣品孵育時(shí)間10分鐘、檢測(cè)溫度25℃。在該條件下，試紙條檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性最佳。靈敏度測(cè)試結(jié)果顯示，試紙條的靈敏度為0.1ng/mL，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)到低濃度的旋毛蟲(chóng)抗原。特異性測(cè)試表明，試紙條與其他寄生蟲(chóng)抗原及正常動(dòng)物血清無(wú)交叉反應(yīng)，具有高度的特異性。穩(wěn)定性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，試紙條在4℃和25℃條件下保存具有較好的穩(wěn)定性，在高溫高濕條件下檢測(cè)性能會(huì)受到較大影響。這可能是由于高溫高濕環(huán)境會(huì)導(dǎo)致抗體變性、膠體金顆粒聚集等，從而影響試紙條的檢測(cè)性能。在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)試紙條的穩(wěn)定性特點(diǎn)，合理選擇保存條件，以確保其檢測(cè)性能的可靠性。5.2與傳統(tǒng)檢測(cè)方法對(duì)比將本研究研制的旋毛蟲(chóng)免疫金標(biāo)單克隆抗體試紙條與傳統(tǒng)檢測(cè)方法，如顯微鏡檢查、PCR、ELISA等進(jìn)行對(duì)比，能更清晰地展現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)與特點(diǎn)，為實(shí)際應(yīng)用提供有力參考。顯微鏡檢查法作為最傳統(tǒng)的旋毛蟲(chóng)檢測(cè)方法，主要通過(guò)將肌肉組織制成薄片，在顯微鏡下直接查找旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)。這種方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，在一些基層檢測(cè)單位仍有應(yīng)用。然而，其缺點(diǎn)也十分明顯。由于旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)在肌肉組織中的分布并不均勻，檢測(cè)時(shí)容易出現(xiàn)漏檢情況，尤其是在旋毛蟲(chóng)感染早期，幼蟲(chóng)數(shù)量較少時(shí)，漏檢率更高。據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計(jì)，顯微鏡檢查法的漏檢率可達(dá)20%-30%。而且，該方法對(duì)檢測(cè)人員的經(jīng)驗(yàn)要求極高，需要檢測(cè)人員能夠準(zhǔn)確識(shí)別旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)的形態(tài)特征，不同檢測(cè)人員之間的檢測(cè)結(jié)果可能存在較大差異。與之相比，本研究的免疫金標(biāo)試紙條操作簡(jiǎn)便，無(wú)需專(zhuān)業(yè)的顯微鏡設(shè)備和豐富的檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，普通人員經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單培訓(xùn)即可操作。且試紙條采用的單克隆抗體具有高度特異性，能夠準(zhǔn)確識(shí)別旋毛蟲(chóng)抗原，大大降低了漏檢和誤檢的概率。PCR技術(shù)，尤其是實(shí)時(shí)定量PCR，是一種基于核酸擴(kuò)增的檢測(cè)方法，能夠?qū)πx(chóng)特定基因序列進(jìn)行擴(kuò)增和定量分析。該技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，能夠在早期感染階段檢測(cè)到病原體。例如，在一些研究中，實(shí)時(shí)定量PCR能夠檢測(cè)到極低拷貝數(shù)的旋毛蟲(chóng)DNA，靈敏度可達(dá)10-100拷貝/μL。但是，PCR技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和操作環(huán)境要求嚴(yán)格，需要專(zhuān)業(yè)的實(shí)驗(yàn)室和技術(shù)人員，且易受到樣本中雜質(zhì)、抑制劑等因素的影響，導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。同時(shí)，PCR檢測(cè)成本相對(duì)較高，需要購(gòu)買(mǎi)昂貴的儀器設(shè)備和試劑，限制了其在基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用。而免疫金標(biāo)試紙條無(wú)需復(fù)雜的儀器設(shè)備，在常溫下即可操作，檢測(cè)成本較低，更適合基層和現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模檢測(cè)的需求。雖然試紙條的靈敏度略低于PCR技術(shù)，但在實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)于旋毛蟲(chóng)的初步篩查和快速診斷具有重要意義。ELISA技術(shù)是一種常用的免疫學(xué)檢測(cè)方法，利用抗原-抗體的特異性結(jié)合原理，通過(guò)酶標(biāo)記物催化底物顯色來(lái)檢測(cè)樣品中的旋毛蟲(chóng)抗體或抗原。ELISA技術(shù)具有較高的靈敏度和特異性，在旋毛蟲(chóng)病的診斷中應(yīng)用廣泛。如采用旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)排泄分泌抗原（ES抗原）建立的ELISA診斷方法，檢出率約在95％以上。然而，ELISA檢測(cè)過(guò)程較為繁瑣，需要經(jīng)過(guò)包被、封閉、加樣、孵育、洗滌、顯色等多個(gè)步驟，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，一般需要數(shù)小時(shí)甚至更長(zhǎng)時(shí)間。而且，ELISA檢測(cè)需要專(zhuān)業(yè)的儀器設(shè)備，如酶標(biāo)儀等，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作人員的技術(shù)水平要求也較高。免疫金標(biāo)試紙條則操作簡(jiǎn)便快捷，只需將待檢樣品滴加到試紙條上，在數(shù)分鐘內(nèi)即可觀察到檢測(cè)結(jié)果。雖然在靈敏度和特異性上，試紙條與ELISA技術(shù)相當(dāng)，但試紙條在檢測(cè)速度和操作簡(jiǎn)便性上具有明顯優(yōu)勢(shì)，更適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。5.3應(yīng)用前景與挑戰(zhàn)本研究研制的旋毛蟲(chóng)免疫金標(biāo)單克隆抗體試紙條在養(yǎng)殖業(yè)、食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，同時(shí)也面臨著一些不容忽視的挑戰(zhàn)。在養(yǎng)殖業(yè)中，試紙條可用于家畜旋毛蟲(chóng)感染的早期篩查。豬、牛、羊等家畜是旋毛蟲(chóng)的常見(jiàn)宿主，感染旋毛蟲(chóng)后不僅影響家畜的生長(zhǎng)發(fā)育，降低肉品質(zhì)量，還會(huì)通過(guò)食物鏈傳播給人類(lèi)。傳統(tǒng)檢測(cè)方法如顯微鏡檢查法操作繁瑣、漏檢率高，ELISA等方法需要專(zhuān)業(yè)設(shè)備和技術(shù)人員，不適合在養(yǎng)殖現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)。而免疫金標(biāo)試紙條操作簡(jiǎn)便，無(wú)需專(zhuān)業(yè)儀器設(shè)備，養(yǎng)殖人員經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單培訓(xùn)即可自行操作。在養(yǎng)殖場(chǎng)中，定期采集家畜的血液或肌肉組織樣本，使用