演講人：日期:免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)介紹目錄CATALOGUE01實(shí)驗(yàn)概述02核心實(shí)驗(yàn)原理03關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)步驟04結(jié)果分析要點(diǎn)05常見問題診斷06技術(shù)應(yīng)用案例PART01實(shí)驗(yàn)概述基本定義與原理定義免疫共沉淀（Co-IP）是一種利用特異性抗體捕獲目標(biāo)蛋白及其相互作用復(fù)合物的技術(shù)，通過抗原-抗體結(jié)合原理從復(fù)雜樣本中分離特定蛋白復(fù)合體。原理基于抗體與靶蛋白的特異性結(jié)合，通過固相載體（如磁珠或瓊脂糖珠）固定抗體-蛋白復(fù)合物，經(jīng)洗滌后獲得高純度互作蛋白，后續(xù)可通過Westernblot或質(zhì)譜分析驗(yàn)證。關(guān)鍵組分包括裂解緩沖液（維持蛋白天然構(gòu)象）、特異性抗體（識別靶蛋白）、ProteinA/G磁珠（結(jié)合抗體-Fc段）以及離心/磁力分離設(shè)備。主要應(yīng)用領(lǐng)域蛋白互作研究鑒定未知相互作用蛋白或驗(yàn)證已知蛋白復(fù)合物，廣泛應(yīng)用于信號通路、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等機(jī)制解析。02040301疾病標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)從病理樣本中富集疾病相關(guān)蛋白復(fù)合物，輔助開發(fā)診斷或治療靶點(diǎn)。藥物靶點(diǎn)篩選通過檢測藥物處理前后蛋白復(fù)合物的變化，評估藥物對特定蛋白互作的影響。復(fù)合物穩(wěn)定性分析研究環(huán)境因素（如pH、溫度）或突變對蛋白復(fù)合物穩(wěn)定性的影響。技術(shù)發(fā)展簡史早期技術(shù)局限初始階段依賴多克隆抗體和低效沉淀方法，存在非特異性結(jié)合率高、靈敏度不足等問題。載體系統(tǒng)革新引入ProteinA/G磁珠和瓊脂糖珠，顯著提高抗體結(jié)合效率并簡化操作流程。高分辨率檢測結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)與高靈敏度抗體，實(shí)現(xiàn)微量蛋白復(fù)合物的精準(zhǔn)鑒定與定量分析。自動化與高通量開發(fā)自動化工作站和微流控芯片，支持大規(guī)模蛋白互作組學(xué)研究。PART02核心實(shí)驗(yàn)原理抗體通過可變區(qū)與抗原表位特異性結(jié)合，這種相互作用依賴于氫鍵、疏水作用和范德華力等非共價鍵，確保結(jié)合的精確性和穩(wěn)定性?？乖?抗體特異性結(jié)合高親和力識別抗原與抗體的結(jié)合界面在空間構(gòu)象上高度匹配，類似“鎖鑰”模型，避免非特異性結(jié)合干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性抗原-抗體復(fù)合物在特定條件下（如低pH或高鹽濃度）可解離，便于后續(xù)洗脫和純化步驟的進(jìn)行?？赡嫘越Y(jié)合天然互作保留將特異性抗體固定于瓊脂糖珠或磁珠等固相載體，形成“誘餌”系統(tǒng)，高效富集溶液中的目標(biāo)蛋白復(fù)合物。抗體偶聯(lián)載體共沉淀策略通過離心或磁分離使載體-抗體-抗原復(fù)合物沉淀，實(shí)現(xiàn)與溶液雜蛋白的物理分離，減少背景噪音。免疫共沉淀通過溫和裂解細(xì)胞保持蛋白復(fù)合物的天然狀態(tài)，確保捕獲目標(biāo)蛋白及其相互作用伙伴的完整性。蛋白復(fù)合物捕獲機(jī)制親和純化基礎(chǔ)過程預(yù)清除步驟使用無關(guān)抗體或空白載體預(yù)處理樣品，去除可能非特異性吸附的雜蛋白，提高后續(xù)特異性結(jié)合效率。梯度洗脫優(yōu)化采用逐步增加鹽濃度或添加競爭性肽段的方法洗脫目標(biāo)蛋白，平衡純化得率與復(fù)合物完整性的需求。交叉驗(yàn)證設(shè)計(jì)結(jié)合陰性對照（如同型抗體）和陽性對照（已知互作蛋白）驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的特異性，排除假陽性干擾。PART03關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞裂解與樣品制備超聲破碎處理對于難裂解的細(xì)胞或組織樣本，可采用超聲破碎輔助裂解，需控制功率和時間以避免蛋白變性，通常采用間歇式超聲（如5秒脈沖/10秒間隔）。離心條件標(biāo)準(zhǔn)化裂解后需以高速離心（如12000×g）去除細(xì)胞碎片和未裂解組分，上清液轉(zhuǎn)移至新管前需通過BCA或Bradford法測定蛋白濃度，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)一致性。裂解緩沖液優(yōu)化根據(jù)目標(biāo)蛋白特性選擇適合的裂解緩沖液（如RIPA、NP-40等），需包含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑以維持蛋白完整性。裂解過程需在低溫環(huán)境下進(jìn)行，避免蛋白降解。030201抗體-瓊脂糖珠孵育抗體選擇與驗(yàn)證優(yōu)先選用經(jīng)IP驗(yàn)證的一抗，避免非特異性結(jié)合。需預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗體效價，推薦使用1-5μg抗體/mg總蛋白比例進(jìn)行孵育。孵育時間與溫度通常選擇4℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育過夜（12-16小時），若時間受限可采用室溫孵育1-2小時，但需監(jiān)測非特異性結(jié)合風(fēng)險。瓊脂糖珠預(yù)處理使用前需用裂解緩沖液洗滌珠子3次以去除儲存液中的穩(wěn)定劑，離心速度控制在1000×g以避免珠體破碎。梯度洗滌策略對于ProteinA/G珠子結(jié)合的抗體-抗原復(fù)合物，可用0.1M甘氨酸（pH2.5-3.0）洗脫，立即用中和緩沖液（如1MTris-HClpH8.5）調(diào)節(jié)pH至中性，避免蛋白酸變性。低pH洗脫法競爭性洗脫替代方案針對高親和力相互作用，可采用游離抗原肽段競爭洗脫，保留目標(biāo)蛋白天然構(gòu)象，適用于后續(xù)功能研究。采用不同鹽濃度（如150mM-500mMNaCl）的洗滌緩沖液分步清洗，逐步去除弱結(jié)合雜質(zhì)。每次洗滌后離心條件需嚴(yán)格一致（1000×g，1分鐘）。復(fù)合物洗滌與洗脫P(yáng)ART04結(jié)果分析要點(diǎn)確保細(xì)胞或組織裂解充分，使用適當(dāng)?shù)牧呀饩彌_液（如RIPA緩沖液）提取目標(biāo)蛋白，并通過離心去除不溶性雜質(zhì)，上清液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。蛋白樣品制備將分離的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF或NC膜上，轉(zhuǎn)膜后使用5%脫脂牛奶或BSA溶液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景信號干擾。轉(zhuǎn)膜與封閉根據(jù)目標(biāo)蛋白分子量選擇合適的凝膠濃度（如8%-12%），將蛋白樣品與上樣緩沖液混合并煮沸變性后上樣，電泳至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部。SDS電泳分離依次孵育一抗和二抗，通過化學(xué)發(fā)光法（ECL）或熒光檢測系統(tǒng)顯影，確保曝光時間適中以避免信號過強(qiáng)或過弱。抗體孵育與顯影WesternBlot檢測流程特異性條帶解讀多克隆抗體交叉反應(yīng)若出現(xiàn)多條帶，需結(jié)合抗體說明書及文獻(xiàn)判斷是否為蛋白異構(gòu)體、降解產(chǎn)物或非特異性結(jié)合，必要時進(jìn)行質(zhì)譜驗(yàn)證。03使用ImageJ等軟件量化條帶灰度值，比較實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異，注意排除上樣量不均或轉(zhuǎn)膜效率差異導(dǎo)致的誤差。02條帶強(qiáng)度分析目標(biāo)條帶位置驗(yàn)證通過比對預(yù)染蛋白Marker確認(rèn)目標(biāo)條帶分子量是否與預(yù)期一致，排除非特異性條帶干擾，必要時使用陽性對照驗(yàn)證抗體特異性。01陰性對照設(shè)置規(guī)范同型對照抗體使用與一抗相同種屬和亞型的非特異性IgG作為陰性對照，排除抗體非特異性結(jié)合導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。空載體或敲除細(xì)胞對照在過表達(dá)或基因編輯實(shí)驗(yàn)中，需設(shè)置空載體轉(zhuǎn)染或目標(biāo)基因敲除的細(xì)胞樣本，驗(yàn)證信號是否依賴于目標(biāo)蛋白的存在。無抗體對照組省略一抗步驟僅用二抗孵育，檢測二抗是否與膜或內(nèi)源性蛋白產(chǎn)生非特異性結(jié)合，確保信號特異性。內(nèi)參蛋白驗(yàn)證檢測樣本中內(nèi)參蛋白（如GAPDH、β-actin）的表達(dá)水平，確認(rèn)實(shí)驗(yàn)組與對照組間上樣量一致，避免結(jié)果偏差。PART05常見問題診斷非特異性結(jié)合控制選擇經(jīng)過驗(yàn)證的高特異性一抗，并通過預(yù)實(shí)驗(yàn)（如WesternBlot）確認(rèn)其與目標(biāo)蛋白的結(jié)合能力，避免交叉反應(yīng)。必要時使用單克隆抗體替代多克隆抗體。優(yōu)化抗體特異性提高洗滌嚴(yán)格性，如增加鹽濃度（150-500mMNaCl）或加入去垢劑（0.1%NP-40），并在低溫條件下（4℃）進(jìn)行洗滌以減少松散結(jié)合。洗滌緩沖液優(yōu)化采用5%BSA或脫脂牛奶作為封閉劑，封閉時間延長至1-2小時，減少非特異性蛋白與磁珠或抗體的結(jié)合?？商砑?.1%Tween-20進(jìn)一步降低背景。封閉條件調(diào)整背景信號過高處理過量抗體會導(dǎo)致非特異性吸附，需通過梯度實(shí)驗(yàn)確定最佳抗體濃度，通常建議使用1-5μg抗體/mg裂解液蛋白。降低抗體用量延長洗滌次數(shù)與時間對照實(shí)驗(yàn)設(shè)置增加洗滌次數(shù)至5-6次，每次洗滌靜置5分鐘，并更換新鮮預(yù)冷的洗滌緩沖液以徹底去除未結(jié)合蛋白。設(shè)立IgG同型對照或空載體轉(zhuǎn)染的陰性對照組，明確背景信號來源，必要時使用ProteinA/G磁珠預(yù)清除樣本中的非目標(biāo)結(jié)合蛋白。目標(biāo)蛋白未檢出方案優(yōu)化抗原-抗體結(jié)合條件嘗試不同孵育溫度（4℃過夜或室溫2小時）及pH值（7.4-8.0），或改用交聯(lián)劑（如DSS）穩(wěn)定蛋白復(fù)合物，提高捕獲效率。驗(yàn)證樣本蛋白表達(dá)通過WesternBlot檢測裂解液中目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平，確保實(shí)驗(yàn)前樣本中目標(biāo)蛋白含量充足（建議濃度≥1μg/μL）。調(diào)整裂解緩沖液成分針對膜蛋白或核蛋白，改用含更強(qiáng)去垢劑（如1%TritonX-100或RIPA緩沖液）的裂解液，并添加蛋白酶抑制劑防止降解。PART06技術(shù)應(yīng)用案例通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)可確認(rèn)文獻(xiàn)報道的蛋白相互作用，例如轉(zhuǎn)錄因子與輔激活因子的結(jié)合，為功能研究提供直接證據(jù)。實(shí)驗(yàn)需優(yōu)化抗體特異性及洗滌條件，避免假陽性干擾。蛋白相互作用驗(yàn)證驗(yàn)證已知蛋白互作網(wǎng)絡(luò)利用該技術(shù)篩選未知相互作用蛋白，結(jié)合質(zhì)譜分析鑒定新組分。需注意設(shè)置陰性對照（如IgG抗體組）排除非特異性結(jié)合。發(fā)現(xiàn)新型蛋白復(fù)合物在不同細(xì)胞狀態(tài)（如應(yīng)激、分化）下檢測目標(biāo)蛋白結(jié)合強(qiáng)度的變化，揭示調(diào)控機(jī)制。需嚴(yán)格控制裂解液成分以維持天然構(gòu)象。動態(tài)互作監(jiān)測信號通路組分鑒定核心激酶復(fù)合體解析通過免疫沉淀關(guān)鍵激酶（如MAPK、AKT），可系統(tǒng)性鑒定其上下游結(jié)合蛋白，繪制通路拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。建議使用蛋白酶抑制劑維持蛋白穩(wěn)定性。受體-配體相互作用研究針對膜受體（如GPCR、RTK）設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，需采用溫和去垢劑（如CHAPS）溶解膜蛋白，保留其結(jié)合活性?？山Y(jié)合磷酸化抗體驗(yàn)證功能狀態(tài)。表觀遺傳調(diào)控復(fù)合物捕獲對組蛋白修飾酶（如HDAC、甲基轉(zhuǎn)移酶）進(jìn)行沉淀，可發(fā)現(xiàn)其招募的染色質(zhì)重塑因子。需優(yōu)化核酸酶處理?xiàng)l件以減少DNA介導(dǎo)的假性結(jié)合。藥物靶點(diǎn)確認(rèn)研究多