基于蛋白質(zhì)組學解析膽管癌發(fā)病機制與治療靶點的探索一、引言1.1研究背景與意義膽管癌是一種起源于膽管上皮細胞的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢。美國《癌癥》雜志發(fā)布的《2017年全球疾病負擔研究》表明，1990-2017年，全球膽管癌發(fā)生率增加了76%，死亡率增加了65%，而我國膽管癌發(fā)病率在30年內(nèi)上升了84%，死亡率上升了44%。膽管癌起病隱匿，早期無明顯臨床癥狀，多數(shù)患者確診時已處于晚期，這使得很多患者無法接受有效治療，整體預后較差，五年生存率不足10%。肝外膽管癌根治性切除術(shù)后3年和5年生存期分別為40％-50％和20％-40％，手術(shù)死亡率約10％；肝內(nèi)膽管癌術(shù)后平均生存期30個月，5年生存率35％-45％，不能手術(shù)者生存期僅為6個月。若不做任何手術(shù)和引流，患者多在作出診斷后3個月內(nèi)死亡，單純引流的晚期患者生存時間很少超過1年。因此，深入探究膽管癌的發(fā)病機制，尋找有效的早期診斷標志物和治療靶點，對于提高膽管癌患者的生存率和改善預后具有重要意義。蛋白質(zhì)組學作為后基因組時代研究的重要內(nèi)容，其理論和技術(shù)的發(fā)展為膽管癌的研究開辟了新道路。蛋白質(zhì)是生命活動的主要執(zhí)行者，細胞內(nèi)的各種生理過程，如信號傳導、代謝調(diào)控、細胞周期調(diào)節(jié)等，都離不開蛋白質(zhì)的參與。蛋白質(zhì)組是指一個基因組、一個細胞或組織、一種生物體所表達的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學旨在從整體角度分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，從而揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律。在膽管癌研究中，蛋白質(zhì)組學技術(shù)可全面分析膽管癌細胞或組織中蛋白質(zhì)的表達情況，鑒定出與膽管癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的差異表達蛋白。通過對這些差異表達蛋白的深入研究，有望揭示膽管癌的發(fā)病機制，為膽管癌的早期診斷、預后評估和治療提供新的生物標志物和潛在治療靶點。例如，通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選出的某些蛋白質(zhì)，可能在膽管癌的早期診斷中具有高靈敏度和特異性，有助于實現(xiàn)膽管癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療；而針對某些與膽管癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，開發(fā)相應的靶向治療藥物，可能為膽管癌患者帶來更有效的治療手段，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。1.2膽管癌概述膽管癌是發(fā)生于膽道上皮細胞的惡性腫瘤，可發(fā)生于膽道系統(tǒng)的各級膽管。根據(jù)腫瘤所在的解剖部位，膽管癌主要分為肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌。肝內(nèi)膽管癌是指起源于二級膽管及其分支以遠的膽管上皮細胞的惡性腫瘤，約占原發(fā)性肝臟惡性腫瘤的15%-20%；肝外膽管癌則起源于左右肝管匯合部至膽總管下端的膽管上皮細胞，又可進一步分為上段膽管癌（肝門部膽管癌）和下段膽管癌，其中肝門部膽管癌最為常見，約占肝外膽管癌的50%-60%。近年來，膽管癌的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均呈上升趨勢。美國《癌癥》雜志發(fā)布的《2017年全球疾病負擔研究》表明，1990-2017年，全球膽管癌發(fā)生率增加了76%，死亡率增加了65%。我國的情況同樣不容樂觀，過去30年里，膽管癌發(fā)病率上升了84%，死亡率上升了44%。膽管癌起病隱匿，早期癥狀不典型，多數(shù)患者確診時已處于晚期，這使得手術(shù)切除率低，預后較差，五年生存率不足10%。其發(fā)病機制目前尚未完全明確，但普遍認為與多種因素有關(guān)，如膽管結(jié)石、原發(fā)性硬化性膽管炎、先天性膽管囊腫、肝吸蟲感染、病毒性肝炎等。這些因素可能通過引起膽管慢性炎癥、細胞增殖異常、基因突變等，進而導致膽管癌的發(fā)生發(fā)展。1.3蛋白質(zhì)組學簡介蛋白質(zhì)組（proteome）這一概念最早由澳大利亞科學家MarcWilkins在1994年提出，它是由“PROTEin”和“genOME”兩個詞組合而成，意為“一個基因組所表達的全部蛋白質(zhì)”。從廣義上來說，蛋白質(zhì)組是指一個細胞、一個組織或一種生物體在特定條件下所表達的全部蛋白質(zhì)。由于基因的表達具有時空特異性，同一基因組在不同細胞、不同組織以及不同生理病理條件下的表達產(chǎn)物存在差異，因此蛋白質(zhì)組是一個動態(tài)變化的整體。蛋白質(zhì)組學（proteomics）則是一門研究蛋白質(zhì)組的新興學科，它旨在從整體層面分析細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的組成、表達水平、修飾狀態(tài)以及蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，從而深入揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律。蛋白質(zhì)組學研究的主要內(nèi)容包括蛋白質(zhì)的分離與鑒定、蛋白質(zhì)定量分析、蛋白質(zhì)翻譯后修飾分析以及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等。在蛋白質(zhì)分離與鑒定方面，常用的技術(shù)有二維凝膠電泳（2-DE）、液相色譜（LC）等，它們能夠?qū)碗s的蛋白質(zhì)混合物分離成單個蛋白質(zhì)；而質(zhì)譜技術(shù)（MS）則是蛋白質(zhì)鑒定的核心技術(shù)，通過測量蛋白質(zhì)或其肽段的質(zhì)荷比，可精確確定蛋白質(zhì)的氨基酸序列和分子量。蛋白質(zhì)定量分析用于比較不同樣品中蛋白質(zhì)的表達水平差異，常見方法有同位素標記相對和絕對定量（iTRAQ）、串聯(lián)質(zhì)量標簽（TMT）標記定量以及非標記定量（label-free）等。蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM），如磷酸化、糖基化、乙?；?，對蛋白質(zhì)的功能具有重要調(diào)節(jié)作用，研究這些修飾有助于深入理解蛋白質(zhì)的功能機制。此外，通過酵母雙雜交、免疫共沉淀等技術(shù)可以研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，從而揭示細胞內(nèi)復雜的信號傳導通路和生物學過程。在癌癥研究領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組學發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。癌癥是一種復雜的多基因疾病，其發(fā)生發(fā)展涉及多個生物學過程和信號通路的異常。蛋白質(zhì)作為生命活動的直接執(zhí)行者，其表達和功能的改變在癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程中起著關(guān)鍵作用。蛋白質(zhì)組學技術(shù)能夠全面、系統(tǒng)地分析腫瘤組織或細胞中的蛋白質(zhì)組，篩選出與癌癥發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的差異表達蛋白，這些蛋白可能成為癌癥早期診斷的生物標志物。例如，在乳腺癌研究中，通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一些在乳腺癌組織中特異性高表達的蛋白質(zhì)，如癌胚抗原（CEA）、糖類抗原15-3（CA15-3）等，這些標志物已被廣泛應用于乳腺癌的臨床診斷和病情監(jiān)測。同時，對差異表達蛋白的功能研究有助于揭示癌癥的發(fā)病機制，為開發(fā)新的治療靶點提供理論依據(jù)。以肺癌為例，蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體（EGFR）的異常激活與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，基于此開發(fā)的EGFR酪氨酸激酶抑制劑，如吉非替尼、厄洛替尼等，為EGFR突變陽性的肺癌患者提供了有效的靶向治療手段。此外，蛋白質(zhì)組學還可用于研究腫瘤的耐藥機制，為克服腫瘤耐藥、提高治療效果提供新思路。二、膽管癌蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)2.1質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組學研究的核心技術(shù)之一，它能夠精確測量蛋白質(zhì)或肽段的質(zhì)荷比（m/z），從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的鑒定、定量和結(jié)構(gòu)分析。在膽管癌蛋白質(zhì)組學研究中，質(zhì)譜技術(shù)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，有助于揭示膽管癌的發(fā)病機制，篩選潛在的診斷標志物和治療靶點。下面將介紹幾種在膽管癌蛋白質(zhì)組學研究中常用的質(zhì)譜技術(shù)。2.1.1液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）是將液相色譜的高效分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度和高特異性檢測能力相結(jié)合的一種分析技術(shù)。其基本原理是，首先利用液相色譜對復雜的蛋白質(zhì)混合物進行分離，將不同的蛋白質(zhì)或肽段按照其物理化學性質(zhì)的差異分離開來。然后，將分離后的組分依次引入質(zhì)譜儀中，在離子源中被電離成帶電離子。這些離子在質(zhì)量分析器中根據(jù)其質(zhì)荷比的不同進行分離，最后由檢測器檢測并記錄離子的信號強度，得到質(zhì)譜圖。通過對質(zhì)譜圖的分析，可以確定蛋白質(zhì)或肽段的分子量、氨基酸序列等信息。在膽管癌研究中，LC-MS/MS技術(shù)被廣泛應用于鑒定膽管癌組織或細胞中的差異表達蛋白。復旦大學的研究團隊運用iTRAQ標記結(jié)合LC-MS/MS技術(shù)，對膽管癌組織和癌旁正常組織進行蛋白質(zhì)組學分析，共鑒定出116個差異表達蛋白，其中上調(diào)蛋白63個，下調(diào)蛋白53個。進一步的生物信息學分析表明，這些差異表達蛋白主要參與了細胞代謝、信號轉(zhuǎn)導、細胞周期調(diào)控等生物學過程。其中，熱休克蛋白90α（HSP90α）在膽管癌組織中顯著高表達，通過細胞實驗和動物實驗驗證，發(fā)現(xiàn)HSP90α能夠促進膽管癌細胞的增殖、遷移和侵襲，提示HSP90α可能是膽管癌潛在的診斷標志物和治療靶點。LC-MS/MS技術(shù)的優(yōu)勢在于其能夠?qū)碗s樣品中的蛋白質(zhì)進行高效分離和準確鑒定，具有高靈敏度、高分辨率和高通量的特點。同時，結(jié)合穩(wěn)定同位素標記技術(shù)（如同位素標記相對和絕對定量，iTRAQ；串聯(lián)質(zhì)量標簽，TMT等），可以實現(xiàn)對不同樣品中蛋白質(zhì)表達水平的相對定量或絕對定量分析，為研究膽管癌發(fā)生發(fā)展過程中蛋白質(zhì)表達的動態(tài)變化提供了有力工具。然而，該技術(shù)也存在一些局限性，如樣品前處理過程較為復雜，對實驗操作人員的技術(shù)要求較高；儀器設(shè)備昂貴，運行成本較高；在分析低豐度蛋白質(zhì)時，靈敏度可能受到一定限制等。2.1.2表面增強激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）表面增強激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）是一種新型的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，它結(jié)合了蛋白質(zhì)芯片技術(shù)和飛行時間質(zhì)譜技術(shù)。其工作原理是，首先將生物樣品（如血清、組織裂解液等）直接與蛋白質(zhì)芯片表面的特異性探針結(jié)合，這些探針可以是抗體、配體、核酸等，能夠特異性地捕獲目標蛋白質(zhì)。然后，用激光脈沖照射芯片表面，使結(jié)合在芯片上的蛋白質(zhì)解析并離子化。離子在電場的作用下加速飛行，根據(jù)其質(zhì)荷比的不同，在飛行時間分析器中飛行的時間也不同，從而可以精確測定離子的質(zhì)荷比，得到蛋白質(zhì)的質(zhì)譜圖。通過對質(zhì)譜圖的分析和比較，可以篩選出不同樣品之間的差異表達蛋白質(zhì)。SELDI-TOF-MS技術(shù)在膽管癌研究中具有重要應用，尤其是在檢測膽管癌腫瘤標志物方面。有研究運用SELDI-TOF-MS技術(shù)對60例膽管癌患者、146例肺癌患者、65例喉癌患者、58例喉咽癌患者、49例膽管良性疾病患者和53例正常人的血清樣品進行蛋白芯片檢測。通過Bio-markerWizard軟件分析，發(fā)現(xiàn)分子量為13.71×103、13.83×103和13.99×103的蛋白峰在膽管癌患者血清樣品中明顯低于對照組。進一步通過1-D膠分離、質(zhì)譜鑒定和免疫沉淀分析，確定這3個差異蛋白峰為野生型甲狀腺運載蛋白（nativeTTR）和它的兩個變體（cysTTR和glutTTR）。ELISA和SELDI技術(shù)分析均表明TTRs在膽管癌血清中的表達下調(diào)，提示TTRs可能作為膽管癌診斷的候選血清標志物。SELDI-TOF-MS技術(shù)具有諸多優(yōu)點，如樣品無需復雜的預處理，可直接檢測；操作簡便、快速，能夠在短時間內(nèi)分析大量樣品；靈敏度高，可檢測低豐度蛋白質(zhì)；可以同時檢測多種蛋白質(zhì)，獲取蛋白質(zhì)指紋圖譜，為疾病的診斷和研究提供豐富的信息。但是，該技術(shù)也存在一些不足之處，例如蛋白質(zhì)芯片的特異性和重復性有待提高，可能會出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果；對蛋白質(zhì)的鑒定能力相對有限，通常需要結(jié)合其他技術(shù)（如串聯(lián)質(zhì)譜、免疫印跡等）進一步確認差異表達蛋白質(zhì)的身份；儀器設(shè)備和芯片成本較高，限制了其大規(guī)模應用。2.1.3矩陣輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）矩陣輔助激光解析離子化飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）是一種“軟電離”質(zhì)譜技術(shù)，在生物大分子分析領(lǐng)域具有廣泛應用。其原理是將待測生物樣品與過量的小分子基質(zhì)（如α-氰基-4-羥基肉桂酸、芥子酸等）混合，形成共結(jié)晶薄膜。當用激光脈沖照射該薄膜時，基質(zhì)分子吸收激光能量并迅速氣化，同時將能量傳遞給生物分子，使生物分子解吸并離子化。離子在電場的加速作用下進入飛行時間分析器，由于不同質(zhì)荷比的離子飛行速度不同，根據(jù)離子到達檢測器的時間差異，可計算出離子的質(zhì)荷比，從而得到生物分子的質(zhì)譜圖。在膽管癌蛋白質(zhì)組學研究中，MALDI-TOF-MS常用于對特定蛋白質(zhì)的分析，如鑒定膽管癌組織中的差異表達蛋白質(zhì)、分析蛋白質(zhì)的翻譯后修飾等。有研究采用MALDI-TOF-MS技術(shù)對膽管癌組織和正常膽管組織中的蛋白質(zhì)進行分析，成功鑒定出多個在膽管癌組織中差異表達的蛋白質(zhì)。其中，波形蛋白（Vimentin）在膽管癌組織中表達上調(diào)，通過進一步的功能實驗證實，Vimentin與膽管癌細胞的遷移和侵襲能力密切相關(guān)，可能在膽管癌的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。MALDI-TOF-MS技術(shù)具有靈敏度高、分辨率高、質(zhì)量范圍廣、分析速度快等優(yōu)點，能夠快速準確地測定生物大分子的分子量，適用于分析多肽、蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物分子。此外，該技術(shù)制樣簡單，對樣品的純度要求相對較低，可耐受一定量的鹽、緩沖劑等雜質(zhì)。然而，MALDI-TOF-MS也存在一些局限性，例如在分析復雜樣品時，可能會出現(xiàn)信號重疊和干擾的問題，影響蛋白質(zhì)的準確鑒定；對低豐度蛋白質(zhì)的檢測能力相對較弱；通常只能提供蛋白質(zhì)的分子量信息，對于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能分析，還需要結(jié)合其他技術(shù)進行深入研究。2.2蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是蛋白質(zhì)組學研究中的一項重要技術(shù)，它能夠在微小的芯片表面固定大量的蛋白質(zhì)探針，通過與樣品中的蛋白質(zhì)相互作用，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的高通量檢測和分析。其原理是將各種具有特異性識別能力的蛋白質(zhì)分子，如抗體、抗原、受體、酶等，以高密度點陣的形式固定在固相載體表面，如玻璃片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠等。當含有蛋白質(zhì)的生物樣品與芯片上的探針分子接觸時，目標蛋白質(zhì)會與相應的探針特異性結(jié)合，然后通過檢測標記物（如熒光、放射性同位素等）的信號強度，來確定樣品中目標蛋白質(zhì)的存在和含量。在膽管癌研究中，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)可用于篩選膽管癌的生物標志物、研究膽管癌的發(fā)病機制以及評估膽管癌的治療效果等。有研究利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)對膽管癌患者和健康人的血清進行檢測，篩選出了多個在膽管癌患者血清中差異表達的蛋白質(zhì)。其中，人附睪蛋白4（HE4）在膽管癌患者血清中的表達水平顯著高于健康人，且其表達水平與膽管癌的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。進一步的研究表明，HE4可能通過激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路，促進膽管癌細胞的增殖、遷移和侵襲。這一研究結(jié)果提示，HE4可能作為膽管癌診斷和預后評估的潛在生物標志物，為膽管癌的早期診斷和治療提供了新的思路。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)具有高通量、高靈敏度、高特異性、快速、簡便等優(yōu)點，能夠同時對多個蛋白質(zhì)進行檢測和分析，大大提高了研究效率。同時，該技術(shù)所需樣品量少，對樣品的純度要求相對較低，適用于復雜生物樣品的分析。然而，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)也存在一些局限性，例如芯片的制備成本較高，探針的固定和穩(wěn)定性有待提高；檢測結(jié)果易受樣品中雜質(zhì)和干擾物質(zhì)的影響，可能出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果；對蛋白質(zhì)的鑒定和定量分析能力相對有限，通常需要結(jié)合其他技術(shù)進行進一步驗證。2.3二維電泳技術(shù)二維電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學研究中的經(jīng)典技術(shù)之一，它能夠?qū)碗s的蛋白質(zhì)混合物在兩個不同的維度上進行分離，從而獲得高分辨率的蛋白質(zhì)圖譜。在膽管癌蛋白質(zhì)組學研究中，二維電泳技術(shù)可用于分離和鑒定膽管癌組織或細胞中的差異表達蛋白質(zhì)，為揭示膽管癌的發(fā)病機制和尋找潛在的診斷標志物提供重要線索。二維電泳技術(shù)主要包括二維微分凝膠電泳和傳統(tǒng)二維電泳技術(shù)，下面將分別對這兩種技術(shù)進行介紹。2.3.1二維微分凝膠電泳（2-DDIGE）二維微分凝膠電泳（2-DDIGE）是在傳統(tǒng)二維電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種熒光標記差異蛋白質(zhì)組分析技術(shù)。其基本原理是在傳統(tǒng)二維電泳的第一向等電聚焦之前，將不同樣品中的蛋白質(zhì)分別用不同的熒光染料（如Cy2、Cy3和Cy5）進行標記。這些熒光染料能夠與蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基或半胱氨酸殘基特異性結(jié)合，且標記過程不會影響蛋白質(zhì)的等電點和分子量。標記后的蛋白質(zhì)混合在一起進行二維電泳分離，在同一凝膠上形成不同樣品蛋白質(zhì)的圖譜。由于不同樣品的蛋白質(zhì)被不同的熒光染料標記，通過不同波長的激光激發(fā)，可分別檢測出不同樣品蛋白質(zhì)的熒光信號，從而實現(xiàn)對不同樣品中蛋白質(zhì)表達水平的精確比較。上海交通大學的研究團隊運用2-DDIGE技術(shù)對膽管癌組織和癌旁正常組織進行蛋白質(zhì)組學分析，旨在篩選出與膽管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的差異表達蛋白。研究人員首先收集了10對膽管癌組織和癌旁正常組織樣本，將癌旁正常組織樣本中的蛋白質(zhì)用Cy3標記，膽管癌組織樣本中的蛋白質(zhì)用Cy5標記，然后將標記后的蛋白質(zhì)混合進行二維電泳分離。電泳結(jié)束后，利用Typhoon多功能激光掃描成像系統(tǒng)對凝膠進行掃描，獲得不同樣品蛋白質(zhì)的熒光圖譜。通過ImageMaster2DPlatinum軟件對熒光圖譜進行分析，共檢測到1000多個蛋白質(zhì)點，其中差異表達倍數(shù)在1.5倍以上且具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）的蛋白質(zhì)點有86個。進一步對這些差異表達蛋白進行質(zhì)譜鑒定和生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)多個在膽管癌組織中顯著上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì)，如熱休克蛋白70（HSP70）在膽管癌組織中表達上調(diào)，而谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1（GSTP1）在膽管癌組織中表達下調(diào)。功能分析表明，這些差異表達蛋白主要參與了細胞增殖、凋亡、代謝、信號轉(zhuǎn)導等生物學過程，提示它們可能在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。2.3.2傳統(tǒng)二維電泳技術(shù)及改進傳統(tǒng)二維電泳技術(shù)的原理是基于蛋白質(zhì)的等電點和分子量的差異，將蛋白質(zhì)在兩個不同的維度上進行分離。第一向是等電聚焦（IEF），在電場的作用下，蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點（pI）的不同在pH梯度膠中遷移，當?shù)鞍踪|(zhì)遷移到其等電點位置時，凈電荷為零，停止遷移，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)按等電點的分離。第二向是十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS），在SDS和還原劑的作用下，蛋白質(zhì)分子解聚并帶上負電荷，其遷移率只與分子量有關(guān)，在聚丙烯酰胺凝膠中根據(jù)分子量大小進行分離。經(jīng)過這兩個方向的分離，蛋白質(zhì)在二維凝膠上形成不同的斑點，每個斑點代表一種蛋白質(zhì)，通過對凝膠上蛋白質(zhì)斑點的分析，可以獲得蛋白質(zhì)的等電點、分子量以及表達量等信息。然而，傳統(tǒng)二維電泳技術(shù)存在一些局限性。首先，其分離效率有限，對于一些等電點相近或分子量相近的蛋白質(zhì)，難以實現(xiàn)完全分離。其次，該技術(shù)對低豐度蛋白質(zhì)的檢測靈敏度較低，容易遺漏一些在生物過程中起重要作用的低豐度蛋白質(zhì)。此外，傳統(tǒng)二維電泳技術(shù)的重復性較差，不同實驗室或同一實驗室不同批次的實驗結(jié)果可能存在較大差異。為了克服這些局限性，研究人員對傳統(tǒng)二維電泳技術(shù)進行了一系列改進。例如，結(jié)合熒光標記技術(shù)，提高對低豐度蛋白質(zhì)的檢測靈敏度。在蛋白質(zhì)分離后，使用熒光染料對蛋白質(zhì)進行標記，然后通過熒光成像系統(tǒng)檢測熒光信號，相比于傳統(tǒng)的染色方法，熒光標記技術(shù)具有更高的靈敏度，能夠檢測到更低豐度的蛋白質(zhì)。此外，優(yōu)化樣品制備和電泳條件也有助于提高二維電泳的分離效果和重復性。在樣品制備過程中，采用合適的蛋白質(zhì)提取方法和預處理步驟，減少雜質(zhì)的干擾，提高蛋白質(zhì)的純度。在電泳條件方面，選擇合適的pH梯度膠、凝膠濃度、電泳時間和電壓等參數(shù)，以獲得更好的分離效果。同時，使用自動化的二維電泳設(shè)備和數(shù)據(jù)分析軟件，也能減少人為因素的影響，提高實驗的重復性和準確性。三、膽管癌蛋白質(zhì)組學研究成果3.1差異表達蛋白篩選通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)，研究人員對膽管癌組織或細胞與正常膽管組織或細胞進行比較分析，篩選出了大量差異表達蛋白。這些差異表達蛋白在膽管癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著重要作用，涉及多個生物學過程和信號通路。以下將從細胞周期調(diào)控、細胞凋亡、細胞遷移和侵襲、血管生成等方面對相關(guān)差異表達蛋白進行闡述。3.1.1細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白細胞周期的正常調(diào)控對于維持細胞的正常生長和增殖至關(guān)重要，而細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白的異常表達往往與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在膽管癌研究中，已有多項研究發(fā)現(xiàn)細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白存在異常表達。有研究運用免疫組化方法檢測了50例膽管癌和20例正常膽管組織中細胞周期素D1（CyclinD1）及p16蛋白表達水平。結(jié)果顯示，在膽管癌中CyclinD1蛋白陽性表達率為72.0％（36／50），顯著高于正常膽管組織，而p16蛋白陽性表達率為42.0％（21／50），顯著低于正常膽管組織。進一步分析發(fā)現(xiàn)，CyclinD1和p16表達與膽管癌分化程度、TNM分期、轉(zhuǎn)移及患者生存期相關(guān)。CyclinD1是細胞周期蛋白家族的重要成員，在細胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當CyclinD1異常高表達時，可與細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）結(jié)合形成復合物，促進視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化，從而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，啟動DNA復制相關(guān)基因的表達，使細胞加速進入S期，促進細胞增殖。而p16蛋白是一種細胞周期依賴性激酶4的抑制因子，能夠與CyclinD1競爭性結(jié)合CDK4，阻止細胞由G1期進入S期，抑制細胞的過度增殖。在膽管癌中，CyclinD1高表達和p16低表達，導致細胞周期調(diào)控失衡，細胞增殖失控，進而促進膽管癌的發(fā)生發(fā)展。另有研究檢測了β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）在正常膽管和膽管癌組織的表達。結(jié)果表明，10例良性膽道疾病膽管組織中，β-catenin表達均位于細胞膜，而胞漿表達很少見，CyclinD1表達呈陰性。而在膽管癌組織中，β-catenin的胞膜表達呈不同程度的減少，表現(xiàn)為胞漿或胞核的表達，其異常表達率為71.4％，有淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移的患者其異常表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，生存期小于1年的患者的異常表達率（84％）明顯高于大于1年者。細胞周期蛋白D1的表達率與膽管癌的增殖和分化程度有關(guān)。β-catenin是一種多功能的蛋白質(zhì)，在細胞內(nèi)參與細胞粘附和Wnt信號通路。在正常情況下，β-catenin主要定位于細胞膜，參與細胞間的粘附連接。當Wnt信號通路激活時，β-catenin在胞漿內(nèi)積累并進入細胞核，與T細胞因子（TCF）/淋巴細胞增強因子（LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因的表達，其中包括CyclinD1。在膽管癌中，β-catenin的異常表達和核轉(zhuǎn)位，激活了CyclinD1的表達，從而促進膽管癌細胞的增殖和分化失控，參與膽管癌的發(fā)生發(fā)展。3.1.2細胞凋亡相關(guān)蛋白細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程，對于維持機體的正常生理平衡和組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在膽管癌中，細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達變化會影響癌細胞的凋亡，進而影響腫瘤的發(fā)展。以凋亡抑制蛋白Survivin為例，有研究應用免疫組織化學方法測定51例膽管癌組織和10例正常膽管組織的Survivin表達水平。結(jié)果顯示，膽管癌組織中Survivin陽性表達率顯著高于正常膽管組織。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成員，其主要通過抑制半胱天冬酶（caspase）的活性來抑制細胞凋亡。在膽管癌中，Survivin的高表達使得癌細胞能夠逃避凋亡，從而促進腫瘤細胞的存活和增殖。同時，Survivin還參與細胞周期的調(diào)控，在G2/M期表達上調(diào)，促進細胞有絲分裂的進行，進一步促進膽管癌細胞的增殖。再如X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP），有研究采用免疫組化法檢測50例膽管癌組織和20例正常膽管組織中XIAP蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)XIAP蛋白在膽管癌組織中的陽性表達率為68.0％，顯著高于正常膽管組織。XIAP能夠直接抑制caspase-3、caspase-7和caspase-9的活性，阻斷細胞凋亡信號通路。在膽管癌中，XIAP的高表達抑制了癌細胞的凋亡，使得腫瘤細胞能夠持續(xù)生長和存活，與膽管癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。與之相反，促凋亡蛋白的低表達也會影響膽管癌細胞的凋亡。例如，Bax是一種促凋亡的Bcl-2家族蛋白，在正常細胞中，Bax以單體形式存在于細胞質(zhì)中。當細胞受到凋亡刺激時，Bax會發(fā)生構(gòu)象改變，形成同源二聚體并插入線粒體膜，導致線粒體膜通透性增加，釋放細胞色素C等凋亡因子，激活caspase級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡。有研究表明，在膽管癌組織中Bax蛋白的表達水平低于正常膽管組織，使得膽管癌細胞對凋亡的敏感性降低，從而促進腫瘤的發(fā)展。3.1.3細胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白膽管癌的轉(zhuǎn)移是導致患者預后不良的重要因素，而細胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白在膽管癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族是一類鋅離子依賴性的內(nèi)肽酶，能夠降解細胞外基質(zhì)和基底膜的成分，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。有研究隨機選取106例膽管癌患者，應用SP免疫組化方法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）蛋白的表達。結(jié)果顯示，MMP-2蛋白在膽管癌組織中的陽性表達率為76.42%（81/106），并與膽管癌組織的臨床病理學特征及患者的預后均有密切的關(guān)系。在發(fā)生腫瘤浸潤、淋巴道轉(zhuǎn)移及低分化的腫瘤組織中，MMP-2蛋白高表達。MMP-2能夠降解Ⅳ型膠原、明膠等細胞外基質(zhì)成分，破壞基底膜的完整性，為腫瘤細胞的遷移和侵襲提供條件。此外，MMP-2還可以通過與其他細胞表面分子相互作用，調(diào)節(jié)細胞的粘附和遷移能力，促進膽管癌細胞的轉(zhuǎn)移。巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）在膽管癌組織中的表達也與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。有研究收集87例膽管癌患者腫瘤病灶及癌旁組織的石蠟標本，用免疫組織化學法檢測其中MIF和MMP-9的表達水平。結(jié)果表明，膽管癌組織中MIF和MMP-9染色強度評分、陽性細胞比例評分、陽性表達總評分均顯著高于癌旁組織。病灶中MIF高表達患者和MMP-9高表達患者的腫瘤體積均顯著大于低表達患者，且MIF高表達和MMP-9高表達的患者的總體生存率顯著低于低表達患者。MIF是一種多功能細胞因子，不僅參與炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)，還在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在膽管癌中，MIF可以通過激活細胞內(nèi)的信號通路，上調(diào)MMP-9等蛋白的表達，促進細胞外基質(zhì)的降解，增強膽管癌細胞的遷移和侵襲能力。綜上所述，細胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白如MMP-2、MIF、MMP-9等在膽管癌中的高表達與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，檢測這些蛋白的表達水平有助于評估膽管癌的惡性程度和患者的預后。3.1.4血管生成相關(guān)蛋白血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，為腫瘤細胞提供營養(yǎng)和氧氣，并為腫瘤細胞進入血液循環(huán)轉(zhuǎn)移到其他部位創(chuàng)造條件。在膽管癌中，血管生成相關(guān)蛋白的異常表達對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有重要影響。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種重要的血管生成因子，在膽管癌的血管生成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究應用免疫組織化學方法測定51例膽管癌組織和10例正常膽管組織的VEGF表達水平，發(fā)現(xiàn)VEGF在膽管癌組織中的陽性表達率顯著高于正常膽管組織，且VEGF表達與膽管癌有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。VEGF能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞，促進內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和存活，增加血管通透性，從而誘導新生血管的形成。在膽管癌中，腫瘤細胞分泌的VEGF與血管內(nèi)皮細胞表面的受體結(jié)合，激活下游信號通路，促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和血管生成，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供必要的營養(yǎng)和氧氣供應。此外，血小板衍生生長因子（PDGF）等血管生成相關(guān)蛋白也在膽管癌的血管生成中發(fā)揮作用。PDGF可以刺激血管平滑肌細胞和纖維母細胞的增殖和遷移，參與血管壁的構(gòu)建和血管生成的調(diào)節(jié)。在膽管癌中，PDGF的異常表達可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細胞成分和細胞外基質(zhì)，促進血管生成，進而影響腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。3.2生物功能注釋在膽管癌蛋白質(zhì)組學研究中，對篩選出的差異表達蛋白進行生物功能注釋，有助于深入了解膽管癌的發(fā)病機制和生物學行為。生物功能注釋主要通過京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析和基因本體論（GO）功能富集分析來實現(xiàn)。通過這些分析，可以揭示差異表達蛋白參與的生物學通路、細胞組成和分子功能，為進一步研究膽管癌的發(fā)生發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。3.2.1KEGG通路分析KEGG通路分析是一種常用的生物信息學方法，用于確定差異表達蛋白參與的生物學通路。通過將差異表達蛋白映射到KEGG數(shù)據(jù)庫中的通路，能夠系統(tǒng)地了解這些蛋白在細胞內(nèi)的生物學功能和相互作用關(guān)系。在膽管癌研究中，KEGG通路分析可以揭示膽管癌發(fā)生發(fā)展過程中異常激活或抑制的信號通路，為尋找潛在的治療靶點提供重要線索。以PI3K-AKT信號通路為例，有研究運用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對膽管癌組織和正常膽管組織進行分析，篩選出差異表達蛋白，并通過KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT信號通路在膽管癌中顯著富集且異常激活。PI3K-AKT信號通路是細胞內(nèi)重要的信號傳導通路之一，在細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和代謝等多種生物學過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，該通路受到嚴格的調(diào)控，以維持細胞的正常功能。然而，在膽管癌中，多種因素可導致PI3K-AKT信號通路的異常激活。例如，磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）的催化亞基p110α基因的突變或擴增，可使PI3K的活性增強，從而激活下游的AKT蛋白。此外，生長因子與其受體結(jié)合后，也可通過招募接頭蛋白和激活Ras蛋白，間接激活PI3K-AKT信號通路。異常激活的PI3K-AKT信號通路在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中具有多方面的作用。在細胞增殖方面，AKT可以通過磷酸化激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），mTOR進一步激活下游的p70S6K和4E-BP1等蛋白，促進蛋白質(zhì)合成，從而促進膽管癌細胞的增殖。在細胞凋亡方面，AKT能夠磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad和caspase-9的活性，同時上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，抑制膽管癌細胞的凋亡。在細胞遷移和侵襲方面，PI3K-AKT信號通路可以通過調(diào)節(jié)細胞骨架的重組和細胞粘附分子的表達，促進膽管癌細胞的遷移和侵襲。例如，AKT可以磷酸化肌動蛋白結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)肌動蛋白的聚合和解聚，從而改變細胞的形態(tài)和運動能力。此外，該通路還可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白的表達，降解細胞外基質(zhì)，為癌細胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。在血管生成方面，PI3K-AKT信號通路可以促進血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達和分泌，誘導腫瘤血管生成，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)和氧氣。3.2.2GO功能富集分析基因本體論（GO）功能富集分析是從細胞組成（CellularComponent，CC）、分子功能（MolecularFunction，MF）和生物學過程（BiologicalProcess，BP）三個層面，對差異表達蛋白進行功能注釋和富集分析，以揭示其在細胞內(nèi)的生物學作用。在膽管癌蛋白質(zhì)組學研究中，GO功能富集分析有助于深入了解差異表達蛋白在膽管癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體功能和作用機制。有研究運用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對膽管癌組織和正常膽管組織進行比較分析，篩選出差異表達蛋白，并對這些蛋白進行GO功能富集分析。在細胞組成方面，發(fā)現(xiàn)差異表達蛋白主要富集在細胞外基質(zhì)、細胞膜、線粒體等細胞結(jié)構(gòu)中。其中，細胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的差異表達可能與膽管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。細胞外基質(zhì)是細胞生存和活動的重要環(huán)境，其組成和結(jié)構(gòu)的改變會影響細胞的粘附、遷移和侵襲能力。在膽管癌中，一些細胞外基質(zhì)降解酶（如基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員）的表達上調(diào)，可能導致細胞外基質(zhì)的降解增加，為癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了條件。此外，細胞膜相關(guān)蛋白的差異表達可能影響細胞的信號傳導和物質(zhì)運輸，進而影響膽管癌細胞的生物學行為。線粒體相關(guān)蛋白的差異表達則可能與細胞的能量代謝和凋亡調(diào)控有關(guān)。線粒體是細胞的能量工廠，其功能異常會影響細胞的能量供應和代謝平衡。在膽管癌中，線粒體相關(guān)蛋白的改變可能導致線粒體功能障礙，影響細胞的能量代謝，同時也可能影響細胞凋亡的調(diào)控，使癌細胞更容易逃避凋亡，從而促進腫瘤的發(fā)展。在分子功能方面，差異表達蛋白主要富集在蛋白結(jié)合、酶活性、轉(zhuǎn)運活性等分子功能類別中。其中，具有蛋白結(jié)合功能的差異表達蛋白可能參與細胞內(nèi)的信號傳導和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。例如，一些轉(zhuǎn)錄因子和信號通路中的關(guān)鍵蛋白通過與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的表達和信號的傳遞。在膽管癌中，這些蛋白結(jié)合功能的改變可能導致信號傳導通路的異常激活或抑制，影響癌細胞的增殖、凋亡和分化等生物學過程。具有酶活性的差異表達蛋白可能參與細胞內(nèi)的代謝反應和信號轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)。例如，一些激酶和磷酸酶的活性改變會影響細胞內(nèi)的磷酸化水平，進而調(diào)節(jié)信號通路的活性。在膽管癌中，這些酶活性的異?？赡軐е录毎x紊亂和信號傳導異常，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。具有轉(zhuǎn)運活性的差異表達蛋白則可能參與細胞內(nèi)物質(zhì)的運輸和跨膜轉(zhuǎn)運。例如，一些離子通道蛋白和轉(zhuǎn)運體的表達改變會影響細胞內(nèi)外離子和小分子物質(zhì)的濃度，進而影響細胞的生理功能。在膽管癌中，這些轉(zhuǎn)運活性的變化可能影響癌細胞的生長、存活和轉(zhuǎn)移能力。在生物學過程方面，差異表達蛋白主要富集在細胞增殖、細胞凋亡、細胞遷移、細胞粘附、血管生成、代謝過程等生物學過程中。細胞增殖相關(guān)的差異表達蛋白的異常表達可能導致膽管癌細胞的增殖失控。例如，一些細胞周期調(diào)控蛋白（如細胞周期蛋白D1、p16等）的表達改變，會影響細胞周期的進程，使癌細胞能夠快速增殖。細胞凋亡相關(guān)的差異表達蛋白的變化可能影響膽管癌細胞的凋亡敏感性。例如，凋亡抑制蛋白（如Survivin、XIAP等）的高表達和促凋亡蛋白（如Bax等）的低表達，會使癌細胞逃避凋亡，促進腫瘤的生長。細胞遷移和細胞粘附相關(guān)的差異表達蛋白的改變與膽管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。例如，一些細胞粘附分子（如E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白等）和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達變化，會影響癌細胞與細胞外基質(zhì)和周圍細胞的粘附能力，以及癌細胞對細胞外基質(zhì)的降解能力，從而促進癌細胞的遷移和侵襲。血管生成相關(guān)的差異表達蛋白的異常表達則與膽管癌的血管生成密切相關(guān)。例如，血管內(nèi)皮生長因子等血管生成因子的高表達，會促進腫瘤血管的生成，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供必要的營養(yǎng)和氧氣。此外，代謝過程相關(guān)的差異表達蛋白的改變可能影響膽管癌細胞的代謝模式。在腫瘤細胞中，代謝重編程是一個常見的現(xiàn)象，癌細胞通過改變代謝途徑來滿足其快速增殖和生存的需求。例如，一些參與糖代謝、脂代謝和氨基酸代謝的酶的表達改變，會使癌細胞的代謝模式發(fā)生改變，增強其對營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用能力，促進腫瘤的生長。3.3潛在治療靶點發(fā)現(xiàn)3.3.1針對關(guān)鍵信號通路的靶點在膽管癌的發(fā)生發(fā)展過程中，多種信號通路的異常激活起著關(guān)鍵作用，其中成纖維細胞生長因子受體2（FGFR2）信號通路備受關(guān)注。FGFR2是成纖維細胞生長因子受體家族的重要成員，在細胞的增殖、分化、遷移和存活等生物學過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。在正常生理狀態(tài)下，F(xiàn)GFR2信號通路受到嚴格調(diào)控，以維持細胞的正常功能。然而，在膽管癌中，F(xiàn)GFR2基因常發(fā)生融合、重排或突變等異常改變，導致FGFR2信號通路的異常激活。這種異常激活使得膽管癌細胞獲得了更強的增殖、遷移和侵襲能力，同時抑制了細胞凋亡，從而促進了膽管癌的發(fā)生發(fā)展。針對FGFR2信號通路異常激活這一關(guān)鍵特征，開發(fā)相應的靶向抑制劑成為治療膽管癌的重要策略。例如，佩米替尼（Pemigatinib）是一種強效、選擇性的FGFR1/2/3口服小分子抑制劑，可通過阻斷腫瘤細胞中FGFR介導的信號通路，有效抑制癌細胞的生長和擴散。多項臨床試驗已證實了佩米替尼在治療FGFR2融合或重排的膽管癌患者中的顯著療效。2020年4月17日，佩米替尼被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）加速批準，成為首個適用于治療FGFR2融合/重排的成人復發(fā)或難治性先前治療、不可切除的局部晚期或轉(zhuǎn)移性膽管癌的藥物。在FIGHT-202這項多中心、開放標簽、單臂、多隊列、2期研究中，共招募了146名患者，其中107名有FGFR2融合或重排。所有患者均自行口服佩米替尼，起始劑量為13.5mg，每天一次（21天周期；服用2周，停用1周）。根據(jù)實體瘤療效評價標準1.1版（RECIST1.1）通過獨立審查評估腫瘤反應，結(jié)果顯示107名FGFR2融合或重排患者中有38名（35.5%）達到了集中確認的客觀反應，3名（2.8%）患者已確認完全緩解，35名（32.7%）已確認部分緩解，107名患者中有88名（82%）實現(xiàn)了疾病控制。中位無進展生存期（mPFS）為6.9個月，數(shù)據(jù)截止時的中位總生存期（mOS）為21.1個月。這些數(shù)據(jù)充分表明，針對FGFR2信號通路的靶向治療能夠顯著抑制膽管癌細胞的生長，為膽管癌患者帶來了新的治療希望和生存獲益，也進一步證實了FGFR2信號通路作為膽管癌潛在治療靶點的可行性和重要性。3.3.2蛋白激酶作為靶點蛋白激酶在細胞內(nèi)信號傳導過程中扮演著關(guān)鍵角色，它們通過催化蛋白質(zhì)的磷酸化修飾，調(diào)節(jié)眾多細胞生理功能，包括細胞增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲等。在膽管癌的發(fā)生發(fā)展進程中，蛋白激酶家族中的多個成員發(fā)生異常激活或表達改變，參與了膽管癌的發(fā)病機制。因此，研究這些異常的蛋白激酶，將其作為潛在的治療靶點，對于膽管癌的治療具有重要意義。華中科技大學的研究團隊在蛋白激酶與膽管癌的研究方面取得了重要成果。他們發(fā)現(xiàn)蛋白激酶D家族激酶（PKD1、PKD2、PKD3）在膽管癌組織中呈高表達，并且這種高表達與膽管癌患者的不良預后密切相關(guān)。通過一系列深入的細胞實驗和動物實驗，研究人員揭示了PKD家族激酶在膽管癌中的致癌作用機制。在細胞實驗中，敲低PKD家族激酶的表達能夠顯著抑制膽管癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。進一步的機制研究表明，PKD家族激酶可以通過激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路，促進膽管癌細胞的增殖和存活。在動物實驗中，使用PKD特異性抑制劑處理攜帶膽管癌異種移植瘤的小鼠，結(jié)果顯示腫瘤生長明顯受到抑制。這些研究結(jié)果充分表明，PKD家族激酶在膽管癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的致癌作用，有望成為膽管癌治療的潛在靶點。以PKD家族激酶為靶點，開發(fā)特異性的抑制劑，可能為膽管癌的治療提供新的有效手段，為改善膽管癌患者的預后帶來新的希望。四、案例分析4.1復旦大學對膽管癌蛋白質(zhì)組學的綜合研究4.1.1研究方法與樣本選取復旦大學的研究團隊對膽管癌的蛋白質(zhì)組學展開了深入研究，旨在全面揭示膽管癌的分子特征，為臨床治療提供有力依據(jù)。2022年6月18日，丁琛、侯英勇、樊嘉等學者共同通訊在《Hepatology》上發(fā)表了題為“ProteogenomicCharacterizationofCholangiocarcinoma”的研究論文。在這項研究中，研究人員收集了217個膽管癌（CCA）樣本以及197個配對正常相鄰組織樣本，樣本來源廣泛且具有代表性。研究采用了綜合多組學分析方法，涵蓋了基因組、蛋白質(zhì)組、磷酸蛋白質(zhì)組等多個層面。在基因組分析方面，通過全外顯子組測序技術(shù)，精確檢測樣本中的基因突變和拷貝數(shù)變異等遺傳信息。在蛋白質(zhì)組分析中，運用高分辨率的質(zhì)譜技術(shù)，對樣本中的蛋白質(zhì)進行全面鑒定和定量分析，從而準確篩選出在膽管癌組織和正常組織中差異表達的蛋白質(zhì)。在磷酸蛋白質(zhì)組分析中，利用磷酸化蛋白質(zhì)富集技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜分析，深入研究蛋白質(zhì)的磷酸化修飾情況，因為蛋白質(zhì)的磷酸化修飾在細胞信號傳導過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，通過對其分析能夠揭示膽管癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵信號通路。通過這種多組學聯(lián)合分析的方式，研究人員能夠從不同角度全面了解膽管癌的分子機制，為后續(xù)的研究和臨床應用奠定堅實基礎(chǔ)。4.1.2研究成果與臨床意義通過蛋白質(zhì)組聚類分析，研究團隊成功確定了三種具有不同臨床結(jié)果、分子特征和潛在治療方法的亞型。這三種亞型在臨床預后方面表現(xiàn)出顯著差異，其中一種亞型患者的生存期相對較長，而另外兩種亞型患者的預后則較差。在分子特征上，不同亞型的基因表達譜、蛋白質(zhì)表達譜以及信號通路的激活狀態(tài)都存在明顯差異。例如，在一種亞型中，某些與細胞增殖相關(guān)的信號通路可能被高度激活，而在另一種亞型中，與細胞凋亡相關(guān)的信號通路可能存在異常抑制。這種分子特征的差異為臨床治療提供了重要的指導意義，醫(yī)生可以根據(jù)患者所屬的亞型，制定更加精準的個性化治療方案。對于細胞增殖信號通路高度激活的亞型，可以采用針對該信號通路的靶向抑制劑進行治療，以抑制癌細胞的增殖；而對于細胞凋亡信號通路異常抑制的亞型，可以開發(fā)相應的藥物來激活細胞凋亡，從而達到治療腫瘤的目的。磷酸蛋白質(zhì)組學分析進一步表征了CCA中的可靶向激酶，為臨床治療提供了新的策略。研究發(fā)現(xiàn)，某些激酶在膽管癌組織中呈現(xiàn)異常激活狀態(tài)，并且這些激酶與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)。基于此，研究人員提出使用細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制劑進行有效治療的策略。CDK在細胞周期調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，異常激活的CDK可能導致細胞周期紊亂，促進癌細胞的增殖。使用CDK抑制劑可以阻斷細胞周期的異常進程，抑制癌細胞的生長。MAPK信號通路則參與細胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學過程，在膽管癌中，該信號通路的異常激活可能促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。MAPK抑制劑能夠阻斷該信號通路的傳導，從而抑制癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。這種針對可靶向激酶的治療策略為膽管癌的治療開辟了新的途徑，有望提高膽管癌患者的治療效果和生存率。研究還深入探討了HBV感染對CCA的影響。結(jié)果表明，HBV感染的CCA患者表現(xiàn)出抗原加工和呈遞（APC）增加以及T細胞浸潤增加的特征?？乖庸ず统蔬f過程是免疫系統(tǒng)識別和清除病原體及腫瘤細胞的重要環(huán)節(jié)，APC增加意味著機體的免疫識別能力增強。T細胞是免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵細胞，其浸潤增加表明機體對腫瘤細胞的免疫攻擊能力增強。與未感染HBV的患者相比，HBV感染的CCA患者預后良好。這一發(fā)現(xiàn)提示，對于HBV感染的CCA患者，可以進一步探索免疫治療的可能性，通過增強機體的免疫功能來對抗腫瘤。例如，可以采用免疫檢查點抑制劑來解除免疫系統(tǒng)的抑制狀態(tài)，增強T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用；或者通過過繼性細胞免疫治療，輸入經(jīng)過體外擴增和激活的腫瘤特異性T細胞，以提高機體對腫瘤的免疫應答。4.2樊嘉院士團隊肝內(nèi)膽管癌研究4.2.1多維分子圖譜繪制2021年12月30日，國際頂級生物醫(yī)學期刊《CancerCell》在線發(fā)表了復旦大學（附屬中山醫(yī)院）肝癌研究所樊嘉院士團隊的最新成果“肝內(nèi)膽管癌的蛋白基因組特征圖譜及臨床亞型”的研究論文。樊嘉院士等團隊合作，利用262例在中山醫(yī)院肝外科手術(shù)切除的肝內(nèi)膽管癌患者來源的樣本，綜合基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、磷酸化蛋白質(zhì)組和微生物組等多組學多維度數(shù)據(jù)，首次系統(tǒng)性繪制了肝內(nèi)膽管癌的多維分子圖譜。在基因組分析方面，研究人員對樣本進行全外顯子組測序，共鑒定了12,197個非同義體細胞點突變和603個插入缺失，確定了包括TP53、KRAS、FGFR2、IDH1/2、BAP1、ARID1A和PBRM1在內(nèi)的16個顯著改變的腫瘤驅(qū)動基因。與西方肝內(nèi)膽管癌人群隊列相比，該隊列顯示出更高的KRAS突變頻率和更低的IDH1、ARID1A和TERT突變頻率。此外，研究還在隊列中觀察到黃曲霉毒素和馬兜鈴酸特征，通過比較具有或不具有黃曲霉毒素特征的所有腫瘤的多組學數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)具有黃曲霉毒素特征的腫瘤顯示出DNA修復和細胞周期通路的上調(diào)以及細胞凋亡、感染炎癥和免疫通路的下調(diào)，且TP53突變與黃曲霉毒素特征顯著相關(guān)。在蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組分析中，蛋白質(zhì)組定量到了10,529種蛋白質(zhì)，磷酸化蛋白質(zhì)組定量到了來自9,832個磷酸化蛋白的62,879個磷酸化位點。通過分析體細胞拷貝數(shù)改變（CNAs）對mRNA、蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白豐度的影響，發(fā)現(xiàn)CNAs對這三個層面的豐度具有順式和反式影響。對于mRNA、蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白，總共觀察到3,981、1,081和408個顯著的順式相關(guān)性，3個組學中只有194個共同的顯著順式影響。總共有963種蛋白質(zhì)同時表現(xiàn)出CNA-mRNA和CNA-蛋白質(zhì)順式效應，它們主要富集在代謝、生物合成和蛋白質(zhì)加工通路中。特別地，14q丟失顯示出與蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組豐度的不同相關(guān)性，對于蛋白質(zhì)豐度隨著14q丟失而增加的585個基因，富集到了剪接體、錯配修復、DNA復制、細胞周期和代謝的通路，此外，14q丟失分別顯示對蛋白酶體基因和細胞周期調(diào)節(jié)子的蛋白表達水平的順式和反式影響。通過分析體細胞驅(qū)動突變對蛋白質(zhì)和磷酸化蛋白豐度的影響，發(fā)現(xiàn)了四個最顯著的驅(qū)動突變（TP53、KRAS、IDH1/2和BAP1）與不同生物學通路的關(guān)聯(lián)。TP53突變與細胞周期、藥物代謝、吞噬體和碳代謝通路的上調(diào)以及ECM-粘著斑、PI3K-AKT和Hippo-YAP信號通路的下調(diào)有關(guān)；KRAS突變與炎癥感染和ECM-粘著斑通路中蛋白質(zhì)的增加以及細胞周期通路中的蛋白質(zhì)減少有關(guān)；且研究隊列中有10例肝內(nèi)膽管癌患者攜帶TP53和KRAS共突變，其生存率明顯低于TP53或KRAS單突變患者，TP53或KRAS雙突變的腫瘤中細胞粘附相關(guān)分子高表達；進一步分析表明，ECM和膽汁分泌通路在BAP1突變腫瘤和IDH1/2突變腫瘤中都相互激活，而吞噬體、炎癥和MAPK通路僅在它們中的其中一個相對活躍。研究還對與FGFR2改變和KRAS突變相關(guān)的磷酸化蛋白質(zhì)組變化進行了探索，發(fā)現(xiàn)所有FGFR2突變都位于激酶域之外，在11.9%的樣本中發(fā)現(xiàn)的FGFR2融合主要是由含有二聚化結(jié)構(gòu)域的融合配偶體產(chǎn)生的，以誘導配體非依賴性受體二聚化，且FGFR2融合是肝內(nèi)膽管癌中的早期克隆事件，KRAS突變的腫瘤顯示出MAPK通路的級聯(lián)激活，而RhoGTPase通路在FGFR2改變的腫瘤中顯著上調(diào)，F(xiàn)GFR2改變的腫瘤在PTPN11的Y62和TLN1的Y70位點上顯示出顯著的酪氨酸磷酸化。4.2.2分子分型與治療策略基于上述多組學分析，樊嘉院士團隊建立了以蛋白質(zhì)組為核心肝內(nèi)膽管癌患者的分子分型：炎癥型（S1）、間質(zhì)型（S2）、代謝型（S3）和分化型（S4）。這四個亞型在基因組、免疫微環(huán)境、治療策略、臨床預后等方面具有各自獨特的特征。炎癥型（S1）多為CA19-9表達升高、腫瘤壞死增加，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，KRAS突變及中性粒細胞聚集增加。間質(zhì)型（S2）有較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，TP53基因突變和成纖維細胞富集。代謝型（S3）的特征是HBV病毒感染。分化型（S4）主要是CA19-9表達較低且腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生較少的患者。這種分子分型對于指導臨床的個體化診治具有重要意義。對于炎癥型患者，由于其KRAS突變及中性粒細胞聚集增加，可考慮針對KRAS信號通路的靶向治療，同時結(jié)合免疫治療來調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，增強機體對腫瘤細胞的免疫攻擊。對于間質(zhì)型患者，鑒于其TP53基因突變和成纖維細胞富集，可探索針對TP53相關(guān)通路的治療策略，以及抑制成纖維細胞增殖和活化的方法，以減少腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。對于代謝型患者，考慮到HBV病毒感染的因素，在治療肝內(nèi)膽管癌的同時，應積極進行抗病毒治療，以控制病毒復制，減少病毒對肝臟的損傷，同時結(jié)合針對腫瘤細胞代謝異常的治療手段。對于分化型患者，因其腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生較少，可根據(jù)腫瘤的具體情況，選擇手術(shù)切除、局部消融等治療方法，同時密切監(jiān)測病情，預防腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移。團隊還明確了肝內(nèi)膽管癌五個主要驅(qū)動基因（TP53、KRAS、FGFR2、IDH1/2、BAP1）的針對性的潛在治療靶點。特別是發(fā)現(xiàn)了10%的肝內(nèi)膽管癌存在FGFR2基因的融合和突變，F(xiàn)GFR2融合蛋白不僅驅(qū)動了肝內(nèi)膽管癌發(fā)生發(fā)展、產(chǎn)生了新的靶向治療靶點，而且部分融合蛋白衍生的抗原肽具有較強免疫原性，能夠引起特異性T細胞群的激活和擴增，也是潛在免疫治療靶點。這為肝內(nèi)膽管癌的治療提供了新的方向和策略，通過針對這些驅(qū)動基因的靶向治療和免疫治療，有望提高肝內(nèi)膽管癌患者的治療效果和生存率。4.3膽管癌膽汁蛋白質(zhì)組學研究4.3.1膽汁樣本分析方法膽汁樣本的采集通常在手術(shù)過程中進行，對于接受膽管手術(shù)的患者，在切除腫瘤組織或進行膽管探查時，使用無菌注射器從膽管中直接抽取膽汁。為了確保樣本的質(zhì)量和穩(wěn)定性，采集后的膽汁需立即進行處理，一般將膽汁樣本置于冰上，并在短時間內(nèi)進行離心，以去除細胞碎片和雜質(zhì)。隨后，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，并儲存于-80℃冰箱中備用，以防止蛋白質(zhì)降解和變性。在對膽汁樣本進行蛋白質(zhì)組學分析時，質(zhì)譜分析是常用的核心技術(shù)。首先，需要對膽汁樣本中的蛋白質(zhì)進行提取和分離。常用的蛋白質(zhì)提取方法包括有機溶劑沉淀法、超濾法等。以有機溶劑沉淀法為例，通常使用或三乙酸（TCA）/***來沉淀蛋白質(zhì)。在沉淀過程中，加入適量的有機溶劑，使蛋白質(zhì)從溶液中析出，然后通過離心收集沉淀的蛋白質(zhì)。超濾法則是利用超濾膜的選擇性透過性，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小對其進行分離，使小分子物質(zhì)透過超濾膜，而蛋白質(zhì)被截留，從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的濃縮和純化。分離得到的蛋白質(zhì)需進行酶解處理，將其消化成小分子肽段，以便于質(zhì)譜分析。常用的酶是胰蛋白酶，它能夠特異性地切割蛋白質(zhì)中的精氨酸和賴氨酸殘基的羧基端，將蛋白質(zhì)分解為一系列長度適中的肽段。酶解后的肽段可通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)進行分析。LC-MS/MS將液相色譜的高效分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度和高特異性檢測能力相結(jié)合。在液相色譜分離過程中，肽段根據(jù)其物理化學性質(zhì)的差異在色譜柱中被分離，然后依次進入質(zhì)譜儀。在質(zhì)譜儀中，肽段被離子化，并在質(zhì)量分析器中根據(jù)質(zhì)荷比的不同進行分離，最后由檢測器檢測并記錄離子的信號強度，得到質(zhì)譜圖。通過對質(zhì)譜圖的分析，可確定肽段的氨基酸序列，進而鑒定出蛋白質(zhì)的種類和結(jié)構(gòu)。4.3.2研究成果與潛在應用多項研究通過對膽管癌患者膽汁蛋白質(zhì)組學的分析，取得了一系列重要成果。有研究運用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對膽管癌患者和健康人膽汁樣本進行比較分析，共鑒定到146個蛋白質(zhì)，其中58個蛋白質(zhì)在健康人和膽管癌患者之間存在顯著差異。這些差異表達的蛋白質(zhì)主要涉及細胞生長、分化和轉(zhuǎn)移等生物學過程。另有研究收集16例肝外膽管癌（EHCC）患者和16例Oddi括約肌功能障礙（SOD）患者膽汁標本，采用同位素相對標記與絕對定量技術(shù)（iTRAQ技術(shù)）進行蛋白組學分析，篩選出表達差異超過2倍的蛋白質(zhì)共12個，通過數(shù)據(jù)庫確定4種有診斷意義的蛋白質(zhì)，分別為MUC3a、AnnexinA3、REG3A、Tumor-associatedtrypsininhibitor（TATI）。從功能上分析，這些差異蛋白質(zhì)與癌細胞的發(fā)生、增殖、分化、轉(zhuǎn)移等均具有密切的關(guān)系。這些研究成果在膽管癌的早期診斷和治療中具有潛在的應用價值。差異表達蛋白可作為潛在的生物標志物用于膽管癌的早期診斷。由于膽管癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，現(xiàn)有的診斷方法存在一定的局限性，因此尋找高靈敏度和特異性的生物標志物對于早期診斷至關(guān)重要。上述研究中發(fā)現(xiàn)的MUC3a、AnnexinA3等蛋白質(zhì)在膽管癌患者膽汁中呈現(xiàn)特異性表達，有望通過檢測膽汁中這些蛋白質(zhì)的含量，實現(xiàn)對膽管癌的早期篩查和診斷。通過開發(fā)相應的檢測試劑盒，利用免疫印跡、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）等技術(shù)，對膽汁樣本中的生物標志物進行定量檢測，有助于提高膽管癌早期診斷的準確性。差異表達蛋白還為膽管癌的治療提供了潛在的靶點。了解膽管癌發(fā)生發(fā)展過程中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的作用機制，能夠為開發(fā)新的治療藥物和治療策略提供依據(jù)。以REG3A為例，其在膽管癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，針對REG3A開發(fā)特異性的抑制劑，可能能夠阻斷癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移信號通路，從而達到治療膽管癌的目的。此外，深入研究差異表達蛋白參與的信號通路，如PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路等，有助于揭示膽管癌的發(fā)病機制，為開發(fā)多靶點聯(lián)合治療策略提供理論支持。通過同時靶向多個關(guān)鍵信號通路，能夠更有效地抑制癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移，提高治療效果。五、挑戰(zhàn)與展望5.1現(xiàn)有研究的局限性盡管膽管癌蛋白質(zhì)組學研究取得了一定的成果，但目前仍存在諸多局限性，這些問題在一定程度上限制了該領(lǐng)域的進一步發(fā)展和臨床應用。在樣本方面，樣本量較小是一個普遍存在的問題。許多研究僅納入了少量的膽管癌患者樣本，這使得研究結(jié)果的代表性和可靠性受到質(zhì)疑。例如，在一些關(guān)于膽管癌差異表達蛋白篩選的研究中，樣本數(shù)量可能僅為幾十例，如此小的樣本量難以全面反映膽管癌患者群體的異質(zhì)性。膽管癌具有高度的異質(zhì)性，不同患者的腫瘤細胞在基因表達、蛋白質(zhì)表達和生物學行為等方面存在較大差異。小樣本量研究可能會遺漏一些在少數(shù)患者中出現(xiàn)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)變化，導致研究結(jié)果的偏差，無法準確揭示膽管癌的發(fā)病機制和尋找有效