活動性肺結(jié)核患者外周血單個核細胞INF-γmRNA表達的研究目錄中文摘要........................................................................................................................Ⅰ英文摘要.......................................................................................................................Ⅱ常用縮寫詞中英文對照.............................................................................................Ⅲ前言................................................................................................................................11.材料與方法................................................................................................................21.1病例來源..................................................................................................................21.2外周血單個核細胞（PBMC）和總RNA的提取..................................................21.2.1儀器與試劑..........................................................................................................21.2.2PBMCs的提取......................................................................................................21.2.3總RNA的提取....................................................................................................21.3RNA的逆轉(zhuǎn)錄以及熒光定量PCR.........................................................................31.3.1儀器與試劑..........................................................................................................31.3.2逆轉(zhuǎn)錄PCR..........................................................................................................31.3.3PCR熒光定量分析..............................................................................................41.4統(tǒng)計學處理..............................................................................................................62.結(jié)果............................................................................................................................62.1檢測結(jié)果..................................................................................................................62.1.1擴增曲線圖及熔解曲線圖...................................................................................62.1.2INF-γmRNA定量檢測........................................................................................62.2統(tǒng)計學分析..............................................................................................................63.討論............................................................................................................................64.結(jié)論.............................................................................................................................7參考文獻........................................................................................................................9致謝.............................................................................................................................11摘要目的:比較活動性肺結(jié)核患者與健康人群外周血單個核細胞INF-γmRNA的表達差異。方法:選取2019年7月至2019年12月的13例活動性肺結(jié)核患者為實驗組，22例健康人為對照組，分別提取其外周血單個核細胞的RNA（Trizol法），將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再利用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）方法檢測INF-γmRNA，進而比較兩種人群INF-γmRNA的表達差異。結(jié)果:經(jīng)統(tǒng)計學獨立樣本t檢驗分析，兩組均值比較P值大于0.05，活動性肺結(jié)核患者與健康人群外周血單個核細胞的INF-γmRNA表達差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論:機體外周血單個核細胞INF-γmRNA表達的檢測，能否作為結(jié)核分枝桿菌感染的檢測指標以及活動性肺結(jié)核患者治療的新靶點仍需進一步研究。關(guān)鍵詞:活動性肺結(jié)核;外周血單個核細胞;INF-γ;mRNAAbstractObjective:TocomparetheexpressionofIFN-γmRNAinperipheralbloodmononuclearcellsbetweenhealthypeopleandactivepulmonary

tuberculosispatients.Methods:FromJuly2019toDecember2019,13patientswithactivepulmonarytuberculosiswereselectedastheexperimentalgroupand22healthypeopleasthecontrolgroup.TheRNAofperipheralbloodmononuclearcells(Trizolmethod)wasextractedrespectively,whichwasreversetranscribedintocDNA,thentheINF-γmRNAwasdetectedbyfluorescencequantitativepolymerasechainreaction(qPCR),andthentheexpressiondifferenceofINF-γmRNAwascomparedbetweenthetwogroups.Results:TherewasnosignificantdifferenceintheexpressionofINF-γmRNAinperipheralbloodmononuclearcellsbetweenpatientswithactivepulmonarytuberculosisandhealthypeople.Conclusion:WhetherthedetectionofINF-γmRNAexpressioninperipheralbloodmononuclearcellscanbeusedasadetectionindexofMycobacteriumtuberculosisinfectionandanewtargetforthetreatmentofactivepulmonarytuberculosisstillneedsfurtherstudy.Keywords:activepulmonary

tuberculosis;peripheralbloodmononuclearcells;IFN-γ;mRNA常用縮寫詞中英文對照表英文縮寫英文名稱中文名稱INF-γinterferon-γγ-干擾素RT-qPCRreverse-transcriptasequantitativepolymerasechainreaction逆轉(zhuǎn)錄-實時定量聚合酶鏈反應(yīng)PBMCperipheralbloodmononuclearcells外周血單個核細胞MHC-Ⅱmajorhistocompatibilitycomplex-Ⅱ主要組織相容性復(fù)合體-ⅡCECFP-10/ESAT-6antigencomplexCE抗原復(fù)合物GAPDHglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase甘油醛-3-磷酸脫氫酶前言結(jié)核病是一種傳染病,是世界上十大死亡原因之一,在2018年全世界中1000萬人患有結(jié)核病，大多數(shù)是成年人[1]。結(jié)核病影響范圍廣泛,研究表明有30個國家的結(jié)核病人數(shù)占世界的87%，包括中國、印度、巴基斯坦和南非等國家[2]，因此，預(yù)防和治療結(jié)核病尤為重要，這需要對結(jié)核病進行快速準確的診斷。在結(jié)核病的發(fā)病機理中，主要是結(jié)核分枝桿菌感染引起的細胞免疫反應(yīng)，結(jié)核桿菌侵入人體后，巨噬細胞吞噬病菌并完成抗原加工和呈遞，然后初始T淋巴細胞活化，發(fā)揮細胞免疫的作用，在這個過程中，T淋巴細胞將病菌識別為“非自身”物質(zhì)。其中，T淋巴細胞的輔助性T細胞（主要是Th1亞群）起重要的作用，主要通過分泌γ-干擾素（Interferon-γ，INF-γ）等細胞因子，動員并激活巨噬細胞，吞噬清除結(jié)核分枝桿菌，一方面參與保護性細胞免疫反應(yīng)，另一方面也可能導致病理性的超敏反應(yīng)。細胞免疫反應(yīng)還可以參與細胞毒作用、引起靶細胞凋亡并促進分枝桿菌暴露，幫助清除病病變。研究表明，INF-γ參與機體內(nèi)結(jié)核桿菌的細胞免疫反應(yīng)，結(jié)核患者體內(nèi)的INF-γ含量增加[5]。唐神結(jié)等研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者血清中的INF-γ與病情嚴重程度有關(guān)，病情嚴重者含量多，表明感染結(jié)核分枝桿菌后促使機體產(chǎn)生更多的INF-γ參與抗結(jié)核免疫反應(yīng)[6]。當前的研究主要是在基因翻譯即蛋白水平檢測血清中的INF-γ含量以幫助了解動態(tài)免疫過程，也可以幫助判斷結(jié)核病患者的嚴重程度，這對于結(jié)核病的診斷和預(yù)防有重要的意義。蛋白質(zhì)是由mRNA翻譯而來的，Montenegro等[7]人發(fā)現(xiàn)mRNA的逆轉(zhuǎn)錄-實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）方法對結(jié)核病的診斷具有一定的價值。張菊俠等[8]同樣在研究中發(fā)現(xiàn)，mRNA的RT-qPCR方法可以準確快速地診斷結(jié)核分枝桿菌感染，這對結(jié)核病的早期診斷和治療具有重要意義。本實驗通過比較活動性肺結(jié)核患者和健康人群的外周血單個核細胞INF-γmRNA的表達水平，初步探討INF-γmRNA表達對活動性肺結(jié)核診斷的意義，同時也就INF-γmRNA的RT-qPCR方法對診斷活動性肺結(jié)核的應(yīng)用價值進行研究。1.材料與方法1.1病例與來源收集2019年7月至2019年12月在中國人民解放軍第八醫(yī)學中心全軍結(jié)核病研究所就診的13例活動性肺結(jié)核患者以及22例健康人，年齡在18~60歲之間。1.2外周血單個核細胞（PBMC）和總RNA的提取1.2.1儀器與試劑主要儀器如表1所示。表1主要儀器及供應(yīng)公司儀器名稱供應(yīng)公司高速離心機Eppendorf公司CO2培養(yǎng)箱Thermo公司冷凍離心機Eppendorf公司主要試劑有：淋巴細胞分離液、PMPI1640培養(yǎng)液、異丙醇、氯仿、無血清培養(yǎng)基AIM、無水乙醇、TRIZOL、無RNase水。1.2.2PBMCs的提取標本采集：收集臨床科室活動性肺結(jié)核患者的外周血，且放置于室溫的時間不超過6小時。分離步驟：(1)取10mL無菌EP管，加入5mLRMPI1640培養(yǎng)液，備用，另取無菌的10mLEP管加入3mL淋巴細胞分離液；(2)將外周血充分混勻，緩慢加入到裝有3mL淋巴細胞液的離心管中，待其形成明顯界面后，放置在室溫下離心（2500rpm，20min）；(3)將離心后的淋巴細胞云霧層用移液槍吸取轉(zhuǎn)移至裝有5mLRMPI1640培養(yǎng)液的離心管中，顛倒混勻后放置在室溫下離心（1500rpm，10min）；(4)離心后，棄去上清液，然后加入5mL37℃RMPI1640培養(yǎng)液，重懸沉淀細胞，放置于室溫下離心（1500rpm，10min）；(5)離心后棄去上清液，加入37℃的無血清培養(yǎng)基AIM100L，用移液槍輕輕吹打使細胞懸??；(6)選擇96孔板的適當區(qū)間，將每個樣本的PBMC混懸液加入到每個孔中，并將其分為陽性和陰性對照孔，其中每個陰性孔添加無血清培養(yǎng)基AIM50L，陽性孔添加CE抗原50L；(7)將裝好試劑的96孔板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~20h（37℃，5%CO2）。1.2.3總RNA的提取用移液槍在96孔板中吹打混勻細胞，然后將其轉(zhuǎn)移至無RNase的1.5mL離心管中，放置于室溫下離心（1500rpm，10min）；(2)離心后盡可能棄去上清液，然后加入1mLTRIZOL，在室溫下放置5min使其完全裂解；(3)加入氯仿（200L氯仿/mLTrizol），震蕩混勻后放置在室溫下15min，再離心（4℃，12000g，15min）；(4)離心后，移液槍吸取上層水相轉(zhuǎn)移至另一個無RNase的離心管中，然后添加異丙醇（0.5mL異丙醇/mLTrizol），混勻后放置在室溫下7min，然后離心（4℃，12000g，10min）;(5)離心后棄去上清液，可以看到RNA沉于管底；(6)在離心管中加入75%乙醇（1mL75%乙醇/mLTrizol），輕輕搖動離心管，使沉淀懸浮起來；(7)離心（4℃，7500g，5min），棄取上清液，再次離心（4℃，7500g，1min），離心后盡可能棄去上清液；(8)將沉淀的RNA在室溫干燥5~10min；(9)在離心管中加入12L的無RNA酶水使RNA溶解；(10)提取的RNA后，用分光光度計測定其濃度和純度（A260/2801.8A260/2301.5），然后進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（取其中的1gRNA），但如果RNA總量<1g，則丟棄。1.3RNA的逆轉(zhuǎn)錄以及熒光定量PCR1.3.1試劑與儀器主要儀器如表2。表2實驗儀器及供應(yīng)公司實驗儀器供應(yīng)公司PCR儀杭州博日科技有限公司熒光定量PCR測定儀Roche公司-20℃冰箱澳柯瑪股份有限公司主要材料及試劑：TakaraRR047試劑盒（逆轉(zhuǎn)錄）、熒光定量八聯(lián)管、PCR離心管、冰盒、KAPA4601試劑盒（PCR）。1.3.2逆轉(zhuǎn)錄PCR(1)在冰上將試劑盒試劑解凍；(2)5×PrimeScriptBuffer2（forRealTime）和5×gDNAEraserBuffer在使用前需要用Vortex振蕩混勻，并輕輕離心后再使用，其余的試劑離心至底部后使用；(3)在冰上準備去除基因組DNA的反應(yīng)體系如表3；表3去除基因組DNA的反應(yīng)體系實驗試劑所需體積gDNAEraser1L5gDNAEraserBuffer2LTotalRNALRNaseFreeH2Oupto10L(4)在冰上加入反應(yīng)體系后放入PCR擴增儀內(nèi)（42℃，2min，4℃）；(5)在冰上準備RNA反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系（SYBRGreen）如表4；表4RNA反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系實驗試劑所需體積配制步驟4的反應(yīng)液10LPrimeScriptEnzymeMixI1L1010LMixRTPrimerMix1L5PrimeScriptBuffer2(forRealTime)4LRNaseFreeH2O4LTotal20L(6)在冰上加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系后放入PCR擴增儀內(nèi)（37℃,15min，85℃,5s）；1.3.3PCR熒光定量分析(1)在冰上解凍試劑、內(nèi)參GAPDH引物（上游TGCACCACCAACTGCTTA、下游GGATGCAGGGATGATGTTC）、IFN-γ引物（上游TCGGTAACTGACTTGAATGTCCA、下游TCGCTTCCCTGTTTTAGCTGC）和cDNA模板；(2)將cDNA模板四倍稀釋，做2個復(fù)孔，然后取1個樣本加入反應(yīng)體系以及熒光染料進行擴增，再根據(jù)獲得的Ct值和拷貝數(shù)做一條標準曲線（直接取已做好的）；(3)在冰上配制PCR反應(yīng)體系如表5；表5PCR反應(yīng)體系實驗試劑試劑體積PCR-gradewater7.2LKAPASYBRFASTqPCRMasterMix(2)Universal10L10Mforwardprimer0.4L10Mreverseprimer0.4LTemplatecDNA2L(4)配制好反應(yīng)體系后，在避光條件下將其分裝于八聯(lián)管中，然后將DNA模板對應(yīng)加入已裝好反應(yīng)體系的八聯(lián)管中（在冰上進行），用EP手套將其扣上后輕彈混勻，稍稍離心將其聚集于底部；(5)最后放入熒光定量分析儀中進行擴增。程序如圖1所示。圖1擴增程序圖1.4統(tǒng)計學處理利用公式2-Ct（Ct=CtIFN--CtGAPDHCt=Ct刺激后-Ct未刺激）計算各個樣本的INF-γmRNA含量，利用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)，其中各計量資料以±s表示，兩組均數(shù)的比較采用t檢驗。2.結(jié)果2.1檢測結(jié)果2.1.1擴增曲線圖及熔解曲線圖GAPDH、IFN-γ的擴增曲線圖和熔解曲線圖如圖2、3所示。圖2GAPDH的擴增曲線圖和熔解曲線圖圖3IFN-γ的擴增曲線圖和熔解曲線圖2.1.2INF-γmRNA定量檢測活動性肺結(jié)核組以及健康人群組外周血單個核細胞INF-γmRNA定量檢測結(jié)果如表6所示。表6兩組外周血單個核細胞的INF-γmRNA檢測結(jié)果組別例數(shù)INF-γmRNA活動性肺結(jié)核組137.67±6.52健康組223.79±2.252.2統(tǒng)計學分析經(jīng)t檢驗分析，顯示活動性肺結(jié)核實驗組和健康對照組均值比較無統(tǒng)計學差異，P=0.069(P>0.05)。3.討論世界衛(wèi)生組織在2015年結(jié)核病全球報告中寫出，全球新增結(jié)核病患者病例數(shù)有1040萬，140萬人死于結(jié)核病，結(jié)核病成為了世界十大死亡原因之一[9]。根據(jù)目前的研究，結(jié)核病的有效管理措施包括及時、準確的診斷[10]。在我國傳統(tǒng)的實驗室診斷中，痰培養(yǎng)法是肺結(jié)核病的診斷金標準，也是藥物治療監(jiān)測的重要標準，這種方法可以準確診斷結(jié)核病，但需要的時間長，會導致結(jié)核病的早期治療的延誤[11-12]。因此，及時準確的檢測結(jié)核分枝桿菌的感染對結(jié)核病的治療具有重要的臨床指導意義。有研究報道，在感染結(jié)核桿菌的體內(nèi)，結(jié)核分支桿菌能激活體內(nèi)的炎癥反應(yīng)細胞，使炎細胞釋放較多的細胞因子，加重炎癥反應(yīng)[13]。其中認為INF-γ被是主要的細胞因子，INF-γ能夠激活巨噬細胞及其溶酶體的活性,進而促進病菌的抗原遞呈[14]。研究報告稱，INF-γ參與抗結(jié)核的免疫反應(yīng)可能與下列機制有關(guān)：機體感染結(jié)核桿菌后，巨噬細胞吞噬病菌，經(jīng)抗原加工后將其呈遞給T細胞，T細胞進而分化為有3種亞群細胞的Th細胞群，其中Th1細胞可分泌INF-γ[15],發(fā)揮保護性Th1細胞反應(yīng)。①INF-γ可以激活更多的效應(yīng)細胞細胞和毒性T細胞，增強巨噬細胞的活性[16]。②INF-γ可增加巨噬細胞上主要組織相容性抗原-Ⅱ類分子(MHC-Ⅱ分子)的表達,促進巨噬細胞活化和抗原提呈作用，增強免疫反應(yīng)[17]。③NO能夠促進巨噬細胞的吞噬作用，而INF-γ可以增強巨噬細胞產(chǎn)生NO，進而間接促進巨噬細胞對結(jié)核分枝桿菌的吞噬作用[18]。大量研究表明，結(jié)核患者和健康人群體內(nèi)INF-γ含量有一定差異[19-20]。吳太鋒等檢測發(fā)現(xiàn)，脊柱結(jié)核患者血清INF-γ表達水平比健康受試者高，表明在脊柱結(jié)核的發(fā)病過程中，INF-γ可能參與其中[21]。黃國樓等在研究中發(fā)現(xiàn)，腸結(jié)核患者血清INF-γ高于健康人群，且經(jīng)治療后結(jié)核患者體內(nèi)INF-γ含量減少，12個月后INF-γ含量和正常人體內(nèi)含量基本相同，提示INF-γ能夠作為腸結(jié)核患者病程發(fā)展的重要指標[22]。還有其他研究顯示結(jié)核患者和健康人之間INF-γ表達含量不同[23-25]。鑒于有研究發(fā)現(xiàn)INF-γmRNA的逆轉(zhuǎn)錄-實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）法對肺結(jié)核的診斷具有一定的價值[7-8]。本研究對活動性肺結(jié)核患者和健康人外周血單個核細胞INF-γmRNA的表達含量進行了初步探討。在實驗過程中，RNA很容易降解，因此在提取PBMC以及RNA時特別注意：①臨床患者的外周血不宜冷凍或冷藏，且放置時間不得超過6小時；②吸取淋巴細胞云霧層時，不要吸取下層的紅細胞；③將細胞從96孔板轉(zhuǎn)移至離心管時，應(yīng)注意孔與離心管對應(yīng)加入，否則會因錯誤添加而導致實驗錯誤；④加入氯仿之后，需要劇烈震蕩15s左右，不能使用渦旋；⑤移液槍吸取上層水相轉(zhuǎn)移至離心管時，不能吸取中間界面和下層酚相；⑥提取出的RNA不能太干燥，否則會很難溶解；⑦測RNA濃度和純度時，將RNA至于冰上。在逆轉(zhuǎn)錄過程中也需注意：①從逆轉(zhuǎn)錄開始的所有步驟都應(yīng)在冰上進行；②準備去除基因組DNA和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系時，應(yīng)自備0.2ml的無RNase的PCR離心管，配好體系后放置于冰上；③在反轉(zhuǎn)錄過程中，不配制總Mix的情況下，將反應(yīng)體系試劑加入步驟4的反應(yīng)溶液中時，先加入5PrimeScriptBuffer2(forRealTime)和RNaseFreeH2O，混勻，再加入RTPrimerMix，混勻，再進行反轉(zhuǎn)錄；④將逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA應(yīng)放置于-20℃冰箱凍存。本實驗結(jié)果顯示：GAPDH的擴增曲線圖和熔解曲線圖中曲線傾斜程度基本一致、單一峰且Tm值在80~90℃之間，說明單一產(chǎn)物特異性擴增；IFN-γ的擴增曲線圖和熔解曲線圖中有雙峰且雜峰在主峰之前說明有非特異性擴增，可能是由于引物濃度過高或者模板濃度過低導致?；顒有苑谓Y(jié)核患者和健康人群兩組的外周血單個核細胞INF-γmRNA的表達均值進行統(tǒng)計學處理時P值大于0.05，無統(tǒng)計學意義。可能的原因為實驗數(shù)據(jù)來源的樣本較少，實驗過程不夠熟煉和規(guī)范，導致實驗組和對照組數(shù)據(jù)無統(tǒng)計學意義。因此，要檢驗INF-γmRNA是否可以作為結(jié)核分枝桿菌感染的檢測指標、INF-γmRNA表達量與活動性肺結(jié)核感染程度是否有關(guān)以及INF-γmRNA的RT-qPCR方法對診斷活動性肺結(jié)核的應(yīng)用價值還需進一步加大樣本量，進行規(guī)范的實驗研究才能得出結(jié)論。4.結(jié)論比較活動性肺結(jié)核患者和健康人外周血單個核細胞INF-γmRNA的表達水平差異，無統(tǒng)計學意義。因此，外周血單個核細胞的INF-γmRNA表達是否可以作為診斷和治療活動性肺結(jié)核的新的靶點以及INF-γmRNA的RT-qPCR方法對診斷活動性肺結(jié)核的應(yīng)用價值，還需進一步實驗研究。參考文獻[1]羅一婷,翁榕星,周芳,余衛(wèi)業(yè),陸普選.2019WHO全球結(jié)核報告：全球與中國關(guān)鍵數(shù)據(jù)分析[J].新發(fā)傳染病電子雜志,2020,5(01):47-50.[2]中華醫(yī)學會放射分會傳染病放射學專業(yè)委員會.肺結(jié)核分級診斷影像學診斷專家共識[J].新發(fā)傳染病電子雜志,2018,3(02):118-127.[3]段新亞,盧邵蓉,王宏澤.CD4T淋巴細胞水平與肺結(jié)核患者發(fā)病的相關(guān)性研究[J].云南醫(yī)藥,2019,40(01):88-90.[4]GROENRA,BOLTJESA,HOUJ,etal.IFN‐λ‐mediatedIL‐12productioninmacrophagesinducesIFN‐γproductioninhumanNKcells[J].EuropeanJournalofImmunology.2015.[5]BELAYM,LEGESSEM,MIHRETA.Lipoarabinomannan‐specificTNF‐αandIFN‐γasmarkersofprotectiveimmunityagainsttuberculosis:acohortstudyinanendemicsetting[J].APMIS,2015,123(10):851-857.[6]李紅,唐神結(jié).肺結(jié)核患者外周血sIL-2R、TNF-α、IFN-γ、IL-6的檢測及意義[J].中國防癆雜志,2011,33(01):57-60.[7]R.A.Montenegro,K.M.Guarines,L.M.Montenegro.AssessmentofmessengerRNA(mRNA)ofMycobacteriumtuberculosisasamarkerofcureinpatientswithpulmonarytuberculosis[J].JournalofAppliedMicrobiology,2014,117(1):266-272.[8]張菊俠，楊萬福.基于85BmRNA的逆轉(zhuǎn)錄-實時定量聚合酶鏈反應(yīng)對肺結(jié)核分枝桿菌感染的診斷價值[J].中華實驗和臨床感染病雜志,2019,13(04):316-319.[9]\t"/detail/WWMERGEJ02/SJQB2B7A201194A4D258FA6D087015BF2882/_blank"AnneGullandMorecasesoftuberculosisthanpreviouslythought,WHOreports[J].BMJ,2016,355:i5562.[10]StaggHR,ZennerD,HarrisRJ.Treatmentoflatenttuberculosisinfection:anetworkmeta-analysis[J].AnnInternMed,2014,161(6):419-428.[11]黃曉偉,吳艷紅.878例肺結(jié)核患者痰培養(yǎng)結(jié)果分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學,2016,43(4):762-764.[12]吳皖卿,張堅華,劉勤連.1976例肺結(jié)核患者痰培養(yǎng)及其藥敏檢測的分析[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學,2013,40(19):3687-3690.[13]SharmaS,GoyalMK,SharmaK.Cytokinesdoplayaroleinpathogenesisoftuberculousmeningitis:AprospectivestudyfromatertiarycarecenterinIndia[J].JNeurolSci,2017,379:131.[14]朱飛,張家堂,邢小微.IL-8、MMP-9、INF-γ的檢測對結(jié)核性腦膜炎及病毒性腦膜炎發(fā)病的意義[J].中華神經(jīng)醫(yī)學雜志,2012,11(8):838.[15]VesoskyB,FlahertyDK,TurnerJ.Th1cytokinesfacilitateCD8-T-cell-mediatedearlyresistancetoinfectionwithMycobacteriumtuberculosisinoldmice[J].InfectImmun,2006,74(6):3314-3324.[16]FlynnJL,ChanJ.Tuberculosis:latencyandreactivation[J].InfectImmun,2001,69(7):419