ICS67.050X04DB64食品中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)方法寧夏回族自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理廳發(fā)布IDB64/T1681—2019本標(biāo)準(zhǔn)是按照GB/T1.1—2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則編寫。本標(biāo)準(zhǔn)由寧夏回族自治區(qū)食品檢測(cè)研究院提出。本標(biāo)準(zhǔn)由寧夏回族自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理廳歸口并組織實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：寧夏回族自治區(qū)食品檢測(cè)研究院、寧夏回族自治區(qū)食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：馮秀娟、夏莉娟、鄧軍、高俊峰、董川、趙艷、李雯。1DB64/T1681—2019食品中沙門氏菌和金黃色葡萄球的快速檢測(cè)方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌檢測(cè)的環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增(LAMP)的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的定性檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB4789.4-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)GB4789.10-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)3縮略語(yǔ)DNA(deoxyribonuclelcadd):脫氧核糖核酸。dNTP(deoxyribonucleosidetriphosphate):脫氧核苷三磷酸。femA:金黃色葡萄球菌的甲氧苯青霉素耐藥有關(guān)的基因。fimI:沙門氏菌I型菌毛蛋白調(diào)控基因。LAMP(loop-mediatedisothermalamplification):環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增。TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醚。4生物安全措施按照GB19489中的有關(guān)規(guī)定執(zhí)行。5防污染措施防止污染措施應(yīng)符合GB/T27403的規(guī)定。利用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)進(jìn)行金黃色葡萄球菌、沙門氏菌的篩選檢測(cè)。根據(jù)金黃色葡萄球菌特有的femA基因序列(參見(jiàn)附錄A),沙門氏菌fimI基因序列(參見(jiàn)附錄B)分別設(shè)計(jì)一套特異性引物，特異性識(shí)別靶序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域。利用BstDNA聚合酶啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，分別在金黃色葡萄球菌femA特異基因序列、沙門氏菌fimI特異基因序列啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成很多類似花椰菜結(jié)構(gòu)的莖環(huán)DNA混合物。當(dāng)發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)體系中添加的染色劑 (SYBRGreenI)能以嵌入方式結(jié)合到擴(kuò)增出來(lái)的DNA混合物小溝處，隨著雙鏈DNA的增加，SYBR2DB64/T1681—2019GreenI染料熒光信號(hào)隨之增強(qiáng)，通過(guò)熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物擴(kuò)增情況，從而達(dá)到檢測(cè)目的基因是否得到擴(kuò)增。根據(jù)Ct值以及是否有“S”型擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。7試劑與材料PCR反應(yīng)使用的引物序列應(yīng)符合表1的規(guī)定。表1PCR反應(yīng)使用的引物序列序列(5'-3')擴(kuò)增片段大小(bp)金黃色葡CCTTCAGCAAGCTTTAACTCATAGTTTACAATAATAACGAGGTCATTGCAGCTTTTCTTGAACA沙門氏菌fimI基因TTCGGATCGCAGTCATTCAGGCGATTGGTGGGTCAGGCAGATAACACCAACATTGCGG7.2試劑材料除有特殊說(shuō)明外，所有實(shí)驗(yàn)用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682中一級(jí)水的要求?！X心浸液肉湯(BHI);——DNA提取試劑：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒；——BstDNA聚合酶：酶濃度8U/μL;——dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP,每種核苷酸濃度10mmol/L;——10×ThermoPol緩沖液含：0.2mol/LTrisHCl,0.1mol/L氯化鉀，0.1mol/L硫酸銨，20mol/L硫酸鎂，1%TritonX-100;——硫酸鎂：50mmol/L;——甜菜堿：5mol/L;——顯色液：SYBRGreenI熒光染料，0.01mM;——陽(yáng)性對(duì)照：沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株或等效標(biāo)準(zhǔn)菌株；——無(wú)菌玻璃器皿(90mm培養(yǎng)皿、500mL三角瓶、1mL移液管、涂布棒);——1000mL無(wú)菌均質(zhì)袋；——1.5mL塑料離心管，200μLPCR反應(yīng)管；——也可采用等效的金黃色葡萄球菌LAMP檢測(cè)試劑盒，沙門氏菌LAMP檢測(cè)試劑盒，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，有關(guān)試劑盒的相關(guān)要求參見(jiàn)附錄C,附錄D。3DB64/T1681—20198儀器與設(shè)備儀器與設(shè)備包括：——恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃;——移液器：量程0.5μL～10μL;量程10μL～100μL;量程100μL～1000μL;——高速臺(tái)式離心機(jī)：≥13000r;——金屬?。?00℃±1℃;——計(jì)時(shí)器；——熒光定量PCR儀。9檢測(cè)程序9.1金黃色葡萄球菌檢測(cè)程序見(jiàn)圖1。待測(cè)樣品25g(mL)樣品+225mL7.5%氯化鈉肉25g(mL)樣品+225mL0.85%生理鹽水，均質(zhì)36℃±1℃18h～24h取100μL增菌液提取DNA選擇2個(gè)~3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度的樣品勻液，接種Baird-Parker平板36℃±1℃24h～48h挑取Baird-Parker平板上的可疑菌落提取DNALAMP反應(yīng)結(jié)果觀察報(bào)告圖1金黃色葡萄球菌檢測(cè)程序49.2沙門氏菌檢測(cè)程序見(jiàn)圖2。報(bào)告圖2沙門氏菌檢測(cè)程序10操作步驟10.1樣品制備與增菌培養(yǎng)10.1.1金黃色葡萄球菌按照GB4789.10—2016第一法5.1、5.2進(jìn)行操作或第二法8.1、8.2、8.3進(jìn)行操作。金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株直接接種到BHI培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h,做陽(yáng)性對(duì)照。10.1.2沙門氏菌按照GB4789.4—2016中5.1預(yù)增菌進(jìn)行操作。沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株直接接種到BHI培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h,做陽(yáng)性對(duì)照。10.2.1增菌液模板DNA的制備DB64/T1681—20195直接取增菌液100μL加到1.5mL無(wú)菌離心管中，渦旋震蕩混勻，100℃±1℃條件下熱浴5min~10min,3000r離心3min,上清液即為模板DNA。若不能當(dāng)天檢測(cè)，吸取上清液于無(wú)菌離心管中，置-20℃以下保存?zhèn)溆谩Ｒ部捎眉?xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌DNA,按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。10.2.2可疑菌落DNA的制備(適用GB4789.10—2016第二法)用1μL接種環(huán)挑取Baird-Parker瓊脂平板上的可疑菌落，懸浮在200μL0.85%滅菌生理分打散制成菌懸液，之后按10.2.1步驟進(jìn)行操作。10.3環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增在試劑配制區(qū)進(jìn)行，在低溫條件下進(jìn)行體系配制。沙門氏菌每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制見(jiàn)表2(25μL反應(yīng)體系):金黃色葡萄球菌每個(gè)樣品測(cè)試反應(yīng)體系配制見(jiàn)表3(25μL反應(yīng)體系):表2金黃色葡萄球菌反應(yīng)體系外引物1(F3)外引物2(B3)內(nèi)引物1(FIP)內(nèi)引物2(BIP)一DNA模板2一一8一表3沙門氏菌反應(yīng)體系外引物1(F3)外引物2(B3)內(nèi)引物1(FIP)內(nèi)引物2(BIP)環(huán)狀上游引物(LF)環(huán)狀下游引物(LB)6DB64/T1681—2019表3沙門氏菌反應(yīng)體系(續(xù))一28在樣品制備區(qū)進(jìn)行。在各設(shè)定的PCR反應(yīng)管中分別加入制備好的模板DNA溶液2μL,蓋緊管蓋，離心5s~10s。10.3.3反應(yīng)過(guò)程在擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行。將10.3.2中離心后的PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)內(nèi)，記錄樣本擺放順序。63℃恒溫?cái)U(kuò)增45min,反應(yīng)程序?yàn)椋?3℃15s,63℃45s作為一個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)從16s~60s收集熒光信號(hào)，總計(jì)45個(gè)循環(huán)。檢測(cè)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線和起峰時(shí)間判定結(jié)果。10.3.4空白對(duì)照、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置每次擴(kuò)增反應(yīng)應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照、空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照?？瞻讓?duì)照以滅菌水替代DNA模板。陰性對(duì)照以提取非目標(biāo)菌DNA代替模板DNA。陽(yáng)性對(duì)照制備：按10.1、10.2.1步驟進(jìn)行操作。10.3.5質(zhì)量控制以下條件有一條不滿足時(shí)，實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效：a)空白對(duì)照：曲線為直線，無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線；b)陰性對(duì)照：曲線為直線或輕微斜線，無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線；c)陽(yáng)性對(duì)照：呈“S”型擴(kuò)增曲線。11結(jié)果與表述11.1結(jié)果的判定空白對(duì)照、陰性對(duì)照以及陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果正常。待檢樣品若有“S”型擴(kuò)增曲線，則判斷樣品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；若無(wú)“S”型擴(kuò)增曲線，或呈一條直線或傾斜的直線，且檢測(cè)出峰時(shí)間為0,判斷樣品檢測(cè)結(jié)果為陰性。11.2.1金黃色葡萄球菌DB64/T1681—20197結(jié)果表述為：每25g(mL)樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。11.2.2沙門氏菌結(jié)果表述為：每25g(mL)樣品中檢出或未檢出沙門氏菌。12廢棄物處理檢測(cè)過(guò)程中的廢棄物，收集后經(jīng)紫外照射30min,高壓滅菌，121℃,30min。8(資料性附錄)金黃色葡萄球菌femA基因特異序列A.1金黃色葡萄球菌femA基因序列(accessionno.AF144661)1atgaagtttacaaatttaacagctaaagagtttggtgcctttacagatagcatgccatac61agtcattcacgcaaactgttggccactatgagttaaagcttgctgaaggttatgaaaca121catttagtgggaataaagaacaataataacgaggtcattgcagcttgcttacttactgct181gtacctgttatgaaagtgttcaagtattttattcaaatcgcggtccagtgatcgattat241gaaaatcaagaactcgtacacttttctttaatgaattatcaaaatatgttaaaaaacat301cgttgtctatacctacatatcgatccatatttaccatatcaatacttgaatcatgatggc361gagattacaggtaatgctggtaatggttggttctttgataaaatgagtaacttaggatt421gaacatactggattccataaaggattgatcctgtgctacaaattcgttatcactcagtg481ttagatttaaaagataaaacagcagatgacatcattaaaaatatggatggacttagaaaa541agaaacacgaaaaaagttaaaaagaatggtgttaaagtaagatatttatctgaagaagaa601ctaccaattttagatcattcatggaagatacgtcagaatcaaaagctttgctgatcgt661gatgacaagtttattacaatcgcttaaaatattacaaagaccgtgtgttagtgccttta721gcgtatatcaattgatgaatatattaaagaactaaatgaagagcgtgatattttaaac781aaagattaaataaagcattaaaggatattgaaaaacgtcctgaaaacaaaaaagcgcat841aacaagcgagataacttacaacaacaacttgatgcaaatgagcaaaagattgaagaaggt901aaacgtctacaagaagaacatggtaatgaattacctatctctgctggtttcttctttatc961aatccattgaagttgtttattatgctggtggtacatcaaatgctttccgtcatttgcc1021ggaagttatgcagtgcaatgggaaatgattaattatgcattaaatcatggcattgaccgt1081tataattctatggtgttagtggtaaatttactgaagatgctgaagatgctggtgtagtt1141aaattcaaaaaaggttacaatgctgaaattattgaatatgttggtgactttattaaacca1201agtaataaacctgtttacacagcatataccgcacttaaaaaagttaaagacagaatttt9DB64/T1681—2019(資料性附錄)沙門氏菌fimI基因特異序列B.1沙門氏菌fimI基因序列(Accessionno.AF083911.1)1cctacgccggtgagcgtgagtggcggtactattcatttcgaaggtaaactggttaatgcg61gcctgtgccgtcagcactaaatccgccgatcaaacggtgacgttgggtcaataccgtacc121gccagcttacggcgattggtgatacgaccgcacaggtgcctttcaccatcgtcctgaat181gactgcgatccgaaagtggcggccaccgctgccgttgctttctctggtcaggcagataac241accaacaataatttgctggctgtctcctctgcggataatagcaccaccgcaaccggcgtc301gggattgaaattcttgataatacctcctcaccgttgaagccggacggcgcgaccttctcg361gcgaagcagtcgctggttgaaggcaccaatacgctgcgttttaccgcacgctataaggca421accgccgccgctacgacgccaggccaggctaatgccgacgccacctttatcatgaaatac481gaataatcccgtcaggaaacgccagggaagaaagacgcctcaatggaagaggctatcggg541gataaaagaga