第頁(yè)單分子定位超分辨成像【摘要】傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡無法分辨超小的物體，那是因?yàn)槭艿焦鈱W(xué)衍射極限的影響。阿貝衍射極限為0.5波長(zhǎng)除以NA，由于可見光最小大概在400nm左右，因此傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡只能最多分辨200nm左右，而要超過這個(gè)分辨率，就出現(xiàn)了超分辨技術(shù)。而激光掃描共聚焦顯微成像技術(shù)雖然能夠一定程度上提高分辨率，但是能得到的效果非常有限。于是人們開始了對(duì)超分辨成像的研究。我主要介紹的就是單分子超分辨這一塊。【關(guān)鍵詞】STORM,PALM,超分辨發(fā)展歷史和原理：（1）發(fā)展歷史：傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡無法分辨超小的物體，那是因?yàn)槭艿焦鈱W(xué)衍射極限的影響。阿貝衍射極限為0.5波長(zhǎng)除以NA，由于可見光最小大概在400nm左右，因此傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡只能最多分辨200nm左右，而要超過這個(gè)分辨率，就出現(xiàn)了超分辨技術(shù)。而激光掃描共聚焦顯微成像技術(shù)雖然能夠一定程度上提高分辨率，但是能得到的效果非常有限。于是人們開始了對(duì)超分辨成像的研究。隨著熒光探針，激光器，探測(cè)器等技術(shù)成熟，對(duì)生物的醫(yī)學(xué)及亞細(xì)胞和大分子的進(jìn)一步研究需求擴(kuò)大，超分辨技術(shù)開始出現(xiàn)，根據(jù)超分辨的原理不同，這個(gè)技術(shù)可以分為兩大類：一是超衍射極限模式的激發(fā)模式，二是對(duì)分子定位的超分辨成像。單分子定位超分辨就是屬于第二類，那他是怎么實(shí)現(xiàn)超分辨的呢？首先是威廉莫納，他一方面首先探測(cè)出了熒光分子，另一方面他也發(fā)現(xiàn)了控制熒光蛋白發(fā)光的方法，即“光激活”，奠定了技術(shù)的基礎(chǔ)。后來來了三位科學(xué)家發(fā)明的技術(shù)：光激活點(diǎn)位顯微，隨機(jī)光學(xué)重建顯微，熒光激活定位顯微這三個(gè)技術(shù)讓單分子定位超分辨有了實(shí)現(xiàn)的可能。這些熒光的激活定位，讓顯微超分辨成像變得容易，他可以定位細(xì)胞的分子大小的結(jié)構(gòu)，并讓其被辨別。原理PALM是光激活定位顯微技術(shù)，其基本原理是用PA-GFP來標(biāo)記蛋白質(zhì)，通過調(diào)節(jié)低波長(zhǎng)激光器的能量，得到較低能量照射細(xì)胞表面，一次僅僅激活出視野范圍內(nèi)稀疏分布的幾個(gè)熒光分子，然后用高波長(zhǎng)激光照射，通過高斯擬合來精確定位這些熒光單分子，在確定這些分子的位置后，我們依然長(zhǎng)時(shí)間使用高波長(zhǎng)激光照射來漂白這些已經(jīng)被定位正確的熒光分子，使他們不能夠被下一輪的激光再激活出來,如此循環(huán)，就可以犧牲時(shí)間獲得一副超分辨圖像（如下圖）。[3]這樣的做法很明顯會(huì)讓實(shí)驗(yàn)只能做一次，因?yàn)槠走^后就不能再使用了，這就是它小小的弊端。STORM技術(shù)即StochasticOpticalReconstructionMicroscopy中文是隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)是用很弱的光激發(fā)熒光分子，使得細(xì)胞的一小部分光分子發(fā)光，而不是全部。這樣由于發(fā)光的點(diǎn)分布比較分散，重疊比較少，每一個(gè)光暈都可以近似為一個(gè)熒光分子。在一次激發(fā)中，可以確定一部分光暈的中心，然后在下一次激發(fā)中，可以確定另外一部分光暈的中心，我們就這樣不斷循環(huán)，然后把這么多的效果圖像疊加，就能形成一個(gè)完整的超分辨圖像。相關(guān)技術(shù)介紹三維STORM技術(shù)。傳統(tǒng)的熒光成像中縱向分辨率完全由高斯函數(shù)擬合曲線光強(qiáng)分部決定。普通的熒光顯微成像一般以平面為主，而這個(gè)技術(shù)可以調(diào)整出一個(gè)縱向分辨率，讓圖像看上去更加的立體。要提高z軸的分辨能力，引入一個(gè)低光角度的柱面鏡到出射的光束路徑中，引入一個(gè)軸向散光，因此可以得到一個(gè)提高軸向z分辨率的方法。利用這個(gè)方法就容易給出細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的3D圖像。（如下圖）[1]多色STORM技術(shù)。在光可控開關(guān)熒光蛋白對(duì)的基礎(chǔ)上，建立Cy3與一系列的熒光蛋白對(duì)例如Cy5.5，Cy3-Cy7這類的蛋白對(duì)在不同的波長(zhǎng)的激光激發(fā)下，可以產(chǎn)生不同的熒光發(fā)射特性，以這可以實(shí)現(xiàn)多色熒光成像分析。這樣就可有不同結(jié)構(gòu)有不同的顏色，實(shí)現(xiàn)多色STORM的技術(shù)。雖然這種超分辨技術(shù)比較精確，但PALM與STORM都有其優(yōu)缺點(diǎn)。PALM的優(yōu)點(diǎn)是分辨率極高，可以看到比較精細(xì)的結(jié)構(gòu)，不僅如此，它還可以用于活細(xì)胞檢測(cè)，這是很難能可貴的，這說明了PALM技術(shù)可以看到一些動(dòng)態(tài)的活細(xì)胞結(jié)構(gòu)。但是缺陷也很明顯，PALM只能定位那些外源的蛋白質(zhì)，而細(xì)胞內(nèi)部的內(nèi)源蛋白質(zhì)無法定位。當(dāng)然，它只能測(cè)一次，無法再對(duì)此進(jìn)行二次測(cè)試。STORM的優(yōu)點(diǎn)也是分辨率極高，同樣可以在理論上可能達(dá)到1nm，這都是單分子超分辨技術(shù)的特點(diǎn)，然而STORM比起PALM，不僅也能用于活細(xì)胞檢測(cè)，而且能夠重復(fù)測(cè)量，當(dāng)然少不了它的STORM多色成像。但是相對(duì)于PALM來說，它成像的速度非常慢，這是一種犧牲時(shí)間來獲得分辨率的方法。展望超分辨顯微成像技術(shù)在問世之后就迅速獲得諾貝爾獎(jiǎng)，足以看出這項(xiàng)充滿潛力的技術(shù)對(duì)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大影響。兩大類的超分辨成像逐漸成熟，理論基礎(chǔ)基本完備，但是應(yīng)用方面與普通的共聚焦顯微鏡還有較大的差距。因此這個(gè)潛力巨大的項(xiàng)目受到了大家的關(guān)注，各個(gè)領(lǐng)域的專家學(xué)者將更多的興趣與科研能力投入其中，我們可以展望到它的未來是美好的。超分辨成像技術(shù)今后的突破應(yīng)該在：1.針對(duì)目前的醫(yī)學(xué)與生物問題進(jìn)行有效的應(yīng)用。2.針對(duì)原有技術(shù)的多模態(tài)發(fā)展更多的投入。3.成像流程和圖像分析技術(shù)的廣泛普及和簡(jiǎn)化。[2]4.降低應(yīng)用的設(shè)備的成本?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】[1]王成，