當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的影響摘要目的：研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)血管性癡呆大鼠（VD）學(xué)習(xí)記憶能力和膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)Ach(乙酰膽堿)含量和AchE（乙酰膽堿酯酶）活性的影響。方法：80只造模后篩選出造模成功大鼠40只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性藥物組（吡拉西坦膠囊）、當(dāng)歸補(bǔ)血湯中，高劑量組。各組大鼠灌胃給藥30天后，進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力，并檢測(cè)各組大鼠海馬組織的膽堿指標(biāo)。結(jié)果：⑴水迷宮空間搜索實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)歸補(bǔ)血湯中、高劑量組、陽(yáng)性組與模型組比較，逃逸平臺(tái)滯留時(shí)間、有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著減少，逃逸平臺(tái)進(jìn)入次數(shù)顯著增加，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。⑵與模型組比較，各組的Ach含量顯著升高（P<0.01），除陽(yáng)性組外AchE活性，其余各組顯著降低(P<0.01)。結(jié)論：當(dāng)歸補(bǔ)血湯通過調(diào)控Ach的含量和其抑制劑AchE的活性改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，對(duì)血管性癡呆有治療作用。關(guān)鍵詞：血管性癡呆學(xué)習(xí)記憶能力乙酰膽堿乙酰膽堿酯酶血管性癡呆（VD）是目前發(fā)病率較高且可以預(yù)防治療的癡呆病癥，其重要表現(xiàn)是學(xué)習(xí)記憶能力的損害。血管性癡呆在中醫(yī)學(xué)中號(hào)稱“呆病”，病位在腦。出現(xiàn)神思遲鈍，遇事善忘，易喜易怒等癥狀，屬于氣虛血瘀、外實(shí)內(nèi)虛，中風(fēng)后腦絡(luò)阻塞，氣血津液難以輸布，陰陽(yáng)失調(diào)，治療時(shí)應(yīng)用補(bǔ)氣養(yǎng)血的治法。當(dāng)歸補(bǔ)血湯善治血虛熱綜合征，也可用于補(bǔ)血?dú)馓?，血管性癡呆的大部分臨床表現(xiàn)，符合當(dāng)歸補(bǔ)血湯的主治證1。并且趙歡等通過臨床實(shí)驗(yàn)研究證明用當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療血管性癡呆優(yōu)于傳統(tǒng)補(bǔ)腎法治療2。但目前對(duì)于當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療血管性癡呆的作用尚未闡明。臨床研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)同學(xué)習(xí)認(rèn)知過程有密不可分的關(guān)系?；浊澳X皮層和海馬的膽堿能神經(jīng)纖維是腦組織內(nèi)最主要的膽堿能通路，對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力的影響占主導(dǎo)地位，在學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮至關(guān)重要的作用3。大腦的學(xué)習(xí)記憶能力強(qiáng)弱主要和海馬組織中乙酰膽堿水平高低有關(guān)4，而腦內(nèi)乙酰膽堿水平的高低由其活性抑制劑AchE所決定。本實(shí)驗(yàn)通過研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及其膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)Ach的含量和AchE的活性的影響，探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)血管性癡呆起效的作用機(jī)制。材料和儀器1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)Wista大鼠80只，體重（250g-300g）由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（甘）2015-0005,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證許可證號(hào)：SCXK（甘）2015-002。1.2實(shí)驗(yàn)藥品藥材購(gòu)買自黃河藥市，,經(jīng)鑒定，當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根。黃芪豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge.var.mongholicus(Bge).Hsiao的根陽(yáng)性藥物（吡拉西坦膠囊）購(gòu)自陜西白鹿制藥股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)為：190409。1.3實(shí)驗(yàn)試劑及儀器乙酰膽堿酯酶AchE試劑盒，批號(hào)為：20200224乙酰膽堿ACH試劑盒,批號(hào)為：20200410考馬斯亮蛋白試劑盒批號(hào)為：20200314，上述試劑盒均生產(chǎn)自南京建成生物研究所。Morris水迷宮（型號(hào)：MT-200,成都泰盟科技有限公司）酶聯(lián)儀（型號(hào)：Benchmark

Plus，美國(guó)伯樂公司）2.方法2.1治療藥液的制備：治療中藥當(dāng)歸補(bǔ)血湯由《內(nèi)外傷辨惑論》確定比例為黃芪：當(dāng)歸＝5：1，藥材：加入的水量=1：10，將藥材浸潤(rùn)一小時(shí)后，煮沸計(jì)時(shí)一小時(shí)過濾。再次加入（藥材：加入的水量=1：8）水熬制40分鐘后過濾，將兩次熬制的藥液合并濃縮。濾冷凍干燥成粉末，給藥時(shí)將陽(yáng)性藥物和當(dāng)歸補(bǔ)血湯干燥粉末分別用蒸餾水配置成相應(yīng)濃度的溶液。2.2模型制備：采用顧靜等[5]

血管性癡呆模型制備采用頸動(dòng)脈反復(fù)夾閉注射硝普鈉單側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎法造模。2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥：制備模型7天后采用水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選大鼠，評(píng)價(jià)造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：（模型組大鼠找到平臺(tái)時(shí)間的均值的總和的均值）-（假手術(shù)組大鼠找到平臺(tái)時(shí)間的均值的總和的均值）/每只大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間的平均值，若比值大于20％則判定為癡呆大鼠，造模成功[6]。將造模成功的大鼠分為4組陽(yáng)性藥物組（吡拉西坦膠囊）、當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組、高劑量組和模型組。查閱文獻(xiàn)[4]

設(shè)定陽(yáng)性藥物（吡拉西坦膠囊）0.324g/kg.d，當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量36g/kg.d，高劑量54g/kg.d。每日一次，連續(xù)30天。假手術(shù)組和模型組給與同等劑量的生理鹽水。2.3Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[7]

：水溫恒溫在18-22℃，水中加入黑色墨汁，使水面不反光。在水迷宮壁上沿粘貼四個(gè)不同顏色不同形狀的圖案做標(biāo)記，將水迷宮分為四個(gè)象限，將第四象限正中位置選做平臺(tái)，水面沒過平臺(tái)2-3cm。第1-5天首先進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，每天每只大鼠放入不同的象限訓(xùn)練3次（有平臺(tái)的象限不進(jìn)行訓(xùn)練）。每次將大鼠頭朝向貼有標(biāo)記的水迷宮池壁，放入水中，用設(shè)備記錄大鼠在水中找到平臺(tái)的時(shí)間，若120S內(nèi)未找到平臺(tái)位置，將其放在平臺(tái)上停留15S，來加深大鼠的記憶。定位航行實(shí)驗(yàn)持續(xù)做5天，并在第五天進(jìn)行空間搜索，移除平臺(tái)，隨機(jī)選擇一個(gè)象限作為入水點(diǎn)（第一象限）將大鼠放入水中，記錄60s內(nèi)大鼠的穿行平臺(tái)的次數(shù)，測(cè)試大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。2.4血管性癡呆大鼠海馬體中膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿及乙酰膽堿酯酶水平的測(cè)定：用濃度為10%的麻醉劑（水合氯醛）麻醉各組大鼠，將海馬組織分離，裝入凍存管中，放入液氮中，之后放入－80℃冰箱。Ach測(cè)定加入9倍量的預(yù)冷的組織提取液，制備組織勻漿液，然后根據(jù)試劑盒測(cè)定Ach、AchE的活性。2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)用SPSS21．0軟件處理，數(shù)據(jù)以`x±S表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05或P<0.01為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.結(jié)果3．1當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)癡呆模型大鼠的各組逃生平臺(tái)停留時(shí)間，逃生平臺(tái)進(jìn)入次數(shù)及進(jìn)入有效范圍活動(dòng)時(shí)間的影響同假手術(shù)組作比較，模型組的逃生平臺(tái)停留時(shí)間及有效范圍活動(dòng)時(shí)間顯著降低、逃生平臺(tái)進(jìn)入次數(shù)顯著減少(P<0．01)、分別降低或減少80.47%、64.70%、69.08%，表明大鼠癡呆模型造模成功。與模型組比較，三個(gè)給藥組的逃生平臺(tái)停留時(shí)間及有效范圍活動(dòng)時(shí)間顯著升高、逃生平臺(tái)進(jìn)入次數(shù)顯著增加(P<0．01)、當(dāng)歸補(bǔ)血湯中和高劑量組，陽(yáng)性組依次增加231.70%、100%、145.22%和526.82%、155.33%、347.82%，和229.26%、133.33%、155.65%，表明各給藥組均對(duì)血管癡呆大鼠治療有作用。與陽(yáng)性組相比較當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組逃逸平臺(tái)滯留時(shí)間及有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著升高、逃逸平臺(tái)進(jìn)入次數(shù)顯著增加(P<0．01)、分別增加90.37%、9.4%、42.91%，表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯的高劑量組治療效果更好。結(jié)果見表1表1Morris水迷宮空間搜索試驗(yàn)結(jié)果(`x±S，n=8)組別逃逸平臺(tái)滯留時(shí)間S逃逸平臺(tái)進(jìn)入次數(shù)有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間(s)假手術(shù)組2.10±0.64△△##4.25±0.50△△#3.72±0.88△△模型組0.41±0.12**##1.50±0.84**##1.15±0.67**#高劑量2.57±0.50△△##3.83±0.97△△5.15±1.27*△△##中劑量1.36±0.40**△△3.00±0.75**△△2.82±0.96△陽(yáng)性1.35±0.41**△△3.50±0.92*△△2.94±0.76△注：與假手術(shù)組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01；與陽(yáng)性藥比較#P<0.05，##P<0.01假手術(shù)組模型組陽(yáng)性組當(dāng)歸補(bǔ)血湯中劑量組高劑量組水迷宮實(shí)驗(yàn)空間搜索軌跡圖3.2當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)血管性癡呆大鼠Ach、AchE含量的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬體勻漿中的Ach含量顯著降低(P<0．01)，AchE活性顯著升高，分別降低或升高99.64%、33.80%，表明造模成功。與模型組比較，當(dāng)歸補(bǔ)血湯高、中劑量組和陽(yáng)性組的Ach含量顯著增加(P<0．01)，分別增加83.92%、75.35%、56.90%、除陽(yáng)性組外AchE活性顯著降低，中、高、分別減少22.10%，38.94%，表明各給藥組均對(duì)血管癡呆大鼠治療有作用。與陽(yáng)性組相比當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組ACH含量顯著增加（17.21%），ACHE活性降低（32.55%），表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯高劑量組組對(duì)血管癡呆大鼠治療更佳。結(jié)果見表2表2當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)血管性癡呆大鼠海馬Ach含量和AChE活性的影響(`x±S，n=8)組別Dose（g/Kg）Ach（μg/mgprot）AchE（U/mgprot）假手術(shù)組—164.43±31.15△△0.71±0.19△△##模型組—82.36±10.19**##0.95±0.17**高劑量54151.48±25.58△△0.58±0.18*△△##中劑量36144.42±29.71△△0.74±0.12△△#陽(yáng)性）0.324129.23±21.26△△0.86±0.16**注：與sham比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01；與陽(yáng)性藥物組比較#P<0.05，##P<0.014．討論現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)中樞膽堿能系統(tǒng)的損害及其遞質(zhì)合成與分解的水平失衡，是造成VD的重要原因。學(xué)習(xí)記憶和膽堿神經(jīng)遞質(zhì)之間存在非常密切的關(guān)系，膽堿神經(jīng)遞質(zhì)是維持正常學(xué)習(xí)記憶的重要條件,Ach是在鈣通道及外界環(huán)境的刺激下，突觸前膜與囊泡接觸，釋放Ach，其在后膜上與相應(yīng)的受體結(jié)合，傳導(dǎo)電信號(hào)，來調(diào)節(jié)Ach的含量，進(jìn)而改善學(xué)習(xí)記憶能力[8]。乙酰膽堿酯酶（AchE）是乙酰膽堿（Ach）的抑制劑，可以阻止乙酰膽堿的合成。經(jīng)過抑制Ach的合成過程調(diào)節(jié)腦內(nèi)突觸間的電信號(hào)的傳導(dǎo)進(jìn)而達(dá)到大腦學(xué)習(xí)記憶能力的調(diào)節(jié)。腦中血流急劇減少會(huì)導(dǎo)致大腦供氧不足，不能保證酶活性的正常的能量供應(yīng),從而破壞Ach合成的反應(yīng)體系[9]。大鼠血管性癡呆病癥的產(chǎn)生，及其病況的改變與腦中Ach含量，和其水解酶AchE活性有密切的關(guān)系。海馬體在缺血缺氧的條件下受到損傷時(shí)，海馬組織中的Ach的合成量減少，其抑制劑AchE堆積，學(xué)習(xí)記憶能力減退[10]。通過提高腦內(nèi)Ach含量，降低AchE的活性從而治療血管性癡呆的西藥已經(jīng)產(chǎn)生,但在治療過程中發(fā)現(xiàn)患者對(duì)西藥易產(chǎn)生耐受性，使治療作用減弱。且毒副作用大，影響治療效果。西藥只能改善患者臨床癥狀，并不能真正阻止VD的進(jìn)展，因此研究中藥藥對(duì)膽堿能系統(tǒng)的調(diào)控作用對(duì)治療VD顯得至關(guān)重要。當(dāng)歸補(bǔ)血湯由《內(nèi)外傷辨惑論》確定比例為黃芪：當(dāng)歸＝5：1，當(dāng)歸可治一切氣可補(bǔ)一切血，補(bǔ)中有動(dòng)，被稱之為血中氣藥。吳紅彥等[11]使用大劑量當(dāng)歸干預(yù)東莨菪堿誘導(dǎo)的血管性癡呆模型，證明單當(dāng)歸能增強(qiáng)血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。曾暉等[12]發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸中所含有的小分子成分當(dāng)歸多糖可以增強(qiáng)血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；黃芪性味甘溫，主歸脾經(jīng)，是補(bǔ)中益氣的要藥，還可以生津養(yǎng)血，升舉陽(yáng)氣。韓懷欽等[13]在研究給與血管性癡呆癡呆模型大鼠黃芪注射液的過程中，發(fā)現(xiàn)黃芪有增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶的作用。劉志洋等[14]研究黃芪中黃芪多糖對(duì)血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響時(shí)，顯示黃芪多糖能很好的增強(qiáng)血管性癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可以有效的增強(qiáng)腦組織中Ach的含量，降低其抑制劑AchE的活性，對(duì)血管性癡呆有良好的治療作用。兩味藥均有增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力的作用，本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)將當(dāng)歸補(bǔ)血湯分為高、中、低三個(gè)劑量組，預(yù)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)低劑量治療效果不佳，故只有高中劑量組。本研究通過水迷宮空間搜索實(shí)驗(yàn)表明,模型組大鼠的逃生平臺(tái)停留時(shí)間及有效范圍活動(dòng)時(shí)間明顯降低、逃生平臺(tái)進(jìn)入次數(shù)明顯減少，數(shù)據(jù)充分的顯示模型組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力減弱，造模成功。灌胃給藥一個(gè)月之后,模型組與假手術(shù)比較Ach含量下降(P<0.01)

,AchE活性上升(P<0.01

)。給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯高中劑量藥物灌胃后，與模型組比較，Ach含量升高，AchE活性降低；大鼠的逃逸平臺(tái)滯留時(shí)間及有效區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著升高、逃逸平臺(tái)進(jìn)入次數(shù)顯著增加，說明學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)。結(jié)果表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力與調(diào)節(jié)Ach的含量和其抑制劑AchE的活性有密切的聯(lián)系。通過給予當(dāng)歸補(bǔ)血湯能改善血管性癡呆大鼠海馬體缺血低氧的條件，使海馬組織的Ach的含量升高，AchE的活性降低，學(xué)習(xí)記憶能力恢復(fù)。參考文獻(xiàn)：[1]高曉蘭,朱增強(qiáng),陳彥文,等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯加味對(duì)血管性癡呆大鼠的腦保護(hù)作用研究[J].西部中醫(yī)藥,2013,26(4):22-25.[2]趙歡,楊東東,郭強(qiáng),寧金麗,王倩男,史敏.基于“精-血-髓一體論”觀察當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療血管性癡呆臨床研究[J].陜西中醫(yī),2016,37(10):1314-13[3]楊振軍,馮佩明,薛景鳳.雌激素對(duì)慢性腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用[J].解剖學(xué)雜志,2010,33(2):200-203.[4]楊春壯,馬英,張春軍,等.補(bǔ)腎醒腦方對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)能力及組織內(nèi)乙酰膽堿酯酶含量的影響[J].中醫(yī)研究,2011,24(12):10-12.[5]顧靜,李海龍,楊長(zhǎng)生,等.血管性癡呆大鼠模型制作方法的改良[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào),2015,(6):634-638.[6]張杰,馬云枝,沈曉明,等.復(fù)智膠囊對(duì)血管性癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改善的作用機(jī)制[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(2):128-132.[7]趙瑛,高偉瑩,余群星,等.基于Morris水迷宮的小鼠學(xué)習(xí)記憶規(guī)律研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2020,36(2):131-136,141.[8]苗光新,毛曉霞,吳曉光,等.山楂葉總黃酮對(duì)血管性癡呆大鼠腦內(nèi)膽堿能活性及學(xué)習(xí)記憶的影響[J].解剖學(xué)雜志,2014,37(2):192-195.[9]白雪,彭艷,唐紅梅,等.加味益氣聰明湯對(duì)血管性癡呆大鼠行為學(xué)及海馬區(qū)乙酰膽堿和膽堿脂酶的影