ICS11.220B41DB12天津市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB12/T521—2014本標(biāo)準(zhǔn)的編寫符合GB/T1.1-2009的要求。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市畜牧獸醫(yī)局提出。本標(biāo)準(zhǔn)由天津市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：劉子芝、趙勇、李志榮、劉紀(jì)艷、尹望中、楊建華、周永燚、王穎、趙晶。本標(biāo)準(zhǔn)于2014年4月發(fā)布。DB12/T521—20141牛結(jié)核病噬菌體檢測(cè)技術(shù)規(guī)范本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了噬菌體生物擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)牛結(jié)核病的定義、設(shè)備和儀器、培養(yǎng)基和試劑、檢測(cè)、結(jié)果判定、注意事項(xiàng)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛結(jié)核病的疫病普查、監(jiān)測(cè)和診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T541動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)采樣方法噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱，因部分能引起宿主菌的裂解，故稱為噬菌體。在人工培養(yǎng)基上，細(xì)菌在噬菌體的作用下裂解形成的圓形斑，稱為噬菌斑。a生物安全柜b離心機(jī)（4000r/min）c振蕩器d水浴鍋（55℃)e恒溫培養(yǎng)箱f有蓋離心管（50mL）g無菌試管（10mL）h移液管（10mL）i三角瓶（100mL，500mL）j平皿（90mm）k移液器及配套吸頭（100μL，1000μL）培養(yǎng)基和試劑配制方法見附錄ADB12/T521—20142按照NY/T541進(jìn)行樣本采集。取牛乳5mL于50mL有蓋離心管中，加10mL的3%NaoH溶液；振蕩混勻，室溫孵育15min；加滅菌完全培養(yǎng)基至30mL，4000r/min離心15min，棄去上清液；再加滅菌完全培養(yǎng)基至30mL，4000r/min離心15min后棄去上清液；加1mL滅菌完全培養(yǎng)基重懸沉淀物，無菌條件下轉(zhuǎn)移至10mL無菌試管中。取2mL?？诒欠置谖铮ɑ?mL保存液中的牛口鼻分泌物棉拭子樣品）于50mL有蓋離心管中，處理方法同6.2.1。6.3.1陰性對(duì)照：吸取1mL滅菌完全培養(yǎng)基于10mL無菌試管中，為“陰性對(duì)照”。6.3.2陽(yáng)性對(duì)照：取50μL指示細(xì)胞溶液用滅菌完全培養(yǎng)基稀釋至1.0×106cfu/mL，取1mL稀釋后的溶6.3.3滅菌雙蒸水空白對(duì)照：滅菌雙蒸水處理方法同6.2.1。6.3.4在陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、空白對(duì)照及樣本管中分別加入100μL噬菌體D29溶液，混勻，于37℃水浴鍋中孵育2h；6.3.5上述反應(yīng)管中分別加100μL殺病毒劑，充分混勻，置于室溫10min；6.3.6上述反應(yīng)管中分別加8mL完全培養(yǎng)基，混勻；6.3.7上述反應(yīng)管中分別加1mL指示細(xì)胞溶液，混勻；6.3.8快速將反應(yīng)管中所有的內(nèi)容物分別倒入相應(yīng)的空的90mm的無菌平皿中；立即加8mL冷卻至55℃左右的瓊脂培養(yǎng)基于各平皿中，快速混勻，置于室溫定型；6.3.9將平皿倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，18h~24h后判讀結(jié)果。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照平皿中噬菌斑數(shù)目≥20個(gè)，陰性對(duì)照平皿的噬菌斑數(shù)少于10個(gè)，同時(shí)無菌雙蒸水空白對(duì)照均無噬菌斑時(shí)，試驗(yàn)成立。受檢樣品平皿中出現(xiàn)大小不等的噬菌斑且≥20個(gè)噬菌斑，或許多噬菌斑相互融合成透明狀判定為陽(yáng)性；平皿中無噬菌斑出現(xiàn)或噬菌斑數(shù)量＜20個(gè)判定為陰性。8.1試驗(yàn)前需將所有試劑和樣本回復(fù)至室溫。8.2加入殺毒劑后一定要徹底搖勻，以殺死全部未進(jìn)入菌體里的噬菌體。8.3由于臨床樣本中可能含有病原體，因此所有操作過程應(yīng)符合相關(guān)生物安全操作規(guī)程，如不得用口直接接觸移液器，正確使用手套、生物安全罩衣、口罩等相應(yīng)的安全防護(hù)設(shè)施。8.4檢測(cè)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)用品和廢棄物，應(yīng)進(jìn)行高溫高壓或其他生物安全處理。DB12/T521—20143將Middlebrook7H9基礎(chǔ)培養(yǎng)基（自購(gòu)）4.7g加入900mL蒸餾水（或去離子水）中，充分混勻，溶解，121℃滅菌10min，冷卻至室溫后使用。置于25℃下貯存，有效期4周。如該溶液污染（渾濁則棄用。無菌條件下，將小牛血清復(fù)合物20mL加至無菌已冷卻的180mL7H9基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，制得完全培養(yǎng)基。4℃保存?zhèn)溆茫行?周。如該溶液污染（渾濁則棄用。取NaoH30g，溶于1000mL蒸餾水中，121℃滅菌10min，冷卻后備用。自購(gòu)，用無菌完全培養(yǎng)基將噬菌體D29調(diào)至工作濃度為1.0×108Pfu/mL，4℃保存?zhèn)溆?。恥垢分枝桿菌（ATCC，607，自購(gòu)用無菌完全培養(yǎng)基將指示細(xì)胞配制成濃度為1.0×10cf/mL，4℃保存?zhèn)溆?。?0mL濃硫酸加入到800mL蒸餾水中，冷卻后再溶入40g硫酸亞鐵銨。在容量瓶中稀釋到1000mL，4℃保存?zhèn)溆?。貯存過程中，該溶液可能褪色