酶免疫技術(shù)專題知識(shí)講座第1頁第二節(jié)酶免疫技術(shù)分類一、均相酶免疫測定二、非均相酶免疫測定第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)一、基礎(chǔ)原理二、方法類型及反應(yīng)原理思索題小結(jié)第2頁放射免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)識(shí)技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)識(shí)技術(shù)第3頁

第一節(jié)酶免疫技術(shù)特點(diǎn)

第4頁主要試劑:

酶標(biāo)識(shí)抗體或抗原酶標(biāo)物特點(diǎn)：

免疫學(xué)活性酶對(duì)底物催化活性抗原抗體反應(yīng)特異性+酶高效催化反應(yīng)專一性原理及特點(diǎn)第5頁特點(diǎn)：靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性好酶標(biāo)識(shí)試劑能夠較長時(shí)間保持穩(wěn)定操作簡便、對(duì)環(huán)境沒有污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣新方法。原理：酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）特異性反應(yīng)酶對(duì)底物顯色反應(yīng)反抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量測定分析

原理及特點(diǎn)第6頁標(biāo)識(shí)酶要求：

活性高性質(zhì)穩(wěn)定專一性強(qiáng)酶催化底物顯色信號(hào)易于判斷和測量方法敏感，重復(fù)性好，簡單易行酶底物易于配制保留，酶及底物價(jià)廉

一、酶和酶作用底物第7頁辣根過氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)輔基是酶活性中心RZ值：403nm（輔基）與275nm（主酶）OD值之比RZ值與酶活性無關(guān)，酶活性單位比RZ值更為主要ELISA中應(yīng)用最為廣泛標(biāo)識(shí)用酶常見酶酶和酶作用底物第8頁堿性磷酸酶（AP）

菌源性AP腸粘膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫測定

常見酶酶和酶作用底物第9頁HRP底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有各種

H2O2為受氫體，HRP對(duì)受氫體專一性很高

常見底物酶和酶作用底物第10頁HRP常見底物

鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ABTS常見底物酶和酶作用底物第11頁OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛底物。

HRP常見底物

酶和酶作用底物第12頁AP底物

β-Gal底物

對(duì)-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）經(jīng)AP作用后產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。

酶作用后，生成高強(qiáng)度熒光物，用熒光計(jì)測量。常見底物酶和酶作用底物第13頁酶免疫技術(shù)關(guān)鍵組成個(gè)別

酶結(jié)合物（conjugate）酶標(biāo)識(shí)物經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成結(jié)合物

二、酶標(biāo)識(shí)抗體或抗原第14頁抗原要求純度高，抗原性完整抗體需要特異性好、效價(jià)高、親協(xié)力強(qiáng)以及比活性較高，能批量生產(chǎn)，易純化。

制備方法要求酶標(biāo)識(shí)抗體或抗原第15頁制備方法要求技術(shù)方法簡單、產(chǎn)率高，重復(fù)性好標(biāo)識(shí)反應(yīng)不影響酶和抗原或抗體活性酶標(biāo)識(shí)物穩(wěn)定，不形成聚合物酶標(biāo)識(shí)抗體或抗原第16頁制備方法過碘酸鈉法（直接法）常見于HRP標(biāo)識(shí)抗體或抗原

戊二醛交聯(lián)法酶標(biāo)識(shí)抗體或抗原第17頁戊二醛交聯(lián)法戊二醛分子中有兩個(gè)相同醛基，可分別與HRP和蛋白質(zhì)分子中氨基結(jié)合。該法有一步法和二步法。二步法標(biāo)識(shí)效率比一步法高，酶標(biāo)識(shí)物質(zhì)量較均一。

酶標(biāo)識(shí)抗體或抗原第18頁純化及判定標(biāo)識(shí)完成后應(yīng)除去反應(yīng)液中游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，防止游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色強(qiáng)度

常見純化方法：葡聚糖凝膠G-200/G-150過柱層析純化50%飽和硫酸銨沉淀提純酶標(biāo)識(shí)抗體或抗原第19頁固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將游離和結(jié)合酶標(biāo)識(shí)物快速分離最常見方法

固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合到固相載體表面

三、固相載體第20頁要求

結(jié)合抗體或抗原容量大抗體或抗原牢靠地固定在其表面不影響免疫反應(yīng)性利于反應(yīng)充分進(jìn)行固相方法簡便易行，快速經(jīng)濟(jì)種類塑料制品

微顆粒膜載體

固相載體第21頁將抗原或抗體結(jié)合于固相載體用1%～5%牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相載體表面未結(jié)合位點(diǎn)，消除非特異性吸附包被coating封閉blocking包被與封閉第22頁

第二節(jié)酶免疫技術(shù)分類

第23頁酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均相非均相固相酶免疫測定液相酶免疫測定組織切片或其它標(biāo)本中抗原定位

液體標(biāo)本中抗原或抗體定性和定量第24頁用于小分子激素和半抗原（如藥品）測定

酶標(biāo)識(shí)物與對(duì)應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)識(shí)酶活性會(huì)發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標(biāo)識(shí)物，經(jīng)過測定標(biāo)識(shí)酶活性改變，而確定抗原或抗體含量。原理一、均相酶免疫測定第25頁最具代表性兩種技術(shù)酶放大免疫測定技術(shù)EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供體免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

均相酶免疫測定第26頁EMIT示意圖第27頁CEDIA示意圖第28頁分類：液相酶免疫測定固相酶免疫測定以聚苯乙烯等材料作為固相載體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是當(dāng)前最為常見固相酶免疫測定與均相不一樣之處需分離游離與結(jié)合酶標(biāo)識(shí)物二、非均相酶免疫測定第29頁

第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

第30頁底物顯色定性或定量分析原理包被反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合分離1234一、基礎(chǔ)原理第31頁固相抗原或抗體

酶標(biāo)識(shí)物（酶結(jié)合物）

酶反應(yīng)底物

三個(gè)必要試劑

二、方法類型及反應(yīng)原理第32頁雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色應(yīng)用：

二價(jià)或二價(jià)以上較大分子抗原測定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA檢測抗原方法第33頁第34頁1、已知抗體包被于載體表面3、加酶標(biāo)抗體與抗原結(jié)合4、加酶作用底物產(chǎn)生顏色2、加待檢物抗原與抗體結(jié)合4、加酶作用底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加待檢物無抗原與抗體結(jié)合3、加酶標(biāo)抗體無抗原結(jié)合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY第35頁競爭法

方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競爭與包被物結(jié)合。加底物顯色。

應(yīng)用：用于只有一個(gè)抗原決定簇小分子半抗原（藥品、激素等）ELISA檢測抗原方法第36頁第37頁洗滌洗滌競爭法測抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待檢物抗原與酶標(biāo)抗原競爭與抗體結(jié)合3、加酶作用底物不顯色或顯色弱3、加酶作用底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測物和酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合YE第38頁間接法方法

用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點(diǎn)一個(gè)酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原對(duì)應(yīng)抗體應(yīng)用

常見于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等測定ELISA檢測抗體方法第39頁第40頁1、已知抗原吸附于載體表面2、加待檢物無抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)抗Ig與抗體結(jié)合4、加酶作用底物產(chǎn)生顏色1、已知抗體吸附于載體表面2、加待檢物有抗體與抗原結(jié)合3、加酶標(biāo)抗Ig抗體4、加酶作用底物不產(chǎn)生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+第41頁雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似應(yīng)用：乙型肝炎表面抗體ELISA檢測抗體方法第42頁競爭法原理：類似檢測抗原競爭法

應(yīng)用：乙型肝炎病毒關(guān)鍵抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)檢測ELISA檢測抗體方法第43頁捕捉法

應(yīng)用：

病原體急性感染診療中IgM型抗體

甲型肝炎HAV-IgM抗體

乙型肝炎病毒關(guān)鍵HBc-IgM抗體ELISA檢測抗體方法第44頁捕捉法

原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕捉待測標(biāo)本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)識(shí)特異性抗原抗體底物顯色

第45頁洗滌洗滌洗滌洗滌捕捉法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待測物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，與特異性抗體結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色2、加待測物只有非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結(jié)合4、加酶標(biāo)抗體無抗原結(jié)合，加底物不顯色第46頁

第四節(jié)

酶免疫測定應(yīng)用

第47頁均相酶免疫測定主要用于藥品和小分子物質(zhì)檢測。非均相免疫測定中ELISA應(yīng)用更為廣泛，ELISA廣泛用于傳染病診療，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗體、“乙肝三對(duì)”、丙肝抗體、丁肝抗體、戊肝抗體）、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細(xì)菌如結(jié)核桿菌、幽門螺桿菌等。也用于一些蛋白質(zhì)檢測，如各種免疫球蛋白、補(bǔ)體、腫瘤