免疫學抗體檢測操作規(guī)范一、概述

免疫學抗體檢測是現(xiàn)代醫(yī)學檢驗的重要組成部分，廣泛應用于疾病診斷、療效監(jiān)測和健康評估。本規(guī)范旨在明確抗體檢測的操作流程、質(zhì)量控制要點及注意事項，確保檢測結(jié)果的準確性和可靠性。

二、操作準備

（一）試劑與耗材準備

1.檢測試劑：確保試劑盒在有效期內(nèi)，未受潮或污染。

2.耗材：包括微量移液器、吸頭、離心管、酶標板等，均需經(jīng)過滅菌處理。

3.校準品：使用標準化的校準品進行濃度驗證。

（二）儀器設(shè)備

1.酶標儀：預熱30分鐘以上，確保讀數(shù)穩(wěn)定。

2.離心機：設(shè)定合適的轉(zhuǎn)速和時間，避免樣本溢出。

3.冰箱：樣本和試劑需儲存在2-8℃條件下。

（三）樣本要求

1.樣本類型：血清、血漿或全血，根據(jù)檢測項目選擇。

2.樣本采集：使用無抗凝劑采血管，避免溶血。

3.樣本保存：采集后4小時內(nèi)完成處理，否則置于-20℃冷凍保存。

三、操作步驟

（一）樣本處理

1.解凍：將冷凍樣本在室溫下解凍，避免反復凍融。

2.離心：3000rpm離心10分鐘，取上清液備用。

3.復溶：如需稀釋，使用無菌生理鹽水或緩沖液進行調(diào)校。

（二）加樣流程

1.配液：按照試劑盒說明書比例混合試劑和樣本。

2.加樣：使用微量移液器精確加入酶標板孔中，避免氣泡。

3.避光：加樣后避光反應30分鐘，避免光照影響活性。

（三）孵育與檢測

1.孵育：將酶標板置于37℃恒溫箱中孵育60分鐘。

2.洗滌：使用自動洗板機洗滌5次，每次3分鐘，棄去廢液。

3.顯色：加入底物液，避光反應15-30分鐘。

（四）結(jié)果讀取

1.定量檢測：使用酶標儀在450nm波長處讀取吸光度值。

2.標準曲線：將吸光度值與校準品濃度繪制線性回歸方程。

3.數(shù)據(jù)分析：根據(jù)公式計算樣本抗體濃度。

四、質(zhì)量控制

（一）室內(nèi)質(zhì)控

1.日間差：每日使用質(zhì)控品檢測，確保結(jié)果波動在±10%范圍內(nèi)。

2.重復性：同一樣本連續(xù)檢測3次，相對偏差≤5%。

（二）室間質(zhì)評

1.參加第三方質(zhì)評計劃，定期比對結(jié)果差異。

2.異常分析：對偏離結(jié)果進行溯源，如試劑污染或操作失誤。

五、注意事項

（一）操作安全

1.佩戴防護手套，避免皮膚接觸試劑。

2.廢棄物分類處理，防止交叉污染。

（二）結(jié)果驗證

1.陰性樣本需重新檢測，確認無假陰性。

2.高濃度樣本需適當稀釋后再測。

（三）設(shè)備維護

1.定期校準酶標儀，確保讀數(shù)準確。

2.離心機轉(zhuǎn)子需每月清潔消毒。

六、總結(jié)

免疫學抗體檢測需嚴格遵循標準化流程，從樣本處理到結(jié)果分析各環(huán)節(jié)均需精準控制。通過規(guī)范操作和質(zhì)量監(jiān)控，可最大限度地減少誤差，提高檢測可靠性。

**一、概述**

免疫學抗體檢測是現(xiàn)代醫(yī)學檢驗的重要組成部分，廣泛應用于疾病診斷、療效監(jiān)測和健康評估。本規(guī)范旨在明確抗體檢測的操作流程、質(zhì)量控制要點及注意事項，確保檢測結(jié)果的準確性和可靠性?？贵w檢測方法多樣，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、化學發(fā)光免疫分析法（CLIA）、膠體金免疫層析法（快速檢測）等，不同方法的具體操作細節(jié)可能存在差異，但核心的質(zhì)控原則和基本流程具有共性。本規(guī)范將以通用流程為主，重點強調(diào)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的控制。

**二、操作準備**

（一）試劑與耗材準備

1.檢測試劑：

(1)嚴格檢查試劑盒包裝是否完好，有無破損、泄漏或受潮跡象。核對試劑盒批號、有效期，確保在有效期內(nèi)使用。

(2)閱讀并充分理解試劑盒說明書，嚴格按照推薦的試劑稀釋比例和方法，使用無菌水或指定緩沖液配制所需工作液（如抗體工作液、酶標二抗工作液、底物液等）。配制好的工作液需標注名稱、濃度、配制日期和有效期（通常為2-4小時），并置于室溫或說明書要求的條件下平衡。

(3)溶解凍干試劑時，應使用專用溶劑，按說明輕輕振搖或攪拌至完全溶解，避免劇烈搖晃產(chǎn)生氣泡或破壞成分。溶解后的試劑需按說明進行混勻或離心。

2.耗材：

(1)微量移液器：選擇合適的量程，校準并檢查零點，確保精度。使用一次性吸頭，避免交叉污染。吸頭需完全插入槍頭內(nèi)，避免卷邊。

(2)吸頭：根據(jù)試劑性質(zhì)選擇合適的材質(zhì)（如聚丙烯、聚乙烯），確保兼容性。使用前檢查有無破損或殘留。

(3)離心管：選擇與樣本量和離心力匹配的管型（如微量離心管、尖底管）。檢查管壁有無細微裂紋。使用前需干燥，避免殘留水分影響檢測。

(4)酶標板：檢查板孔有無滲漏、破損或劃痕。必要時可用洗滌液潤洗后干燥備用。確保板架穩(wěn)固。

(5)其他：如槍頭架、加樣吸管架、洗板架、封板膜、吸水紙等，均需保持清潔干燥。

（二）儀器設(shè)備

1.酶標儀/化學發(fā)光檢測儀：

(1)開機預熱：至少預熱30-45分鐘，確保儀器穩(wěn)定。檢查光源強度、波長準確性（使用標準校準液或空白對照進行驗證）。

(2)校準：使用配套的校準軟件或標準校準品，定期（如每周或根據(jù)使用頻率）對儀器進行校準，特別是吸光度讀數(shù)和線性范圍。

(3)清潔：每次使用后或定期（如每天或每班次）清潔樣品針、清洗針（ELISA板讀數(shù)儀）、反應孔內(nèi)壁等?；瘜W發(fā)光檢測儀需特別注意探針和流動池的清潔。

2.離心機：

(1)設(shè)定參數(shù)：根據(jù)樣本類型和說明書要求，設(shè)定合適的離心轉(zhuǎn)速（rpm）或相對離心力（RCF）及時間。常用樣本處理離心如3000-5000rpm，通常為10分鐘。

(2)轉(zhuǎn)子檢查：確保使用正確的轉(zhuǎn)子，檢查轉(zhuǎn)子有無損壞或平衡問題。開機前目視確認樣品管是否放置平穩(wěn)。

(3)操作：蓋好蓋子后啟動，觀察運行狀態(tài)，避免超速或長時間空轉(zhuǎn)。結(jié)束后待轉(zhuǎn)子完全停止后再取出。

3.恒溫設(shè)備

(1)孵育箱：設(shè)置并驗證溫度（通常37℃±0.5℃），放置溫度計進行監(jiān)控。確保箱內(nèi)空氣流通，避免樣本堆積過密影響熱交換。

(2)冰箱/冷凍柜：定期檢查溫度記錄，確保維持在2-8℃（冷藏）或-20℃或更低（冷凍）。避免溫度波動過大。使用帶門封條的冰箱儲存高危樣本。

4.其他輔助設(shè)備：

(1)超純水系統(tǒng)/去離子水：確保提供符合實驗要求的純水。

(2)移液器清洗站/超聲波清洗機：用于清潔移液器吸頭等耗材。

(3)紫外可見分光光度計：用于測定試劑濃度或空白吸光度。

（三）樣本要求

1.樣本類型：根據(jù)檢測目的和方法選擇合適的樣本類型，最常用的是血清（經(jīng)離心后取上清）、血漿（EDTA、檸檬酸鈉或肝素抗凝，離心后取上清）、全血（用于某些特定檢測如血型或HIV快速檢測）或組織液/尿液等。

2.樣本采集：

(1)遵循標準采血規(guī)程，使用合適的采血管（如血清管、EDTA管等）。確保采血量滿足檢測及必要的復溶需求。

(2)避免溶血：止血帶不宜束縛過久，采血后輕柔混勻，必要時可低速離心（如1500rpm,5分鐘）去除紅細胞。

(3)標記：樣本管必須清晰、準確標注患者信息（ID）、樣本類型、采集日期和時間。使用條形碼或RFID技術(shù)可減少標識錯誤。

3.樣本處理與保存：

(1)及時處理：采集后的樣本應盡快處理（通常4小時內(nèi)），避免長時間室溫放置導致成分變化。

(2)離心：采集后立即或盡快（如4小時內(nèi)）在室溫或4℃下以3000-5000rpm離心10-15分鐘，取上清液或按規(guī)定處理（如血漿需去除血小板層）。

(3)復溶與稀釋：如樣本過濃（高滴度），需用無菌生理鹽水或指定稀釋液進行適當稀釋，并記錄稀釋倍數(shù)。使用移液器精確稀釋，混勻。

(4)保存：無法及時檢測的樣本，需分裝（避免反復凍融主樣本），置于-20℃或更低溫度（如-80℃）冷凍保存。記錄凍存日期。某些樣本（如穩(wěn)定性較差的自身抗體）可能需要特殊處理（如添加防腐劑，但需確認不影響檢測）。

**三、操作步驟**

（一）樣本處理（續(xù)）

1.解凍：從冷凍庫存取出樣本，置于室溫（約15-25℃）或37℃水浴中解凍。輕輕搖晃促進溶解，避免劇烈振動。解凍后若樣本出現(xiàn)凍晶或沉淀，需再次低速離心（如3000rpm,10分鐘）。

2.離心：針對血清/血漿樣本，若采集后未立即處理或復溶后，需再次離心（如3500rpm,10分鐘）確保無脂血或細胞沉淀。

3.復溶與稀釋：參照二（三）（3）執(zhí)行。注意稀釋液的選擇（如ELISA常用PBST、Tris緩沖液等），避免干擾反應。精確記錄原始樣本體積和稀釋液體積，計算最終稀釋濃度。

（二）加樣流程

1.配液：

(1)按照說明書，使用移液器精確吸取各試劑（如抗體、酶標二抗、底物等），加入配套的反應容器（如酶標板微孔）或混合管中。

(2)若需預溫，將配好的試劑在設(shè)定溫度（如37℃）平衡10-15分鐘。

(3)混勻：使用移液器吸打或混旋器（確保轉(zhuǎn)速適中，避免產(chǎn)生氣泡或shearforce破壞分子）混勻試劑，確保無沉淀或聚集。

2.加樣：

(1)標記：在酶標板底部或邊緣清晰標記加樣孔位（如樣本、對照、試劑名稱、加樣方向）。

(2)加樣本/對照：使用一次性移液器吸頭，吸取規(guī)定體積的樣本或?qū)φ掌?，垂直、緩慢加入對應孔中，避免接觸孔壁導致蒸發(fā)或污染。每加完一個樣本/對照更換吸頭。

(3)加試劑：更換相應試劑的移液器吸頭（或根據(jù)說明書是否可復用），按順序加入各反應試劑，確保加樣體積準確。加樣動作輕柔，避免產(chǎn)生氣泡。

(4)避光：加樣完畢后，立即蓋上酶標板蓋或封板膜，置于避光環(huán)境中。ELISA等依賴光反應的檢測需嚴格避光。

（三）孵育與檢測

1.孵育：

(1)溫度：將加好樣的酶標板置于預熱好的恒溫孵育箱中。

(2)時間：孵育時間根據(jù)說明書和具體實驗確定，常見如ELISA抗體孵育60分鐘，二抗孵育30-60分鐘?；瘜W發(fā)光孵育時間通常較短（如15-30分鐘）。孵育過程中保持濕度（如加蓋）。

(3)間隔：期間避免震動或移動板架。

2.洗滌（僅適用于ELISA、化學發(fā)光等固相法）：

(1)開蓋：從孵育箱中取出酶標板，小心開蓋。

(2)洗板機操作：將酶標板放置在自動洗板機上，設(shè)置好洗滌次數(shù)（通常5-6次）、每次洗滌時間（如60-90秒）、液面高度和漂洗液（如洗滌緩沖液TBST/TBST+Tween）。

(3)棄液：每次洗滌后，確保充分排空廢液?？奢p彈板架或使用洗板機功能將殘留液體吸干。

(4)跳過孔（若需要）：根據(jù)實驗設(shè)計，設(shè)置是否跳過空白孔或某些孔進行洗滌。

(5)洗滌確認：洗滌結(jié)束后，可向板孔中加入少量洗滌液，觀察有無游離熒光或顏色，確認洗滌干凈（背景信號應低）。

3.顯色/檢測：

(1)底物加入：更換一次性吸頭，按說明書加入規(guī)定體積的酶底物液（如TMB、ABTS等），或加入化學發(fā)光底物。避免加錯。

(2)反應：將酶標板置于室溫或37℃避光反應。反應時間需嚴格控制，如TMB通常為15-30分鐘。化學發(fā)光反應時間更短，需在信號峰值前讀取。

(3)讀取信號：

-酶聯(lián)免疫（TMB）：使用酶標儀在450nm波長處測定吸光度（OD值）。建議同時讀取參考波長（如600nm）扣除背景干擾。

-化學發(fā)光：使用化學發(fā)光檢測儀在特定通道（根據(jù)試劑說明書）讀取相對光單位（RLU）。讀取時需在信號下降曲線的線性期進行，避免信號飽和。

（四）結(jié)果讀取與分析

1.定量檢測：

(1)校準曲線繪制：使用配套的標準品，根據(jù)其已知濃度和測得的信號值（OD或RLU），在Excel等軟件中繪制標準曲線（通常為濃度對數(shù)與信號值的線性回歸）。計算回歸方程（y=mx+b）和線性相關(guān)系數(shù)（R2），要求R2>0.99（或根據(jù)方法學要求）。

(2)樣本計算：將待測樣本的信號值代入校準曲線方程，計算出對應的抗體濃度。注意考慮樣本稀釋倍數(shù)，進行濃度換算。

2.定性/半定量檢測（如膠體金）：

(1)判讀：根據(jù)說明書，肉眼或使用讀數(shù)儀判斷樣本孔是否出現(xiàn)陽性線、陰性線及對照線。陽性線顯色強度有梯度時，按由強到弱判斷結(jié)果。

(2)記錄：清晰記錄定性結(jié)果（陽性/陰性）或半定量分級。

3.數(shù)據(jù)處理與報告：

(1)審核結(jié)果：檢查樣本編號、加樣、孵育、讀數(shù)等過程有無記錄錯誤或異常。核對計算是否準確。

(2)報告生成：按照實驗室報告模板，填寫樣本信息、檢測項目、方法、結(jié)果（濃度或定性）、單位、質(zhì)控信息等。由授權(quán)人員審核簽字。

(3)保存記錄：保存原始數(shù)據(jù)（如酶標儀讀數(shù)截圖）、計算過程、質(zhì)控記錄等。

**四、質(zhì)量控制**

（一）室內(nèi)質(zhì)控（IQC）

1.日間差控制：

(1)每日檢測：在每個工作班次開始時或常規(guī)檢測中，使用至少2個水平的質(zhì)控品（低、中濃度）進行檢測。

(2)結(jié)果評估：將質(zhì)控品結(jié)果與當日繪制的校準曲線計算值或預定目標值進行比較。允許的偏差范圍通常由制造商或?qū)嶒炇腋鶕?jù)經(jīng)驗確定（如±10%或±15%），需預先設(shè)定并記錄。

(3)異常處理：若質(zhì)控結(jié)果超出允許范圍，需立即查找原因（如試劑問題、儀器漂移、操作失誤等），解決問題后重新檢測質(zhì)控品直至合格，并重做當天所有樣本或按規(guī)定處理。

2.重復性控制：

(1)同一樣本復測：選取1-2個穩(wěn)定的中濃度質(zhì)控品，連續(xù)檢測3次。

(2)計算變異系數(shù)（CV）：CV=(標準差/平均值)×100%。通常要求CV≤5%或8%（根據(jù)方法學要求）。

(3)結(jié)果判斷：若CV超出范圍，需評估操作的一致性，必要時重新培訓或檢查設(shè)備。

（二）室間質(zhì)評（EQA）

1.參與計劃：定期（如每月或每季度）向第三方質(zhì)評機構(gòu)申請并參與相應的免疫學檢測項目（如抗體檢測）的室間質(zhì)評。

2.結(jié)果比對：收到質(zhì)評結(jié)果后，與實驗室自定目標值或機構(gòu)提供的參考值進行比較。

3.異常分析：若實驗室結(jié)果與共識值/參考值有顯著偏離，需進行系統(tǒng)性調(diào)查：

(1)復核室內(nèi)質(zhì)控記錄，確認是否存在持續(xù)性系統(tǒng)誤差。

(2)重新評估校準曲線的線性、靈敏度等性能指標。

(3)檢查試劑批間差異，必要時更換試劑批號或廠家。

(4)驗證儀器狀態(tài)和操作流程。

(5)調(diào)整策略以改進檢測性能，并將分析結(jié)果和改進措施報告給質(zhì)評機構(gòu)。

**五、注意事項**

（一）操作安全

1.個體防護：實驗過程中必須佩戴合適的個人防護裝備（PPE），包括醫(yī)用口罩、防護眼鏡/面屏、一次性手套。處理潛在污染樣本（如高濃度樣本、未知樣本）時需佩戴更高級別的防護（如防護服）。

2.化學品安全：正確儲存和使用試劑。了解試劑的安全數(shù)據(jù)表（SDS），避免接觸皮膚和眼睛。如不慎接觸，按SDS指示處理。廢液需按實驗室規(guī)定分類收集和處理。

3.樣本安全：處理生物樣本時需遵守生物安全原則，防止樣本間交叉污染。銳器（如離心管尖）需放入專用銳器盒。

4.環(huán)境控制：保持實驗區(qū)域清潔、整潔、有序。防止灰塵和污染物進入實驗環(huán)境。

（二）結(jié)果驗證

1.陰性結(jié)果復核：對于臨床意義較高的陰性結(jié)果，或與預期不符的陰性結(jié)果，建議進行重復檢測確認。必要時可進行稀釋后再測，以排除高濃度鉤狀效應（HookEffect）。

2.陽性結(jié)果確認：對于首次檢測陽性的樣本，或結(jié)果顯著升高的樣本，建議進行復查。部分項目可能需要結(jié)合其他檢測指標或臨床信息進行綜合判斷。

3.奇特結(jié)果報告：如出現(xiàn)無法解釋的異常結(jié)果（如信號極低、極高等），需詳細記錄所有相關(guān)信息，并在報告中注明，供臨床參考或進一步檢測。

4.高濃度樣本處理：當樣本抗體濃度過高，超出檢測線性范圍時，必須按照說明書或?qū)嶒炇襍OP進行適當稀釋，并在報告中注明稀釋倍數(shù)。

（三）設(shè)備維護

1.日常檢查：每次使用前后檢查設(shè)備功能是否正常，如酶標儀的光路、洗板機的噴淋和吸液系統(tǒng)、離心機的轉(zhuǎn)子等。

2.定期校準：嚴格按照設(shè)備說明書和實驗室維護計劃，對關(guān)鍵參數(shù)（如酶標儀波長、光源強度、洗板機時間/液位、離心機轉(zhuǎn)速/力）進行校準和驗證。

3.清潔保養(yǎng)：定期對設(shè)備進行內(nèi)部和外部清潔。自動洗板機需定期檢查濾網(wǎng)、泵等部件，并使用專用清洗劑維護。

4.記錄存檔：所有設(shè)備操作、校準、維修、保養(yǎng)記錄均需詳細記錄并存檔，確保證設(shè)備的可追溯性。

**六、總結(jié)**

免疫學抗體檢測是一項精密的實驗技術(shù)，其結(jié)果的準確性直接關(guān)系到后續(xù)的診斷、評估或決策。嚴格執(zhí)行標準化的操作規(guī)范是保證結(jié)果可靠性的基礎(chǔ)。從樣本的采集、處理、保存到試劑的配制、加樣、孵育、洗滌、檢測及結(jié)果分析，每一個環(huán)節(jié)都需嚴謹細致。同時，建立并有效運行室內(nèi)質(zhì)控和參與室間質(zhì)評，是持續(xù)監(jiān)控和提升檢測質(zhì)量的重要手段。此外，操作人員的安全意識、對異常結(jié)果的警惕性以及設(shè)備的良好維護，同樣是確保檢測工作順利、結(jié)果可信不可或缺的部分。通過全面遵循本規(guī)范，并結(jié)合實驗室實際情況不斷優(yōu)化，可以有效提高免疫學抗體檢測的整體水平。

一、概述

免疫學抗體檢測是現(xiàn)代醫(yī)學檢驗的重要組成部分，廣泛應用于疾病診斷、療效監(jiān)測和健康評估。本規(guī)范旨在明確抗體檢測的操作流程、質(zhì)量控制要點及注意事項，確保檢測結(jié)果的準確性和可靠性。

二、操作準備

（一）試劑與耗材準備

1.檢測試劑：確保試劑盒在有效期內(nèi)，未受潮或污染。

2.耗材：包括微量移液器、吸頭、離心管、酶標板等，均需經(jīng)過滅菌處理。

3.校準品：使用標準化的校準品進行濃度驗證。

（二）儀器設(shè)備

1.酶標儀：預熱30分鐘以上，確保讀數(shù)穩(wěn)定。

2.離心機：設(shè)定合適的轉(zhuǎn)速和時間，避免樣本溢出。

3.冰箱：樣本和試劑需儲存在2-8℃條件下。

（三）樣本要求

1.樣本類型：血清、血漿或全血，根據(jù)檢測項目選擇。

2.樣本采集：使用無抗凝劑采血管，避免溶血。

3.樣本保存：采集后4小時內(nèi)完成處理，否則置于-20℃冷凍保存。

三、操作步驟

（一）樣本處理

1.解凍：將冷凍樣本在室溫下解凍，避免反復凍融。

2.離心：3000rpm離心10分鐘，取上清液備用。

3.復溶：如需稀釋，使用無菌生理鹽水或緩沖液進行調(diào)校。

（二）加樣流程

1.配液：按照試劑盒說明書比例混合試劑和樣本。

2.加樣：使用微量移液器精確加入酶標板孔中，避免氣泡。

3.避光：加樣后避光反應30分鐘，避免光照影響活性。

（三）孵育與檢測

1.孵育：將酶標板置于37℃恒溫箱中孵育60分鐘。

2.洗滌：使用自動洗板機洗滌5次，每次3分鐘，棄去廢液。

3.顯色：加入底物液，避光反應15-30分鐘。

（四）結(jié)果讀取

1.定量檢測：使用酶標儀在450nm波長處讀取吸光度值。

2.標準曲線：將吸光度值與校準品濃度繪制線性回歸方程。

3.數(shù)據(jù)分析：根據(jù)公式計算樣本抗體濃度。

四、質(zhì)量控制

（一）室內(nèi)質(zhì)控

1.日間差：每日使用質(zhì)控品檢測，確保結(jié)果波動在±10%范圍內(nèi)。

2.重復性：同一樣本連續(xù)檢測3次，相對偏差≤5%。

（二）室間質(zhì)評

1.參加第三方質(zhì)評計劃，定期比對結(jié)果差異。

2.異常分析：對偏離結(jié)果進行溯源，如試劑污染或操作失誤。

五、注意事項

（一）操作安全

1.佩戴防護手套，避免皮膚接觸試劑。

2.廢棄物分類處理，防止交叉污染。

（二）結(jié)果驗證

1.陰性樣本需重新檢測，確認無假陰性。

2.高濃度樣本需適當稀釋后再測。

（三）設(shè)備維護

1.定期校準酶標儀，確保讀數(shù)準確。

2.離心機轉(zhuǎn)子需每月清潔消毒。

六、總結(jié)

免疫學抗體檢測需嚴格遵循標準化流程，從樣本處理到結(jié)果分析各環(huán)節(jié)均需精準控制。通過規(guī)范操作和質(zhì)量監(jiān)控，可最大限度地減少誤差，提高檢測可靠性。

**一、概述**

免疫學抗體檢測是現(xiàn)代醫(yī)學檢驗的重要組成部分，廣泛應用于疾病診斷、療效監(jiān)測和健康評估。本規(guī)范旨在明確抗體檢測的操作流程、質(zhì)量控制要點及注意事項，確保檢測結(jié)果的準確性和可靠性。抗體檢測方法多樣，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、化學發(fā)光免疫分析法（CLIA）、膠體金免疫層析法（快速檢測）等，不同方法的具體操作細節(jié)可能存在差異，但核心的質(zhì)控原則和基本流程具有共性。本規(guī)范將以通用流程為主，重點強調(diào)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的控制。

**二、操作準備**

（一）試劑與耗材準備

1.檢測試劑：

(1)嚴格檢查試劑盒包裝是否完好，有無破損、泄漏或受潮跡象。核對試劑盒批號、有效期，確保在有效期內(nèi)使用。

(2)閱讀并充分理解試劑盒說明書，嚴格按照推薦的試劑稀釋比例和方法，使用無菌水或指定緩沖液配制所需工作液（如抗體工作液、酶標二抗工作液、底物液等）。配制好的工作液需標注名稱、濃度、配制日期和有效期（通常為2-4小時），并置于室溫或說明書要求的條件下平衡。

(3)溶解凍干試劑時，應使用專用溶劑，按說明輕輕振搖或攪拌至完全溶解，避免劇烈搖晃產(chǎn)生氣泡或破壞成分。溶解后的試劑需按說明進行混勻或離心。

2.耗材：

(1)微量移液器：選擇合適的量程，校準并檢查零點，確保精度。使用一次性吸頭，避免交叉污染。吸頭需完全插入槍頭內(nèi)，避免卷邊。

(2)吸頭：根據(jù)試劑性質(zhì)選擇合適的材質(zhì)（如聚丙烯、聚乙烯），確保兼容性。使用前檢查有無破損或殘留。

(3)離心管：選擇與樣本量和離心力匹配的管型（如微量離心管、尖底管）。檢查管壁有無細微裂紋。使用前需干燥，避免殘留水分影響檢測。

(4)酶標板：檢查板孔有無滲漏、破損或劃痕。必要時可用洗滌液潤洗后干燥備用。確保板架穩(wěn)固。

(5)其他：如槍頭架、加樣吸管架、洗板架、封板膜、吸水紙等，均需保持清潔干燥。

（二）儀器設(shè)備

1.酶標儀/化學發(fā)光檢測儀：

(1)開機預熱：至少預熱30-45分鐘，確保儀器穩(wěn)定。檢查光源強度、波長準確性（使用標準校準液或空白對照進行驗證）。

(2)校準：使用配套的校準軟件或標準校準品，定期（如每周或根據(jù)使用頻率）對儀器進行校準，特別是吸光度讀數(shù)和線性范圍。

(3)清潔：每次使用后或定期（如每天或每班次）清潔樣品針、清洗針（ELISA板讀數(shù)儀）、反應孔內(nèi)壁等。化學發(fā)光檢測儀需特別注意探針和流動池的清潔。

2.離心機：

(1)設(shè)定參數(shù)：根據(jù)樣本類型和說明書要求，設(shè)定合適的離心轉(zhuǎn)速（rpm）或相對離心力（RCF）及時間。常用樣本處理離心如3000-5000rpm，通常為10分鐘。

(2)轉(zhuǎn)子檢查：確保使用正確的轉(zhuǎn)子，檢查轉(zhuǎn)子有無損壞或平衡問題。開機前目視確認樣品管是否放置平穩(wěn)。

(3)操作：蓋好蓋子后啟動，觀察運行狀態(tài)，避免超速或長時間空轉(zhuǎn)。結(jié)束后待轉(zhuǎn)子完全停止后再取出。

3.恒溫設(shè)備

(1)孵育箱：設(shè)置并驗證溫度（通常37℃±0.5℃），放置溫度計進行監(jiān)控。確保箱內(nèi)空氣流通，避免樣本堆積過密影響熱交換。

(2)冰箱/冷凍柜：定期檢查溫度記錄，確保維持在2-8℃（冷藏）或-20℃或更低（冷凍）。避免溫度波動過大。使用帶門封條的冰箱儲存高危樣本。

4.其他輔助設(shè)備：

(1)超純水系統(tǒng)/去離子水：確保提供符合實驗要求的純水。

(2)移液器清洗站/超聲波清洗機：用于清潔移液器吸頭等耗材。

(3)紫外可見分光光度計：用于測定試劑濃度或空白吸光度。

（三）樣本要求

1.樣本類型：根據(jù)檢測目的和方法選擇合適的樣本類型，最常用的是血清（經(jīng)離心后取上清）、血漿（EDTA、檸檬酸鈉或肝素抗凝，離心后取上清）、全血（用于某些特定檢測如血型或HIV快速檢測）或組織液/尿液等。

2.樣本采集：

(1)遵循標準采血規(guī)程，使用合適的采血管（如血清管、EDTA管等）。確保采血量滿足檢測及必要的復溶需求。

(2)避免溶血：止血帶不宜束縛過久，采血后輕柔混勻，必要時可低速離心（如1500rpm,5分鐘）去除紅細胞。

(3)標記：樣本管必須清晰、準確標注患者信息（ID）、樣本類型、采集日期和時間。使用條形碼或RFID技術(shù)可減少標識錯誤。

3.樣本處理與保存：

(1)及時處理：采集后的樣本應盡快處理（通常4小時內(nèi)），避免長時間室溫放置導致成分變化。

(2)離心：采集后立即或盡快（如4小時內(nèi)）在室溫或4℃下以3000-5000rpm離心10-15分鐘，取上清液或按規(guī)定處理（如血漿需去除血小板層）。

(3)復溶與稀釋：如樣本過濃（高滴度），需用無菌生理鹽水或指定稀釋液進行適當稀釋，并記錄稀釋倍數(shù)。使用移液器精確稀釋，混勻。

(4)保存：無法及時檢測的樣本，需分裝（避免反復凍融主樣本），置于-20℃或更低溫度（如-80℃）冷凍保存。記錄凍存日期。某些樣本（如穩(wěn)定性較差的自身抗體）可能需要特殊處理（如添加防腐劑，但需確認不影響檢測）。

**三、操作步驟**

（一）樣本處理（續(xù)）

1.解凍：從冷凍庫存取出樣本，置于室溫（約15-25℃）或37℃水浴中解凍。輕輕搖晃促進溶解，避免劇烈振動。解凍后若樣本出現(xiàn)凍晶或沉淀，需再次低速離心（如3000rpm,10分鐘）。

2.離心：針對血清/血漿樣本，若采集后未立即處理或復溶后，需再次離心（如3500rpm,10分鐘）確保無脂血或細胞沉淀。

3.復溶與稀釋：參照二（三）（3）執(zhí)行。注意稀釋液的選擇（如ELISA常用PBST、Tris緩沖液等），避免干擾反應。精確記錄原始樣本體積和稀釋液體積，計算最終稀釋濃度。

（二）加樣流程

1.配液：

(1)按照說明書，使用移液器精確吸取各試劑（如抗體、酶標二抗、底物等），加入配套的反應容器（如酶標板微孔）或混合管中。

(2)若需預溫，將配好的試劑在設(shè)定溫度（如37℃）平衡10-15分鐘。

(3)混勻：使用移液器吸打或混旋器（確保轉(zhuǎn)速適中，避免產(chǎn)生氣泡或shearforce破壞分子）混勻試劑，確保無沉淀或聚集。

2.加樣：

(1)標記：在酶標板底部或邊緣清晰標記加樣孔位（如樣本、對照、試劑名稱、加樣方向）。

(2)加樣本/對照：使用一次性移液器吸頭，吸取規(guī)定體積的樣本或?qū)φ掌罚怪?、緩慢加入對應孔中，避免接觸孔壁導致蒸發(fā)或污染。每加完一個樣本/對照更換吸頭。

(3)加試劑：更換相應試劑的移液器吸頭（或根據(jù)說明書是否可復用），按順序加入各反應試劑，確保加樣體積準確。加樣動作輕柔，避免產(chǎn)生氣泡。

(4)避光：加樣完畢后，立即蓋上酶標板蓋或封板膜，置于避光環(huán)境中。ELISA等依賴光反應的檢測需嚴格避光。

（三）孵育與檢測

1.孵育：

(1)溫度：將加好樣的酶標板置于預熱好的恒溫孵育箱中。

(2)時間：孵育時間根據(jù)說明書和具體實驗確定，常見如ELISA抗體孵育60分鐘，二抗孵育30-60分鐘?；瘜W發(fā)光孵育時間通常較短（如15-30分鐘）。孵育過程中保持濕度（如加蓋）。

(3)間隔：期間避免震動或移動板架。

2.洗滌（僅適用于ELISA、化學發(fā)光等固相法）：

(1)開蓋：從孵育箱中取出酶標板，小心開蓋。

(2)洗板機操作：將酶標板放置在自動洗板機上，設(shè)置好洗滌次數(shù)（通常5-6次）、每次洗滌時間（如60-90秒）、液面高度和漂洗液（如洗滌緩沖液TBST/TBST+Tween）。

(3)棄液：每次洗滌后，確保充分排空廢液?？奢p彈板架或使用洗板機功能將殘留液體吸干。

(4)跳過孔（若需要）：根據(jù)實驗設(shè)計，設(shè)置是否跳過空白孔或某些孔進行洗滌。

(5)洗滌確認：洗滌結(jié)束后，可向板孔中加入少量洗滌液，觀察有無游離熒光或顏色，確認洗滌干凈（背景信號應低）。

3.顯色/檢測：

(1)底物加入：更換一次性吸頭，按說明書加入規(guī)定體積的酶底物液（如TMB、ABTS等），或加入化學發(fā)光底物。避免加錯。

(2)反應：將酶標板置于室溫或37℃避光反應。反應時間需嚴格控制，如TMB通常為15-30分鐘?；瘜W發(fā)光反應時間更短，需在信號峰值前讀取。

(3)讀取信號：

-酶聯(lián)免疫（TMB）：使用酶標儀在450nm波長處測定吸光度（OD值）。建議同時讀取參考波長（如600nm）扣除背景干擾。

-化學發(fā)光：使用化學發(fā)光檢測儀在特定通道（根據(jù)試劑說明書）讀取相對光單位（RLU）。讀取時需在信號下降曲線的線性期進行，避免信號飽和。

（四）結(jié)果讀取與分析

1.定量檢測：

(1)校準曲線繪制：使用配套的標準品，根據(jù)其已知濃度和測得的信號值（OD或RLU），在Excel等軟件中繪制標準曲線（通常為濃度對數(shù)與信號值的線性回歸）。計算回歸方程（y=mx+b）和線性相關(guān)系數(shù)（R2），要求R2>0.99（或根據(jù)方法學要求）。

(2)樣本計算：將待測樣本的信號值代入校準曲線方程，計算出對應的抗體濃度。注意考慮樣本稀釋倍數(shù)，進行濃度換算。

2.定性/半定量檢測（如膠體金）：

(1)判讀：根據(jù)說明書，肉眼或使用讀數(shù)儀判斷樣本孔是否出現(xiàn)陽性線、陰性線及對照線。陽性線顯色強度有梯度時，按由強到弱判斷結(jié)果。

(2)記錄：清晰記錄定性結(jié)果（陽性/陰性）或半定量分級。

3.數(shù)據(jù)處理與報告：

(1)審核結(jié)果：檢查樣本編號、加樣、孵育、讀數(shù)等過程有無記錄錯誤或異常。核對計算是否準確。

(2)報告生成：按照實驗室報告模板，填寫樣本信息、檢測項目、方法、結(jié)果（濃度或定性）、單位、質(zhì)控信息等。由授權(quán)人員審核簽字。

(3)保存記錄：保存原始數(shù)據(jù)（如酶標儀讀數(shù)截圖）、計算過程、質(zhì)控記錄等。

**四、質(zhì)量控制**

（一）室內(nèi)質(zhì)控（IQC）

1.日間差控制：

(1)每日檢測：在每個工作班次開始時或常規(guī)檢測中，使用至少2個水平的質(zhì)控品（低、中濃度）進行檢測。

(2)結(jié)果評估：將質(zhì)控品結(jié)果與當日繪制的校準曲線計算值或預定目標值進行比較。允許的偏差范圍通常由制造商或?qū)嶒炇腋鶕?jù)經(jīng)驗確定（如±10%或±15%），需預先設(shè)定并記錄。

(3)異常處理：若質(zhì)控結(jié)果超出允許范圍，需立即查找原因（如試劑問題、儀器漂移、操作失誤等），解決問題后重新檢測質(zhì)控品直至合格，并重做當天所有樣本或按規(guī)定處理。

2.重復性控制：

(1)同一樣本復測：選取1-2個穩(wěn)定的中濃度質(zhì)控品，連續(xù)檢測3次。

(2)計算變異系數(shù)（CV）：CV=(標準差/平均值)×100%。通常要求CV≤5%或8%（根據(jù)方法學要求）。

(3)結(jié)果判斷：若CV超出范圍，需評估操作的一致性，必要時重新培訓或檢查