免疫學(xué)規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)流程一、免疫學(xué)規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)流程概述

免疫學(xué)規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)流程是指在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)、研究和應(yīng)用中，為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和安全性而制定的一系列標(biāo)準(zhǔn)化操作步驟和規(guī)范。本流程旨在為免疫學(xué)相關(guān)工作人員提供一套系統(tǒng)、規(guī)范的指導(dǎo)，以減少人為誤差，提高工作效率，并保障實(shí)驗(yàn)人員的安全。以下將從免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、樣本處理、實(shí)驗(yàn)操作、結(jié)果分析及數(shù)據(jù)處理等方面進(jìn)行詳細(xì)闡述。

二、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

（一）實(shí)驗(yàn)環(huán)境準(zhǔn)備

1.選擇潔凈、通風(fēng)良好的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境符合生物安全要求。

2.實(shí)驗(yàn)前對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、設(shè)備等進(jìn)行清潔消毒，使用75%酒精或合適的消毒劑進(jìn)行表面擦拭。

3.確保實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫濕度適宜，避免過(guò)高或過(guò)低的溫濕度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

（二）實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑準(zhǔn)備

1.準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需的儀器設(shè)備，如離心機(jī)、電泳儀、酶標(biāo)儀等，并確保設(shè)備處于良好工作狀態(tài)。

2.檢查實(shí)驗(yàn)所需的試劑、抗體、標(biāo)記物等是否在有效期內(nèi)，避免使用過(guò)期試劑。

3.根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，提前配制好所需溶液，如磷酸鹽緩沖液（PBS）、吐溫-20（Tween-20）等，并標(biāo)注清晰。

（三）實(shí)驗(yàn)人員準(zhǔn)備

1.實(shí)驗(yàn)人員需穿戴合適的實(shí)驗(yàn)服、手套、口罩等個(gè)人防護(hù)用品，確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的個(gè)人安全。

2.事先了解實(shí)驗(yàn)流程和操作要點(diǎn)，熟悉實(shí)驗(yàn)所需試劑的性質(zhì)和注意事項(xiàng)。

3.如有需要，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前的培訓(xùn)，確保所有人員掌握正確的操作方法。

三、樣本處理

（一）樣本采集

1.根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的樣本類(lèi)型，如血液、組織、細(xì)胞等。

2.嚴(yán)格按照無(wú)菌操作原則進(jìn)行樣本采集，避免樣本污染。

3.采集后立即將樣本置于適宜的保存液中，如EDTA抗凝劑、RNA保護(hù)劑等。

（二）樣本前處理

1.根據(jù)樣本類(lèi)型，進(jìn)行相應(yīng)的前處理操作，如血液樣本需進(jìn)行抗凝、離心等步驟。

2.組織樣本需進(jìn)行固定、脫水、包埋等處理，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

3.細(xì)胞樣本需進(jìn)行洗滌、計(jì)數(shù)、培養(yǎng)等步驟，確保細(xì)胞狀態(tài)良好。

（三）樣本保存

1.對(duì)于不需要立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的樣本，需置于-80℃冰箱保存，以減少樣本降解。

2.保存過(guò)程中需避免反復(fù)凍融，以免影響樣本質(zhì)量。

3.定期檢查樣本保存狀態(tài)，確保樣本在有效期內(nèi)使用。

四、實(shí)驗(yàn)操作

（一）免疫印跡實(shí)驗(yàn)

1.樣本制備：將處理好的樣本進(jìn)行蛋白提取、SDS電泳分離。

2.轉(zhuǎn)膜：將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF或NC膜上，封閉非特異性位點(diǎn)。

3.一抗孵育：將膜與特異性一抗進(jìn)行孵育，使一抗與目標(biāo)蛋白結(jié)合。

4.二抗孵育：將膜與標(biāo)記有酶的二抗進(jìn)行孵育，增強(qiáng)信號(hào)檢測(cè)。

5.化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：使用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，成像并分析結(jié)果。

（二）ELISA實(shí)驗(yàn)

1.板孔包被：將樣本或標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)板孔中，包被目標(biāo)蛋白。

2.封閉：加入封閉液，封閉非特異性位點(diǎn)。

3.一抗孵育：將板孔與特異性一抗進(jìn)行孵育，結(jié)合目標(biāo)蛋白。

4.二抗孵育：將板孔與標(biāo)記有酶的二抗進(jìn)行孵育，增強(qiáng)信號(hào)。

5.底物顯色：加入底物溶液，進(jìn)行酶促反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。

6.終止反應(yīng)：加入終止液，終止酶促反應(yīng)，進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。

（三）流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)

1.細(xì)胞制備：將處理好的細(xì)胞進(jìn)行洗滌、染色，標(biāo)記特異性抗體。

2.上機(jī)檢測(cè)：將細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞儀，進(jìn)行細(xì)胞分析。

3.數(shù)據(jù)采集：采集細(xì)胞數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

五、結(jié)果分析及數(shù)據(jù)處理

（一）結(jié)果分析

1.對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定性或定量分析，如免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的條帶灰度值分析。

2.比較不同實(shí)驗(yàn)組之間的差異，如ELISA實(shí)驗(yàn)中不同樣本的吸光度值比較。

3.結(jié)合文獻(xiàn)資料和實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑢?duì)結(jié)果進(jìn)行解釋和討論。

（二）數(shù)據(jù)處理

1.使用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，如t檢驗(yàn)、方差分析等。

2.繪制圖表展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如柱狀圖、折線圖等。

3.對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行保存和備份，以便后續(xù)查閱和分析。

**三、樣本處理（續(xù)）**

（一）樣本采集（續(xù)）

1.**樣本類(lèi)型選擇與說(shuō)明：**

***血液樣本：**常用于檢測(cè)血清中的抗體、抗原或細(xì)胞因子。需根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目選擇采集靜脈血或毛細(xì)血管血。靜脈血通常用量較大（如5-10ml），適用于ELISA、化學(xué)發(fā)光等檢測(cè)；毛細(xì)血管血（如指尖血）用量較少，適用于快速檢測(cè)或需要減少患者不適的情況。

***組織樣本：**可分為新鮮組織、福爾馬林固定石蠟包埋組織（FFPE）和冰凍組織。新鮮組織適用于需要保持細(xì)胞形態(tài)和進(jìn)行原位雜交的實(shí)驗(yàn)；FFPE組織樣本保存時(shí)間長(zhǎng)，是進(jìn)行RNA原位雜交（RNA-ISH）、免疫組化（IHC）等分子病理學(xué)研究的常用樣本；冰凍組織適用于需要保持蛋白質(zhì)組學(xué)或基因組學(xué)完整性的實(shí)驗(yàn)。

***細(xì)胞樣本：**可來(lái)源于外周血、組織培養(yǎng)細(xì)胞、體液（如腦脊液、尿液）等。外周血淋巴細(xì)胞是免疫學(xué)研究的常用細(xì)胞來(lái)源，可用于流式細(xì)胞術(shù)分析、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)等；組織培養(yǎng)細(xì)胞需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的細(xì)胞系或原代細(xì)胞；體液樣本根據(jù)其來(lái)源和檢測(cè)需求進(jìn)行采集。

2.**采集工具與無(wú)菌操作：**

*使用一次性、無(wú)菌的采血管和注射器。采血管通常含有不同的抗凝劑或促凝劑，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的管型（如EDTA、肝素、檸檬酸鈉抗凝管，或普通干燥管）。EDTA主要用于血液細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式分析；肝素適用于需要長(zhǎng)期保存或進(jìn)行某些特定分子檢測(cè)的血漿樣本；檸檬酸鈉常用于凝血功能檢測(cè)。

*嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作規(guī)程，采集前用75%酒精對(duì)采樣部位進(jìn)行消毒，待酒精揮發(fā)后再進(jìn)行穿刺，防止微生物污染樣本。

3.**采集過(guò)程中的注意事項(xiàng)：**

***標(biāo)識(shí)清晰：**每個(gè)樣本容器必須清晰、準(zhǔn)確地標(biāo)注樣本編號(hào)、采集日期、時(shí)間、姓名/代碼、樣本類(lèi)型等信息，防止混淆。

***避免溶血：**采集和處理血液樣本時(shí)需輕柔，避免用力擠壓穿刺部位，以免造成紅細(xì)胞破裂導(dǎo)致溶血，影響檢測(cè)結(jié)果（如影響某些蛋白定量或干擾某些檢測(cè)方法）。

***抗凝劑比例：**確保采血管中抗凝劑與血液的比例準(zhǔn)確無(wú)誤，這對(duì)于維持血液的有形成分形態(tài)和功能至關(guān)重要。

***體液樣本：**采集體液樣本時(shí)，需使用專(zhuān)用采血管或容器，確保采集量充足，并盡量避免混入血液或其他污染物。

（二）樣本前處理（續(xù)）

1.**血液樣本處理：**

***靜置與離心：**血液采集后，室溫靜置15-30分鐘，使血液自然分層。隨后在3000-4000rpm下離心5-10分鐘，分離血漿和血細(xì)胞。若需檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物或進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，則需分離出白細(xì)胞層（層流式離心）。

***血漿/血清保存：**取上清血漿或血清（避免攪動(dòng)沉淀），分裝于無(wú)菌Ep管中，立即-80℃凍存。若樣本量較大，可分裝成小份凍存，減少反復(fù)凍融對(duì)樣本的影響。

***全血處理：**若需檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)成分或進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)直接分析，需將新鮮全血與細(xì)胞裂解液或特定固定/裂解緩沖液混合，按說(shuō)明書(shū)操作。

2.**組織樣本處理：**

***新鮮組織：**

***即時(shí)處理：**迅速置于預(yù)冷的RNALater溶液或細(xì)胞裂解緩沖液中，或立即進(jìn)行原位雜交、免疫熒光等操作。

***RNA提取：**需快速冷凍（如液氮速凍）或立即置于-80℃保存，以穩(wěn)定RNA，減少降解。

***蛋白提取：**可直接進(jìn)行組織勻漿，提取總蛋白。

***FFPE組織處理：**

***脫蠟復(fù)水：**將石蠟包埋的組織切片（通常4μm）置于脫蠟液中（如xylene），通過(guò)多次更換脫蠟液和梯度乙醇水溶液，將組織從石蠟中完全脫出并重新水化。

***抗原修復(fù)：**脫水后的組織切片需進(jìn)行抗原修復(fù)，以恢復(fù)或增強(qiáng)抗原表位的可及性。常用方法包括熱修復(fù)（如檸檬酸鹽緩沖液煮沸）或酶修復(fù)（如含EDTA的緩沖液）。修復(fù)條件（時(shí)間、溫度）需根據(jù)抗原特性?xún)?yōu)化。

***洗滌：**抗原修復(fù)后，用PBS或Tris緩沖液進(jìn)行充分洗滌。

***冰凍組織處理：**解凍后可直接用于蛋白提取、RNA提取或進(jìn)行免疫組化、免疫熒光等操作。注意避免反復(fù)凍融。

3.**細(xì)胞樣本處理：**

***細(xì)胞培養(yǎng)：**對(duì)于傳代細(xì)胞，需在細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)（如80%-90%匯合度）用胰蛋白酶消化，PBS洗滌后重懸計(jì)數(shù)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

***細(xì)胞裂解：**若需檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)成分，需用預(yù)冷的裂解緩沖液（含或不含蛋白酶抑制劑）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解。裂解方式可以是溫和裂解（如使用裂解緩沖液重懸）或強(qiáng)力裂解（如加入去垢劑）。裂解后需冰上孵育一段時(shí)間，使蛋白質(zhì)變性充分釋放。

***流式細(xì)胞術(shù)準(zhǔn)備：**將細(xì)胞重懸于特定的流式細(xì)胞術(shù)緩沖液（如FACS緩沖液，含適量的電解質(zhì)和蛋白質(zhì)抑制劑），調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至合適范圍（通常1×10^6-1×10^8cells/mL），避光保存于4℃或室溫（根據(jù)緩沖液和實(shí)驗(yàn)要求）。

（三）樣本保存（續(xù)）

1.**保存溫度要求：**

***-20℃：**適用于大多數(shù)需要中期保存的樣本，如血清、血漿、部分細(xì)胞裂解物、酶標(biāo)抗體等。對(duì)于蛋白質(zhì)類(lèi)樣本，-20℃能較好地抑制某些酶的活性，減緩降解。

***-80℃：**適用于對(duì)穩(wěn)定性要求高的樣本，如RNA、部分蛋白質(zhì)（尤其是酶或結(jié)構(gòu)蛋白）、需要長(zhǎng)期保存的樣本。低至-80℃的溫度能最大程度地減緩生物大分子的降解和變性。建議使用深低溫凍存管，并考慮使用RNALater等保護(hù)劑。

***-130℃或更低：**對(duì)于最敏感的RNA樣本，建議在-130℃或更低的溫度下保存，以進(jìn)一步減少RNA降解。

***4℃：**適用于需要短期保存或置于冰箱冷藏的樣本，如某些抗凝血漿（需注意抗凝劑影響和時(shí)效）、細(xì)胞培養(yǎng)液、某些生物試劑等。但需注意，4℃保存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，特別是對(duì)于RNA和蛋白質(zhì)樣本。

***液氮（-196℃）：**適用于需要長(zhǎng)期、超低溫保存的樣本，如大量細(xì)胞系、病毒庫(kù)、DNA文庫(kù)等。液氮保存可以確保樣本在極低溫度下長(zhǎng)期穩(wěn)定。

2.**凍存策略：**

***分裝：**將樣本分裝于多個(gè)小容器中凍存，避免反復(fù)凍融對(duì)樣本造成損傷。每個(gè)容器應(yīng)包含足夠量的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并留有少量冗余。

***防凝：**在分裝時(shí)可在管底加一小球石蠟油或液體石蠟，隔絕空氣，防止凍存過(guò)程中樣本形成冰晶損傷細(xì)胞或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

***標(biāo)記：**凍存管或容器的標(biāo)簽必須清晰、持久地標(biāo)注樣本信息，包括編號(hào)、類(lèi)型、凍存日期、預(yù)期用途等，并固定在管外，方便識(shí)別和取用。

3.**解凍注意事項(xiàng)：**

***37℃水浴或37℃溫育：**對(duì)于需要快速解凍的樣本（如用于某些酶促反應(yīng)或細(xì)胞復(fù)蘇），可在37℃水浴中或37℃溫育箱中解凍。注意觀察，避免樣本沸騰。

***冰水?。?*對(duì)于蛋白質(zhì)或RNA樣本，為減少變性或降解，可在冰水浴中緩慢解凍。解凍過(guò)程中需輕輕搖晃樣本管，加速融解。

***避免37℃或溫水?。?*對(duì)于RNA樣本尤其要避免使用37℃或溫水浴解凍，高溫會(huì)顯著加速RNA酶的活性，導(dǎo)致RNA降解。

***立即使用或處理：**解凍后的樣本應(yīng)盡快用于實(shí)驗(yàn)或進(jìn)行下一步處理，避免長(zhǎng)時(shí)間放置在室溫下。

**四、實(shí)驗(yàn)操作（續(xù)）**

（一）免疫印跡實(shí)驗(yàn)（WesternBlot）（續(xù)）

1.**蛋白轉(zhuǎn)膜優(yōu)化（續(xù)）：**

***封閉條件優(yōu)化：**嘗試不同的封閉時(shí)間（如1-4小時(shí)）和溫度（如室溫或4℃），以及不同的封閉劑濃度（如5%脫脂奶粉、5%BSA），觀察封閉效果（可通過(guò)后續(xù)抗體孵育時(shí)間來(lái)判斷），選擇背景最低、特異性最強(qiáng)的條件。

***封閉劑選擇：**5%脫脂奶粉是常用的封閉劑，適用于大多數(shù)抗體；BSA封閉效果可能更好，但背景有時(shí)略高；脫脂奶粉和BSA可按比例混合使用。

***封閉液pH值：**封閉液通常使用Tris緩沖鹽溶液（TBS）或磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS），pH值一般調(diào)至7.4-7.6，確?？贵w和蛋白處于最佳工作狀態(tài)。

2.**一抗孵育優(yōu)化（續(xù)）：**

***抗體濃度：**一抗?jié)舛韧ǔＰ枰ㄟ^(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。一般起始濃度可參考說(shuō)明書(shū)，然后根據(jù)封閉效果和后續(xù)二抗信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)ㄈ?:1000,1:2000,1:4000等）試驗(yàn)，選擇信號(hào)清晰、背景適中的最佳濃度。

***孵育時(shí)間：**一抗孵育時(shí)間通常較長(zhǎng)，一般設(shè)置在4℃過(guò)夜（增強(qiáng)結(jié)合和特異性），或室溫孵育1-4小時(shí)。對(duì)于某些抗體或低豐度蛋白，4℃過(guò)夜是更優(yōu)選的方式。

***緩沖液：**一抗孵育通常在封閉液的基礎(chǔ)上，根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)調(diào)整緩沖液成分，如增加甘油濃度以增加抗體溶解度，或適當(dāng)調(diào)整pH值。也可考慮加入封閉液原液的一部分以維持環(huán)境穩(wěn)定。

***濕盒孵育：**使用濕盒（濕膜槽）進(jìn)行一抗和二抗孵育，可增加抗體與膜的接觸面積，并提供穩(wěn)定的濕度，有利于抗體結(jié)合，提高信號(hào)強(qiáng)度和特異性。濕盒可用保鮮膜、密封袋或?qū)Ｓ脻衲げ壑谱鳌?/p>

3.**二抗孵育優(yōu)化（續(xù)）：**

***二抗選擇：**根據(jù)一抗的來(lái)源（動(dòng)物種類(lèi)，如羊抗鼠、兔抗鼠）和檢測(cè)體系（化學(xué)發(fā)光、ECL、熒光）選擇合適的二抗。二抗需與一抗特異性結(jié)合，并能有效連接酶或熒光標(biāo)記物。

***二抗?jié)舛龋?*二抗?jié)舛韧ǔＲ残枰獌?yōu)化，常用濃度范圍在1:5000至1:20000之間。濃度過(guò)高易產(chǎn)生高背景，濃度過(guò)低則信號(hào)弱。同樣建議通過(guò)倍比稀釋試驗(yàn)選擇。

***孵育時(shí)間：**二抗孵育時(shí)間通常比一抗短，一般在室溫下孵育1-2小時(shí)。對(duì)于信號(hào)較弱的實(shí)驗(yàn)，可適當(dāng)延長(zhǎng)至4小時(shí)。

***洗滌：**二抗孵育后，必須進(jìn)行徹底的洗滌，以去除未結(jié)合的二抗，降低背景。建議使用TBST或TBST+Tween-20的緩沖液進(jìn)行洗滌，洗滌次數(shù)通常為3-5次，每次10-15分鐘。洗滌條件（如緩沖液濃度、是否含吐溫、洗滌次數(shù)和時(shí)間）對(duì)背景影響很大，需仔細(xì)優(yōu)化。

4.**化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)優(yōu)化（續(xù)）：**

***底物選擇與新鮮度：**選用質(zhì)量可靠的ECL底物試劑盒。ECL試劑對(duì)光敏感，需現(xiàn)配現(xiàn)用，配制后應(yīng)立即使用或短期避光保存（具體參照說(shuō)明書(shū)）。底物溶液的配制需精確，避免比例失調(diào)。

***孵育時(shí)間：**加入ECL底物后，需在避光條件下進(jìn)行孵育，孵育時(shí)間通常為1-10分鐘，具體時(shí)間取決于信號(hào)強(qiáng)度和背景，需要通過(guò)試驗(yàn)確定。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致信號(hào)衰減和背景增高。

***化學(xué)發(fā)光成像：**使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（如凝膠成像儀）進(jìn)行成像。建議使用成像系統(tǒng)自帶的軟件設(shè)置曝光時(shí)間，從短時(shí)間開(kāi)始嘗試，逐步增加曝光時(shí)間，直至獲得最佳信號(hào)-背景比，避免因曝光不足或過(guò)度導(dǎo)致信號(hào)丟失或偽影。

***膜保存：**成像后，化學(xué)發(fā)光信號(hào)會(huì)逐漸減弱，若需保存結(jié)果，應(yīng)立即將膜用保鮮膜包裹后放入-20℃或-80℃冰箱保存。

（二）ELISA實(shí)驗(yàn)（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）（續(xù)）

1.**板孔封閉優(yōu)化（續(xù)）：**

***封閉液選擇：**5%脫脂奶粉和5%BSA是最常用的封閉液。脫脂奶粉成本較低，封閉效果廣泛適用；BSA封閉效果通常更好，尤其對(duì)于某些抗體。也可嘗試脫脂奶粉與BSA混合（如1%脫脂奶粉+1%BSA）。

***封閉液體積：**通常每孔加入100-200μL封閉液，確保板孔被完全覆蓋。

***封閉溫度與時(shí)間：**室溫封閉1-2小時(shí)，或4℃過(guò)夜。室溫封閉操作便捷，4℃過(guò)夜封閉效果通常更好，背景可能更低?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需求和封閉效果選擇。

***封閉后洗滌：**封閉完成后，必須進(jìn)行充分的洗滌（通常用洗滌緩沖液洗滌5-6次，每次3-5分鐘），以去除未結(jié)合的封閉液，防止其干擾后續(xù)步驟的信號(hào)。

2.**樣本/標(biāo)準(zhǔn)品加載優(yōu)化（續(xù)）：**

***加載體積：**通常每孔加入100μL樣本或標(biāo)準(zhǔn)品。確保樣本/標(biāo)準(zhǔn)品與板孔底部充分接觸。

***孵育時(shí)間：**樣本/標(biāo)準(zhǔn)品孵育時(shí)間通常為1-2小時(shí)（室溫）或過(guò)夜（4℃）。對(duì)于高豐度抗原，室溫孵育通常足夠；對(duì)于低豐度抗原，4℃過(guò)夜孵育可提高檢測(cè)靈敏度。

***加載方式：**使用移液器精確加樣，確保每孔加樣量一致。可使用多孔移液器或自動(dòng)化加樣設(shè)備提高效率和準(zhǔn)確性。

3.**一抗孵育優(yōu)化（續(xù)）：**

***抗體濃度：**一抗?jié)舛韧瑯有枰獌?yōu)化，常用范圍在1:1000至1:5000之間。建議根據(jù)說(shuō)明書(shū)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇合適的起始濃度，并進(jìn)行倍比稀釋試驗(yàn)。

***孵育條件：**可在封閉液的基礎(chǔ)上，根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)調(diào)整緩沖液（如增加甘油濃度、調(diào)整pH值），或加入封閉液原液。通常在室溫或4℃進(jìn)行孵育，時(shí)間同封閉。

***濕盒孵育：**推薦使用濕盒孵育，以增加抗體與板孔中抗原的結(jié)合效率。

4.**二抗孵育優(yōu)化（續(xù)）：**

***二抗選擇：**選擇能與ELISA板（通常是聚苯乙烯材質(zhì)）和一抗特異性結(jié)合的二抗，并帶有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記。需確認(rèn)二抗的宿主物種與一抗來(lái)源相匹配。

***二抗?jié)舛龋?*常用濃度范圍在1:5000至1:20000。濃度需根據(jù)一抗的效力、樣本背景和信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行優(yōu)化。

***孵育條件：**同一抗孵育，通常在室溫或4℃進(jìn)行，時(shí)間1-2小時(shí)或過(guò)夜。

5.**底物顯色優(yōu)化（續(xù)）：**

***底物選擇：**根據(jù)檢測(cè)酶（HRP或AP）選擇相應(yīng)的底物（如TMB、ABTS）。TMB穩(wěn)定性好，信號(hào)清晰，常用于HRP檢測(cè)；ABTS對(duì)HRP檢測(cè)也常用，信號(hào)穩(wěn)定。AP底物通常用于酶標(biāo)儀檢測(cè)。

***底物配制：**嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)配制底物溶液，通常是即用型液體，或需臨用前將固態(tài)底物溶解于相應(yīng)的緩沖液中。配制好的底物需避光保存。

***顯色條件：**加入底物后，在室溫避光條件下進(jìn)行孵育。HRP-TMB顯色通常在37℃孵育10-30分鐘，ABTS-HRP顯色則在室溫孵育20-40分鐘。顯色時(shí)間需根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度和背景優(yōu)化，過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致背景增高，過(guò)短則信號(hào)不足。

***終止反應(yīng)：**加入終止液（如2MHCl或1MH?SO?）后，應(yīng)立即在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值。終止液會(huì)立即停止酶促反應(yīng)，并將產(chǎn)物顏色轉(zhuǎn)化為無(wú)色或穩(wěn)定的顏色，便于定量。讀取吸光度值后，應(yīng)盡快完成數(shù)據(jù)記錄。

6.**數(shù)據(jù)讀取與計(jì)算（續(xù)）：**

***酶標(biāo)儀設(shè)置：**使用酶標(biāo)儀在正確的波長(zhǎng)下讀取吸光度值。HRP-TMB在450nm處讀取，有時(shí)會(huì)設(shè)置參考波長(zhǎng)（如600nm）進(jìn)行調(diào)零。

***標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：**使用標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)的吸光度值，在Excel等軟件中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（常用四參數(shù)邏輯回歸模型或線性回歸模型）。確保標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好（R2值接近1）。

***樣本濃度計(jì)算：**將樣本的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣本中目標(biāo)抗原的濃度或相對(duì)含量。對(duì)于非線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，需使用對(duì)應(yīng)方程進(jìn)行計(jì)算。

（三）流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)（FlowCytometry）（續(xù)）

1.**細(xì)胞染色優(yōu)化（續(xù)）：**

***抗體選擇：**選擇高質(zhì)量、特異性強(qiáng)、經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的熒光標(biāo)記抗體。注意抗體是否與目標(biāo)細(xì)胞類(lèi)型和表面標(biāo)志物兼容。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的熒光標(biāo)記顏色（如PE、FITC、AlexaFluor系列等），避免熒光串色干擾。

***抗體濃度：**流式細(xì)胞術(shù)通常需要較低的抗體濃度。建議參考說(shuō)明書(shū)，并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳工作濃度。一般起始濃度可在0.1-1μg/mL范圍內(nèi)嘗試，選擇能產(chǎn)生清晰、離散陽(yáng)性峰且背景盡可能低的濃度。

***染色時(shí)間：**細(xì)胞與抗體孵育時(shí)間通常為15-30分鐘（室溫，避光）。過(guò)短可能導(dǎo)致結(jié)合不完全，過(guò)長(zhǎng)則可能引起非特異性結(jié)合增加或細(xì)胞活化。

***染色緩沖液：**使用磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）或細(xì)胞表面染色專(zhuān)用緩沖液（如FACS緩沖液），通常含0.1%-0.5%的疊氮鈉（NaN?）作為防腐劑，以抑制細(xì)胞內(nèi)酶活性。緩沖液需預(yù)冷至4℃。

***細(xì)胞固定與permeabilization（如需）：**

***固定：**對(duì)于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核抗原，需在染色前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定。常用固定劑為多聚甲醛（Paraformaldehyde），固定后需用PBS洗滌去除未結(jié)合的固定劑。固定步驟需在冰上或4℃進(jìn)行，時(shí)間通常為10-20分鐘。

***透化：**檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原（如磷酸化蛋白、細(xì)胞因子）通常需要通透細(xì)胞膜。常用透化劑為0.1%的皂角苷（Saponin）或0.1%-0.3%的透化劑（如Paraformaldehyde/TritonX-100混合物）。透化步驟需在冰上或4℃進(jìn)行，時(shí)間通常為5-15分鐘。注意透化條件可能影響細(xì)胞膜完整性，需優(yōu)化。

***細(xì)胞內(nèi)染色（如需）：**細(xì)胞固定和透化后，需用含0.05%-0.1%疊氮鈉的PBS或特異性緩沖液洗滌，然后加入細(xì)胞內(nèi)染色抗體（通常為PE或APC標(biāo)記）進(jìn)行孵育，避光，室溫15-30分鐘。

***洗滌：**每一步抗體染色后，以及固定、透化后，都必須用預(yù)冷的染色緩沖液進(jìn)行充分洗滌（通常洗滌2-3次），以去除未結(jié)合的抗體和試劑，減少非特異性信號(hào)。

2.**上機(jī)檢測(cè)前準(zhǔn)備（續(xù)）：**

***細(xì)胞濃度：**將染色完成的細(xì)胞重懸于流式細(xì)胞術(shù)緩沖液（通常是無(wú)鈣鎂的PBS或FACS緩沖液，不含疊氮鈉）中，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至合適范圍，通常為1×10^5至1×10^7cells/mL。細(xì)胞濃度過(guò)高可能導(dǎo)致?lián)頂D效應(yīng)，信號(hào)減弱；過(guò)低則信號(hào)太弱，難以檢測(cè)。

***上樣：**將細(xì)胞懸液輕輕混勻，緩慢上樣至流式細(xì)胞儀樣品管中，避免產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)干擾液流和光學(xué)檢測(cè)。

***設(shè)置對(duì)照：**必須設(shè)置至少兩個(gè)陰性對(duì)照：

***未染色對(duì)照（Stain-freecontrol）：**不加任何抗體，直接進(jìn)行流式檢測(cè)。用于評(píng)估細(xì)胞自發(fā)熒光和背景熒光水平。

***同型對(duì)照（Isotypecontrol）：**加入與一抗同種來(lái)源（如均為鼠源IgG）但特異性不同的熒光標(biāo)記抗體（如IgG1-FITC或IgG2a-PE）。用于評(píng)估染色過(guò)程中的非特異性結(jié)合。

***儀器校準(zhǔn)：**檢查流式細(xì)胞儀的熒光通道和散射光通道是否正常，必要時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球進(jìn)行校準(zhǔn)，確保不同顏色熒光的準(zhǔn)確檢測(cè)和補(bǔ)償。

3.**數(shù)據(jù)采集參數(shù)設(shè)置（續(xù)）：**

***參數(shù)選擇：**根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)選擇合適的散射光參數(shù)（FSC,SSC）和熒光通道。檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物時(shí)，通常使用FSC和SSC進(jìn)行初步gating，然后在目標(biāo)熒光通道上進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞分析。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原時(shí)，通常先根據(jù)FSC/SSC圖選出目標(biāo)細(xì)胞群體，再在該群體內(nèi)分析細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)。

***閾值設(shè)置：**為每個(gè)熒光通道設(shè)置合適的閾值，以排除細(xì)胞碎片、噪聲等非目標(biāo)信號(hào)。閾值設(shè)置過(guò)低會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性，過(guò)高則丟失弱陽(yáng)性細(xì)胞信號(hào)。

***采集模式：**選擇合適的采集模式，如列表模式（ListMode）可記錄每個(gè)細(xì)胞的所有參數(shù)信息，適用于后續(xù)詳細(xì)分析和統(tǒng)計(jì)分析；閾值模式（ThresholdMode）或門(mén)控模式（GatedMode）可快速篩選目標(biāo)細(xì)胞。

***采集速度：**根據(jù)細(xì)胞濃度和實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置合適的采集速度。細(xì)胞濃度過(guò)高時(shí)，需降低采集速度或分池稀釋后再上樣，以避免儀器過(guò)載。

4.**數(shù)據(jù)分析（續(xù)）：**

***數(shù)據(jù)導(dǎo)入與查看：**將流式數(shù)據(jù)文件（如.FCS文件）導(dǎo)入到FlowJo、FCSExpress等流式數(shù)據(jù)分析軟件中。使用維數(shù)還原技術(shù)（如散點(diǎn)圖、直方圖、二維等高線圖）初步查看數(shù)據(jù)分布和細(xì)胞群體。

***建立Gating策略：**根據(jù)FSC/SSC圖和其他參數(shù)，建立合理的gating策略，以準(zhǔn)確地分離出目標(biāo)細(xì)胞群體。Gating策略應(yīng)清晰、穩(wěn)定，并能在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中重現(xiàn)。

***熒光定量分析：**在目標(biāo)細(xì)胞群體內(nèi)，對(duì)各個(gè)熒光通道進(jìn)行定量分析?？梢允褂脤?duì)數(shù)或線性尺度展示熒光強(qiáng)度。比較不同實(shí)驗(yàn)組之間的熒光強(qiáng)度差異。

***統(tǒng)計(jì)與圖表：**對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理（如t檢驗(yàn)、ANOVA等），并使用合適的圖表（如柱狀圖、箱線圖、熱圖）展示結(jié)果。

***結(jié)果解讀：**結(jié)合實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮捅尘爸R(shí)，對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行解釋和討論，得出結(jié)論。

**五、結(jié)果分析及數(shù)據(jù)處理（續(xù)）**

（一）結(jié)果分析（續(xù)）

1.**定性分析深化：**

***亞群識(shí)別：**在流式細(xì)胞術(shù)中，通過(guò)多維參數(shù)分析（如FSC,SSC,2-4個(gè)熒光通道）可以識(shí)別和區(qū)分細(xì)胞亞群。例如，在淋巴細(xì)胞群體中區(qū)分CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等。

***表達(dá)模式差異：**比較不同實(shí)驗(yàn)條件下，目標(biāo)蛋白或標(biāo)志物在細(xì)胞亞群中的表達(dá)水平差異（如高表達(dá)、低表達(dá)、無(wú)表達(dá)），或表達(dá)模式的改變（如從膜表達(dá)轉(zhuǎn)為胞內(nèi)表達(dá)）。

***細(xì)胞功能狀態(tài)判斷：**通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面激活標(biāo)志物（如CD25,CD69）或細(xì)胞因子分泌（通過(guò)流式檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子），判斷細(xì)胞的活化、增殖或功能狀態(tài)。

2.**定量分析深化：**

***相對(duì)定量：**在ELISA和WesternBlot中，通過(guò)將樣本吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，得到目標(biāo)蛋白的相對(duì)濃度或倍數(shù)變化。注意比較時(shí)需考慮樣本間的變異性和標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍。

***絕對(duì)定量（WesternBlot）：**通過(guò)使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并結(jié)合內(nèi)參蛋白（如β-actin,GAPDH）的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行歸一化校正，可以更精確地估計(jì)樣本中目標(biāo)蛋白的絕對(duì)含量。內(nèi)參蛋白的選擇需確保其在不同實(shí)驗(yàn)條件下表達(dá)穩(wěn)定。

***熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化：**在流式細(xì)胞術(shù)中，熒光強(qiáng)度受到多種因素影響（如抗體效價(jià)、細(xì)胞數(shù)量、固定/透化條件）。為消除這些干擾，常需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，如使用內(nèi)參對(duì)照（未染色對(duì)照或同型對(duì)照）進(jìn)行校正，或使用不同實(shí)驗(yàn)樣本間的比例關(guān)系進(jìn)行分析。

3.**數(shù)據(jù)可視化優(yōu)化：**

***圖表選擇：**根據(jù)數(shù)據(jù)類(lèi)型和分析目的選擇最合適的圖表。比較組間差異常用柱狀圖或箱線圖；展示細(xì)胞群體分布常用散點(diǎn)圖、直方圖；展示多變量關(guān)系常用熱圖、散點(diǎn)矩陣圖。

***圖表規(guī)范：**圖表應(yīng)包含清晰的標(biāo)題、坐標(biāo)軸標(biāo)簽（包括單位）、圖例（如有），以及必要的注釋說(shuō)明。確保圖表比例協(xié)調(diào)，數(shù)據(jù)點(diǎn)清晰可辨。

***趨勢(shì)分析：**結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，分析數(shù)據(jù)背后的生物學(xué)趨勢(shì)和規(guī)律。注意區(qū)分統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性與生物學(xué)意義。

4.**結(jié)合背景知識(shí)：**

*將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已知的生物學(xué)知識(shí)和文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比較和聯(lián)系。解釋結(jié)果的生物學(xué)意義，探討可能的分子機(jī)制或生理過(guò)程。

*分析結(jié)果的局限性和潛在的偏差，并提出進(jìn)一步研究的方向和建議。

（二）數(shù)據(jù)處理（續(xù)）

1.**原始數(shù)據(jù)整理與備份：**

***數(shù)據(jù)格式統(tǒng)一：**確保所有原始數(shù)據(jù)（如FCS文件、吸光度值記錄、圖像文件）按照統(tǒng)一的格式進(jìn)行存儲(chǔ)和命名，方便查找和整理。

***元數(shù)據(jù)記錄：**詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)相關(guān)的元數(shù)據(jù)，包括實(shí)驗(yàn)日期、樣本編號(hào)、實(shí)驗(yàn)條件（抗體濃度、孵育時(shí)間、溫度等）、儀器參數(shù)、操作人員等信息。這些信息對(duì)于結(jié)果的可重復(fù)性和可追溯性至關(guān)重要。

***定期備份：**對(duì)所有原始數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)記錄進(jìn)行定期備份，存儲(chǔ)在安全的地方（如移動(dòng)硬盤(pán)、服務(wù)器），防止數(shù)據(jù)丟失。

2.**數(shù)據(jù)預(yù)處理：**

***數(shù)據(jù)清洗：**檢查原始數(shù)據(jù)是否存在異常值、缺失值或錯(cuò)誤記錄，并進(jìn)行必要的處理（如剔除異常值、插補(bǔ)缺失值）。在流式數(shù)據(jù)中，可能需要去除雙陽(yáng)性細(xì)胞（如凋亡細(xì)胞、細(xì)胞碎片）。

***數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換：**根據(jù)需要，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，如對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換（常用于流式熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)），以改善數(shù)據(jù)的正態(tài)性或線性關(guān)系，便于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。

***標(biāo)準(zhǔn)化處理：**如前所述，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，消除系統(tǒng)誤差和個(gè)體差異。在流式數(shù)據(jù)中，常用的標(biāo)準(zhǔn)化方法包括對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化、Z-score標(biāo)準(zhǔn)化等。

3.**統(tǒng)計(jì)分析方法選擇：**

***參數(shù)檢驗(yàn)：**根據(jù)數(shù)據(jù)類(lèi)型（計(jì)量資料、計(jì)數(shù)資料）和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（單組、兩組、多組、配對(duì)）選擇合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法。常用方法包括t檢驗(yàn)、方差分析（ANOVA）、卡方檢驗(yàn)等。

***非參數(shù)檢驗(yàn)：**當(dāng)數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或方差齊性時(shí)，可考慮使用非參數(shù)檢驗(yàn)方法，如Mann-WhitneyU檢驗(yàn)、Kruskal-Wallis檢驗(yàn)等。

***相關(guān)性分析：**當(dāng)研究變量間的關(guān)系時(shí)，可進(jìn)行相關(guān)性分析，如Pearson相關(guān)系數(shù)、Spearman秩相關(guān)系數(shù)等。

***回歸分析：**當(dāng)研究自變量對(duì)因變量的影響時(shí)，可使用回歸分析方法。

4.**使用統(tǒng)計(jì)分析軟件：**

***專(zhuān)業(yè)軟件：**推薦使用專(zhuān)業(yè)的統(tǒng)計(jì)分析軟件（如GraphPadPrism,SPSS,R語(yǔ)言,Python等）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。這些軟件功能強(qiáng)大，能處理復(fù)雜的統(tǒng)計(jì)模型，并生成專(zhuān)業(yè)的圖表。

***軟件學(xué)習(xí)：**學(xué)習(xí)并掌握所選統(tǒng)計(jì)分析軟件的基本操作和常用分析方法。

***結(jié)果解讀：**準(zhǔn)確解讀統(tǒng)計(jì)軟件輸出的結(jié)果，包括P值、置信區(qū)間、效應(yīng)量等統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。理解統(tǒng)計(jì)結(jié)果的生物學(xué)意義。

5.**結(jié)果報(bào)告撰寫(xiě)：**

***結(jié)構(gòu)化報(bào)告：**按照標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)報(bào)告格式撰寫(xiě)結(jié)果，包括引言（簡(jiǎn)要背景）、方法（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作步驟）、結(jié)果（數(shù)據(jù)呈現(xiàn)和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果）、討論（結(jié)果解釋和意義）。

***圖文并茂：**使用清晰的圖表展示數(shù)據(jù)和分析結(jié)果，使讀者更容易理解。

***客觀準(zhǔn)確：**客觀、準(zhǔn)確地描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，避免主觀臆斷和夸大。對(duì)結(jié)果的局限性進(jìn)行說(shuō)明。

***規(guī)范表達(dá)：**使用規(guī)范的學(xué)術(shù)語(yǔ)言進(jìn)行表達(dá)，避免口語(yǔ)化和模糊不清的描述。確保結(jié)論有數(shù)據(jù)支持。

一、免疫學(xué)規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)流程概述

免疫學(xué)規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)流程是指在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)、研究和應(yīng)用中，為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和安全性而制定的一系列標(biāo)準(zhǔn)化操作步驟和規(guī)范。本流程旨在為免疫學(xué)相關(guān)工作人員提供一套系統(tǒng)、規(guī)范的指導(dǎo)，以減少人為誤差，提高工作效率，并保障實(shí)驗(yàn)人員的安全。以下將從免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、樣本處理、實(shí)驗(yàn)操作、結(jié)果分析及數(shù)據(jù)處理等方面進(jìn)行詳細(xì)闡述。

二、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

（一）實(shí)驗(yàn)環(huán)境準(zhǔn)備

1.選擇潔凈、通風(fēng)良好的實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境符合生物安全要求。

2.實(shí)驗(yàn)前對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、設(shè)備等進(jìn)行清潔消毒，使用75%酒精或合適的消毒劑進(jìn)行表面擦拭。

3.確保實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫濕度適宜，避免過(guò)高或過(guò)低的溫濕度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

（二）實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑準(zhǔn)備

1.準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)所需的儀器設(shè)備，如離心機(jī)、電泳儀、酶標(biāo)儀等，并確保設(shè)備處于良好工作狀態(tài)。

2.檢查實(shí)驗(yàn)所需的試劑、抗體、標(biāo)記物等是否在有效期內(nèi)，避免使用過(guò)期試劑。

3.根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，提前配制好所需溶液，如磷酸鹽緩沖液（PBS）、吐溫-20（Tween-20）等，并標(biāo)注清晰。

（三）實(shí)驗(yàn)人員準(zhǔn)備

1.實(shí)驗(yàn)人員需穿戴合適的實(shí)驗(yàn)服、手套、口罩等個(gè)人防護(hù)用品，確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的個(gè)人安全。

2.事先了解實(shí)驗(yàn)流程和操作要點(diǎn)，熟悉實(shí)驗(yàn)所需試劑的性質(zhì)和注意事項(xiàng)。

3.如有需要，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前的培訓(xùn)，確保所有人員掌握正確的操作方法。

三、樣本處理

（一）樣本采集

1.根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的樣本類(lèi)型，如血液、組織、細(xì)胞等。

2.嚴(yán)格按照無(wú)菌操作原則進(jìn)行樣本采集，避免樣本污染。

3.采集后立即將樣本置于適宜的保存液中，如EDTA抗凝劑、RNA保護(hù)劑等。

（二）樣本前處理

1.根據(jù)樣本類(lèi)型，進(jìn)行相應(yīng)的前處理操作，如血液樣本需進(jìn)行抗凝、離心等步驟。

2.組織樣本需進(jìn)行固定、脫水、包埋等處理，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

3.細(xì)胞樣本需進(jìn)行洗滌、計(jì)數(shù)、培養(yǎng)等步驟，確保細(xì)胞狀態(tài)良好。

（三）樣本保存

1.對(duì)于不需要立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的樣本，需置于-80℃冰箱保存，以減少樣本降解。

2.保存過(guò)程中需避免反復(fù)凍融，以免影響樣本質(zhì)量。

3.定期檢查樣本保存狀態(tài)，確保樣本在有效期內(nèi)使用。

四、實(shí)驗(yàn)操作

（一）免疫印跡實(shí)驗(yàn)

1.樣本制備：將處理好的樣本進(jìn)行蛋白提取、SDS電泳分離。

2.轉(zhuǎn)膜：將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF或NC膜上，封閉非特異性位點(diǎn)。

3.一抗孵育：將膜與特異性一抗進(jìn)行孵育，使一抗與目標(biāo)蛋白結(jié)合。

4.二抗孵育：將膜與標(biāo)記有酶的二抗進(jìn)行孵育，增強(qiáng)信號(hào)檢測(cè)。

5.化學(xué)發(fā)光檢測(cè)：使用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)，成像并分析結(jié)果。

（二）ELISA實(shí)驗(yàn)

1.板孔包被：將樣本或標(biāo)準(zhǔn)品加入酶標(biāo)板孔中，包被目標(biāo)蛋白。

2.封閉：加入封閉液，封閉非特異性位點(diǎn)。

3.一抗孵育：將板孔與特異性一抗進(jìn)行孵育，結(jié)合目標(biāo)蛋白。

4.二抗孵育：將板孔與標(biāo)記有酶的二抗進(jìn)行孵育，增強(qiáng)信號(hào)。

5.底物顯色：加入底物溶液，進(jìn)行酶促反應(yīng)，產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)。

6.終止反應(yīng)：加入終止液，終止酶促反應(yīng)，進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。

（三）流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)

1.細(xì)胞制備：將處理好的細(xì)胞進(jìn)行洗滌、染色，標(biāo)記特異性抗體。

2.上機(jī)檢測(cè)：將細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞儀，進(jìn)行細(xì)胞分析。

3.數(shù)據(jù)采集：采集細(xì)胞數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

五、結(jié)果分析及數(shù)據(jù)處理

（一）結(jié)果分析

1.對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行定性或定量分析，如免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的條帶灰度值分析。

2.比較不同實(shí)驗(yàn)組之間的差異，如ELISA實(shí)驗(yàn)中不同樣本的吸光度值比較。

3.結(jié)合文獻(xiàn)資料和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，?duì)結(jié)果進(jìn)行解釋和討論。

（二）數(shù)據(jù)處理

1.使用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，如t檢驗(yàn)、方差分析等。

2.繪制圖表展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如柱狀圖、折線圖等。

3.對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行保存和備份，以便后續(xù)查閱和分析。

**三、樣本處理（續(xù)）**

（一）樣本采集（續(xù)）

1.**樣本類(lèi)型選擇與說(shuō)明：**

***血液樣本：**常用于檢測(cè)血清中的抗體、抗原或細(xì)胞因子。需根據(jù)檢測(cè)項(xiàng)目選擇采集靜脈血或毛細(xì)血管血。靜脈血通常用量較大（如5-10ml），適用于ELISA、化學(xué)發(fā)光等檢測(cè)；毛細(xì)血管血（如指尖血）用量較少，適用于快速檢測(cè)或需要減少患者不適的情況。

***組織樣本：**可分為新鮮組織、福爾馬林固定石蠟包埋組織（FFPE）和冰凍組織。新鮮組織適用于需要保持細(xì)胞形態(tài)和進(jìn)行原位雜交的實(shí)驗(yàn)；FFPE組織樣本保存時(shí)間長(zhǎng)，是進(jìn)行RNA原位雜交（RNA-ISH）、免疫組化（IHC）等分子病理學(xué)研究的常用樣本；冰凍組織適用于需要保持蛋白質(zhì)組學(xué)或基因組學(xué)完整性的實(shí)驗(yàn)。

***細(xì)胞樣本：**可來(lái)源于外周血、組織培養(yǎng)細(xì)胞、體液（如腦脊液、尿液）等。外周血淋巴細(xì)胞是免疫學(xué)研究的常用細(xì)胞來(lái)源，可用于流式細(xì)胞術(shù)分析、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)等；組織培養(yǎng)細(xì)胞需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的細(xì)胞系或原代細(xì)胞；體液樣本根據(jù)其來(lái)源和檢測(cè)需求進(jìn)行采集。

2.**采集工具與無(wú)菌操作：**

*使用一次性、無(wú)菌的采血管和注射器。采血管通常含有不同的抗凝劑或促凝劑，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的管型（如EDTA、肝素、檸檬酸鈉抗凝管，或普通干燥管）。EDTA主要用于血液細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式分析；肝素適用于需要長(zhǎng)期保存或進(jìn)行某些特定分子檢測(cè)的血漿樣本；檸檬酸鈉常用于凝血功能檢測(cè)。

*嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作規(guī)程，采集前用75%酒精對(duì)采樣部位進(jìn)行消毒，待酒精揮發(fā)后再進(jìn)行穿刺，防止微生物污染樣本。

3.**采集過(guò)程中的注意事項(xiàng)：**

***標(biāo)識(shí)清晰：**每個(gè)樣本容器必須清晰、準(zhǔn)確地標(biāo)注樣本編號(hào)、采集日期、時(shí)間、姓名/代碼、樣本類(lèi)型等信息，防止混淆。

***避免溶血：**采集和處理血液樣本時(shí)需輕柔，避免用力擠壓穿刺部位，以免造成紅細(xì)胞破裂導(dǎo)致溶血，影響檢測(cè)結(jié)果（如影響某些蛋白定量或干擾某些檢測(cè)方法）。

***抗凝劑比例：**確保采血管中抗凝劑與血液的比例準(zhǔn)確無(wú)誤，這對(duì)于維持血液的有形成分形態(tài)和功能至關(guān)重要。

***體液樣本：**采集體液樣本時(shí)，需使用專(zhuān)用采血管或容器，確保采集量充足，并盡量避免混入血液或其他污染物。

（二）樣本前處理（續(xù)）

1.**血液樣本處理：**

***靜置與離心：**血液采集后，室溫靜置15-30分鐘，使血液自然分層。隨后在3000-4000rpm下離心5-10分鐘，分離血漿和血細(xì)胞。若需檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物或進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，則需分離出白細(xì)胞層（層流式離心）。

***血漿/血清保存：**取上清血漿或血清（避免攪動(dòng)沉淀），分裝于無(wú)菌Ep管中，立即-80℃凍存。若樣本量較大，可分裝成小份凍存，減少反復(fù)凍融對(duì)樣本的影響。

***全血處理：**若需檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)成分或進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)直接分析，需將新鮮全血與細(xì)胞裂解液或特定固定/裂解緩沖液混合，按說(shuō)明書(shū)操作。

2.**組織樣本處理：**

***新鮮組織：**

***即時(shí)處理：**迅速置于預(yù)冷的RNALater溶液或細(xì)胞裂解緩沖液中，或立即進(jìn)行原位雜交、免疫熒光等操作。

***RNA提?。?*需快速冷凍（如液氮速凍）或立即置于-80℃保存，以穩(wěn)定RNA，減少降解。

***蛋白提取：**可直接進(jìn)行組織勻漿，提取總蛋白。

***FFPE組織處理：**

***脫蠟復(fù)水：**將石蠟包埋的組織切片（通常4μm）置于脫蠟液中（如xylene），通過(guò)多次更換脫蠟液和梯度乙醇水溶液，將組織從石蠟中完全脫出并重新水化。

***抗原修復(fù)：**脫水后的組織切片需進(jìn)行抗原修復(fù)，以恢復(fù)或增強(qiáng)抗原表位的可及性。常用方法包括熱修復(fù)（如檸檬酸鹽緩沖液煮沸）或酶修復(fù)（如含EDTA的緩沖液）。修復(fù)條件（時(shí)間、溫度）需根據(jù)抗原特性?xún)?yōu)化。

***洗滌：**抗原修復(fù)后，用PBS或Tris緩沖液進(jìn)行充分洗滌。

***冰凍組織處理：**解凍后可直接用于蛋白提取、RNA提取或進(jìn)行免疫組化、免疫熒光等操作。注意避免反復(fù)凍融。

3.**細(xì)胞樣本處理：**

***細(xì)胞培養(yǎng)：**對(duì)于傳代細(xì)胞，需在細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)（如80%-90%匯合度）用胰蛋白酶消化，PBS洗滌后重懸計(jì)數(shù)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

***細(xì)胞裂解：**若需檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)成分，需用預(yù)冷的裂解緩沖液（含或不含蛋白酶抑制劑）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解。裂解方式可以是溫和裂解（如使用裂解緩沖液重懸）或強(qiáng)力裂解（如加入去垢劑）。裂解后需冰上孵育一段時(shí)間，使蛋白質(zhì)變性充分釋放。

***流式細(xì)胞術(shù)準(zhǔn)備：**將細(xì)胞重懸于特定的流式細(xì)胞術(shù)緩沖液（如FACS緩沖液，含適量的電解質(zhì)和蛋白質(zhì)抑制劑），調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至合適范圍（通常1×10^6-1×10^8cells/mL），避光保存于4℃或室溫（根據(jù)緩沖液和實(shí)驗(yàn)要求）。

（三）樣本保存（續(xù)）

1.**保存溫度要求：**

***-20℃：**適用于大多數(shù)需要中期保存的樣本，如血清、血漿、部分細(xì)胞裂解物、酶標(biāo)抗體等。對(duì)于蛋白質(zhì)類(lèi)樣本，-20℃能較好地抑制某些酶的活性，減緩降解。

***-80℃：**適用于對(duì)穩(wěn)定性要求高的樣本，如RNA、部分蛋白質(zhì)（尤其是酶或結(jié)構(gòu)蛋白）、需要長(zhǎng)期保存的樣本。低至-80℃的溫度能最大程度地減緩生物大分子的降解和變性。建議使用深低溫凍存管，并考慮使用RNALater等保護(hù)劑。

***-130℃或更低：**對(duì)于最敏感的RNA樣本，建議在-130℃或更低的溫度下保存，以進(jìn)一步減少RNA降解。

***4℃：**適用于需要短期保存或置于冰箱冷藏的樣本，如某些抗凝血漿（需注意抗凝劑影響和時(shí)效）、細(xì)胞培養(yǎng)液、某些生物試劑等。但需注意，4℃保存時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，特別是對(duì)于RNA和蛋白質(zhì)樣本。

***液氮（-196℃）：**適用于需要長(zhǎng)期、超低溫保存的樣本，如大量細(xì)胞系、病毒庫(kù)、DNA文庫(kù)等。液氮保存可以確保樣本在極低溫度下長(zhǎng)期穩(wěn)定。

2.**凍存策略：**

***分裝：**將樣本分裝于多個(gè)小容器中凍存，避免反復(fù)凍融對(duì)樣本造成損傷。每個(gè)容器應(yīng)包含足夠量的樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并留有少量冗余。

***防凝：**在分裝時(shí)可在管底加一小球石蠟油或液體石蠟，隔絕空氣，防止凍存過(guò)程中樣本形成冰晶損傷細(xì)胞或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

***標(biāo)記：**凍存管或容器的標(biāo)簽必須清晰、持久地標(biāo)注樣本信息，包括編號(hào)、類(lèi)型、凍存日期、預(yù)期用途等，并固定在管外，方便識(shí)別和取用。

3.**解凍注意事項(xiàng)：**

***37℃水浴或37℃溫育：**對(duì)于需要快速解凍的樣本（如用于某些酶促反應(yīng)或細(xì)胞復(fù)蘇），可在37℃水浴中或37℃溫育箱中解凍。注意觀察，避免樣本沸騰。

***冰水?。?*對(duì)于蛋白質(zhì)或RNA樣本，為減少變性或降解，可在冰水浴中緩慢解凍。解凍過(guò)程中需輕輕搖晃樣本管，加速融解。

***避免37℃或溫水浴：**對(duì)于RNA樣本尤其要避免使用37℃或溫水浴解凍，高溫會(huì)顯著加速RNA酶的活性，導(dǎo)致RNA降解。

***立即使用或處理：**解凍后的樣本應(yīng)盡快用于實(shí)驗(yàn)或進(jìn)行下一步處理，避免長(zhǎng)時(shí)間放置在室溫下。

**四、實(shí)驗(yàn)操作（續(xù)）**

（一）免疫印跡實(shí)驗(yàn)（WesternBlot）（續(xù)）

1.**蛋白轉(zhuǎn)膜優(yōu)化（續(xù)）：**

***封閉條件優(yōu)化：**嘗試不同的封閉時(shí)間（如1-4小時(shí)）和溫度（如室溫或4℃），以及不同的封閉劑濃度（如5%脫脂奶粉、5%BSA），觀察封閉效果（可通過(guò)后續(xù)抗體孵育時(shí)間來(lái)判斷），選擇背景最低、特異性最強(qiáng)的條件。

***封閉劑選擇：**5%脫脂奶粉是常用的封閉劑，適用于大多數(shù)抗體；BSA封閉效果可能更好，但背景有時(shí)略高；脫脂奶粉和BSA可按比例混合使用。

***封閉液pH值：**封閉液通常使用Tris緩沖鹽溶液（TBS）或磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS），pH值一般調(diào)至7.4-7.6，確?？贵w和蛋白處于最佳工作狀態(tài)。

2.**一抗孵育優(yōu)化（續(xù)）：**

***抗體濃度：**一抗?jié)舛韧ǔＰ枰ㄟ^(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。一般起始濃度可參考說(shuō)明書(shū)，然后根據(jù)封閉效果和后續(xù)二抗信號(hào)強(qiáng)度，進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)ㄈ?:1000,1:2000,1:4000等）試驗(yàn)，選擇信號(hào)清晰、背景適中的最佳濃度。

***孵育時(shí)間：**一抗孵育時(shí)間通常較長(zhǎng)，一般設(shè)置在4℃過(guò)夜（增強(qiáng)結(jié)合和特異性），或室溫孵育1-4小時(shí)。對(duì)于某些抗體或低豐度蛋白，4℃過(guò)夜是更優(yōu)選的方式。

***緩沖液：**一抗孵育通常在封閉液的基礎(chǔ)上，根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)調(diào)整緩沖液成分，如增加甘油濃度以增加抗體溶解度，或適當(dāng)調(diào)整pH值。也可考慮加入封閉液原液的一部分以維持環(huán)境穩(wěn)定。

***濕盒孵育：**使用濕盒（濕膜槽）進(jìn)行一抗和二抗孵育，可增加抗體與膜的接觸面積，并提供穩(wěn)定的濕度，有利于抗體結(jié)合，提高信號(hào)強(qiáng)度和特異性。濕盒可用保鮮膜、密封袋或?qū)Ｓ脻衲げ壑谱鳌?/p>

3.**二抗孵育優(yōu)化（續(xù)）：**

***二抗選擇：**根據(jù)一抗的來(lái)源（動(dòng)物種類(lèi)，如羊抗鼠、兔抗鼠）和檢測(cè)體系（化學(xué)發(fā)光、ECL、熒光）選擇合適的二抗。二抗需與一抗特異性結(jié)合，并能有效連接酶或熒光標(biāo)記物。

***二抗?jié)舛龋?*二抗?jié)舛韧ǔＲ残枰獌?yōu)化，常用濃度范圍在1:5000至1:20000之間。濃度過(guò)高易產(chǎn)生高背景，濃度過(guò)低則信號(hào)弱。同樣建議通過(guò)倍比稀釋試驗(yàn)選擇。

***孵育時(shí)間：**二抗孵育時(shí)間通常比一抗短，一般在室溫下孵育1-2小時(shí)。對(duì)于信號(hào)較弱的實(shí)驗(yàn)，可適當(dāng)延長(zhǎng)至4小時(shí)。

***洗滌：**二抗孵育后，必須進(jìn)行徹底的洗滌，以去除未結(jié)合的二抗，降低背景。建議使用TBST或TBST+Tween-20的緩沖液進(jìn)行洗滌，洗滌次數(shù)通常為3-5次，每次10-15分鐘。洗滌條件（如緩沖液濃度、是否含吐溫、洗滌次數(shù)和時(shí)間）對(duì)背景影響很大，需仔細(xì)優(yōu)化。

4.**化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)優(yōu)化（續(xù)）：**

***底物選擇與新鮮度：**選用質(zhì)量可靠的ECL底物試劑盒。ECL試劑對(duì)光敏感，需現(xiàn)配現(xiàn)用，配制后應(yīng)立即使用或短期避光保存（具體參照說(shuō)明書(shū)）。底物溶液的配制需精確，避免比例失調(diào)。

***孵育時(shí)間：**加入ECL底物后，需在避光條件下進(jìn)行孵育，孵育時(shí)間通常為1-10分鐘，具體時(shí)間取決于信號(hào)強(qiáng)度和背景，需要通過(guò)試驗(yàn)確定。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致信號(hào)衰減和背景增高。

***化學(xué)發(fā)光成像：**使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（如凝膠成像儀）進(jìn)行成像。建議使用成像系統(tǒng)自帶的軟件設(shè)置曝光時(shí)間，從短時(shí)間開(kāi)始嘗試，逐步增加曝光時(shí)間，直至獲得最佳信號(hào)-背景比，避免因曝光不足或過(guò)度導(dǎo)致信號(hào)丟失或偽影。

***膜保存：**成像后，化學(xué)發(fā)光信號(hào)會(huì)逐漸減弱，若需保存結(jié)果，應(yīng)立即將膜用保鮮膜包裹后放入-20℃或-80℃冰箱保存。

（二）ELISA實(shí)驗(yàn)（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）（續(xù)）

1.**板孔封閉優(yōu)化（續(xù)）：**

***封閉液選擇：**5%脫脂奶粉和5%BSA是最常用的封閉液。脫脂奶粉成本較低，封閉效果廣泛適用；BSA封閉效果通常更好，尤其對(duì)于某些抗體。也可嘗試脫脂奶粉與BSA混合（如1%脫脂奶粉+1%BSA）。

***封閉液體積：**通常每孔加入100-200μL封閉液，確保板孔被完全覆蓋。

***封閉溫度與時(shí)間：**室溫封閉1-2小時(shí)，或4℃過(guò)夜。室溫封閉操作便捷，4℃過(guò)夜封閉效果通常更好，背景可能更低?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需求和封閉效果選擇。

***封閉后洗滌：**封閉完成后，必須進(jìn)行充分的洗滌（通常用洗滌緩沖液洗滌5-6次，每次3-5分鐘），以去除未結(jié)合的封閉液，防止其干擾后續(xù)步驟的信號(hào)。

2.**樣本/標(biāo)準(zhǔn)品加載優(yōu)化（續(xù)）：**

***加載體積：**通常每孔加入100μL樣本或標(biāo)準(zhǔn)品。確保樣本/標(biāo)準(zhǔn)品與板孔底部充分接觸。

***孵育時(shí)間：**樣本/標(biāo)準(zhǔn)品孵育時(shí)間通常為1-2小時(shí)（室溫）或過(guò)夜（4℃）。對(duì)于高豐度抗原，室溫孵育通常足夠；對(duì)于低豐度抗原，4℃過(guò)夜孵育可提高檢測(cè)靈敏度。

***加載方式：**使用移液器精確加樣，確保每孔加樣量一致?？墒褂枚嗫滓埔浩骰蜃詣?dòng)化加樣設(shè)備提高效率和準(zhǔn)確性。

3.**一抗孵育優(yōu)化（續(xù)）：**

***抗體濃度：**一抗?jié)舛韧瑯有枰獌?yōu)化，常用范圍在1:1000至1:5000之間。建議根據(jù)說(shuō)明書(shū)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇合適的起始濃度，并進(jìn)行倍比稀釋試驗(yàn)。

***孵育條件：**可在封閉液的基礎(chǔ)上，根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)調(diào)整緩沖液（如增加甘油濃度、調(diào)整pH值），或加入封閉液原液。通常在室溫或4℃進(jìn)行孵育，時(shí)間同封閉。

***濕盒孵育：**推薦使用濕盒孵育，以增加抗體與板孔中抗原的結(jié)合效率。

4.**二抗孵育優(yōu)化（續(xù)）：**

***二抗選擇：**選擇能與ELISA板（通常是聚苯乙烯材質(zhì)）和一抗特異性結(jié)合的二抗，并帶有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記。需確認(rèn)二抗的宿主物種與一抗來(lái)源相匹配。

***二抗?jié)舛龋?*常用濃度范圍在1:5000至1:20000。濃度需根據(jù)一抗的效力、樣本背景和信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行優(yōu)化。

***孵育條件：**同一抗孵育，通常在室溫或4℃進(jìn)行，時(shí)間1-2小時(shí)或過(guò)夜。

5.**底物顯色優(yōu)化（續(xù)）：**

***底物選擇：**根據(jù)檢測(cè)酶（HRP或AP）選擇相應(yīng)的底物（如TMB、ABTS）。TMB穩(wěn)定性好，信號(hào)清晰，常用于HRP檢測(cè)；ABTS對(duì)HRP檢測(cè)也常用，信號(hào)穩(wěn)定。AP底物通常用于酶標(biāo)儀檢測(cè)。

***底物配制：**嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)配制底物溶液，通常是即用型液體，或需臨用前將固態(tài)底物溶解于相應(yīng)的緩沖液中。配制好的底物需避光保存。

***顯色條件：**加入底物后，在室溫避光條件下進(jìn)行孵育。HRP-TMB顯色通常在37℃孵育10-30分鐘，ABTS-HRP顯色則在室溫孵育20-40分鐘。顯色時(shí)間需根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度和背景優(yōu)化，過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致背景增高，過(guò)短則信號(hào)不足。

***終止反應(yīng)：**加入終止液（如2MHCl或1MH?SO?）后，應(yīng)立即在酶標(biāo)儀上讀取吸光度值。終止液會(huì)立即停止酶促反應(yīng)，并將產(chǎn)物顏色轉(zhuǎn)化為無(wú)色或穩(wěn)定的顏色，便于定量。讀取吸光度值后，應(yīng)盡快完成數(shù)據(jù)記錄。

6.**數(shù)據(jù)讀取與計(jì)算（續(xù)）：**

***酶標(biāo)儀設(shè)置：**使用酶標(biāo)儀在正確的波長(zhǎng)下讀取吸光度值。HRP-TMB在450nm處讀取，有時(shí)會(huì)設(shè)置參考波長(zhǎng)（如600nm）進(jìn)行調(diào)零。

***標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：**使用標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)的吸光度值，在Excel等軟件中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（常用四參數(shù)邏輯回歸模型或線性回歸模型）。確保標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好（R2值接近1）。

***樣本濃度計(jì)算：**將樣本的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣本中目標(biāo)抗原的濃度或相對(duì)含量。對(duì)于非線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，需使用對(duì)應(yīng)方程進(jìn)行計(jì)算。

（三）流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)（FlowCytometry）（續(xù)）

1.**細(xì)胞染色優(yōu)化（續(xù)）：**

***抗體選擇：**選擇高質(zhì)量、特異性強(qiáng)、經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的熒光標(biāo)記抗體。注意抗體是否與目標(biāo)細(xì)胞類(lèi)型和表面標(biāo)志物兼容。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的熒光標(biāo)記顏色（如PE、FITC、AlexaFluor系列等），避免熒光串色干擾。

***抗體濃度：**流式細(xì)胞術(shù)通常需要較低的抗體濃度。建議參考說(shuō)明書(shū)，并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳工作濃度。一般起始濃度可在0.1-1μg/mL范圍內(nèi)嘗試，選擇能產(chǎn)生清晰、離散陽(yáng)性峰且背景盡可能低的濃度。

***染色時(shí)間：**細(xì)胞與抗體孵育時(shí)間通常為15-30分鐘（室溫，避光）。過(guò)短可能導(dǎo)致結(jié)合不完全，過(guò)長(zhǎng)則可能引起非特異性結(jié)合增加或細(xì)胞活化。

***染色緩沖液：**使用磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）或細(xì)胞表面染色專(zhuān)用緩沖液（如FACS緩沖液），通常含0.1%-0.5%的疊氮鈉（NaN?）作為防腐劑，以抑制細(xì)胞內(nèi)酶活性。緩沖液需預(yù)冷至4℃。

***細(xì)胞固定與permeabilization（如需）：**

***固定：**對(duì)于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞核抗原，需在染色前對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定。常用固定劑為多聚甲醛（Paraformaldehyde），固定后需用PBS洗滌去除未結(jié)合的固定劑。固定步驟需在冰上或4℃進(jìn)行，時(shí)間通常為10-20分鐘。

***透化：**檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原（如磷酸化蛋白、細(xì)胞因子）通常需要通透細(xì)胞膜。常用透化劑為0.1%的皂角苷（Saponin）或0.1%-0.3%的透化劑（如Paraformaldehyde/TritonX-100混合物）。透化步驟需在冰上或4℃進(jìn)行，時(shí)間通常為5-15分鐘。注意透化條件可能影響細(xì)胞膜完整性，需優(yōu)化。

***細(xì)胞內(nèi)染色（如需）：**細(xì)胞固定和透化后，需用含0.05%-0.1%疊氮鈉的PBS或特異性緩沖液洗滌，然后加入細(xì)胞內(nèi)染色抗體（通常為PE或APC標(biāo)記）進(jìn)行孵育，避光，室溫15-30分鐘。

***洗滌：**每一步抗體染色后，以及固定、透化后，都必須用預(yù)冷的染色緩沖液進(jìn)行充分洗滌（通常洗滌2-3次），以去除未結(jié)合的抗體和試劑，減少非特異性信號(hào)。

2.**上機(jī)檢測(cè)前準(zhǔn)備（續(xù)）：**

***細(xì)胞濃度：**將染色完成的細(xì)胞重懸于流式細(xì)胞術(shù)緩沖液（通常是無(wú)鈣鎂的PBS或FACS緩沖液，不含疊氮鈉）中，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至合適范圍，通常為1×10^5至1×10^7cells/mL。細(xì)胞濃度過(guò)高可能導(dǎo)致?lián)頂D效應(yīng)，信號(hào)減弱；過(guò)低則信號(hào)太弱，難以檢測(cè)。

***上樣：**將細(xì)胞懸液輕輕混勻，緩慢上樣至流式細(xì)胞儀樣品管中，避免產(chǎn)生氣泡。氣泡會(huì)干擾液流和光學(xué)檢測(cè)。

***設(shè)置對(duì)照：**必須設(shè)置至少兩個(gè)陰性對(duì)照：

***未染色對(duì)照（Stain-freecontrol）：**不加任何抗體，直接進(jìn)行流式檢測(cè)。用于評(píng)估細(xì)胞自發(fā)熒光和背景熒光水平。

***同型對(duì)照（Isotypecontrol）：**加入與一抗同種來(lái)源（如均為鼠源IgG）但特異性不同的熒光標(biāo)記抗體（如IgG1-FITC或IgG2a-PE）。用于評(píng)估染色過(guò)程中的非特異性結(jié)合。

***儀器校準(zhǔn)：**檢查流式細(xì)胞儀的熒光通道和散射光通道是否正常，必要時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球進(jìn)行校準(zhǔn)，確保不同顏色熒光的準(zhǔn)確檢測(cè)和補(bǔ)償。

3.**數(shù)據(jù)采集參數(shù)設(shè)置（續(xù)）：**

***參數(shù)選擇：**根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)選擇合適的散射光參數(shù)（FSC,SSC）和熒光通道。檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物時(shí)，通常使用FSC和SSC進(jìn)行初步gating，然后在目標(biāo)熒光通道上進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞分析。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原時(shí)，通常先根據(jù)FSC/SSC圖選出目標(biāo)細(xì)胞群體，再在該群體內(nèi)分析細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)。

***閾值設(shè)置：**為每個(gè)熒光通道設(shè)置合適的閾值，以排除細(xì)胞碎片、噪聲等非目標(biāo)信號(hào)。閾值設(shè)置過(guò)低會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性，過(guò)高則丟失弱陽(yáng)性細(xì)胞信號(hào)。

***采集模式：**選擇合適的采集模式，如列表模式（ListMode）可記錄每個(gè)細(xì)胞的所有參數(shù)信息，適用于后續(xù)詳細(xì)分析和統(tǒng)計(jì)分析；閾值模式（ThresholdMode）或門(mén)控模式（GatedMode）可快速篩選目標(biāo)細(xì)胞。

***采集速度：**根據(jù)細(xì)胞濃度和實(shí)驗(yàn)要求設(shè)置合適的采集速度。細(xì)胞濃度過(guò)高時(shí)，需降低采集速度或分池稀釋后再上樣，以避免儀器過(guò)載。

4.**數(shù)據(jù)分析（續(xù)）：**

***數(shù)據(jù)導(dǎo)入與查看：**將流式數(shù)據(jù)文件（如.FCS文件）導(dǎo)入到FlowJo、FCSExpress等流式數(shù)據(jù)分析軟件中。使用維數(shù)還原技術(shù)（如散點(diǎn)圖、直方圖、二維等高線圖）初步查看數(shù)據(jù)分布和細(xì)胞群體。

***建立Gating策略：**根據(jù)FSC/SSC圖和其他參數(shù)，建立合理的gating策略，以準(zhǔn)確地分離出目標(biāo)細(xì)胞群體。Gating策略應(yīng)清晰、穩(wěn)定，并能在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中重現(xiàn)。

***熒光定量分析：**