免疫學(xué)研究手冊(cè)一、免疫學(xué)概述

免疫學(xué)是研究生物體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及其與外界環(huán)境相互作用的科學(xué)。它不僅涉及基礎(chǔ)生物學(xué)原理，還廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。本手冊(cè)旨在為免疫學(xué)研究提供系統(tǒng)性的指導(dǎo)，涵蓋免疫學(xué)的基本概念、研究方法、關(guān)鍵技術(shù)及前沿進(jìn)展。

（一）免疫學(xué)的基本概念

1.免疫系統(tǒng)組成

(1)先天性免疫系統(tǒng)：包括物理屏障（皮膚、黏膜）、化學(xué)屏障（分泌液）、免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等）和免疫分子（補(bǔ)體系統(tǒng)、干擾素等）。

(2)獲得性免疫系統(tǒng)：包括B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫和T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，具有特異性和記憶性。

2.免疫應(yīng)答過(guò)程

(1)抗原識(shí)別：免疫細(xì)胞通過(guò)表面受體（如T細(xì)胞受體、B細(xì)胞受體）識(shí)別抗原。

(2)免疫細(xì)胞活化：抗原呈遞細(xì)胞（APC）將抗原信息傳遞給T細(xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。

(3)免疫效應(yīng)：激活的T細(xì)胞和B細(xì)胞分化為效應(yīng)細(xì)胞，清除病原體或異常細(xì)胞。

(4)免疫記憶：部分細(xì)胞分化為記憶細(xì)胞，提供長(zhǎng)期免疫保護(hù)。

（二）免疫學(xué)研究方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

(1)常用模型：小鼠、大鼠、斑馬魚(yú)等，用于研究免疫應(yīng)答、疾病機(jī)制及藥物篩選。

(2)建模方法：包括基因敲除、轉(zhuǎn)基因、無(wú)菌動(dòng)物等技術(shù)。

2.細(xì)胞學(xué)分析

(1)流式細(xì)胞術(shù)：檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記、細(xì)胞周期、凋亡等指標(biāo)。

(2)免疫細(xì)胞分選：通過(guò)磁珠分選或FACS技術(shù)獲取特定細(xì)胞群體。

3.分子生物學(xué)技術(shù)

(1)PCR技術(shù)：檢測(cè)基因表達(dá)、抗原序列分析。

(2)基因編輯：CRISPR/Cas9技術(shù)用于修飾免疫細(xì)胞基因。

（三）免疫學(xué)研究應(yīng)用

1.醫(yī)學(xué)領(lǐng)域

(1)腫瘤免疫：通過(guò)免疫檢查點(diǎn)抑制劑、CAR-T細(xì)胞療法等手段治療癌癥。

(2)自身免疫疾?。貉芯考膊“l(fā)病機(jī)制，開(kāi)發(fā)靶向藥物（如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥）。

2.農(nóng)業(yè)領(lǐng)域

(1)動(dòng)物疫病防控：利用疫苗、免疫增強(qiáng)劑提高動(dòng)物免疫力。

(2)轉(zhuǎn)基因作物：培育抗病品種，減少農(nóng)藥使用。

二、免疫學(xué)研究關(guān)鍵技術(shù)

（一）免疫熒光技術(shù)

1.原理：利用熒光標(biāo)記的抗體檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)或組織中的抗原。

2.操作步驟：

(1)細(xì)胞固定：使用甲醇或甲醛固定細(xì)胞。

(2)封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)：使用封閉液（如BSA、血清）。

(3)一抗孵育：加入特異性抗體。

(4)二抗孵育：加入熒光標(biāo)記的二抗。

(5)成像分析：通過(guò)熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

（二）ELISA技術(shù)

1.原理：酶標(biāo)記的抗體與抗原結(jié)合，通過(guò)底物顯色定量分析。

2.類(lèi)型：

(1)直接ELISA：直接用酶標(biāo)抗體檢測(cè)抗原。

(2)間接ELISA：用生物素標(biāo)記抗體，再結(jié)合鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物。

(3)雙抗體夾心ELISA：檢測(cè)抗原需同時(shí)存在捕獲抗體和檢測(cè)抗體。

（三）細(xì)胞因子檢測(cè)

1.方法：

(1)Luminex技術(shù)：高通量檢測(cè)多種細(xì)胞因子。

(2)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）：?jiǎn)我换蛏倭考?xì)胞因子檢測(cè)。

2.應(yīng)用：評(píng)估免疫應(yīng)答強(qiáng)度、疾病狀態(tài)（如炎癥、感染）。

三、免疫學(xué)研究前沿

（一）免疫調(diào)控機(jī)制

1.腸道菌群與免疫：腸道微生物通過(guò)代謝產(chǎn)物影響免疫細(xì)胞功能。

2.免疫checkpoints：研究PD-1/PD-L1等抑制性通路，開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物。

（二）免疫治療進(jìn)展

1.CAR-T細(xì)胞療法：改造患者T細(xì)胞靶向癌細(xì)胞。

2.免疫療法聯(lián)合化療：提高腫瘤治療療效。

（三）單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)

1.技術(shù)優(yōu)勢(shì)：解析復(fù)雜免疫微環(huán)境中的細(xì)胞異質(zhì)性。

2.應(yīng)用場(chǎng)景：腫瘤免疫微環(huán)境分析、自身免疫病機(jī)制研究。

四、免疫學(xué)研究倫理

1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：遵循3R原則（替代、減少、優(yōu)化）。

2.人類(lèi)樣本：獲得知情同意，保護(hù)隱私。

3.數(shù)據(jù)共享：避免利益沖突，規(guī)范成果發(fā)布。

**一、免疫學(xué)概述**

免疫學(xué)是生物學(xué)的一個(gè)重要分支，專(zhuān)注于研究生物體（包括動(dòng)物和人類(lèi)）的免疫系統(tǒng)、其組成部分、功能機(jī)制以及與內(nèi)外環(huán)境（如病原體、腫瘤細(xì)胞、異物等）的相互作用。它不僅是一個(gè)基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域，為理解生命活動(dòng)提供了重要視角，其研究成果還在醫(yī)學(xué)診斷、疾病治療（如疫苗開(kāi)發(fā)、免疫治療）、生物技術(shù)等多個(gè)方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。本手冊(cè)旨在為免疫學(xué)研究者提供一個(gè)系統(tǒng)性的知識(shí)框架和實(shí)用的操作指南，內(nèi)容涵蓋從基本概念到前沿技術(shù)的各個(gè)方面，力求信息準(zhǔn)確、邏輯清晰、操作性強(qiáng)。

（一）免疫學(xué)的基本概念

1.免疫系統(tǒng)組成

(1)先天性免疫系統(tǒng)（InnateImmuneSystem）：這是生物體抵御病原體入侵的第一道防線，具有非特異性和快速反應(yīng)的特點(diǎn)。其組成成分包括：

***物理屏障**：如皮膚、黏膜及其附屬物（汗腺、皮脂腺等），能物理性地阻止大部分病原體進(jìn)入體內(nèi)。例如，皮膚角質(zhì)層的致密結(jié)構(gòu)、呼吸道黏膜的纖毛運(yùn)動(dòng)和黏液分泌，都屬于物理屏障的范疇。

***化學(xué)屏障**：體表和體內(nèi)分泌物含有多種抑菌或殺菌物質(zhì)。例如，皮膚和黏膜表面的pH值（偏酸性）、唾液中的溶菌酶、胃液中的胃酸、淚液和汗液中的溶菌酶和IgA，都能抑制或殺滅部分微生物。

***免疫細(xì)胞**：主要包括吞噬細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞Macrophages、中性粒細(xì)胞Neutrophils）和自然殺傷細(xì)胞（NKCells）。吞噬細(xì)胞能夠識(shí)別、吞噬并消化病原體或細(xì)胞碎片；中性粒細(xì)胞是炎癥早期到達(dá)感染部位的主要吞噬細(xì)胞；NK細(xì)胞能直接殺傷缺乏MHCI類(lèi)分子的靶細(xì)胞（如被病毒感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞）。

***免疫分子**：包括補(bǔ)體系統(tǒng)（ComplementSystem）、干擾素（Interferons,IFNs）、細(xì)胞因子（Cytokines）等。補(bǔ)體系統(tǒng)通過(guò)經(jīng)典途徑、凝集素途徑和替代途徑激活，能裂解病原體、促進(jìn)吞噬、激活NK細(xì)胞等；干擾素主要由被病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生，能干擾病毒復(fù)制并增強(qiáng)其他免疫細(xì)胞的功能；細(xì)胞因子種類(lèi)繁多，如白細(xì)胞介素（ILs）、腫瘤壞死因子（TNFs）等，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵的“指揮官”作用。

(2)獲得性免疫系統(tǒng)（AdaptiveImmuneSystem）：也稱(chēng)為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)或特異性免疫系統(tǒng)，其特點(diǎn)是具有高度的特異性（針對(duì)特定抗原產(chǎn)生應(yīng)答）和免疫記憶（再次接觸相同抗原時(shí)能更快、更強(qiáng)地反應(yīng)）。其核心細(xì)胞是淋巴細(xì)胞，主要包括：

***B淋巴細(xì)胞（BCells）**：在骨髓中發(fā)育成熟。B細(xì)胞通過(guò)其表面的B細(xì)胞受體（BCR，本質(zhì)是膜結(jié)合型IgM或IgD）特異性識(shí)別可溶性抗原。被抗原激活后，B細(xì)胞可以分化為漿細(xì)胞（PlasmaCells），產(chǎn)生大量特異性抗體；或分化為記憶B細(xì)胞（MemoryBCells），為二次免疫應(yīng)答做準(zhǔn)備。

***T淋巴細(xì)胞（TCells）**：在胸腺中發(fā)育成熟。T細(xì)胞具有兩種主要的表面受體：T細(xì)胞受體（TCR）。T細(xì)胞的活化通常需要兩個(gè)信號(hào)：第一信號(hào)來(lái)自TCR與抗原呈遞細(xì)胞（APC）上呈遞的抗原肽-MHC分子的結(jié)合；第二信號(hào)來(lái)自共刺激分子（如B7-CD28）。根據(jù)功能和表面標(biāo)記，T細(xì)胞可分為：

***輔助性T細(xì)胞（HelperTCells,Th,或CD4+T細(xì)胞）**：識(shí)別由APC（如樹(shù)突狀細(xì)胞DCs）通過(guò)MHCII類(lèi)分子呈遞的抗原?；罨腡h細(xì)胞能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，協(xié)調(diào)和增強(qiáng)B細(xì)胞應(yīng)答、細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答以及其他免疫細(xì)胞的功能。

***細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CytotoxicTCells,Tc,或CD8+T細(xì)胞）**：識(shí)別由被感染的體細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞通過(guò)MHCI類(lèi)分子呈遞的抗原肽。活化的CD8+T細(xì)胞分化為效應(yīng)細(xì)胞，能直接殺傷表達(dá)相應(yīng)抗原的靶細(xì)胞。

***調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（RegulatoryTCells,Tregs）**：如CD25+CD4+Foxp3+T細(xì)胞，在維持免疫耐受、防止自身免疫性疾病發(fā)生中起重要作用，能抑制其他T細(xì)胞的活性。

***記憶性T細(xì)胞（MemoryTCells）**：包括效應(yīng)記憶T細(xì)胞（TEM）和中心記憶T細(xì)胞（TCM），在二次免疫應(yīng)答中迅速被激活并產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫效應(yīng)。

2.免疫應(yīng)答過(guò)程

(1)抗原識(shí)別：免疫應(yīng)答的起始是免疫細(xì)胞對(duì)特定抗原的識(shí)別。不同類(lèi)型的免疫細(xì)胞通過(guò)不同的受體識(shí)別不同類(lèi)型的抗原。

***B細(xì)胞識(shí)別**：BCR直接識(shí)別完整的、可溶性的抗原分子。識(shí)別通常較“非特異性”（能識(shí)別抗原的多表位）。

***T細(xì)胞識(shí)別**：TCR識(shí)別的是與MHC分子結(jié)合呈遞的抗原肽片段（通常是8-15個(gè)氨基酸長(zhǎng)）。T細(xì)胞的識(shí)別具有嚴(yán)格的“MHC限制性”：CD8+T細(xì)胞識(shí)別由MHCI類(lèi)分子呈遞的肽（主要在感染細(xì)胞內(nèi)）；CD4+T細(xì)胞識(shí)別由MHCII類(lèi)分子呈遞的肽（主要在APC內(nèi)）。

(2)免疫細(xì)胞活化：獲得性免疫應(yīng)答需要復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，通常涉及至少兩個(gè)信號(hào)：

***信號(hào)1（核心信號(hào)）**：TCR/BCR與其識(shí)別的抗原肽-MHC復(fù)合物的結(jié)合。這是特異性識(shí)別。

***信號(hào)2（共刺激信號(hào)）**：主要來(lái)自APC或活化的T細(xì)胞提供的共刺激分子與T細(xì)胞表面相應(yīng)受體的結(jié)合（如CD80/CD86與CD28）。信號(hào)2對(duì)于T細(xì)胞活化的充分啟動(dòng)至關(guān)重要，能提供“第二信使”，促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄因子激活等。缺乏信號(hào)2的T細(xì)胞活化可能不充分或朝向耐受方向發(fā)展。

***對(duì)于B細(xì)胞**：B細(xì)胞活化通常也需要信號(hào)1（BCR結(jié)合抗原）和信號(hào)2（來(lái)自Th細(xì)胞的CD40L與B細(xì)胞CD40的結(jié)合）。此外，某些抗原（如TI抗原）的活化可能只需要信號(hào)1和補(bǔ)體分子的協(xié)同刺激。

(3)免疫效應(yīng)：活化的免疫細(xì)胞分化并發(fā)揮功能，清除抗原。

***T細(xì)胞效應(yīng)**：CD8+T細(xì)胞分化為效應(yīng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL），通過(guò)釋放穿孔素（Perforin）和顆粒酶（Granzyme）或誘導(dǎo)Fas/FasL途徑來(lái)殺傷靶細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h1、Th2、Th17、Tfh等亞型，分別產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子，調(diào)控炎癥反應(yīng)、體液免疫、抗感染免疫等不同方向。記憶T細(xì)胞則長(zhǎng)期存活，維持免疫記憶。

***B細(xì)胞效應(yīng)**：活化的B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞是“抗體工廠”，能合成并大量分泌針對(duì)特定抗原的抗體（Isotypeswitching可能產(chǎn)生IgG,IgA,IgE等不同類(lèi)型）。抗體通過(guò)中和毒素、調(diào)理吞噬、激活補(bǔ)體、結(jié)合Fc受體（介導(dǎo)ADCC）等多種機(jī)制發(fā)揮免疫效應(yīng)。部分B細(xì)胞分化為記憶B細(xì)胞，提供長(zhǎng)期保護(hù)。

(4)免疫記憶：這是獲得性免疫的重要特征。在初次免疫應(yīng)答后，一部分活化的B細(xì)胞和T細(xì)胞會(huì)分化為長(zhǎng)壽命的記憶細(xì)胞（MemoryBCells和MemoryTCells）。當(dāng)機(jī)體再次遇到相同的抗原時(shí)，記憶細(xì)胞能被迅速激活，產(chǎn)生比初次應(yīng)答更快、更強(qiáng)、更持久的免疫效應(yīng)，這就是免疫記憶的機(jī)制，是疫苗能夠提供保護(hù)的基礎(chǔ)。

（二）免疫學(xué)研究方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型：在免疫學(xué)研究中，動(dòng)物模型是研究免疫機(jī)制、評(píng)估疫苗或藥物效果不可或缺的工具。選擇合適的模型對(duì)于研究的順利進(jìn)行至關(guān)重要。

(1)常用模型：

***小鼠**：是最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有遺傳背景清晰（許多品系如C57BL/6,BALB/c等）、易于操作、成本相對(duì)較低、與人類(lèi)免疫系統(tǒng)有較高相似性等優(yōu)點(diǎn)?？蛇M(jìn)行各種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括細(xì)胞學(xué)分析、分子生物學(xué)研究、藥物測(cè)試等。

***大鼠**：體型比小鼠大，某些免疫應(yīng)答（如補(bǔ)體系統(tǒng)）與人類(lèi)更接近，常用于藥理學(xué)研究、更大規(guī)模的免疫刺激實(shí)驗(yàn)等。

***斑馬魚(yú)（Zebrafish）**：作為一種模式生物，其發(fā)育速度快、透明體表便于觀察、部分免疫細(xì)胞和通路與人類(lèi)相似，尤其在研究先天免疫、炎癥反應(yīng)、疫苗開(kāi)發(fā)等方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

***其他模型**：如豚鼠（常用作過(guò)敏反應(yīng)研究）、裸鼠（缺乏MHCII類(lèi)分子，主要用于研究細(xì)胞免疫）、轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠（用于研究特定基因功能）。

(2)建模方法：

***病原體感染模型**：通過(guò)給動(dòng)物接種特定病原體（病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)），模擬自然感染過(guò)程，研究宿主免疫應(yīng)答、疾病發(fā)展過(guò)程及免疫干預(yù)策略。例如，用小鼠感染李斯特菌研究先天免疫；用大鼠感染鉤蟲(chóng)研究腸道免疫。

***免疫缺陷動(dòng)物模型**：如裸鼠（無(wú)胸腺，T細(xì)胞缺乏）、SCID小鼠（嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷，T細(xì)胞和B細(xì)胞均缺乏），用于研究特定免疫細(xì)胞或分子的功能。

***轉(zhuǎn)基因/基因敲除/敲入動(dòng)物**：通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建帶有特定基因修改的動(dòng)物，用于研究該基因在免疫系統(tǒng)中的功能。例如，構(gòu)建CD4基因敲除小鼠研究T細(xì)胞功能。

***腫瘤模型**：荷瘤小鼠或大鼠模型用于研究腫瘤免疫逃逸機(jī)制、開(kāi)發(fā)免疫治療藥物（如免疫檢查點(diǎn)抑制劑）。

2.細(xì)胞學(xué)分析：細(xì)胞水平的研究是理解免疫應(yīng)答機(jī)制的基礎(chǔ)。

(1)流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,FCM）：是一種快速、精確、高通量分析單個(gè)細(xì)胞物理和化學(xué)特性的技術(shù)。

***原理**：利用激光照射單細(xì)胞懸液，細(xì)胞依次通過(guò)激光束時(shí)，會(huì)散射光（前向散射FSC，反映細(xì)胞大??；側(cè)向散射SSC，反映細(xì)胞顆粒度）并發(fā)出熒光（由細(xì)胞表面或胞內(nèi)標(biāo)記的熒光抗體、熒光蛋白等發(fā)出）。通過(guò)檢測(cè)這些信號(hào)，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)、分選和群體分析。

***常用標(biāo)記物**：CD系列分子（用于鑒定T細(xì)胞亞群、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等）、細(xì)胞因子受體、活化標(biāo)志物（如CD69,CD25）、凋亡相關(guān)蛋白（如AnnexinV,PI）、細(xì)胞周期標(biāo)記物等。

***應(yīng)用**：分析免疫細(xì)胞的種類(lèi)、比例、活化狀態(tài)、功能狀態(tài)（如細(xì)胞因子分泌能力）、細(xì)胞周期、凋亡情況等。是免疫學(xué)研究中最常用的技術(shù)之一。

(2)免疫細(xì)胞分選（CellSorting）：在流式細(xì)胞術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合細(xì)胞分選技術(shù)（如熒光激活細(xì)胞分選FACS或磁性激活細(xì)胞分選MACS），可以根據(jù)預(yù)先設(shè)定的熒光標(biāo)記陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，將特定類(lèi)型的細(xì)胞群體從混合細(xì)胞樣本中分離出來(lái)，用于后續(xù)的功能研究、基因測(cè)序等。

***FACS**：通過(guò)計(jì)算機(jī)控制電磁閥，將符合條件的細(xì)胞分選到不同的收集管中?？蓪?shí)現(xiàn)高純度、高回收率的細(xì)胞分選。

***MACS**：利用磁珠標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞，在磁場(chǎng)中通過(guò)磁珠的磁性將目標(biāo)細(xì)胞吸附下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)分選。操作相對(duì)FACS簡(jiǎn)單，尤其適用于分選大量細(xì)胞。

(3)其他細(xì)胞學(xué)技術(shù)：如相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)；暗視野顯微鏡觀察細(xì)胞動(dòng)態(tài)過(guò)程（如吞噬）；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（體外維持、增殖、功能誘導(dǎo)等）。

3.分子生物學(xué)技術(shù)：在分子水平上研究免疫基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫分子結(jié)構(gòu)等功能。

(1)PCR技術(shù)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）：一種在體外快速擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)。

***原理**：利用DNA聚合酶在引物作用下，沿模板鏈合成互補(bǔ)DNA鏈，經(jīng)過(guò)變性-退火-延伸的循環(huán)過(guò)程，使目標(biāo)DNA片段呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。

***應(yīng)用**：檢測(cè)基因表達(dá)（如Q-PCR檢測(cè)mRNA水平）、檢測(cè)病原體DNA/RNA、基因分型、構(gòu)建基因重組體等。

***類(lèi)型**：常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR，能定量分析起始模板量）、巢式PCR（提高檢測(cè)靈敏度）、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR，用于檢測(cè)mRNA）。

(2)基因編輯技術(shù)：能夠?qū)ι矬w基因組進(jìn)行精確、高效、可逆的修飾的技術(shù)。

***CRISPR/Cas9系統(tǒng)**：是目前最主流的基因編輯技術(shù)。利用一段引導(dǎo)RNA（gRNA）識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)DNA序列，然后通過(guò)Cas9核酸酶在該位點(diǎn)進(jìn)行切割，引發(fā)細(xì)胞自身的DNA修復(fù)機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除、插入、替換等操作。

***應(yīng)用**：構(gòu)建免疫細(xì)胞基因功能研究模型、改造免疫細(xì)胞用于治療（如CAR-T細(xì)胞）、研究遺傳病與免疫的關(guān)系。

(3)基因表達(dá)譜分析：如微陣列（Microarray）和下一代測(cè)序（Next-GenerationSequencing,NGS）技術(shù)。

***原理**：微陣列可以在一張芯片上固定大量基因的探針，通過(guò)與樣本中的mRNA（或cDNA）雜交，檢測(cè)大量基因的表達(dá)水平變化。NGS則可以對(duì)樣本中所有或大部分的RNA、DNA進(jìn)行測(cè)序，提供更全面、更精確的分子信息。

***應(yīng)用**：比較不同免疫狀態(tài)下（如活化T細(xì)胞與靜息T細(xì)胞）基因表達(dá)譜的差異；研究細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控；繪制免疫細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，解析免疫細(xì)胞的異質(zhì)性和功能狀態(tài)。

（三）免疫學(xué)研究應(yīng)用

1.醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：免疫學(xué)研究成果深刻改變了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的面貌。

(1)腫瘤免疫：利用免疫系統(tǒng)對(duì)抗腫瘤細(xì)胞是當(dāng)前免疫治療的熱點(diǎn)。

***免疫檢查點(diǎn)抑制劑**：阻斷腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD-1或其配體PD-L1與T細(xì)胞上相應(yīng)受體（PD-CTLA-4）的結(jié)合，解除對(duì)T細(xì)胞的抑制，使其能持續(xù)殺傷腫瘤。代表藥物有PD-1抑制劑（如納武利尤單抗、帕博利珠單抗）和PD-L1抑制劑。

***過(guò)繼性細(xì)胞療法**：收集患者自身的免疫細(xì)胞（主要是T細(xì)胞），在體外通過(guò)基因工程技術(shù)改造（如加入識(shí)別腫瘤特異抗原的CAR結(jié)構(gòu)），擴(kuò)增后再輸回患者體內(nèi)，使其能特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞療法是目前最成功的例子。

***腫瘤疫苗**：利用腫瘤特異性抗原（如突變抗原、腫瘤相關(guān)抗原）制備疫苗，激發(fā)患者自身的抗腫瘤免疫應(yīng)答。

***免疫細(xì)胞治療**：如使用CIK細(xì)胞（細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞）、NK細(xì)胞等進(jìn)行治療。

(2)自身免疫疾?。哼@類(lèi)疾病是由于免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤地攻擊自身組織而引起的。

***發(fā)病機(jī)制研究**：通過(guò)動(dòng)物模型和患者樣本，研究自身免疫病的觸發(fā)因素（如環(huán)境因素、遺傳易感性）、免疫耐受的破壞機(jī)制等。

***治療策略**：目標(biāo)是控制異常免疫應(yīng)答，減少組織損傷。常用方法包括：

***免疫抑制劑**：如糖皮質(zhì)激素（潑尼松）、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤等，能廣泛抑制免疫反應(yīng)，但副作用較大。

***生物制劑**：靶向特定免疫分子或細(xì)胞的藥物，如TNF-α抑制劑（依那西普、英夫利西單抗）、IL-6抑制劑（托珠單抗）、B細(xì)胞清除療法（利妥昔單抗，針對(duì)CD20陽(yáng)性B細(xì)胞）。

***免疫調(diào)節(jié)劑**：如小劑量糖皮質(zhì)激素、免疫球蛋白等。

(3)感染性疾?。阂呙缡穷A(yù)防感染性疾病最有效的手段。

***疫苗開(kāi)發(fā)**：基于免疫學(xué)原理，設(shè)計(jì)和制備各種類(lèi)型的疫苗，如減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗、mRNA疫苗等。疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫通常包括體液免疫（抗體）和細(xì)胞免疫（T細(xì)胞）。

***免疫診斷**：利用抗原抗體反應(yīng)等免疫學(xué)原理，檢測(cè)體內(nèi)是否存在特定病原體或其產(chǎn)生的抗體/抗原，用于疾病的早期診斷、感染狀態(tài)評(píng)估、療效監(jiān)測(cè)等。常用方法有ELISA、膠體金法、免疫熒光法、快速診斷試劑盒等。

***治療性抗體**：?jiǎn)慰寺】贵w可用于治療某些感染，如中和毒素（如肉毒桿菌素）、阻止病毒吸附細(xì)胞、清除感染細(xì)胞等。

2.農(nóng)業(yè)領(lǐng)域：免疫學(xué)原理在動(dòng)植物健康保障和育種中也有重要應(yīng)用。

(1)動(dòng)物疫病防控：通過(guò)免疫學(xué)手段預(yù)防和控制動(dòng)物傳染病。

***疫苗免疫**：為家畜家禽（如豬、雞、牛）接種疫苗，建立群體免疫屏障，降低發(fā)病率。疫苗研發(fā)需考慮免疫原性、安全性、有效性等因素。

***免疫增強(qiáng)劑**：使用某些物質(zhì)（如疫苗佐劑、植物提取物、中草藥等）增強(qiáng)動(dòng)物免疫系統(tǒng)的應(yīng)答能力，提高疫苗效果。

***疾病監(jiān)測(cè)**：通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)（如ELISA檢測(cè)抗體）、病原學(xué)檢測(cè)等方法，監(jiān)測(cè)動(dòng)物群的健康狀況和疫病流行情況。

(2)植物免疫：研究植物的防御機(jī)制，提高作物的抗病能力。

***抗病育種**：利用自然抗病資源或通過(guò)基因工程將抗病基因?qū)胱魑?，培育抗病品種，減少農(nóng)藥使用。

***誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR）和獲得性系統(tǒng)抗性（ASR）**：通過(guò)特定處理（如接種植物促生菌PGPR、使用水楊酸、乙烯等信號(hào)分子），激活植物的防御系統(tǒng)，使其對(duì)多種病原物產(chǎn)生廣譜、持久的抗性。

***植物病害診斷**：利用ELISA、抗體芯片、分子診斷技術(shù)（如PCR、qPCR）等檢測(cè)植物體內(nèi)的病原菌或病毒。

二、免疫學(xué)研究關(guān)鍵技術(shù)

（一）免疫熒光技術(shù)

1.原理：免疫熒光技術(shù)利用熒光標(biāo)記的抗體（熒光素標(biāo)記的二抗或直接標(biāo)記的一抗）與細(xì)胞或組織切片中的靶抗原發(fā)生特異性結(jié)合。結(jié)合后，在特定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下，熒光標(biāo)記物會(huì)發(fā)出相應(yīng)顏色的熒光，通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀等設(shè)備可以觀察到抗原的定位、分布和相對(duì)含量。根據(jù)熒光顏色（如FITC綠色、TRITC紅色、AlexaFluor系列多種顏色）和顯色方式（直接法或間接法），可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶抗原。

2.操作步驟（以間接免疫熒光法為例）：

(1)**樣本制備**：

***組織固定**：取材后立即放入固定液（常用4%多聚甲醛或4%甲醛溶液）中，4℃固定數(shù)小時(shí)至過(guò)夜。固定作用是使組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，抗原不易流失。注意選擇合適的固定時(shí)間，過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致抗原變性。

***滲透**：將固定后的樣本放入滲透液（如0.1MPBS或Tris緩沖液，含0.1%-0.5%TritonX-100或SDS）中，4℃滲透30分鐘至1小時(shí)。滲透作用是使固定液和抗體等試劑能進(jìn)入組織內(nèi)部。

***洗滌**：用PBS或TBS緩沖液洗滌樣本3-5次，每次15-30分鐘，以去除未結(jié)合的固定劑和滲透劑。建議使用冷緩沖液洗滌。

***封閉（阻斷非特異性結(jié)合）**：將樣本置于含血清（同種來(lái)源血清最佳，如兔血清封閉兔源抗體）或BSA（牛血清白蛋白）的封閉液中，室溫孵育1-2小時(shí)。此步驟能封閉細(xì)胞膜、細(xì)胞器等背景位點(diǎn)，防止抗體非特異性吸附，減少背景熒光。

***抗原修復(fù)（可選）**：對(duì)于某些不易與抗體結(jié)合的抗原（如甲醛固定的蛋白質(zhì)），可能需要進(jìn)行抗原修復(fù)，如用熱修復(fù)（TRIS-EDTA緩沖液，95℃加熱10-20分鐘）或酶修復(fù)（如用胰蛋白酶或蛋白酶K處理）。

(2)**一抗孵育**：將樣本置于含特異性一抗（直接識(shí)別抗原的抗體）的抗體工作液中，通常在4℃孵育過(guò)夜，使一抗充分與靶抗原結(jié)合。有時(shí)也可在室溫下孵育1-2小時(shí)，但靈敏度可能較低。

(3)**洗滌**：用PBS或TBS緩沖液洗滌樣本3-5次，每次15分鐘，去除未結(jié)合的一抗。

(4)**二抗孵育**：將樣本置于含熒光素標(biāo)記的、能與對(duì)應(yīng)一抗物種來(lái)源的二抗結(jié)合的熒光二抗工作液中，室溫避光孵育1小時(shí)。例如，如果使用兔源一抗，則需用山羊抗兔IgG-FITC作為二抗。二抗需經(jīng)過(guò)優(yōu)化濃度，避免過(guò)飽和導(dǎo)致背景高。

(5)**洗滌**：同步驟(3)，洗滌3-5次，去除未結(jié)合的二抗。

(6)**復(fù)染（可選）**：如果需要觀察細(xì)胞核或細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可在最后一步用DAPI（藍(lán)色熒光）或Hoechst（藍(lán)色熒光）染料對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。

(7)**封片**：將樣本置于含抗熒光淬滅劑（如DAPI封片劑）的封片液中，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察或保存。

3.儀器設(shè)備：熒光顯微鏡（正置或倒置，需配備相應(yīng)激發(fā)光源和濾光片組）、載玻片、蓋玻片、冷庫(kù)、搖床等。

4.結(jié)果分析：通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)的位置（細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、細(xì)胞核）、強(qiáng)度和分布模式?？梢允褂肐mageJ等軟件進(jìn)行定量分析，如熒光強(qiáng)度積分、陽(yáng)性細(xì)胞百分比等。需要注意設(shè)置陰性對(duì)照（未加一抗或用非特異性抗體替代一抗的對(duì)照）以排除背景熒光干擾。

（二）ELISA技術(shù)

1.原理：ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）是一種基于抗原抗體特異性結(jié)合，并通過(guò)酶標(biāo)記物顯色進(jìn)行定性和定量分析的技術(shù)。其核心是利用固相載體（如酶標(biāo)板微孔）固定抗原或抗體，使反應(yīng)體系封閉在固相表面進(jìn)行，便于洗滌和檢測(cè)，特異性高，靈敏度高。

2.類(lèi)型及操作要點(diǎn)：

(1)**直接ELISA**：

***原理**：將已知抗原固定在酶標(biāo)板微孔表面，洗滌后直接加入酶標(biāo)記的一抗，孵育后洗滌，加入底物顯色，最后測(cè)定吸光度值。

***操作要點(diǎn)**：抗原固定是關(guān)鍵，需優(yōu)化固定條件（濃度、緩沖液pH、時(shí)間、溫度）以確?？乖浞直┞恫⒈挥行Ч潭??？贵w濃度也需優(yōu)化。

(2)**間接ELISA**：

***原理**：將已知抗原固定在酶標(biāo)板微孔表面，洗滌后加入未標(biāo)記的一抗（針對(duì)抗原），孵育后洗滌，再加入酶標(biāo)記的二抗（針對(duì)一抗的種屬來(lái)源，如羊抗鼠IgG-HRP），孵育后洗滌，加入底物顯色，測(cè)定吸光度值。

***操作要點(diǎn)**：由于使用了二抗，檢測(cè)靈敏度通常高于直接ELISA。但操作步驟多，需要分別優(yōu)化一抗和二抗的濃度及孵育條件。需設(shè)置陰性對(duì)照（未加一抗或用非特異性抗體替代一抗的對(duì)照）。

(3)**競(jìng)爭(zhēng)ELISA**：

***原理**：將待測(cè)樣本和已知量的標(biāo)記抗原（如放射性同位素標(biāo)記或酶標(biāo)記）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相上的一抗。孵育后洗滌，加入能結(jié)合標(biāo)記抗原的抗體（或直接加酶標(biāo)抗體），最后加入底物顯色。樣本中待測(cè)抗原濃度越高，則結(jié)合到固相上的標(biāo)記抗原就越少，顯色越淺（或放射性計(jì)數(shù)越低），呈現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。

***應(yīng)用**：常用于檢測(cè)小分子物質(zhì)（如激素、藥物、毒素）。

(4)**雙抗體夾心ELISA**：

***原理**：將已知抗原固定在酶標(biāo)板微孔表面，洗滌后加入酶標(biāo)記的一抗，孵育后洗滌，再加入未標(biāo)記的捕獲抗體（能與抗原的另一表位結(jié)合），使一抗和捕獲抗體形成“夾心”結(jié)構(gòu)包裹住抗原，孵育后洗滌，加入底物顯色，測(cè)定吸光度值。

***操作要點(diǎn)**：特異性強(qiáng)，靈敏度高，是檢測(cè)抗原最常用的ELISA類(lèi)型。關(guān)鍵在于優(yōu)化包被抗原和酶標(biāo)抗體（夾心抗體）的濃度及孵育條件。需要設(shè)置陰性對(duì)照（未加包被抗原或酶標(biāo)抗體）。

3.操作步驟（以雙抗體夾心ELISA為例）：

(1)**包被**：將已知濃度的抗原稀釋后加入酶標(biāo)板微孔中，4℃包被過(guò)夜或室溫包被2-4小時(shí)。包被后用洗滌液（如洗滌緩沖液，含0.05%Tween-20的PBS）洗滌3次。

(2)**封閉**：加入封閉液（如5%脫脂奶粉或BSA的封閉緩沖液）室溫孵育1-2小時(shí)，封閉未結(jié)合的固相位點(diǎn)。封閉后用洗滌液洗滌3-5次。

(3)**加酶標(biāo)抗體（夾心抗體）**：將酶標(biāo)記的二抗（針對(duì)一抗的種屬來(lái)源）用稀釋液稀釋至合適濃度，加入酶標(biāo)板微孔中，室溫孵育1小時(shí)。孵育后用洗滌液洗滌3-5次。

(4)**加底物**：向每個(gè)微孔加入適量酶的底物溶液（如TMB、ABTS等），避光室溫孵育15-30分鐘（或根據(jù)說(shuō)明書(shū)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整），底物在酶的作用下發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物。

(5)**終止反應(yīng)**：加入終止液（如2MH2SO4或HCl），終止酶與底物的反應(yīng)。此時(shí)有色產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為無(wú)色物質(zhì)，溶液顏色變深。

(6)**測(cè)定吸光度**：立即使用酶標(biāo)儀在指定波長(zhǎng)（如TMB為450nm，ABTS為405nm）測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。OD值與樣本中待測(cè)抗原濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。

4.儀器設(shè)備：酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀、移液器及吸頭、洗板機(jī)（可選）、水浴鍋或恒溫?fù)u床、底物孵育箱等。

5.結(jié)果分析：通過(guò)酶標(biāo)儀讀取各孔OD值。計(jì)算平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作）或公式（OD值=C×k，其中C為抗原濃度，k為比例常數(shù)）計(jì)算樣本中待測(cè)抗原的濃度。需設(shè)置空白對(duì)照（不含任何樣本或抗原的孔，用于校準(zhǔn)）、陰性對(duì)照（不含樣本的孔，用于判斷非特異性結(jié)合）和陽(yáng)性對(duì)照（已知抗原濃度的孔，用于判斷實(shí)驗(yàn)有效性）。

（三）細(xì)胞因子檢測(cè)

1.方法：細(xì)胞因子是免疫細(xì)胞產(chǎn)生的小分子蛋白質(zhì)，在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。檢測(cè)細(xì)胞因子水平是研究免疫應(yīng)答狀態(tài)的重要手段。

(1)**Luminex技術(shù)（xMAP技術(shù)）**：

***原理**：一種高通量、多參數(shù)檢測(cè)技術(shù)。將多種不同的檢測(cè)分子（如生物素標(biāo)記的抗體、熒光微球、捕獲抗體等）固定在微球表面，通過(guò)磁力分離，實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)微球內(nèi)多種生物分子（如細(xì)胞因子、抗體、微生物等）的同時(shí)檢測(cè)和定量。

***操作流程**：通常包括以下步驟：

***樣本準(zhǔn)備**：收集細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿或組織提取液等樣本。必要時(shí)進(jìn)行離心去除細(xì)胞碎片。

***標(biāo)準(zhǔn)品制備**：制作細(xì)胞因子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

***加樣**：將樣本、標(biāo)準(zhǔn)品和Luminex檢測(cè)試劑盒（包含預(yù)包被有捕獲抗體的微球和生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體）加入反應(yīng)管中混合。

***孵育**：室溫孵育，使樣本中的細(xì)胞因子與微球上的捕獲抗體結(jié)合，然后加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體。

***磁分離**：通過(guò)磁力架將結(jié)合了生物分子簇的微球與游離組分分離。

***洗滌**：洗滌微球，去除未結(jié)合的游離組分。

***檢測(cè)**：將微球轉(zhuǎn)移到流式細(xì)胞儀中，用激光激發(fā)微球，檢測(cè)每個(gè)微球上結(jié)合的生物素分子簇發(fā)出的熒光信號(hào)。根據(jù)熒光強(qiáng)度和微球類(lèi)型，即可確定樣本中各細(xì)胞因子的濃度。

***應(yīng)用**：可同時(shí)檢測(cè)數(shù)十種甚至上百種細(xì)胞因子，靈敏度高，是研究細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)和免疫微環(huán)境的強(qiáng)大工具。

(2)**ELISA技術(shù)**：

***原理**：與上文所述ELISA類(lèi)似，但通常用于檢測(cè)單一或少量細(xì)胞因子。通過(guò)抗原抗體反應(yīng)，將細(xì)胞因子捕獲在固相載體上，然后用酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)底物顯色定量。

***類(lèi)型**：主要有雙抗體夾心ELISA（最常用，特異性高）、間接ELISA（用生物素標(biāo)記的抗體檢測(cè)）等。

***操作**：參照ELISA技術(shù)步驟進(jìn)行，但需使用針對(duì)特定細(xì)胞因子的包被抗體和酶標(biāo)抗體。

***應(yīng)用**：廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)（如炎癥狀態(tài)評(píng)估）、研究實(shí)驗(yàn)室中細(xì)胞因子水平的定量分析。

2.應(yīng)用：細(xì)胞因子檢測(cè)在免疫學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

***評(píng)估免疫應(yīng)答**：檢測(cè)不同免疫刺激（如疫苗、藥物、病原體感染）下細(xì)胞因子（如IL-2,IFN-γ,TNF-α,IL-4,IL-10等）的表達(dá)變化，判斷免疫應(yīng)答的類(lèi)型（Th1,Th2,Th17等）和強(qiáng)度。

***疾病狀態(tài)研究**：分析不同疾病（如感染性疾病、自身免疫病、腫瘤、過(guò)敏性疾?。┗颊唧w內(nèi)的細(xì)胞因子譜，了解疾病發(fā)生發(fā)展的免疫機(jī)制。

***藥物研發(fā)與評(píng)價(jià)**：檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的影響，評(píng)估藥物的免疫調(diào)節(jié)作用。

***免疫治療監(jiān)測(cè)**：在免疫治療（如細(xì)胞因子治療、免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療）過(guò)程中，監(jiān)測(cè)相關(guān)細(xì)胞因子的變化，評(píng)估療效和安全性。

三、免疫學(xué)研究前沿

（一）免疫調(diào)控機(jī)制

1.腸道菌群與免疫：腸道是人體最大的免疫器官，約70-80%的免疫細(xì)胞位于腸道相關(guān)淋巴組織（GALT）。腸道菌群作為最大的微生物群落，與宿主免疫系統(tǒng)之間存在著復(fù)雜而精密的相互作用。

***雙向溝通機(jī)制**：腸道菌群通過(guò)其代謝產(chǎn)物（如丁酸鹽、TMAO）、結(jié)構(gòu)成分（如LPS）和細(xì)胞因子（如IL-22）等，影響宿主免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能（如促進(jìn)Treg細(xì)胞產(chǎn)生、增強(qiáng)Th17反應(yīng)）。反過(guò)來(lái)，宿主免疫系統(tǒng)也通過(guò)分泌免疫因子（如IL-10,TGF-β）和物理屏障（如腸道上皮細(xì)胞）調(diào)節(jié)腸道菌群的組成和定植。

***研究進(jìn)展**：利用宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)，系統(tǒng)研究腸道菌群與特定免疫疾?。ㄈ缪装Y性腸病IBD、過(guò)敏性疾病、自身免疫?。┑年P(guān)系。開(kāi)發(fā)基于腸道菌群的干預(yù)策略（如益生菌、益生元、糞菌移植FMT）作為疾病治療的輔助手段。

2.免疫檢查點(diǎn)：免疫檢查點(diǎn)是一類(lèi)存在于免疫細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)受體-配體復(fù)合物，它們?cè)诰S持免疫耐受、防止自身免疫病和腫瘤免疫逃逸中起著關(guān)鍵的“剎車(chē)”作用。當(dāng)免疫細(xì)胞過(guò)度活化時(shí)，免疫檢查點(diǎn)分子會(huì)被激活，向T細(xì)胞等免疫細(xì)胞發(fā)送抑制信號(hào)，從而終止免疫應(yīng)答。

***主要檢查點(diǎn)分子**：

***PD-1/PD-L1通路**：PD-1是T細(xì)胞表面的inhibitoryreceptor，PD-L1是多種細(xì)胞（包括腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞）表面表達(dá)的ligand。PD-1與PD-L1結(jié)合后抑制T細(xì)胞活性。PD-1/PD-L1通路是當(dāng)前腫瘤免疫治療的主要靶點(diǎn)。

***CTLA-4/CD80/CD86通路**：CTLA-4是T細(xì)胞表面的inhibitoryreceptor，與APC表面的CD80/CD86結(jié)合，抑制APC提呈抗原和T細(xì)胞活化。

***其他檢查點(diǎn)**：如LAG-3、TIM-3、TIGIT等，也在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。

***研究進(jìn)展**：深入解析免疫檢查點(diǎn)分子的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，開(kāi)發(fā)新型靶向藥物（如抗體、小分子抑制劑），克服腫瘤免疫逃逸，提高免疫治療效果。同時(shí)研究免疫檢查點(diǎn)在維持自身免疫耐受中的作用，為治療自身免疫病提供新思路。

（二）免疫治療進(jìn)展

1.腫瘤免疫治療：利用患者自身的免疫系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗腫瘤。

(1)**免疫檢查點(diǎn)抑制劑**：如上文所述，通過(guò)阻斷PD-1/PD-L1或CTLA-4通路，解除對(duì)T細(xì)胞的抑制，恢復(fù)其殺傷腫瘤的能力。已在多種腫瘤（如黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、腎癌等）的治療中取得顯著成效。

(2)**過(guò)繼性細(xì)胞療法（ACT）**：從患者體內(nèi)采集免疫細(xì)胞（主要是T細(xì)胞），在體外通過(guò)基因工程技術(shù)改造（如CAR-T細(xì)胞療法），使其特異性識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞，然后重新輸回患者體內(nèi)。CAR-T細(xì)胞療法是當(dāng)前最成功的ACT方案，尤其在血液腫瘤治療中效果突出。

(3)**腫瘤疫苗**：利用腫瘤特異性抗原（如突變抗原、腫瘤相關(guān)抗原）制備疫苗，激發(fā)患者自身的抗腫瘤免疫應(yīng)答?？煞譃轭A(yù)防性疫苗（預(yù)防腫瘤發(fā)生）和治療性疫苗（治療已發(fā)生的腫瘤）。

(4)**免疫細(xì)胞治療**：如使用CIK細(xì)胞（細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞）、NK細(xì)胞等進(jìn)行治療，通過(guò)體外增殖擴(kuò)增或基因修飾增強(qiáng)其抗腫瘤活性。

2.其他疾病免疫治療：免疫調(diào)節(jié)策略不僅限于腫瘤，也在其他疾病領(lǐng)域展現(xiàn)出潛力。

(1)**自身免疫性疾病治療**：通過(guò)抑制過(guò)度活化的免疫細(xì)胞或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，控制疾病進(jìn)展。如使用B細(xì)胞清除療法（利妥昔單抗）治療CD20陽(yáng)性B細(xì)胞相關(guān)的自身免疫??；使用JAK抑制劑等靶向藥物調(diào)節(jié)信號(hào)通路。

(2)**感染性疾病治療**：利用免疫調(diào)節(jié)劑或免疫細(xì)胞療法治療難治性感染。如使用免疫增強(qiáng)劑提高機(jī)體抵抗力；開(kāi)發(fā)針對(duì)特定病原體的免疫治療策略。

(3)**過(guò)敏性疾病治療**：通過(guò)免疫療法（如脫敏治療）調(diào)節(jié)過(guò)敏反應(yīng)，降低機(jī)體對(duì)過(guò)敏原的敏感性。

（三）單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)

1.原理：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠?qū)蝹€(gè)細(xì)胞內(nèi)的全部或部分基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組等分子信息進(jìn)行測(cè)序和分析。通過(guò)去除細(xì)胞間異質(zhì)性，揭示細(xì)胞群體內(nèi)部的復(fù)雜性和功能多樣性。主要技術(shù)包括單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）、單細(xì)胞DNA測(cè)序（scDNA-seq）、單細(xì)胞ATAC測(cè)序（scATAC-seq）等。

(1)**scRNA-seq**：通過(guò)反轉(zhuǎn)錄過(guò)程將單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行測(cè)序?？梢詸z測(cè)細(xì)胞表達(dá)的基因種類(lèi)和豐度，繪制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，分析細(xì)胞分化軌跡、細(xì)胞亞群特征和功能狀態(tài)。

(2)**scDNA-seq**：主要用于檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的基因組結(jié)構(gòu)變異（如SNV、INDEL）、拷貝數(shù)變異（CNV）和染色體結(jié)構(gòu)變異。常用于腫瘤基因組研究、細(xì)胞遺傳學(xué)研究。

(3)**scATAC-seq**：通過(guò)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域的DNA序列，間接反映基因的轉(zhuǎn)錄活性。適用于研究染色質(zhì)重塑、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞狀態(tài)。

2.應(yīng)用：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序技術(shù)在免疫學(xué)研究中具有革命性的意義。

(1)**解析免疫細(xì)胞異質(zhì)性**：揭示不同免疫細(xì)胞亞群（如T細(xì)胞亞群、B細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞亞群、巨噬細(xì)胞亞群）的分子特征和功能差異。

(2)**繪制免疫細(xì)胞分化圖譜**：追蹤免疫細(xì)胞在發(fā)育和應(yīng)答過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，解析分化路徑。

(3)**研究免疫微環(huán)境**：分析免疫細(xì)胞與其他細(xì)胞（如

一、免疫學(xué)概述

免疫學(xué)是研究生物體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及其與外界環(huán)境相互作用的科學(xué)。它不僅涉及基礎(chǔ)生物學(xué)原理，還廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。本手冊(cè)旨在為免疫學(xué)研究提供系統(tǒng)性的指導(dǎo)，涵蓋免疫學(xué)的基本概念、研究方法、關(guān)鍵技術(shù)及前沿進(jìn)展。

（一）免疫學(xué)的基本概念

1.免疫系統(tǒng)組成

(1)先天性免疫系統(tǒng)：包括物理屏障（皮膚、黏膜）、化學(xué)屏障（分泌液）、免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等）和免疫分子（補(bǔ)體系統(tǒng)、干擾素等）。

(2)獲得性免疫系統(tǒng)：包括B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫和T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，具有特異性和記憶性。

2.免疫應(yīng)答過(guò)程

(1)抗原識(shí)別：免疫細(xì)胞通過(guò)表面受體（如T細(xì)胞受體、B細(xì)胞受體）識(shí)別抗原。

(2)免疫細(xì)胞活化：抗原呈遞細(xì)胞（APC）將抗原信息傳遞給T細(xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。

(3)免疫效應(yīng)：激活的T細(xì)胞和B細(xì)胞分化為效應(yīng)細(xì)胞，清除病原體或異常細(xì)胞。

(4)免疫記憶：部分細(xì)胞分化為記憶細(xì)胞，提供長(zhǎng)期免疫保護(hù)。

（二）免疫學(xué)研究方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

(1)常用模型：小鼠、大鼠、斑馬魚(yú)等，用于研究免疫應(yīng)答、疾病機(jī)制及藥物篩選。

(2)建模方法：包括基因敲除、轉(zhuǎn)基因、無(wú)菌動(dòng)物等技術(shù)。

2.細(xì)胞學(xué)分析

(1)流式細(xì)胞術(shù)：檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記、細(xì)胞周期、凋亡等指標(biāo)。

(2)免疫細(xì)胞分選：通過(guò)磁珠分選或FACS技術(shù)獲取特定細(xì)胞群體。

3.分子生物學(xué)技術(shù)

(1)PCR技術(shù)：檢測(cè)基因表達(dá)、抗原序列分析。

(2)基因編輯：CRISPR/Cas9技術(shù)用于修飾免疫細(xì)胞基因。

（三）免疫學(xué)研究應(yīng)用

1.醫(yī)學(xué)領(lǐng)域

(1)腫瘤免疫：通過(guò)免疫檢查點(diǎn)抑制劑、CAR-T細(xì)胞療法等手段治療癌癥。

(2)自身免疫疾?。貉芯考膊“l(fā)病機(jī)制，開(kāi)發(fā)靶向藥物（如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥）。

2.農(nóng)業(yè)領(lǐng)域

(1)動(dòng)物疫病防控：利用疫苗、免疫增強(qiáng)劑提高動(dòng)物免疫力。

(2)轉(zhuǎn)基因作物：培育抗病品種，減少農(nóng)藥使用。

二、免疫學(xué)研究關(guān)鍵技術(shù)

（一）免疫熒光技術(shù)

1.原理：利用熒光標(biāo)記的抗體檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)或組織中的抗原。

2.操作步驟：

(1)細(xì)胞固定：使用甲醇或甲醛固定細(xì)胞。

(2)封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)：使用封閉液（如BSA、血清）。

(3)一抗孵育：加入特異性抗體。

(4)二抗孵育：加入熒光標(biāo)記的二抗。

(5)成像分析：通過(guò)熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

（二）ELISA技術(shù)

1.原理：酶標(biāo)記的抗體與抗原結(jié)合，通過(guò)底物顯色定量分析。

2.類(lèi)型：

(1)直接ELISA：直接用酶標(biāo)抗體檢測(cè)抗原。

(2)間接ELISA：用生物素標(biāo)記抗體，再結(jié)合鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物。

(3)雙抗體夾心ELISA：檢測(cè)抗原需同時(shí)存在捕獲抗體和檢測(cè)抗體。

（三）細(xì)胞因子檢測(cè)

1.方法：

(1)Luminex技術(shù)：高通量檢測(cè)多種細(xì)胞因子。

(2)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）：?jiǎn)我换蛏倭考?xì)胞因子檢測(cè)。

2.應(yīng)用：評(píng)估免疫應(yīng)答強(qiáng)度、疾病狀態(tài)（如炎癥、感染）。

三、免疫學(xué)研究前沿

（一）免疫調(diào)控機(jī)制

1.腸道菌群與免疫：腸道微生物通過(guò)代謝產(chǎn)物影響免疫細(xì)胞功能。

2.免疫checkpoints：研究PD-1/PD-L1等抑制性通路，開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物。

（二）免疫治療進(jìn)展

1.CAR-T細(xì)胞療法：改造患者T細(xì)胞靶向癌細(xì)胞。

2.免疫療法聯(lián)合化療：提高腫瘤治療療效。

（三）單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)

1.技術(shù)優(yōu)勢(shì)：解析復(fù)雜免疫微環(huán)境中的細(xì)胞異質(zhì)性。

2.應(yīng)用場(chǎng)景：腫瘤免疫微環(huán)境分析、自身免疫病機(jī)制研究。

四、免疫學(xué)研究倫理

1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：遵循3R原則（替代、減少、優(yōu)化）。

2.人類(lèi)樣本：獲得知情同意，保護(hù)隱私。

3.數(shù)據(jù)共享：避免利益沖突，規(guī)范成果發(fā)布。

**一、免疫學(xué)概述**

免疫學(xué)是生物學(xué)的一個(gè)重要分支，專(zhuān)注于研究生物體（包括動(dòng)物和人類(lèi)）的免疫系統(tǒng)、其組成部分、功能機(jī)制以及與內(nèi)外環(huán)境（如病原體、腫瘤細(xì)胞、異物等）的相互作用。它不僅是一個(gè)基礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域，為理解生命活動(dòng)提供了重要視角，其研究成果還在醫(yī)學(xué)診斷、疾病治療（如疫苗開(kāi)發(fā)、免疫治療）、生物技術(shù)等多個(gè)方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。本手冊(cè)旨在為免疫學(xué)研究者提供一個(gè)系統(tǒng)性的知識(shí)框架和實(shí)用的操作指南，內(nèi)容涵蓋從基本概念到前沿技術(shù)的各個(gè)方面，力求信息準(zhǔn)確、邏輯清晰、操作性強(qiáng)。

（一）免疫學(xué)的基本概念

1.免疫系統(tǒng)組成

(1)先天性免疫系統(tǒng)（InnateImmuneSystem）：這是生物體抵御病原體入侵的第一道防線，具有非特異性和快速反應(yīng)的特點(diǎn)。其組成成分包括：

***物理屏障**：如皮膚、黏膜及其附屬物（汗腺、皮脂腺等），能物理性地阻止大部分病原體進(jìn)入體內(nèi)。例如，皮膚角質(zhì)層的致密結(jié)構(gòu)、呼吸道黏膜的纖毛運(yùn)動(dòng)和黏液分泌，都屬于物理屏障的范疇。

***化學(xué)屏障**：體表和體內(nèi)分泌物含有多種抑菌或殺菌物質(zhì)。例如，皮膚和黏膜表面的pH值（偏酸性）、唾液中的溶菌酶、胃液中的胃酸、淚液和汗液中的溶菌酶和IgA，都能抑制或殺滅部分微生物。

***免疫細(xì)胞**：主要包括吞噬細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞Macrophages、中性粒細(xì)胞Neutrophils）和自然殺傷細(xì)胞（NKCells）。吞噬細(xì)胞能夠識(shí)別、吞噬并消化病原體或細(xì)胞碎片；中性粒細(xì)胞是炎癥早期到達(dá)感染部位的主要吞噬細(xì)胞；NK細(xì)胞能直接殺傷缺乏MHCI類(lèi)分子的靶細(xì)胞（如被病毒感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞）。

***免疫分子**：包括補(bǔ)體系統(tǒng)（ComplementSystem）、干擾素（Interferons,IFNs）、細(xì)胞因子（Cytokines）等。補(bǔ)體系統(tǒng)通過(guò)經(jīng)典途徑、凝集素途徑和替代途徑激活，能裂解病原體、促進(jìn)吞噬、激活NK細(xì)胞等；干擾素主要由被病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生，能干擾病毒復(fù)制并增強(qiáng)其他免疫細(xì)胞的功能；細(xì)胞因子種類(lèi)繁多，如白細(xì)胞介素（ILs）、腫瘤壞死因子（TNFs）等，在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中起著關(guān)鍵的“指揮官”作用。

(2)獲得性免疫系統(tǒng)（AdaptiveImmuneSystem）：也稱(chēng)為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)或特異性免疫系統(tǒng)，其特點(diǎn)是具有高度的特異性（針對(duì)特定抗原產(chǎn)生應(yīng)答）和免疫記憶（再次接觸相同抗原時(shí)能更快、更強(qiáng)地反應(yīng)）。其核心細(xì)胞是淋巴細(xì)胞，主要包括：

***B淋巴細(xì)胞（BCells）**：在骨髓中發(fā)育成熟。B細(xì)胞通過(guò)其表面的B細(xì)胞受體（BCR，本質(zhì)是膜結(jié)合型IgM或IgD）特異性識(shí)別可溶性抗原。被抗原激活后，B細(xì)胞可以分化為漿細(xì)胞（PlasmaCells），產(chǎn)生大量特異性抗體；或分化為記憶B細(xì)胞（MemoryBCells），為二次免疫應(yīng)答做準(zhǔn)備。

***T淋巴細(xì)胞（TCells）**：在胸腺中發(fā)育成熟。T細(xì)胞具有兩種主要的表面受體：T細(xì)胞受體（TCR）。T細(xì)胞的活化通常需要兩個(gè)信號(hào)：第一信號(hào)來(lái)自TCR與抗原呈遞細(xì)胞（APC）上呈遞的抗原肽-MHC分子的結(jié)合；第二信號(hào)來(lái)自共刺激分子（如B7-CD28）。根據(jù)功能和表面標(biāo)記，T細(xì)胞可分為：

***輔助性T細(xì)胞（HelperTCells,Th,或CD4+T細(xì)胞）**：識(shí)別由APC（如樹(shù)突狀細(xì)胞DCs）通過(guò)MHCII類(lèi)分子呈遞的抗原?；罨腡h細(xì)胞能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，協(xié)調(diào)和增強(qiáng)B細(xì)胞應(yīng)答、細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答以及其他免疫細(xì)胞的功能。

***細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CytotoxicTCells,Tc,或CD8+T細(xì)胞）**：識(shí)別由被感染的體細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞通過(guò)MHCI類(lèi)分子呈遞的抗原肽?；罨腃D8+T細(xì)胞分化為效應(yīng)細(xì)胞，能直接殺傷表達(dá)相應(yīng)抗原的靶細(xì)胞。

***調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（RegulatoryTCells,Tregs）**：如CD25+CD4+Foxp3+T細(xì)胞，在維持免疫耐受、防止自身免疫性疾病發(fā)生中起重要作用，能抑制其他T細(xì)胞的活性。

***記憶性T細(xì)胞（MemoryTCells）**：包括效應(yīng)記憶T細(xì)胞（TEM）和中心記憶T細(xì)胞（TCM），在二次免疫應(yīng)答中迅速被激活并產(chǎn)生強(qiáng)大的免疫效應(yīng)。

2.免疫應(yīng)答過(guò)程

(1)抗原識(shí)別：免疫應(yīng)答的起始是免疫細(xì)胞對(duì)特定抗原的識(shí)別。不同類(lèi)型的免疫細(xì)胞通過(guò)不同的受體識(shí)別不同類(lèi)型的抗原。

***B細(xì)胞識(shí)別**：BCR直接識(shí)別完整的、可溶性的抗原分子。識(shí)別通常較“非特異性”（能識(shí)別抗原的多表位）。

***T細(xì)胞識(shí)別**：TCR識(shí)別的是與MHC分子結(jié)合呈遞的抗原肽片段（通常是8-15個(gè)氨基酸長(zhǎng)）。T細(xì)胞的識(shí)別具有嚴(yán)格的“MHC限制性”：CD8+T細(xì)胞識(shí)別由MHCI類(lèi)分子呈遞的肽（主要在感染細(xì)胞內(nèi)）；CD4+T細(xì)胞識(shí)別由MHCII類(lèi)分子呈遞的肽（主要在APC內(nèi)）。

(2)免疫細(xì)胞活化：獲得性免疫應(yīng)答需要復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，通常涉及至少兩個(gè)信號(hào)：

***信號(hào)1（核心信號(hào)）**：TCR/BCR與其識(shí)別的抗原肽-MHC復(fù)合物的結(jié)合。這是特異性識(shí)別。

***信號(hào)2（共刺激信號(hào)）**：主要來(lái)自APC或活化的T細(xì)胞提供的共刺激分子與T細(xì)胞表面相應(yīng)受體的結(jié)合（如CD80/CD86與CD28）。信號(hào)2對(duì)于T細(xì)胞活化的充分啟動(dòng)至關(guān)重要，能提供“第二信使”，促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄因子激活等。缺乏信號(hào)2的T細(xì)胞活化可能不充分或朝向耐受方向發(fā)展。

***對(duì)于B細(xì)胞**：B細(xì)胞活化通常也需要信號(hào)1（BCR結(jié)合抗原）和信號(hào)2（來(lái)自Th細(xì)胞的CD40L與B細(xì)胞CD40的結(jié)合）。此外，某些抗原（如TI抗原）的活化可能只需要信號(hào)1和補(bǔ)體分子的協(xié)同刺激。

(3)免疫效應(yīng)：活化的免疫細(xì)胞分化并發(fā)揮功能，清除抗原。

***T細(xì)胞效應(yīng)**：CD8+T細(xì)胞分化為效應(yīng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL），通過(guò)釋放穿孔素（Perforin）和顆粒酶（Granzyme）或誘導(dǎo)Fas/FasL途徑來(lái)殺傷靶細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h1、Th2、Th17、Tfh等亞型，分別產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子，調(diào)控炎癥反應(yīng)、體液免疫、抗感染免疫等不同方向。記憶T細(xì)胞則長(zhǎng)期存活，維持免疫記憶。

***B細(xì)胞效應(yīng)**：活化的B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞是“抗體工廠”，能合成并大量分泌針對(duì)特定抗原的抗體（Isotypeswitching可能產(chǎn)生IgG,IgA,IgE等不同類(lèi)型）?？贵w通過(guò)中和毒素、調(diào)理吞噬、激活補(bǔ)體、結(jié)合Fc受體（介導(dǎo)ADCC）等多種機(jī)制發(fā)揮免疫效應(yīng)。部分B細(xì)胞分化為記憶B細(xì)胞，提供長(zhǎng)期保護(hù)。

(4)免疫記憶：這是獲得性免疫的重要特征。在初次免疫應(yīng)答后，一部分活化的B細(xì)胞和T細(xì)胞會(huì)分化為長(zhǎng)壽命的記憶細(xì)胞（MemoryBCells和MemoryTCells）。當(dāng)機(jī)體再次遇到相同的抗原時(shí)，記憶細(xì)胞能被迅速激活，產(chǎn)生比初次應(yīng)答更快、更強(qiáng)、更持久的免疫效應(yīng)，這就是免疫記憶的機(jī)制，是疫苗能夠提供保護(hù)的基礎(chǔ)。

（二）免疫學(xué)研究方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型：在免疫學(xué)研究中，動(dòng)物模型是研究免疫機(jī)制、評(píng)估疫苗或藥物效果不可或缺的工具。選擇合適的模型對(duì)于研究的順利進(jìn)行至關(guān)重要。

(1)常用模型：

***小鼠**：是最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有遺傳背景清晰（許多品系如C57BL/6,BALB/c等）、易于操作、成本相對(duì)較低、與人類(lèi)免疫系統(tǒng)有較高相似性等優(yōu)點(diǎn)。可進(jìn)行各種免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括細(xì)胞學(xué)分析、分子生物學(xué)研究、藥物測(cè)試等。

***大鼠**：體型比小鼠大，某些免疫應(yīng)答（如補(bǔ)體系統(tǒng)）與人類(lèi)更接近，常用于藥理學(xué)研究、更大規(guī)模的免疫刺激實(shí)驗(yàn)等。

***斑馬魚(yú)（Zebrafish）**：作為一種模式生物，其發(fā)育速度快、透明體表便于觀察、部分免疫細(xì)胞和通路與人類(lèi)相似，尤其在研究先天免疫、炎癥反應(yīng)、疫苗開(kāi)發(fā)等方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

***其他模型**：如豚鼠（常用作過(guò)敏反應(yīng)研究）、裸鼠（缺乏MHCII類(lèi)分子，主要用于研究細(xì)胞免疫）、轉(zhuǎn)基因或基因敲除小鼠（用于研究特定基因功能）。

(2)建模方法：

***病原體感染模型**：通過(guò)給動(dòng)物接種特定病原體（病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)），模擬自然感染過(guò)程，研究宿主免疫應(yīng)答、疾病發(fā)展過(guò)程及免疫干預(yù)策略。例如，用小鼠感染李斯特菌研究先天免疫；用大鼠感染鉤蟲(chóng)研究腸道免疫。

***免疫缺陷動(dòng)物模型**：如裸鼠（無(wú)胸腺，T細(xì)胞缺乏）、SCID小鼠（嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷，T細(xì)胞和B細(xì)胞均缺乏），用于研究特定免疫細(xì)胞或分子的功能。

***轉(zhuǎn)基因/基因敲除/敲入動(dòng)物**：通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建帶有特定基因修改的動(dòng)物，用于研究該基因在免疫系統(tǒng)中的功能。例如，構(gòu)建CD4基因敲除小鼠研究T細(xì)胞功能。

***腫瘤模型**：荷瘤小鼠或大鼠模型用于研究腫瘤免疫逃逸機(jī)制、開(kāi)發(fā)免疫治療藥物（如免疫檢查點(diǎn)抑制劑）。

2.細(xì)胞學(xué)分析：細(xì)胞水平的研究是理解免疫應(yīng)答機(jī)制的基礎(chǔ)。

(1)流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,FCM）：是一種快速、精確、高通量分析單個(gè)細(xì)胞物理和化學(xué)特性的技術(shù)。

***原理**：利用激光照射單細(xì)胞懸液，細(xì)胞依次通過(guò)激光束時(shí)，會(huì)散射光（前向散射FSC，反映細(xì)胞大小；側(cè)向散射SSC，反映細(xì)胞顆粒度）并發(fā)出熒光（由細(xì)胞表面或胞內(nèi)標(biāo)記的熒光抗體、熒光蛋白等發(fā)出）。通過(guò)檢測(cè)這些信號(hào)，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)、分選和群體分析。

***常用標(biāo)記物**：CD系列分子（用于鑒定T細(xì)胞亞群、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等）、細(xì)胞因子受體、活化標(biāo)志物（如CD69,CD25）、凋亡相關(guān)蛋白（如AnnexinV,PI）、細(xì)胞周期標(biāo)記物等。

***應(yīng)用**：分析免疫細(xì)胞的種類(lèi)、比例、活化狀態(tài)、功能狀態(tài)（如細(xì)胞因子分泌能力）、細(xì)胞周期、凋亡情況等。是免疫學(xué)研究中最常用的技術(shù)之一。

(2)免疫細(xì)胞分選（CellSorting）：在流式細(xì)胞術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合細(xì)胞分選技術(shù)（如熒光激活細(xì)胞分選FACS或磁性激活細(xì)胞分選MACS），可以根據(jù)預(yù)先設(shè)定的熒光標(biāo)記陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，將特定類(lèi)型的細(xì)胞群體從混合細(xì)胞樣本中分離出來(lái)，用于后續(xù)的功能研究、基因測(cè)序等。

***FACS**：通過(guò)計(jì)算機(jī)控制電磁閥，將符合條件的細(xì)胞分選到不同的收集管中?？蓪?shí)現(xiàn)高純度、高回收率的細(xì)胞分選。

***MACS**：利用磁珠標(biāo)記目標(biāo)細(xì)胞，在磁場(chǎng)中通過(guò)磁珠的磁性將目標(biāo)細(xì)胞吸附下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)分選。操作相對(duì)FACS簡(jiǎn)單，尤其適用于分選大量細(xì)胞。

(3)其他細(xì)胞學(xué)技術(shù)：如相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)；暗視野顯微鏡觀察細(xì)胞動(dòng)態(tài)過(guò)程（如吞噬）；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（體外維持、增殖、功能誘導(dǎo)等）。

3.分子生物學(xué)技術(shù)：在分子水平上研究免疫基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫分子結(jié)構(gòu)等功能。

(1)PCR技術(shù)（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）：一種在體外快速擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)。

***原理**：利用DNA聚合酶在引物作用下，沿模板鏈合成互補(bǔ)DNA鏈，經(jīng)過(guò)變性-退火-延伸的循環(huán)過(guò)程，使目標(biāo)DNA片段呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。

***應(yīng)用**：檢測(cè)基因表達(dá)（如Q-PCR檢測(cè)mRNA水平）、檢測(cè)病原體DNA/RNA、基因分型、構(gòu)建基因重組體等。

***類(lèi)型**：常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR，能定量分析起始模板量）、巢式PCR（提高檢測(cè)靈敏度）、逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR，用于檢測(cè)mRNA）。

(2)基因編輯技術(shù)：能夠?qū)ι矬w基因組進(jìn)行精確、高效、可逆的修飾的技術(shù)。

***CRISPR/Cas9系統(tǒng)**：是目前最主流的基因編輯技術(shù)。利用一段引導(dǎo)RNA（gRNA）識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)DNA序列，然后通過(guò)Cas9核酸酶在該位點(diǎn)進(jìn)行切割，引發(fā)細(xì)胞自身的DNA修復(fù)機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除、插入、替換等操作。

***應(yīng)用**：構(gòu)建免疫細(xì)胞基因功能研究模型、改造免疫細(xì)胞用于治療（如CAR-T細(xì)胞）、研究遺傳病與免疫的關(guān)系。

(3)基因表達(dá)譜分析：如微陣列（Microarray）和下一代測(cè)序（Next-GenerationSequencing,NGS）技術(shù)。

***原理**：微陣列可以在一張芯片上固定大量基因的探針，通過(guò)與樣本中的mRNA（或cDNA）雜交，檢測(cè)大量基因的表達(dá)水平變化。NGS則可以對(duì)樣本中所有或大部分的RNA、DNA進(jìn)行測(cè)序，提供更全面、更精確的分子信息。

***應(yīng)用**：比較不同免疫狀態(tài)下（如活化T細(xì)胞與靜息T細(xì)胞）基因表達(dá)譜的差異；研究細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控；繪制免疫細(xì)胞單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，解析免疫細(xì)胞的異質(zhì)性和功能狀態(tài)。

（三）免疫學(xué)研究應(yīng)用

1.醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：免疫學(xué)研究成果深刻改變了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的面貌。

(1)腫瘤免疫：利用免疫系統(tǒng)對(duì)抗腫瘤細(xì)胞是當(dāng)前免疫治療的熱點(diǎn)。

***免疫檢查點(diǎn)抑制劑**：阻斷腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD-1或其配體PD-L1與T細(xì)胞上相應(yīng)受體（PD-CTLA-4）的結(jié)合，解除對(duì)T細(xì)胞的抑制，使其能持續(xù)殺傷腫瘤。代表藥物有PD-1抑制劑（如納武利尤單抗、帕博利珠單抗）和PD-L1抑制劑。

***過(guò)繼性細(xì)胞療法**：收集患者自身的免疫細(xì)胞（主要是T細(xì)胞），在體外通過(guò)基因工程技術(shù)改造（如加入識(shí)別腫瘤特異抗原的CAR結(jié)構(gòu)），擴(kuò)增后再輸回患者體內(nèi)，使其能特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞療法是目前最成功的例子。

***腫瘤疫苗**：利用腫瘤特異性抗原（如突變抗原、腫瘤相關(guān)抗原）制備疫苗，激發(fā)患者自身的抗腫瘤免疫應(yīng)答。

***免疫細(xì)胞治療**：如使用CIK細(xì)胞（細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞）、NK細(xì)胞等進(jìn)行治療。

(2)自身免疫疾?。哼@類(lèi)疾病是由于免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤地攻擊自身組織而引起的。

***發(fā)病機(jī)制研究**：通過(guò)動(dòng)物模型和患者樣本，研究自身免疫病的觸發(fā)因素（如環(huán)境因素、遺傳易感性）、免疫耐受的破壞機(jī)制等。

***治療策略**：目標(biāo)是控制異常免疫應(yīng)答，減少組織損傷。常用方法包括：

***免疫抑制劑**：如糖皮質(zhì)激素（潑尼松）、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤等，能廣泛抑制免疫反應(yīng)，但副作用較大。

***生物制劑**：靶向特定免疫分子或細(xì)胞的藥物，如TNF-α抑制劑（依那西普、英夫利西單抗）、IL-6抑制劑（托珠單抗）、B細(xì)胞清除療法（利妥昔單抗，針對(duì)CD20陽(yáng)性B細(xì)胞）。

***免疫調(diào)節(jié)劑**：如小劑量糖皮質(zhì)激素、免疫球蛋白等。

(3)感染性疾?。阂呙缡穷A(yù)防感染性疾病最有效的手段。

***疫苗開(kāi)發(fā)**：基于免疫學(xué)原理，設(shè)計(jì)和制備各種類(lèi)型的疫苗，如減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗、mRNA疫苗等。疫苗誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫通常包括體液免疫（抗體）和細(xì)胞免疫（T細(xì)胞）。

***免疫診斷**：利用抗原抗體反應(yīng)等免疫學(xué)原理，檢測(cè)體內(nèi)是否存在特定病原體或其產(chǎn)生的抗體/抗原，用于疾病的早期診斷、感染狀態(tài)評(píng)估、療效監(jiān)測(cè)等。常用方法有ELISA、膠體金法、免疫熒光法、快速診斷試劑盒等。

***治療性抗體**：?jiǎn)慰寺】贵w可用于治療某些感染，如中和毒素（如肉毒桿菌素）、阻止病毒吸附細(xì)胞、清除感染細(xì)胞等。

2.農(nóng)業(yè)領(lǐng)域：免疫學(xué)原理在動(dòng)植物健康保障和育種中也有重要應(yīng)用。

(1)動(dòng)物疫病防控：通過(guò)免疫學(xué)手段預(yù)防和控制動(dòng)物傳染病。

***疫苗免疫**：為家畜家禽（如豬、雞、牛）接種疫苗，建立群體免疫屏障，降低發(fā)病率。疫苗研發(fā)需考慮免疫原性、安全性、有效性等因素。

***免疫增強(qiáng)劑**：使用某些物質(zhì)（如疫苗佐劑、植物提取物、中草藥等）增強(qiáng)動(dòng)物免疫系統(tǒng)的應(yīng)答能力，提高疫苗效果。

***疾病監(jiān)測(cè)**：通過(guò)血清學(xué)檢測(cè)（如ELISA檢測(cè)抗體）、病原學(xué)檢測(cè)等方法，監(jiān)測(cè)動(dòng)物群的健康狀況和疫病流行情況。

(2)植物免疫：研究植物的防御機(jī)制，提高作物的抗病能力。

***抗病育種**：利用自然抗病資源或通過(guò)基因工程將抗病基因?qū)胱魑?，培育抗病品種，減少農(nóng)藥使用。

***誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（ISR）和獲得性系統(tǒng)抗性（ASR）**：通過(guò)特定處理（如接種植物促生菌PGPR、使用水楊酸、乙烯等信號(hào)分子），激活植物的防御系統(tǒng)，使其對(duì)多種病原物產(chǎn)生廣譜、持久的抗性。

***植物病害診斷**：利用ELISA、抗體芯片、分子診斷技術(shù)（如PCR、qPCR）等檢測(cè)植物體內(nèi)的病原菌或病毒。

二、免疫學(xué)研究關(guān)鍵技術(shù)

（一）免疫熒光技術(shù)

1.原理：免疫熒光技術(shù)利用熒光標(biāo)記的抗體（熒光素標(biāo)記的二抗或直接標(biāo)記的一抗）與細(xì)胞或組織切片中的靶抗原發(fā)生特異性結(jié)合。結(jié)合后，在特定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下，熒光標(biāo)記物會(huì)發(fā)出相應(yīng)顏色的熒光，通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀等設(shè)備可以觀察到抗原的定位、分布和相對(duì)含量。根據(jù)熒光顏色（如FITC綠色、TRITC紅色、AlexaFluor系列多種顏色）和顯色方式（直接法或間接法），可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶抗原。

2.操作步驟（以間接免疫熒光法為例）：

(1)**樣本制備**：

***組織固定**：取材后立即放入固定液（常用4%多聚甲醛或4%甲醛溶液）中，4℃固定數(shù)小時(shí)至過(guò)夜。固定作用是使組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，抗原不易流失。注意選擇合適的固定時(shí)間，過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致抗原變性。

***滲透**：將固定后的樣本放入滲透液（如0.1MPBS或Tris緩沖液，含0.1%-0.5%TritonX-100或SDS）中，4℃滲透30分鐘至1小時(shí)。滲透作用是使固定液和抗體等試劑能進(jìn)入組織內(nèi)部。

***洗滌**：用PBS或TBS緩沖液洗滌樣本3-5次，每次15-30分鐘，以去除未結(jié)合的固定劑和滲透劑。建議使用冷緩沖液洗滌。

***封閉（阻斷非特異性結(jié)合）**：將樣本置于含血清（同種來(lái)源血清最佳，如兔血清封閉兔源抗體）或BSA（牛血清白蛋白）的封閉液中，室溫孵育1-2小時(shí)。此步驟能封閉細(xì)胞膜、細(xì)胞器等背景位點(diǎn)，防止抗體非特異性吸附，減少背景熒光。

***抗原修復(fù)（可選）**：對(duì)于某些不易與抗體結(jié)合的抗原（如甲醛固定的蛋白質(zhì)），可能需要進(jìn)行抗原修復(fù)，如用熱修復(fù)（TRIS-EDTA緩沖液，95℃加熱10-20分鐘）或酶修復(fù)（如用胰蛋白酶或蛋白酶K處理）。

(2)**一抗孵育**：將樣本置于含特異性一抗（直接識(shí)別抗原的抗體）的抗體工作液中，通常在4℃孵育過(guò)夜，使一抗充分與靶抗原結(jié)合。有時(shí)也可在室溫下孵育1-2小時(shí)，但靈敏度可能較低。

(3)**洗滌**：用PBS或TBS緩沖液洗滌樣本3-5次，每次15分鐘，去除未結(jié)合的一抗。

(4)**二抗孵育**：將樣本置于含熒光素標(biāo)記的、能與對(duì)應(yīng)一抗物種來(lái)源的二抗結(jié)合的熒光二抗工作液中，室溫避光孵育1小時(shí)。例如，如果使用兔源一抗，則需用山羊抗兔IgG-FITC作為二抗。二抗需經(jīng)過(guò)優(yōu)化濃度，避免過(guò)飽和導(dǎo)致背景高。

(5)**洗滌**：同步驟(3)，洗滌3-5次，去除未結(jié)合的二抗。

(6)**復(fù)染（可選）**：如果需要觀察細(xì)胞核或細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可在最后一步用DAPI（藍(lán)色熒光）或Hoechst（藍(lán)色熒光）染料對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。

(7)**封片**：將樣本置于含抗熒光淬滅劑（如DAPI封片劑）的封片液中，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察或保存。

3.儀器設(shè)備：熒光顯微鏡（正置或倒置，需配備相應(yīng)激發(fā)光源和濾光片組）、載玻片、蓋玻片、冷庫(kù)、搖床等。

4.結(jié)果分析：通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光信號(hào)的位置（細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、細(xì)胞核）、強(qiáng)度和分布模式?？梢允褂肐mageJ等軟件進(jìn)行定量分析，如熒光強(qiáng)度積分、陽(yáng)性細(xì)胞百分比等。需要注意設(shè)置陰性對(duì)照（未加一抗或用非特異性抗體替代一抗的對(duì)照）以排除背景熒光干擾。

（二）ELISA技術(shù)

1.原理：ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）是一種基于抗原抗體特異性結(jié)合，并通過(guò)酶標(biāo)記物顯色進(jìn)行定性和定量分析的技術(shù)。其核心是利用固相載體（如酶標(biāo)板微孔）固定抗原或抗體，使反應(yīng)體系封閉在固相表面進(jìn)行，便于洗滌和檢測(cè)，特異性高，靈敏度高。

2.類(lèi)型及操作要點(diǎn)：

(1)**直接ELISA**：

***原理**：將已知抗原固定在酶標(biāo)板微孔表面，洗滌后直接加入酶標(biāo)記的一抗，孵育后洗滌，加入底物顯色，最后測(cè)定吸光度值。

***操作要點(diǎn)**：抗原固定是關(guān)鍵，需優(yōu)化固定條件（濃度、緩沖液pH、時(shí)間、溫度）以確?？乖浞直┞恫⒈挥行Ч潭??？贵w濃度也需優(yōu)化。

(2)**間接ELISA**：

***原理**：將已知抗原固定在酶標(biāo)板微孔表面，洗滌后加入未標(biāo)記的一抗（針對(duì)抗原），孵育后洗滌，再加入酶標(biāo)記的二抗（針對(duì)一抗的種屬來(lái)源，如羊抗鼠IgG-HRP），孵育后洗滌，加入底物顯色，測(cè)定吸光度值。

***操作要點(diǎn)**：由于使用了二抗，檢測(cè)靈敏度通常高于直接ELISA。但操作步驟多，需要分別優(yōu)化一抗和二抗的濃度及孵育條件。需設(shè)置陰性對(duì)照（未加一抗或用非特異性抗體替代一抗的對(duì)照）。

(3)**競(jìng)爭(zhēng)ELISA**：

***原理**：將待測(cè)樣本和已知量的標(biāo)記抗原（如放射性同位素標(biāo)記或酶標(biāo)記）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相上的一抗。孵育后洗滌，加入能結(jié)合標(biāo)記抗原的抗體（或直接加酶標(biāo)抗體），最后加入底物顯色。樣本中待測(cè)抗原濃度越高，則結(jié)合到固相上的標(biāo)記抗原就越少，顯色越淺（或放射性計(jì)數(shù)越低），呈現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。

***應(yīng)用**：常用于檢測(cè)小分子物質(zhì)（如激素、藥物、毒素）。

(4)**雙抗體夾心ELISA**：

***原理**：將已知抗原固定在酶標(biāo)板微孔表面，洗滌后加入酶標(biāo)記的一抗，孵育后洗滌，再加入未標(biāo)記的捕獲抗體（能與抗原的另一表位結(jié)合），使一抗和捕獲抗體形成“夾心”結(jié)構(gòu)包裹住抗原，孵育后洗滌，加入底物顯色，測(cè)定吸光度值。

***操作要點(diǎn)**：特異性強(qiáng)，靈敏度高，是檢測(cè)抗原最常用的ELISA類(lèi)型。關(guān)鍵在于優(yōu)化包被抗原和酶標(biāo)抗體（夾心抗體）的濃度及孵育條件。需要設(shè)置陰性對(duì)照（未加包被抗原或酶標(biāo)抗體）。

3.操作步驟（以雙抗體夾心ELISA為例）：

(1)**包被**：將已知濃度的抗原稀釋后加入酶標(biāo)板微孔中，4℃包被過(guò)夜或室溫包被2-4小時(shí)。包被后用洗滌液（如洗滌緩沖液，含0.05%Tween-20的PBS）洗滌3次。

(2)**封閉**：加入封閉液（如5%脫脂奶粉或BSA的封閉緩沖液）室溫孵育1-2小時(shí)，封閉未結(jié)合的固相位點(diǎn)。封閉后用洗滌液洗滌3-5次。

(3)**加酶標(biāo)抗體（夾心抗體）**：將酶標(biāo)記的二抗（針對(duì)一抗的種屬來(lái)源）用稀釋液稀釋至合適濃度，加入酶標(biāo)板微孔中，室溫孵育1小時(shí)。孵育后用洗滌液洗滌3-5次。

(4)**加底物**：向每個(gè)微孔加入適量酶的底物溶液（如TMB、ABTS等），避光室溫孵育15-30分鐘（或根據(jù)說(shuō)明書(shū)及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整），底物在酶的作用下發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物。

(5)**終止反應(yīng)**：加入終止液（如2MH2SO4或HCl），終止酶與底物的反應(yīng)。此時(shí)有色產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為無(wú)色物質(zhì)，溶液顏色變深。

(6)**測(cè)定吸光度**：立即使用酶標(biāo)儀在指定波長(zhǎng)（如TMB為450nm，ABTS為405nm）測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。OD值與樣本中待測(cè)抗原濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。

4.儀器設(shè)備：酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀、移液器及吸頭、洗板機(jī)（可選）、水浴鍋或恒溫?fù)u床、底物孵育箱等。

5.結(jié)果分析：通過(guò)酶標(biāo)儀讀取各孔OD值。計(jì)算平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作）或公式（OD值=C×k，其中C為抗原濃度，k為比例常數(shù)）計(jì)算樣本中待測(cè)抗原的濃度。需設(shè)置空白對(duì)照（不含任何樣本或抗原的孔，用于校準(zhǔn)）、陰性對(duì)照（不含樣本的孔，用于判斷非特異性結(jié)合）和陽(yáng)性對(duì)照（已知抗原濃度的孔，用于判斷實(shí)驗(yàn)有效性）。

（三）細(xì)胞因子檢測(cè)

1.方法：細(xì)胞因子是免疫細(xì)胞產(chǎn)生的小分子蛋白質(zhì)，在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。檢測(cè)細(xì)胞因子水平是研究免疫應(yīng)答狀態(tài)的重要手段。

(1)**Luminex技術(shù)（xMAP技術(shù)）**：

***原理**：一種高通量、多參數(shù)檢測(cè)技術(shù)。將多種不同的檢測(cè)分子（如生物素標(biāo)記的抗體、熒光微球、捕獲抗體等）固定在微球表面，通過(guò)磁力分離，實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)微球內(nèi)多種生物分子（如細(xì)胞因子、抗體、微生物等）的同時(shí)檢測(cè)和定量。

***操作流程**：通常包括以下步驟：

***樣本準(zhǔn)備**：收集細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿或組織提取液等樣本。必要時(shí)進(jìn)行離心去除細(xì)胞碎片。

***標(biāo)準(zhǔn)品制備**：制作細(xì)胞因子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

***加樣**：將樣本、標(biāo)準(zhǔn)品和Luminex檢測(cè)試劑盒（包含預(yù)包被有捕獲抗體的微球和生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體）加入反應(yīng)管中混合。

***孵育**：室溫孵育，使樣本中的細(xì)胞因子與微球上的捕獲抗體結(jié)合，然后加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體。

***磁分離**：通過(guò)磁力架將結(jié)合了生物分子簇的微球與游離組分分離。

***洗滌**：洗滌微球，去除未結(jié)合的游離組分。

***檢測(cè)**：將微球