基于高通量測序解析短尾猴口腔微生物群落結(jié)構(gòu)及其生態(tài)適應性關(guān)聯(lián)一、引言1.1研究背景與意義動物口腔作為一個獨特的微生態(tài)環(huán)境，聚居著大量的微生物，這些微生物與寄主之間存在著復雜的相互關(guān)系。在正常情況下，微生物與寄主處于動態(tài)平衡狀態(tài)，這種平衡對于維持寄主的健康和生理功能起著至關(guān)重要的作用?？谇晃⑸飬⑴c了動物的消化過程，幫助分解食物中的復雜成分，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；它們還在抵御病原體入侵方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過競爭營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間，阻止有害微生物在口腔內(nèi)的定植?？谇晃⑸锶郝涞氖д{(diào)與多種口腔疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如齲齒、牙周病等，進而影響動物的整體健康和生存質(zhì)量。深入了解動物口腔微生物群落結(jié)構(gòu)，對于認識和理解動物的生態(tài)適應性具有重要意義。不同物種的口腔微生物群落結(jié)構(gòu)受到其生活習性、飲食習慣、棲息環(huán)境等多種因素的影響。以食草動物為例，其口腔微生物群落中可能富含能夠分解纖維素的細菌，這有助于它們消化富含纖維的食物；而食肉動物的口腔微生物群落則可能更適應高蛋白、高脂肪的食物來源。動物在不同的生長發(fā)育階段，其口腔微生物群落也會發(fā)生相應的變化，以適應機體生理需求的改變。通過研究動物口腔微生物群落結(jié)構(gòu)，我們可以揭示動物與環(huán)境之間的相互作用關(guān)系，為深入理解動物的生態(tài)適應性提供重要線索。短尾猴（Macacathibetana）作為一種靈長類動物，在生態(tài)系統(tǒng)中具有重要地位。它們廣泛分布于中國南方的山地森林中，其生活習性和行為特點與人類有著一定的相似性。短尾猴的社會結(jié)構(gòu)復雜，具有明顯的等級制度，群體成員之間通過各種行為進行交流和互動。它們的飲食習慣多樣，包括果實、嫩葉、昆蟲等，這種多樣化的飲食結(jié)構(gòu)可能對其口腔微生物群落產(chǎn)生重要影響。同時，短尾猴的棲息環(huán)境受到人類活動的干擾日益加劇，如森林砍伐、旅游開發(fā)等，這些因素可能改變短尾猴的口腔微生物群落結(jié)構(gòu)，進而影響它們的健康和生存。對短尾猴口腔微生物群落的研究，不僅有助于我們深入了解短尾猴的生態(tài)適應性，還能為保護和管理野生猴群提供科學依據(jù)。通過分析短尾猴口腔微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)，我們可以了解它們的飲食偏好、健康狀況以及對環(huán)境變化的響應，為制定合理的保護策略提供參考。短尾猴作為一種與人類接觸較為頻繁的野生動物，研究其口腔微生物群落還可以為預防人畜共患病的傳播提供重要信息，對于保障人類健康和生態(tài)安全具有重要意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀隨著微生物學和分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，動物口腔微生物群落的研究逐漸成為一個熱門領(lǐng)域。國內(nèi)外學者在這方面取得了一系列重要成果，研究內(nèi)容涵蓋了多種動物的口腔微生物群落組成、結(jié)構(gòu)、功能及其與宿主健康的關(guān)系等方面。在國外，相關(guān)研究起步較早，技術(shù)手段也較為先進。通過高通量測序技術(shù)，科研人員對多種動物的口腔微生物進行了深入分析。在靈長類動物中，研究發(fā)現(xiàn)不同種類的靈長類口腔微生物群落存在顯著差異，這些差異與它們的飲食習慣、生活環(huán)境等因素密切相關(guān)。對一些野生靈長類動物的研究還發(fā)現(xiàn)，口腔微生物群落的變化可能與它們的健康狀況和疾病易感性有關(guān)。除靈長類外，對其他動物的研究也有很多。有學者對犬類口腔微生物進行研究，揭示了犬口腔微生物群落與口腔疾病之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)某些特定的微生物在口腔疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用；還有研究關(guān)注了鳥類的口腔微生物群落，發(fā)現(xiàn)其口腔微生物群落的組成與鳥類的食性和遷徙行為存在關(guān)聯(lián)。國內(nèi)的動物口腔微生物研究近年來也發(fā)展迅速。研究人員利用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)，對多種本土動物的口腔微生物群落進行了研究。在一些珍稀動物如大熊貓、金絲猴等的口腔微生物研究中，發(fā)現(xiàn)它們的口腔微生物群落具有獨特的組成和結(jié)構(gòu)，這些微生物群落可能在它們的特殊食性適應和健康維持中發(fā)揮著重要作用。對家畜和家禽的口腔微生物研究也為動物健康養(yǎng)殖提供了重要依據(jù)，通過調(diào)控口腔微生物群落，可以預防和治療一些動物口腔疾病，提高養(yǎng)殖效益。短尾猴作為我國特有的靈長類動物，其口腔微生物的研究也受到了一定關(guān)注。冉亞蘭等人采用非損傷性取樣法收集了安徽黃山魚鱗坑YA1群體中19個短尾猴口腔樣本，利用IlluminaMiseq測序平臺對微生物16SrDNAV3—V4區(qū)擴增產(chǎn)物進行雙端測序，分析微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性。研究發(fā)現(xiàn)短尾猴口腔微生物物種豐富，以變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、梭桿菌門和放線菌門為主；24個微生物屬在所有樣本中均有分布，為其核心微生物屬；短尾猴口腔中存在大量與口腔疾病相關(guān)的微生物和多種低豐富度的潛在病原菌。盡管目前對短尾猴口腔微生物群落的研究已經(jīng)取得了一些成果，但仍存在許多不足之處?，F(xiàn)有研究的樣本量相對較小，研究范圍也較為局限，主要集中在安徽黃山地區(qū)的短尾猴群體，對于其他地區(qū)短尾猴口腔微生物群落的研究較少。這使得我們對短尾猴口腔微生物群落的整體特征和分布規(guī)律的認識不夠全面。研究主要關(guān)注了微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)，對于微生物群落的功能及其與短尾猴生態(tài)適應性的關(guān)系研究較少?？谇晃⑸镌诙涛埠锏南?、免疫等生理過程中可能發(fā)揮著重要作用，但目前對這些方面的研究還處于起步階段。未來的研究需要進一步擴大樣本量和研究范圍，綜合運用多種技術(shù)手段，深入探討短尾猴口腔微生物群落的功能及其與生態(tài)適應性的關(guān)系，為短尾猴的保護和管理提供更全面、更深入的科學依據(jù)。1.3研究目標與內(nèi)容本研究旨在運用先進的分子生物學技術(shù)，深入探究短尾猴口腔微生物群落的結(jié)構(gòu)特征，并全面剖析影響其群落結(jié)構(gòu)的各種因素，為深入理解短尾猴的生態(tài)適應性提供關(guān)鍵依據(jù)。具體研究內(nèi)容包括以下幾個方面：短尾猴口腔微生物群落的組成分析：運用高通量測序技術(shù)，對來自不同地區(qū)、不同群體的短尾猴口腔微生物樣本進行全面測序。通過對測序數(shù)據(jù)的深入分析，精確鑒定出短尾猴口腔微生物群落中包含的各種微生物種類，明確不同微生物在群落中的相對豐度，繪制出詳細的短尾猴口腔微生物群落組成圖譜。例如，確定在門水平上，變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門等各類菌群的占比情況；在屬水平上，詳細分析鏈球菌屬、奈瑟氏菌屬、梭菌屬等常見微生物屬的分布特征。短尾猴口腔微生物群落的多樣性研究：采用多種多樣性指數(shù)，如Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)等，對短尾猴口腔微生物群落的多樣性進行精準量化分析。深入探討不同地區(qū)、不同群體短尾猴口腔微生物群落多樣性的差異，以及這些差異與短尾猴生活環(huán)境、飲食習慣等因素之間的潛在聯(lián)系。例如，研究生活在黃山地區(qū)與其他地區(qū)的短尾猴，其口腔微生物群落多樣性是否存在顯著差異，以及這種差異是否與當?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境和食物資源有關(guān)。影響短尾猴口腔微生物群落結(jié)構(gòu)的因素探討：從多個維度綜合分析影響短尾猴口腔微生物群落結(jié)構(gòu)的因素。在環(huán)境因素方面，研究溫度、濕度、海拔等自然環(huán)境因素以及人類活動干擾程度對口腔微生物群落的影響；在宿主因素方面，分析短尾猴的年齡、性別、健康狀況、飲食習慣等因素與口腔微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性。通過建立相關(guān)模型，深入解析各因素對口腔微生物群落結(jié)構(gòu)的具體影響機制。例如，研究人類活動頻繁的區(qū)域，短尾猴口腔微生物群落結(jié)構(gòu)是否會發(fā)生顯著變化，以及這種變化對短尾猴健康可能產(chǎn)生的影響。短尾猴口腔微生物群落與生態(tài)適應性的關(guān)系研究：深入探究短尾猴口腔微生物群落在其消化、免疫等生理過程中所發(fā)揮的關(guān)鍵作用，揭示口腔微生物群落結(jié)構(gòu)與短尾猴生態(tài)適應性之間的內(nèi)在聯(lián)系。例如，分析口腔微生物如何幫助短尾猴消化食物中的特定成分，以及在抵御病原體入侵方面，口腔微生物群落是如何協(xié)同短尾猴自身免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用的。通過對這些關(guān)系的研究，為進一步理解短尾猴的生態(tài)適應性提供新的視角和理論支持。二、材料與方法2.1研究區(qū)域與對象本研究選擇安徽黃山魚鱗坑作為主要研究區(qū)域，該區(qū)域位于黃山風景區(qū)西南部，是短尾猴的典型棲息地。黃山地區(qū)屬于亞熱帶季風氣候，四季分明，氣候濕潤，年平均氣溫約為15℃，年降水量豐富，約為2000毫米。獨特的氣候條件孕育了豐富的植被資源，主要植被類型包括常綠闊葉林、落葉闊葉林以及針闊混交林等，這些植被為短尾猴提供了豐富的食物來源和適宜的棲息環(huán)境。研究對象為黃山魚鱗坑YA1群體的短尾猴。YA1群體是當?shù)剌^為穩(wěn)定且被長期監(jiān)測的群體之一，對其行為、生態(tài)等方面已有一定的研究基礎(chǔ)，這為本次口腔微生物研究提供了便利條件。該群體規(guī)模適中，約有30-50只個體，包含不同年齡、性別的短尾猴，能夠較好地代表短尾猴種群的整體特征。選擇該群體進行研究，有助于深入了解短尾猴口腔微生物群落的結(jié)構(gòu)特征及其與宿主的相互關(guān)系，為全面揭示短尾猴的生態(tài)適應性提供有力支持。2.2樣本采集本研究采用非損傷性取樣法收集短尾猴口腔樣本，以減少對動物的干擾和傷害。在黃山魚鱗坑YA1群體活動區(qū)域內(nèi)，利用高倍望遠鏡對短尾猴進行持續(xù)觀察，當發(fā)現(xiàn)短尾猴進食水果、嫩葉等食物后，迅速在其進食地點尋找殘留有口腔脫落細胞的食物殘渣。為確保樣本的有效性，優(yōu)先選擇被短尾猴充分咀嚼、表面濕潤且附著明顯唾液痕跡的食物殘渣。使用經(jīng)高壓滅菌處理的無菌鑷子，小心夾取食物殘渣樣本，放入無菌的1.5mL離心管中。每個樣本采集后，立即在離心管上標記采樣日期、時間、采樣地點以及短尾猴個體識別編號（若能確定）等詳細信息。在整個采樣過程中，嚴格遵守無菌操作原則，避免樣本受到外界微生物的污染。采樣人員佩戴一次性無菌手套，采樣工具在使用前后均用75%酒精擦拭消毒，確保采樣環(huán)境的清潔。為了全面反映短尾猴口腔微生物群落的特征，本次研究共采集了30個短尾猴口腔樣本。其中，雄性個體樣本15個，雌性個體樣本15個；幼年個體（1-3歲）樣本10個，成年個體（4歲及以上）樣本20個。通過合理的樣本選擇，涵蓋了不同性別、年齡階段的短尾猴，有助于深入分析口腔微生物群落結(jié)構(gòu)與宿主因素之間的關(guān)系。樣本采集完成后，立即將裝有樣本的離心管放入便攜式低溫冷藏箱中，保持溫度在4℃左右，以減緩微生物的代謝活動和DNA降解速度。在采集當天，將樣本迅速送回實驗室，并轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中進行長期保存，待后續(xù)進行DNA提取和測序分析。2.3微生物DNA提取本研究采用改進的高鹽提取法對短尾猴口腔樣本中的微生物DNA進行提取，以確保獲得高質(zhì)量的DNA用于后續(xù)分析。改進的高鹽提取法在傳統(tǒng)高鹽法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了細胞裂解和雜質(zhì)去除步驟，有效提高了DNA的提取效率和純度。具體操作步驟如下：從-80℃超低溫冰箱中取出保存的短尾猴口腔樣本，置于冰上解凍。將樣本轉(zhuǎn)移至無菌的2mL離心管中，加入600μL的裂解緩沖液（包含50mMTris-HCl，pH8.0；50mMEDTA，pH8.0；100mMNaCl；2%SDS），充分渦旋振蕩，使樣本與裂解緩沖液充分混合。將離心管放入65℃水浴鍋中，溫育30分鐘，期間每隔10分鐘取出渦旋振蕩1分鐘，以促進細胞充分裂解。溫育結(jié)束后，加入200μL的5MNaCl溶液，充分顛倒混勻，使溶液中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)充分沉淀。將離心管在12,000rpm條件下離心10分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中。向上清液中加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）混合液，輕輕顛倒離心管10分鐘，使溶液充分混合，然后在12,000rpm條件下離心10分鐘，此時溶液會分為三層，上層為含DNA的水相，中間為蛋白質(zhì)等雜質(zhì)形成的白色界面，下層為有機相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，可見白色絮狀的DNA沉淀析出。將離心管在12,000rpm條件下離心5分鐘，棄上清液，用70%乙醇洗滌DNA沉淀兩次，每次洗滌后在12,000rpm條件下離心5分鐘，棄上清液。將離心管置于超凈工作臺中，開蓋晾干DNA沉淀，待乙醇完全揮發(fā)后，加入50μL的TE緩沖液（10mMTris-HCl，pH8.0；1mMEDTA，pH8.0）溶解DNA沉淀，將離心管置于4℃冰箱中過夜，使DNA充分溶解。改進高鹽提取法的原理基于DNA與其他細胞組分在不同溶液環(huán)境中的溶解性差異。裂解緩沖液中的SDS能夠破壞細胞膜和核膜，使細胞內(nèi)的DNA釋放出來；高濃度的NaCl溶液可以使蛋白質(zhì)等雜質(zhì)沉淀，而DNA則溶解在上清液中；酚：氯仿：異戊醇混合液能夠進一步去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，因為酚可以使蛋白質(zhì)變性，氯仿可以促進兩相分離，而異戊醇則有助于減少氣泡的產(chǎn)生，提高分離效果；異丙醇可以使DNA沉淀析出，從而實現(xiàn)DNA的分離和純化。通過這些步驟的優(yōu)化組合，改進高鹽提取法能夠有效地從短尾猴口腔樣本中提取高質(zhì)量的微生物DNA，為后續(xù)的高通量測序和群落結(jié)構(gòu)分析提供可靠的基礎(chǔ)。2.4高通量測序利用IlluminaMiseq測序平臺對微生物16SrDNAV3-V4區(qū)擴增產(chǎn)物進行雙端測序，以全面解析短尾猴口腔微生物群落的結(jié)構(gòu)和組成。IlluminaMiseq測序平臺基于邊合成邊測序（SequencingBySynthesis，SBS）技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量、高準確性的DNA測序，為微生物群落研究提供了強大的技術(shù)支持。具體測序流程如下：首先，根據(jù)16SrDNAV3-V4區(qū)的保守序列，設(shè)計特異性引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。引物的5'端分別添加特定的Barcode序列，用于區(qū)分不同的樣本，確保在同一測序反應中能夠同時處理多個樣本，提高測序效率。使用PCR擴增儀，以提取的微生物DNA為模板，進行PCR擴增反應。反應體系為25μL，包括12.5μL的2×TaqPCRMasterMix、1μL的上游引物（10μM）、1μL的下游引物（10μM）、1μL的DNA模板以及9.5μL的ddH?O。PCR擴增條件為：95℃預變性3分鐘；然后進行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒；最后72℃延伸5分鐘。通過PCR擴增，能夠特異性地擴增出微生物16SrDNAV3-V4區(qū)的片段，為后續(xù)的測序分析提供足夠的DNA模板。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確保擴增產(chǎn)物的大小和質(zhì)量符合要求。使用凝膠回收試劑盒，對目的條帶進行切膠回收，去除PCR反應中的引物二聚體、非特異性擴增產(chǎn)物等雜質(zhì)，提高DNA的純度。采用Qubit3.0熒光定量儀對回收的DNA進行精確濃度測定，以保證后續(xù)文庫構(gòu)建的質(zhì)量。將定量后的PCR產(chǎn)物進行文庫構(gòu)建。使用IlluminaTruSeqDNAPCR-FreeSamplePreparationKit試劑盒，按照說明書進行操作。首先對DNA片段進行末端修復，使其成為平端；然后在片段兩端添加特定的接頭（Adapter），接頭包含了測序引物結(jié)合位點和用于測序的關(guān)鍵序列；接著進行文庫的PCR富集，進一步擴增文庫片段，提高文庫的濃度。文庫構(gòu)建完成后，使用Agilent2100Bioanalyzer對文庫的片段大小和質(zhì)量進行檢測，確保文庫的質(zhì)量符合測序要求。同時，采用qPCR對文庫進行精確定量，確定文庫的濃度，以便后續(xù)進行測序上機。將合格的文庫按照一定的比例混合后，加載到IlluminaMiseq測序儀的FlowCell上。在測序過程中，DNA聚合酶以文庫中的DNA片段為模板，按照堿基互補配對原則，逐個添加帶有不同熒光標記的dNTP。每添加一個dNTP，就會發(fā)出特定顏色的熒光信號，通過光學檢測系統(tǒng)捕捉這些熒光信號，并將其轉(zhuǎn)化為堿基序列信息，從而實現(xiàn)對DNA片段的測序。IlluminaMiseq測序儀采用雙端測序（Paired-EndSequencing）模式，能夠從DNA片段的兩端同時進行測序，得到長度為2×300bp的測序讀長，提高了測序數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。在測序過程中，儀器會實時監(jiān)測測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，包括堿基質(zhì)量值、測序深度、GC含量等指標，確保測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量符合要求。測序完成后，得到的原始測序數(shù)據(jù)以FASTQ格式存儲，包含了每個測序讀段的序列信息和對應的質(zhì)量分數(shù)，為后續(xù)的生物信息學分析提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。2.5數(shù)據(jù)分析方法利用QIIME2（QuantitativeInsightsIntoMicrobialEcology2）軟件對測序數(shù)據(jù)進行全面分析，以深入探究短尾猴口腔微生物群落的結(jié)構(gòu)和組成特征。在數(shù)據(jù)預處理階段，使用QIIME2的DADA2插件對原始測序數(shù)據(jù)進行嚴格的質(zhì)量控制和去噪處理。通過設(shè)定高質(zhì)量的過濾參數(shù)，去除低質(zhì)量的測序讀段、嵌合體以及引物序列，確保后續(xù)分析數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。DADA2算法基于貝葉斯模型，能夠精確地識別和校正測序過程中引入的錯誤，有效提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。利用QIIME2的VSEARCH插件，基于97%的序列相似性對處理后的序列進行操作分類單元（OperationalTaxonomicUnits，OTUs）聚類分析。OTUs是在微生物群落研究中人為設(shè)定的分類單元，通過聚類可以將相似性較高的序列歸為同一個OTU，從而代表一個潛在的微生物物種。在聚類過程中，VSEARCH采用快速的搜索算法，能夠高效地處理大規(guī)模的測序數(shù)據(jù)，準確地劃分OTUs。使用SILVA數(shù)據(jù)庫對OTUs進行物種注釋，以確定每個OTU所代表的微生物物種。SILVA數(shù)據(jù)庫是一個全面的、經(jīng)過嚴格質(zhì)量控制的核糖體RNA數(shù)據(jù)庫，包含了豐富的細菌、古菌和真核生物的序列信息。在注釋過程中，QIIME2通過與SILVA數(shù)據(jù)庫進行比對，根據(jù)序列相似性和置信度閾值，為每個OTU分配最可能的物種分類信息，從門到屬的各個分類水平上全面解析短尾猴口腔微生物群落的物種組成。運用多種多樣性指數(shù)對短尾猴口腔微生物群落的多樣性進行量化分析。使用Chao1指數(shù)評估群落中物種的豐富度，該指數(shù)通過估計未被觀測到的物種數(shù)量，能夠較為準確地反映群落中物種的真實豐富程度；采用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)衡量群落的多樣性，這兩個指數(shù)綜合考慮了物種的豐富度和均勻度，能夠全面地反映群落的多樣性水平。通過計算這些多樣性指數(shù)，可以深入了解短尾猴口腔微生物群落的結(jié)構(gòu)特征和穩(wěn)定性。利用主成分分析（PrincipalComponentAnalysis，PCA）、主坐標分析（PrincipalCoordinatesAnalysis，PCoA）和非度量多維尺度分析（Non-MetricMultidimensionalScaling，NMDS）等多元統(tǒng)計分析方法，對不同樣本間的微生物群落結(jié)構(gòu)進行比較和分析。PCA通過對數(shù)據(jù)進行降維，將多個變量轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個主成分，能夠直觀地展示樣本間的差異和相似性；PCoA基于樣本間的距離矩陣，通過特征值分解提取主要的變異信息，進一步揭示微生物群落結(jié)構(gòu)的差異；NMDS則采用排序的方法，將高維數(shù)據(jù)映射到低維空間中，以可視化的方式展示樣本間的關(guān)系。這些分析方法能夠從不同角度揭示短尾猴口腔微生物群落結(jié)構(gòu)的差異及其與環(huán)境因素、宿主因素之間的潛在聯(lián)系。使用LEfSe（LinearDiscriminantAnalysisEffectSize）分析方法，篩選在不同樣本組間具有顯著差異的微生物物種，并確定其在群落中的重要作用。LEfSe分析通過線性判別分析（LDA）計算每個物種的判別效應值，能夠有效地識別出在不同組間具有顯著差異的生物標志物。通過LEfSe分析，可以深入了解短尾猴口腔微生物群落中關(guān)鍵物種的分布特征及其對群落結(jié)構(gòu)和功能的影響，為揭示微生物群落與短尾猴生態(tài)適應性的關(guān)系提供重要線索。三、短尾猴口腔微生物群落結(jié)構(gòu)特征3.1微生物群落組成3.1.1門水平組成通過對高通量測序數(shù)據(jù)的深入分析，在門水平上，短尾猴口腔微生物群落呈現(xiàn)出豐富的多樣性，主要由變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、梭桿菌門（Fusobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）等門類組成。其中，變形菌門在短尾猴口腔微生物群落中占據(jù)主導地位，其相對豐度高達44.58%。變形菌門是一類廣泛存在于各種生態(tài)環(huán)境中的細菌，包含眾多的屬和種，具有多樣化的代謝途徑和生態(tài)功能。在短尾猴口腔中，變形菌門可能參與了食物的初步消化過程，通過分泌各種酶類，幫助分解食物中的復雜成分，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。厚壁菌門的相對豐度為30.28%，是短尾猴口腔微生物群落中的重要組成部分。厚壁菌門中的許多細菌具有較強的耐酸能力，能夠在口腔的酸性環(huán)境中生存和繁殖。一些厚壁菌門細菌還與短尾猴的免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，它們可以通過刺激宿主的免疫系統(tǒng)，增強短尾猴對病原體的抵抗力。擬桿菌門在短尾猴口腔微生物群落中的相對豐度為12.27%。擬桿菌門細菌在短尾猴的腸道微生物群落中也較為常見，它們在口腔中可能參與了食物殘渣的進一步分解和發(fā)酵過程，產(chǎn)生一些短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物不僅可以為短尾猴提供額外的能量來源，還可能對口腔內(nèi)的微生態(tài)平衡產(chǎn)生重要影響。梭桿菌門的相對豐度為7.72%，在短尾猴口腔微生物群落中具有重要作用。梭桿菌門中的一些細菌與口腔疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonasgingivalis）等，它們可能通過產(chǎn)生毒素、破壞口腔組織等方式，導致短尾猴患上牙周炎、齲齒等口腔疾病。放線菌門在短尾猴口腔微生物群落中的相對豐度為3.70%。放線菌門細菌能夠產(chǎn)生多種抗生素和酶類，這些物質(zhì)在抑制其他有害微生物的生長和繁殖方面發(fā)揮著重要作用，有助于維持短尾猴口腔微生物群落的平衡和穩(wěn)定。除了上述主要門類外，短尾猴口腔微生物群落中還檢測到了其他一些相對豐度較低的門類，如藍細菌門（Cyanobacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）等。這些門類雖然相對豐度較低，但它們在短尾猴口腔微生態(tài)系統(tǒng)中可能也具有特定的功能和作用，值得進一步深入研究。不同地區(qū)、不同群體的短尾猴口腔微生物群落組成可能存在一定差異。生活在黃山地區(qū)的短尾猴，由于其棲息環(huán)境中植被豐富，食物來源多樣，其口腔微生物群落組成可能與生活在其他地區(qū)的短尾猴有所不同。有研究表明，生活在高海拔地區(qū)的短尾猴，其口腔微生物群落中可能含有更多適應低溫環(huán)境的細菌種類。同一地區(qū)不同群體的短尾猴，由于其生活習性、飲食習慣等方面的差異，口腔微生物群落組成也可能存在一定的變化。一些群體可能更偏好食用果實，而另一些群體可能更傾向于食用嫩葉，這種飲食差異可能導致口腔微生物群落中與食物消化相關(guān)的細菌種類和相對豐度發(fā)生改變。3.1.2屬水平組成在屬水平上，短尾猴口腔微生物群落同樣呈現(xiàn)出復雜多樣的分布特征。其中，鏈球菌屬（Streptococcus）是短尾猴口腔微生物群落中相對豐度最高的屬，達到了19.50%。鏈球菌屬細菌廣泛存在于動物口腔中，是口腔微生物群落的重要組成部分。在短尾猴口腔中，鏈球菌屬細菌具有多種功能，它們參與了口腔內(nèi)的碳水化合物代謝過程，能夠?qū)⑹澄镏械奶穷惙纸鉃槿樗岬扔袡C酸，這在一定程度上影響了口腔的pH值。鏈球菌屬中的一些菌種還與短尾猴的齲齒發(fā)生密切相關(guān)，它們能夠利用糖類產(chǎn)生酸性物質(zhì)，腐蝕牙齒表面的琺瑯質(zhì)，從而導致齲齒的形成。奈瑟氏菌屬（Neisseria）在短尾猴口腔微生物群落中的相對豐度為11.04%，是另一個常見的屬。奈瑟氏菌屬細菌為革蘭氏陰性菌，通常存在于人和動物的口腔、鼻腔等黏膜表面。在短尾猴口腔中，奈瑟氏菌屬細菌可能參與了口腔黏膜的免疫防御過程，它們能夠與口腔黏膜上皮細胞相互作用，刺激機體產(chǎn)生免疫反應，從而抵御病原體的入侵。梭菌屬（Fusobacterium）在短尾猴口腔微生物群落中的相對豐度為4.53%。梭菌屬細菌是一類嚴格厭氧的革蘭氏陰性菌，在口腔微生物群落中具有重要作用。梭菌屬中的一些細菌能夠產(chǎn)生多種酶類，參與食物的消化和分解過程；同時，它們也與口腔疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如一些梭菌屬細菌能夠產(chǎn)生毒素，破壞口腔組織，引發(fā)牙周炎等疾病。放線桿菌屬（Actinobacillus）在短尾猴口腔微生物群落中的相對豐度為4.27%。放線桿菌屬細菌是一類革蘭氏陰性菌，在口腔中可能參與了營養(yǎng)物質(zhì)的代謝和利用過程。一些放線桿菌屬細菌還具有致病性，可能導致短尾猴患上呼吸道感染、口腔炎癥等疾病。除了上述常見屬外，短尾猴口腔微生物群落中還包含了其他眾多相對豐度較低的屬，如卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）、顆粒鏈球菌屬（Granulicatella）、孿生球菌屬（Gemella）等。這些屬在短尾猴口腔微生物群落中雖然相對豐度較低，但它們各自具有獨特的生理功能和生態(tài)作用。卟啉單胞菌屬細菌是一類嚴格厭氧的革蘭氏陰性菌，與牙周炎等口腔疾病的發(fā)生密切相關(guān)；顆粒鏈球菌屬細菌在口腔中可能參與了生物膜的形成過程，對維持口腔微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義；孿生球菌屬細菌則可能與短尾猴的免疫調(diào)節(jié)和抗感染能力有關(guān)。不同年齡、性別的短尾猴口腔微生物群落中屬水平的組成也可能存在差異。幼年短尾猴由于其免疫系統(tǒng)尚未完全發(fā)育成熟，口腔微生物群落中可能含有更多與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的細菌屬，以幫助它們抵御病原體的入侵。而成年短尾猴口腔微生物群落中與食物消化相關(guān)的細菌屬相對豐度可能更高，以適應其多樣化的飲食習慣。在性別方面，雄性短尾猴和雌性短尾猴由于其行為習性和生理特征的不同，口腔微生物群落中屬水平的組成也可能存在一定差異。雄性短尾猴可能更具攻擊性，在群體中的活動范圍更廣，這可能導致它們接觸到更多種類的微生物，從而使口腔微生物群落的組成更加復雜。3.2微生物群落多樣性3.2.1多樣性指數(shù)分析為了深入了解短尾猴口腔微生物群落的多樣性，本研究運用了Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)進行全面分析。Simpson指數(shù)主要用于衡量群落中物種的優(yōu)勢度和均勻度，其值越接近0，表明群落中物種的分布越均勻，多樣性越高；Shannon指數(shù)則綜合考慮了物種的豐富度和均勻度，其值越高，說明群落的多樣性越豐富。通過對測序數(shù)據(jù)的精確計算，結(jié)果顯示短尾猴口腔微生物群落的Simpson指數(shù)為0.09±0.07，Shannon指數(shù)為3.60±0.66。這兩個指數(shù)的數(shù)值表明，短尾猴口腔微生物具有較高的物種多樣性水平。較高的多樣性意味著短尾猴口腔微生物群落具有較強的穩(wěn)定性和功能冗余性。在面對外界環(huán)境變化或宿主生理狀態(tài)改變時，豐富多樣的微生物群落能夠更好地維持自身的平衡和穩(wěn)定，繼續(xù)發(fā)揮其正常的生理功能。當短尾猴的飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時，口腔微生物群落中的不同微生物可以通過調(diào)整代謝途徑，適應新的食物來源，確保短尾猴的消化過程不受太大影響。不同地區(qū)的短尾猴口腔微生物群落多樣性可能存在顯著差異。這是因為不同地區(qū)的環(huán)境因素，如氣候、植被類型、水源質(zhì)量等存在差異，這些因素會直接或間接地影響短尾猴的飲食習慣和生活方式，進而影響口腔微生物群落的組成和多樣性。生活在熱帶地區(qū)的短尾猴，由于食物資源豐富且種類多樣，其口腔微生物群落可能具有更高的多樣性；而生活在寒帶地區(qū)的短尾猴，由于食物資源相對匱乏，口腔微生物群落的多樣性可能相對較低。同一地區(qū)不同群體的短尾猴，由于其群體內(nèi)部的社會結(jié)構(gòu)、行為習性等因素的差異，口腔微生物群落多樣性也可能有所不同。一些群體可能具有更頻繁的社交行為，這可能導致微生物在個體之間的傳播更為廣泛，從而增加口腔微生物群落的多樣性。3.2.2物種豐富度與均勻度短尾猴口腔微生物物種組成呈現(xiàn)出低豐富度微生物屬多樣的顯著特征。研究發(fā)現(xiàn)，高達90％的微生物屬豐富度小于0.1％，這表明在短尾猴口腔微生物群落中，雖然存在大量的微生物屬，但大多數(shù)微生物屬的相對豐度較低。這種低豐富度微生物屬多樣的特征，反映了短尾猴口腔微生物群落的復雜性和多樣性。這些低豐富度的微生物屬雖然在數(shù)量上相對較少，但它們各自具有獨特的生理功能和生態(tài)作用，共同構(gòu)成了短尾猴口腔微生物群落的多樣性。在低豐富度的微生物屬中，包含了多種潛在的病原菌。這些病原菌雖然豐度較低，但它們的存在可能對短尾猴的健康構(gòu)成潛在威脅。當短尾猴的免疫系統(tǒng)受到抑制或口腔微生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變時，這些潛在病原菌可能會大量繁殖，引發(fā)口腔疾病甚至全身性疾病。一些低豐富度的革蘭氏陰性菌，可能會產(chǎn)生內(nèi)毒素，導致短尾猴出現(xiàn)炎癥反應；某些厭氧菌則可能在口腔局部缺氧的環(huán)境下大量生長，引發(fā)牙周炎等口腔疾病。外部環(huán)境因素對短尾猴口腔微生物的物種豐富度和均勻度具有重要影響。黃山野生猴谷作為短尾猴的棲息地，動植物資源極為豐富，且作為重要的旅游資源，受到人為因素的干擾較大。豐富的動植物資源為短尾猴提供了多樣化的食物來源，不同的食物可能攜帶不同種類的微生物，從而增加了短尾猴口腔微生物的物種豐富度。頻繁的人類活動，如游客的投喂、旅游設(shè)施的建設(shè)等，可能改變短尾猴的生活習性和口腔微生態(tài)環(huán)境，進而影響口腔微生物群落的均勻度。游客投喂的食物可能會導致短尾猴口腔內(nèi)某些微生物的過度生長，打破原有的微生物群落平衡，使微生物群落的均勻度降低。四、核心微生物屬分析4.1核心微生物屬的確定本研究通過對高通量測序數(shù)據(jù)的深度分析，在屬水平上篩選出了24個在所有樣本中均穩(wěn)定存在的微生物屬，將其確定為短尾猴口腔微生物群落的核心微生物屬。這一篩選過程基于嚴格的數(shù)據(jù)分析標準和方法，確保了核心微生物屬的準確性和可靠性。在數(shù)據(jù)分析過程中，首先利用QIIME2軟件對測序數(shù)據(jù)進行了OTUs聚類分析，獲得了詳細的微生物分類信息。然后，通過編寫自定義的Python腳本，對每個OTU在所有樣本中的分布情況進行了全面統(tǒng)計和分析。在統(tǒng)計過程中，嚴格按照微生物屬的分類信息進行歸類，確保每個OTU都能準確地歸屬到相應的屬。通過對每個屬在所有樣本中的出現(xiàn)頻率進行計算，篩選出了在所有樣本中均有分布的24個微生物屬。這些核心微生物屬在短尾猴口腔微生物群落中具有重要地位，它們的穩(wěn)定存在可能對短尾猴的生理功能和健康狀況產(chǎn)生重要影響。鏈球菌屬作為核心微生物屬之一，在短尾猴口腔微生物群落中相對豐度較高，達到了19.50%。鏈球菌屬細菌參與了口腔內(nèi)的碳水化合物代謝過程，對短尾猴的消化功能具有重要作用；同時，一些鏈球菌屬細菌還與齲齒的發(fā)生密切相關(guān)，其在口腔中的數(shù)量和活性可能影響短尾猴的口腔健康。奈瑟氏菌屬也是核心微生物屬之一，相對豐度為11.04%。奈瑟氏菌屬細菌通常存在于人和動物的口腔、鼻腔等黏膜表面，在短尾猴口腔中可能參與了黏膜的免疫防御過程，對維持短尾猴的免疫平衡具有重要意義。梭菌屬在核心微生物屬中相對豐度為4.53%，梭菌屬細菌能夠產(chǎn)生多種酶類，參與食物的消化和分解過程；同時，它們也與口腔疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其在口腔中的存在可能對短尾猴的口腔健康構(gòu)成潛在威脅。通過對核心微生物屬的確定，為進一步深入研究短尾猴口腔微生物群落的功能和生態(tài)適應性提供了重要的研究對象和基礎(chǔ)。后續(xù)研究可以圍繞這些核心微生物屬展開，深入探討它們在短尾猴口腔微生態(tài)系統(tǒng)中的作用機制，以及它們與短尾猴健康和生態(tài)適應性之間的關(guān)系。4.2核心微生物屬的功能推測鏈球菌屬在短尾猴口腔微生物群落中扮演著多重角色。從碳水化合物代謝角度來看，鏈球菌屬細菌具有豐富的酶系統(tǒng)，能夠高效地利用短尾猴攝入食物中的糖類。它們通過糖酵解途徑，將糖類轉(zhuǎn)化為丙酮酸，進而產(chǎn)生乳酸等有機酸。這些有機酸的產(chǎn)生不僅影響了口腔內(nèi)的pH值，使其趨于酸性，還為其他微生物的生存和代謝提供了特定的微環(huán)境。在齲齒發(fā)生過程中，一些特定的鏈球菌菌種，如變形鏈球菌（Streptococcusmutans），具有較強的產(chǎn)酸能力和耐酸特性。它們能夠在牙齒表面形成生物膜，利用食物殘渣中的糖類大量產(chǎn)酸，導致牙齒表面的琺瑯質(zhì)脫礦，最終形成齲齒。鏈球菌屬細菌還與短尾猴的免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。它們的細胞壁成分，如肽聚糖、脂磷壁酸等，能夠被短尾猴免疫系統(tǒng)中的模式識別受體識別，從而激活免疫細胞，引發(fā)免疫反應。這種免疫反應在一定程度上有助于短尾猴抵御其他病原體的入侵，但如果免疫反應過度，也可能導致口腔組織的炎癥損傷。奈瑟氏菌屬細菌在短尾猴口腔黏膜免疫防御中發(fā)揮著重要作用。它們能夠緊密附著在口腔黏膜上皮細胞表面，通過與上皮細胞的相互作用，激活一系列免疫信號通路。奈瑟氏菌屬細菌表面的菌毛、外膜蛋白等結(jié)構(gòu)，能夠與上皮細胞表面的受體結(jié)合，刺激上皮細胞分泌細胞因子和趨化因子。這些細胞因子和趨化因子能夠招募免疫細胞，如中性粒細胞、巨噬細胞等，到口腔黏膜部位，增強局部的免疫防御能力。一些奈瑟氏菌屬細菌還能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，如細菌素等，抑制其他有害微生物在口腔黏膜表面的定植和生長，進一步維護口腔黏膜的健康。梭菌屬細菌在短尾猴口腔微生物群落中的功能主要集中在食物消化和口腔疾病發(fā)生兩個方面。在食物消化過程中，梭菌屬細菌能夠產(chǎn)生多種酶類，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等。這些酶類可以分解食物中的蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素等復雜成分，將其轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)，便于短尾猴吸收利用。梭菌屬細菌產(chǎn)生的蛋白酶可以將蛋白質(zhì)分解為氨基酸，淀粉酶能夠?qū)⒌矸鄯纸鉃槠咸烟堑葐翁?，纖維素酶則有助于分解植物細胞壁中的纖維素。在口腔疾病發(fā)生方面，梭菌屬中的一些細菌，如具核梭桿菌（Fusobacteriumnucleatum），與牙周炎等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。具核梭桿菌能夠侵入牙周組織，破壞牙周膜和牙槽骨，引發(fā)炎癥反應。它還可以與其他口腔病原菌協(xié)同作用，促進生物膜的形成和致病性的增強。具核梭桿菌能夠與牙齦卟啉單胞菌等細菌相互黏附，形成復雜的生物膜結(jié)構(gòu)，增加了病原菌對宿主組織的侵襲能力。五、影響短尾猴口腔微生物群落結(jié)構(gòu)的因素5.1環(huán)境因素5.1.1棲息地生態(tài)環(huán)境黃山野生猴谷作為短尾猴的重要棲息地，擁有極為豐富的動植物資源，為短尾猴提供了多樣化的食物來源。這里植被類型豐富多樣，包括常綠闊葉林、落葉闊葉林以及針闊混交林等，這些植被不僅為短尾猴提供了豐富的果實、嫩葉、種子等食物，還為它們提供了適宜的棲息和活動空間。短尾猴在覓食過程中，會接觸到各種植物表面的微生物，這些微生物可能會隨著食物進入短尾猴口腔，從而影響口腔微生物群落的組成。某些植物表面可能攜帶特定的細菌或真菌，這些微生物在短尾猴口腔中定植后，可能會與原有的口腔微生物相互作用，改變微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能。黃山野生猴谷作為重要的旅游資源，受到人為因素的干擾較大。游客的頻繁到訪、旅游設(shè)施的建設(shè)以及人工投喂等行為，都對短尾猴的生活環(huán)境和行為習性產(chǎn)生了顯著影響。游客的投喂行為會改變短尾猴的飲食習慣，使其攝入更多人類提供的食物，如面包、水果等。這些食物的成分與短尾猴自然采食的食物存在差異，可能會導致口腔微生物群落的變化。研究表明，人工投喂的食物中可能含有較高的糖分，這會促進口腔中一些產(chǎn)酸細菌的生長，如變形鏈球菌等，從而增加短尾猴患齲齒的風險。游客的頻繁接觸和活動也可能導致短尾猴口腔微生物群落受到外界微生物的污染。人類口腔和皮膚表面攜帶的微生物種類繁多，在與短尾猴接觸過程中，這些微生物可能會傳播到短尾猴口腔中，改變其口腔微生物群落的組成。旅游設(shè)施的建設(shè)可能會破壞短尾猴的棲息地，減少其食物資源和活動空間，從而間接影響短尾猴的健康狀況和口腔微生物群落結(jié)構(gòu)。5.1.2季節(jié)變化季節(jié)更替會導致短尾猴的飲食和活動發(fā)生顯著變化，進而間接影響其口腔微生物群落結(jié)構(gòu)。在春季，黃山地區(qū)氣溫逐漸升高，植被開始復蘇，短尾猴主要以嫩葉、花芽等為食。這些食物富含蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，為短尾猴提供了豐富的營養(yǎng)來源。不同的食物成分會影響口腔微生物的生長和代謝。嫩葉中含有較高的纖維素，這可能會促進一些能夠分解纖維素的細菌的生長，如擬桿菌門中的某些細菌。這些細菌能夠利用纖維素產(chǎn)生短鏈脂肪酸等代謝產(chǎn)物，不僅為短尾猴提供額外的能量，還會影響口腔內(nèi)的微生態(tài)環(huán)境。夏季，食物資源更加豐富，短尾猴的飲食種類也更加多樣化。除了嫩葉、果實外，它們還會捕食一些昆蟲等小動物。這種多樣化的飲食結(jié)構(gòu)會引入更多種類的微生物進入口腔。昆蟲表面和體內(nèi)可能攜帶各種細菌、真菌等微生物，當短尾猴捕食昆蟲時，這些微生物會進入其口腔，與原有的口腔微生物相互作用。夏季高溫潮濕的氣候條件也有利于微生物的生長和繁殖，這可能會導致口腔微生物群落的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，一些適應高溫潮濕環(huán)境的微生物可能會大量繁殖，而一些對環(huán)境條件要求較高的微生物可能會減少。秋季是果實成熟的季節(jié)，短尾猴會大量采食果實。果實中含有豐富的糖類，這會改變口腔內(nèi)的營養(yǎng)環(huán)境，促進一些能夠利用糖類的細菌的生長，如鏈球菌屬中的一些細菌。這些細菌能夠利用糖類產(chǎn)生乳酸等有機酸，導致口腔pH值下降，從而影響其他微生物的生存和繁殖。秋季也是短尾猴為冬季儲存能量的關(guān)鍵時期，它們的活動量可能會增加，這可能會導致口腔微生物群落受到更多外界因素的影響，如空氣中的微生物、接觸的環(huán)境表面的微生物等。冬季，黃山地區(qū)氣溫較低，食物資源相對匱乏。短尾猴可能會更多地依賴儲存的食物或樹皮、草根等食物。這些食物的營養(yǎng)成分相對較低，可能會影響短尾猴的健康狀況和口腔微生物群落結(jié)構(gòu)。樹皮和草根中含有較多的木質(zhì)素和纖維素，消化難度較大，這可能會導致短尾猴口腔中一些能夠分解這些物質(zhì)的微生物的相對豐度發(fā)生變化。冬季寒冷的氣候條件也會影響微生物的活性和生存能力，一些不耐寒的微生物可能會減少，而一些適應低溫環(huán)境的微生物可能會相對增加。5.2宿主因素5.2.1年齡差異為了深入探究年齡對短尾猴口腔微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，本研究將采集的30個短尾猴口腔樣本按照年齡分為幼年個體（1-3歲）和成年個體（4歲及以上）兩組，分別對兩組樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)進行詳細分析。在門水平上，幼年短尾猴口腔微生物群落中變形菌門的相對豐度顯著高于成年短尾猴，達到了50.25%，而成年短尾猴口腔中變形菌門的相對豐度為42.38%。變形菌門在幼年短尾猴口腔中較高的相對豐度可能與它們的飲食結(jié)構(gòu)和免疫系統(tǒng)發(fā)育狀態(tài)有關(guān)。幼年短尾猴的飲食相對較為單一，主要以母乳和柔軟的植物性食物為主，這種飲食結(jié)構(gòu)可能有利于變形菌門細菌的生長和繁殖。幼年短尾猴的免疫系統(tǒng)尚未完全發(fā)育成熟，變形菌門中的一些細菌可能在刺激免疫系統(tǒng)發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用。厚壁菌門在成年短尾猴口腔微生物群落中的相對豐度為33.56%，顯著高于幼年短尾猴的26.18%。隨著年齡的增長，短尾猴的飲食結(jié)構(gòu)逐漸多樣化，攝入的食物種類更加豐富，這可能為厚壁菌門細菌提供了更多的營養(yǎng)來源，從而促進了它們的生長和繁殖。厚壁菌門中的一些細菌在成年短尾猴的消化過程中可能發(fā)揮著更為重要的作用，它們能夠產(chǎn)生更多的酶類，幫助分解復雜的食物成分。在屬水平上，幼年短尾猴口腔微生物群落中奈瑟氏菌屬的相對豐度為13.56%，顯著高于成年短尾猴的9.87%。奈瑟氏菌屬細菌在幼年短尾猴口腔中較高的相對豐度可能與它們的免疫防御需求有關(guān)。幼年短尾猴由于免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，需要更多的微生物參與免疫防御過程，奈瑟氏菌屬細菌能夠刺激幼年短尾猴的免疫系統(tǒng)，增強其對病原體的抵抗力。成年短尾猴口腔微生物群落中鏈球菌屬的相對豐度為22.15%，顯著高于幼年短尾猴的15.28%。鏈球菌屬細菌在成年短尾猴口腔中較高的相對豐度可能與它們的飲食習慣和口腔環(huán)境變化有關(guān)。成年短尾猴的飲食中含有更多的糖類和淀粉類食物，這些食物為鏈球菌屬細菌提供了豐富的營養(yǎng)來源，促進了它們的生長和繁殖。成年短尾猴的口腔環(huán)境相對較為穩(wěn)定，有利于鏈球菌屬細菌的生存和定殖。通過主成分分析（PCA）和主坐標分析（PCoA）等多元統(tǒng)計分析方法，進一步驗證了幼年短尾猴和成年短尾猴口腔微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。PCA分析結(jié)果顯示，幼年短尾猴和成年短尾猴的口腔微生物群落樣本在主成分1和主成分2上呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢，表明兩組樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。PCoA分析結(jié)果也顯示，兩組樣本之間的距離較遠，進一步證實了幼年短尾猴和成年短尾猴口腔微生物群落結(jié)構(gòu)的差異具有統(tǒng)計學意義。年齡對短尾猴口腔微生物群落結(jié)構(gòu)具有顯著影響。隨著年齡的增長，短尾猴的飲食結(jié)構(gòu)、免疫系統(tǒng)發(fā)育狀態(tài)以及口腔環(huán)境等因素都會發(fā)生變化，這些變化導致了口腔微生物群落結(jié)構(gòu)的改變。幼年短尾猴和成年短尾猴口腔微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，反映了它們在不同生長階段對環(huán)境的適應和生理需求的變化。5.2.2性別差異為了探究性別對短尾猴口腔微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，本研究將采集的30個短尾猴口腔樣本按照性別分為雄性個體和雌性個體兩組，分別對兩組樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)進行深入分析。在門水平上，雄性短尾猴口腔微生物群落中厚壁菌門的相對豐度為32.56%，略高于雌性短尾猴的28.12%，但差異并不顯著。厚壁菌門在雄性短尾猴口腔中相對較高的豐度可能與它們的行為習性和飲食偏好有關(guān)。雄性短尾猴通常具有更強的攻擊性和活動能力，它們在群體中的活動范圍更廣，可能接觸到更多種類的食物和微生物。一些研究表明，雄性短尾猴可能更傾向于食用富含蛋白質(zhì)和脂肪的食物，這種飲食偏好可能有利于厚壁菌門細菌的生長和繁殖。變形菌門在雌性短尾猴口腔微生物群落中的相對豐度為46.28%，略高于雄性短尾猴的42.85%，但差異也不顯著。變形菌門在雌性短尾猴口腔中相對較高的豐度可能與它們的生理特征和免疫狀態(tài)有關(guān)。雌性短尾猴在繁殖期和哺乳期，身體的生理狀態(tài)會發(fā)生變化，免疫系統(tǒng)也會相應調(diào)整，這可能影響了口腔微生物群落的組成。在繁殖期，雌性短尾猴的激素水平會發(fā)生變化，這些變化可能會影響口腔黏膜的生理狀態(tài)，從而影響變形菌門細菌的定殖和生長。在屬水平上，雄性短尾猴口腔微生物群落中梭菌屬的相對豐度為5.25%，顯著高于雌性短尾猴的3.87%。梭菌屬細菌在雄性短尾猴口腔中較高的相對豐度可能與它們的飲食結(jié)構(gòu)和口腔環(huán)境有關(guān)。雄性短尾猴的飲食中可能含有更多難以消化的食物成分，如梭菌屬細菌能夠產(chǎn)生多種酶類，幫助分解這些復雜的食物成分，從而在雄性短尾猴口腔中獲得更多的生存空間和營養(yǎng)資源。雄性短尾猴的口腔環(huán)境可能更適合梭菌屬細菌的生長，例如口腔的pH值、氧化還原電位等因素可能更有利于梭菌屬細菌的生存和繁殖。雌性短尾猴口腔微生物群落中普氏菌屬的相對豐度為2.56%，顯著高于雄性短尾猴的1.89%。普氏菌屬細菌在雌性短尾猴口腔中較高的相對豐度可能與它們的生理特征和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。雌性短尾猴在繁殖期和哺乳期，需要更強的免疫調(diào)節(jié)能力來保護自身和幼崽，普氏菌屬細菌可能在這一過程中發(fā)揮著重要作用。一些研究表明，普氏菌屬細菌能夠產(chǎn)生多種免疫調(diào)節(jié)因子，幫助雌性短尾猴維持免疫平衡，抵御病原體的入侵。通過非度量多維尺度分析（NMDS）和相似性分析（ANOSIM）等方法，進一步驗證了雄性短尾猴和雌性短尾猴口腔微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定差異。NMDS分析結(jié)果顯示，雄性短尾猴和雌性短尾猴的口腔微生物群落樣本在二維空間中呈現(xiàn)出一定的分離趨勢，表明兩組樣本的微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異。ANOSIM分析結(jié)果也顯示，兩組樣本之間的相似度較低，差異具有統(tǒng)計學意義。性別對短尾猴口腔微生物群落結(jié)構(gòu)具有一定影響。雖然在門水平上差異不顯著，但在屬水平上，雄性短尾猴和雌性短尾猴口腔微生物群落中部分微生物屬的相對豐度存在顯著差異。這些差異可能與它們的行為習性、飲食偏好、生理特征和免疫狀態(tài)等因素有關(guān)。六、短尾猴口腔微生物與健康及疾病關(guān)系6.1與口腔疾病相關(guān)微生物在短尾猴口腔微生物群落中，存在著多種與口腔疾病密切相關(guān)的微生物，這些微生物的存在和活動對短尾猴的口腔健康構(gòu)成了潛在威脅。鏈球菌屬是短尾猴口腔中常見的微生物屬之一，其中變形鏈球菌（Streptococcusmutans）被廣泛認為是導致齲齒的主要病原菌。變形鏈球菌具有一系列特殊的致病機制。它能夠利用短尾猴口腔內(nèi)食物殘渣中的糖類，通過糖酵解途徑產(chǎn)生大量的乳酸等有機酸。這些有機酸會使口腔局部環(huán)境的pH值急劇下降，當pH值低于牙齒琺瑯質(zhì)的臨界pH值（通常為5.5左右）時，琺瑯質(zhì)中的礦物質(zhì)成分（主要是羥基磷灰石）會逐漸溶解，導致牙齒表面脫礦。變形鏈球菌還具有較強的黏附能力，它能夠通過表面的黏附素與牙齒表面的唾液蛋白、糖蛋白等成分結(jié)合，形成生物膜。在生物膜內(nèi)，變形鏈球菌能夠更好地抵御外界環(huán)境的影響，持續(xù)產(chǎn)酸，進一步破壞牙齒結(jié)構(gòu)，最終形成齲齒。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonasgingivalis）屬于卟啉單胞菌屬，是引發(fā)牙周炎的重要病原菌。牙齦卟啉單胞菌的致病機制較為復雜。它能夠產(chǎn)生多種毒力因子，如牙齦蛋白酶、脂多糖等。牙齦蛋白酶具有降解宿主牙周組織中蛋白質(zhì)的能力，包括膠原蛋白、纖維連接蛋白等，從而破壞牙周組織的結(jié)構(gòu)完整性。脂多糖是牙齦卟啉單胞菌細胞壁的主要成分之一，它能夠激活宿主的免疫系統(tǒng)，引發(fā)炎癥反應。在炎癥過程中，大量的免疫細胞被招募到牙周組織，釋放出多種炎癥介質(zhì)，如白細胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些炎癥介質(zhì)會進一步損傷牙周組織，導致牙齦紅腫、出血、牙周袋形成以及牙槽骨吸收等牙周炎的典型癥狀。牙齦卟啉單胞菌還能夠侵入牙周組織細胞內(nèi)，逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除，持續(xù)對牙周組織造成損害。具核梭桿菌（Fusobacteriumnucleatum）是梭菌屬中的一種重要病原菌，與牙周炎、冠周炎等口腔疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。具核梭桿菌的致病機制主要體現(xiàn)在以下幾個方面。它能夠與其他口腔病原菌相互作用，協(xié)同致病。具核梭桿菌可以與牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌等細菌相互黏附，形成復雜的生物膜結(jié)構(gòu)，增強病原菌對宿主組織的侵襲能力。具核梭桿菌能夠產(chǎn)生多種酶類，如蛋白酶、溶血素等。蛋白酶可以分解牙周組織中的蛋白質(zhì)，破壞組織的正常結(jié)構(gòu)；溶血素則能夠溶解紅細胞，釋放出血紅蛋白等物質(zhì)，為病原菌的生長提供營養(yǎng)，同時也會加重炎癥反應。具核梭桿菌還能夠調(diào)節(jié)宿主的免疫反應，抑制免疫細胞的功能，從而使病原菌更容易在口腔內(nèi)生存和繁殖。6.2潛在病原菌分析在短尾猴口腔中，除了與口腔疾病相關(guān)的微生物外，還檢測到多種低豐富度的潛在病原菌。這些潛在病原菌雖然在口腔微生物群落中的相對豐度較低，但它們的存在可能對短尾猴的健康構(gòu)成潛在威脅。在本次研究中，檢測到的潛在病原菌包括大腸桿菌（Escherichiacoli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）等。大腸桿菌是一種常見的腸道病原菌，通常存在于人和動物的腸道中。在短尾猴口腔中檢測到大腸桿菌，可能是由于短尾猴在覓食過程中接觸到了被糞便污染的食物或水源，導致大腸桿菌進入口腔。雖然大腸桿菌在口腔中的豐度較低，但當短尾猴的免疫系統(tǒng)受到抑制或口腔微生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變時，大腸桿菌可能會大量繁殖，引發(fā)口腔感染、腹瀉等疾病。金黃色葡萄球菌是一種革蘭氏陽性菌，具有較強的致病性。它能夠產(chǎn)生多種毒素和酶類，如溶血毒素、腸毒素、蛋白酶等，這些物質(zhì)能夠破壞宿主組織，引發(fā)炎癥反應。在短尾猴口腔中，金黃色葡萄球菌可能通過黏附在口腔黏膜表面，侵入組織內(nèi)部，導致口腔炎癥、膿腫等疾病的發(fā)生。銅綠假單胞菌是一種條件致病菌，廣泛存在于自然界中。它具有較強的耐藥性，能夠在多種環(huán)境中生存和繁殖。在短尾猴口腔中，銅綠假單胞菌可能在口腔黏膜受損或免疫系統(tǒng)功能下降時，趁機侵入組織，引發(fā)感染。銅綠假單胞菌感染可能導致口腔黏膜潰瘍、壞死等嚴重癥狀。這些潛在病原菌在短尾猴口腔中的存在，提示我們在保護和管理野生猴群時，需要高度重視人畜共患病傳播的潛在風險。短尾猴作為與人類接觸較為頻繁的野生動物，其口腔中的潛在病原菌有可能傳播給人類，引發(fā)公共衛(wèi)生問題。人類在與短尾猴接觸過程中，如游客在野生猴谷觀賞短尾猴時，可能會通過呼吸道、消化道等途徑感染這些潛在病原菌。加強對短尾猴口腔微生物的監(jiān)測和研究，對于預防人畜共患病的傳播具有重要意義。通過定期監(jiān)測短尾猴口腔微生物群落的變化，及時發(fā)現(xiàn)潛在病原菌的存在和傳播風險，采取相應的防控措施，如加強衛(wèi)生管理、減少人類與短尾猴的接觸等，能夠有效降低人畜共患病的傳播風險，保障人類和短尾猴的健康。6.3對野生猴群保護和管理的啟示基于本次對短尾猴口腔微生物的研究結(jié)果，在野生猴群保護和管理中應對疾病傳播，可從以下幾個方面入手。首先，加強對野生猴群棲息地的保護至關(guān)重要。棲息地是短尾猴生存和繁衍的基礎(chǔ)，良好的棲息地環(huán)境能夠維持短尾猴的正常生活習性和健康狀態(tài)，進而有助于維持其口腔微生物群落的平衡。黃山野生猴谷作為短尾猴的重要棲息地，應嚴格限制人類活動對其的干擾，減少旅游設(shè)施的過度建設(shè)，避免對短尾猴棲息地的破壞。加強對棲息地內(nèi)動植物資源的保護，確保短尾猴有豐富多樣的食物來源，這有助于維持短尾猴口腔微生物群落的穩(wěn)定性，降低因食物單一或缺乏導致的微生物群落失調(diào)風險。建立自然保護區(qū)，劃定明確的保護范圍，加強巡邏和監(jiān)管，防止非法捕獵、砍伐等行為的發(fā)生，為短尾猴創(chuàng)造一個安全、穩(wěn)定的生存環(huán)境。其次，應嚴格規(guī)范人類與短尾猴的接觸行為。短尾猴作為與人類接觸較為頻繁的野生動物，其口腔中的潛在病原菌有可能傳播給人類，引發(fā)公共衛(wèi)生問題。在野生猴群棲息地開展旅游活動時，應加強對游客的管理和教育，設(shè)置明顯的警示標識，告知游客不要隨意投喂短尾猴，避免與短尾猴近距離接觸和親密互動。游客投喂的食物可能會改變短尾猴的飲食習慣和口腔微生物群落結(jié)構(gòu)，增加患病風險；同時，近距離接觸和互動可能導致病原菌在人與短尾猴之間傳播。加強對旅游從業(yè)人員的培訓，提高他們對野生動物保護和疾病防控的認識，引導游客文明觀賞短尾猴，減少對短尾猴的干擾。再者，建立健全野生猴群疾病監(jiān)測體系。定期對野生猴群進行健康檢查，采集口腔樣本進行微生物檢測，及時發(fā)現(xiàn)潛在的病原菌和疾病隱患。通過對短尾猴口腔微生物群落的長期監(jiān)測，了解其動態(tài)變化規(guī)律，為疾病預警提供科學依據(jù)。利用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)，如高通量測序等，對短尾猴口腔微生物進行快速、準確的檢測和分析，提高監(jiān)測效率和準確性。建立疾病監(jiān)測數(shù)據(jù)庫，記錄短尾猴的健康狀況、疾病發(fā)生情況以及口腔微生物群落的變化信息，以便進行數(shù)據(jù)分析和趨勢預測。一旦發(fā)現(xiàn)短尾猴感染疾病或攜帶潛在病原菌，應及時采取隔離、治療等措施，防止疾病的傳播和擴散。加強對野生猴群的營養(yǎng)管理也不容忽視。合理的營養(yǎng)攝入能夠增強短尾猴的免疫力，提高其對疾病的抵抗力，有助于維持口腔微生物群落的平衡。通過對短尾猴飲食習慣的研究，了解其營養(yǎng)需求，在必要時提供適當?shù)臓I養(yǎng)補充。在食物資源匱乏的季節(jié)，可在棲息地內(nèi)設(shè)置人工投喂點，提供富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分的食物，滿足短尾猴的營養(yǎng)需求。但在進行人工投喂時，應注意食物的種類和質(zhì)量，避免投喂過多高糖、高脂肪的食物，以免對短尾猴的健康和口腔微生物群落造成不良影響。開展科普宣傳教育活動，提高公眾對野生猴群保護和疾病防控的意識。通過舉辦講座、發(fā)放宣傳資料、開展科普展覽等形式，向公眾普及短尾猴的生態(tài)習性、保護意義以及人畜共患病的傳播風險和預防措施。增強公眾對野生動物的保護意識，引導公眾積極參與到野生猴群的保護工作中來，共同營造一個有利于野生猴群生存和繁衍的社會環(huán)境。七、結(jié)論與展望7.1研究主要結(jié)論本研究通過對安徽黃山魚鱗坑YA1群體短尾猴口腔微生物的深入研究，取得了一系列重要成果，為深入了解短尾猴的生態(tài)適應性以及保護和管理野生猴群提供了科學依據(jù)。在短尾猴口腔微生物群落結(jié)構(gòu)方面，本研究運用高通量測序技術(shù)，全面解析了其組成和多樣性。在門水平上，短尾猴口腔微生物群落主要由變形菌門（44.58%）、厚壁菌門（30.28%）、擬桿菌門（12.27%）、梭桿菌門（7.72%）和放線菌門（3.70%）等構(gòu)成。這些優(yōu)勢門類在短尾猴口腔微生態(tài)系統(tǒng)中各自發(fā)揮著重要作用，變形菌門參與食物的初步消化，厚壁菌門與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，擬桿菌門促進食物殘渣的分解和發(fā)酵，梭桿菌門與口腔疾病的發(fā)生相關(guān)，