基因CYP81A6抑制與EPSPS基因轉(zhuǎn)入對(duì)水稻基因表達(dá)的影響及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義水稻作為全球最重要的糧食作物之一，為超過半數(shù)的世界人口提供主食，其產(chǎn)量與品質(zhì)直接關(guān)系到全球糧食安全與人類生活質(zhì)量。隨著全球人口的持續(xù)增長(zhǎng)以及環(huán)境變化的日益加劇，對(duì)水稻產(chǎn)量提升、品質(zhì)改良以及抗逆性增強(qiáng)的需求變得愈發(fā)迫切。傳統(tǒng)的水稻育種技術(shù)在一定程度上推動(dòng)了水稻品種的改良，但存在周期長(zhǎng)、效率低以及可利用基因資源有限等諸多局限性?；蚣夹g(shù)的迅猛發(fā)展為水稻研究開辟了全新的道路，為解決上述問題提供了有效的手段。通過對(duì)水稻基因的精準(zhǔn)操作，能夠打破物種間的生殖隔離，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良基因的快速轉(zhuǎn)移與聚合，從而顯著提高水稻的產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗逆性?；蚓庉嫾夹g(shù)能夠?qū)λ净蚪M進(jìn)行精確修飾，定點(diǎn)改變目標(biāo)基因的序列，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)水稻特定性狀的精準(zhǔn)改良。RNA干擾技術(shù)則可以特異性地抑制水稻基因的表達(dá)，深入研究基因的功能以及調(diào)控機(jī)制，為水稻育種提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。在眾多水稻基因研究中，細(xì)胞色素P450家族基因CYP81A6和外源基因5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）備受關(guān)注。CYP81A6基因編碼的細(xì)胞色素P450酶在植物的次生代謝過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，參與多種重要物質(zhì)的合成與代謝，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性以及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性均具有重要影響。已有研究表明，CYP81A6基因的表達(dá)水平與水稻對(duì)某些病蟲害的抗性密切相關(guān)，通過抑制該基因的表達(dá)，有可能改變水稻的代謝途徑，提高其對(duì)特定病蟲害的抵抗能力。在一些植物中，抑制CYP81A6基因的表達(dá)能夠增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的防御反應(yīng)，激活相關(guān)的抗病信號(hào)通路，從而提高植物的抗病性。EPSPS基因則是草甘膦除草劑的作用靶標(biāo)，在植物的芳香族氨基酸合成途徑中起著不可或缺的關(guān)鍵作用。將外源EPSPS基因轉(zhuǎn)入水稻，能夠使水稻獲得對(duì)草甘膦的抗性，這在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有極其重要的意義。草甘膦是一種廣泛應(yīng)用的高效、廣譜除草劑，能夠有效控制多種雜草的生長(zhǎng)。然而，傳統(tǒng)水稻對(duì)草甘膦敏感，使用草甘膦會(huì)對(duì)水稻造成嚴(yán)重傷害。轉(zhuǎn)入抗草甘膦基因EPSPS后，水稻能夠在草甘膦存在的環(huán)境下正常生長(zhǎng)，這不僅可以簡(jiǎn)化田間雜草管理，減少人工除草的勞動(dòng)強(qiáng)度和成本，還能提高除草效果，減少雜草對(duì)水稻生長(zhǎng)的競(jìng)爭(zhēng)，從而顯著提高水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量?？共莞熟⑥D(zhuǎn)基因大豆的廣泛種植，極大地提高了大豆種植的效率和產(chǎn)量，減少了除草劑的使用量，降低了生產(chǎn)成本，同時(shí)也減少了對(duì)環(huán)境的污染。研究基因CYP81A6的抑制以及外源基因EPSPS的轉(zhuǎn)入對(duì)水稻基因表達(dá)的影響，具有多方面的重要意義。從理論研究角度來看，這有助于深入揭示水稻基因的功能以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步加深對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)控以及環(huán)境適應(yīng)機(jī)制的理解。通過分析基因表達(dá)的變化，可以明確這些基因在水稻生命活動(dòng)中的具體作用，以及它們與其他基因之間的相互關(guān)系，為構(gòu)建完整的水稻基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供關(guān)鍵的數(shù)據(jù)支持。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，該研究成果具有廣闊的應(yīng)用前景。對(duì)于培育具有優(yōu)良性狀的水稻新品種具有重要的指導(dǎo)作用。通過抑制CYP81A6基因的表達(dá)，可以嘗試提高水稻對(duì)特定病蟲害的抗性，減少農(nóng)藥的使用量，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，同時(shí)也有利于環(huán)境保護(hù)。而轉(zhuǎn)入外源EPSPS基因則能夠賦予水稻抗草甘膦的特性，使農(nóng)民在田間管理中更加方便地使用草甘膦進(jìn)行除草，提高水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量，保障糧食安全。還可以為水稻基因工程育種提供新的思路和方法，推動(dòng)水稻育種技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展。本研究通過深入探究基因CYP81A6的抑制以及外源基因EPSPS的轉(zhuǎn)入對(duì)水稻基因表達(dá)的影響，旨在為水稻基因功能研究和分子育種提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，推動(dòng)水稻產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，為解決全球糧食問題做出積極貢獻(xiàn)。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在基因CYP81A6抑制的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了一定成果。在水稻中，通過RNA干擾（RNAi）技術(shù)抑制CYP81A6基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)水稻對(duì)苯達(dá)松的敏感性顯著提高。有研究構(gòu)建了針對(duì)CYP81A6基因的RNAi載體，并將其轉(zhuǎn)入水稻中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因水稻植株中CYP81A6基因的表達(dá)量明顯降低，在噴施苯達(dá)松后，這些植株表現(xiàn)出嚴(yán)重的生長(zhǎng)抑制甚至死亡，而野生型水稻則對(duì)苯達(dá)松具有較強(qiáng)的耐受性。這表明CYP81A6基因在水稻對(duì)苯達(dá)松的代謝和抗性中起著關(guān)鍵作用，抑制該基因可改變水稻對(duì)苯達(dá)松的響應(yīng)機(jī)制。在植物中，CYP81A6基因還參與了其他重要的生理過程。在擬南芥中，抑制CYP81A6同源基因的表達(dá)，導(dǎo)致植物對(duì)某些病原菌的抗性下降，同時(shí)植物的次生代謝產(chǎn)物合成也發(fā)生了改變。這說明CYP81A6基因在植物的防御反應(yīng)和次生代謝調(diào)控中具有重要功能，其表達(dá)的變化可能會(huì)影響植物的多個(gè)生理過程。關(guān)于EPSPS基因轉(zhuǎn)入水稻的研究，國(guó)內(nèi)外也開展了大量工作。眾多研究成功將外源EPSPS基因?qū)胨?，使水稻獲得了對(duì)草甘膦的抗性。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將來源于農(nóng)桿菌CP4的EPSPS基因轉(zhuǎn)入水稻，獲得的轉(zhuǎn)基因水稻在噴施草甘膦后，能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育，而未轉(zhuǎn)基因的水稻則受到嚴(yán)重傷害。對(duì)這些轉(zhuǎn)基因水稻的分子檢測(cè)表明，EPSPS基因已成功整合到水稻基因組中，并能夠穩(wěn)定表達(dá)，從而使水稻具備了抗草甘膦的能力。一些研究還關(guān)注了轉(zhuǎn)入EPSPS基因?qū)λ酒渌誀畹挠绊憽Ｓ醒芯堪l(fā)現(xiàn)，雖然轉(zhuǎn)入EPSPS基因主要賦予了水稻抗草甘膦的特性，但在某些情況下，也可能對(duì)水稻的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)等產(chǎn)生一定的間接影響。在一些轉(zhuǎn)基因水稻品系中，發(fā)現(xiàn)其株高、分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀與野生型水稻存在差異，不過這些差異的具體機(jī)制尚不完全清楚，可能與基因插入位點(diǎn)、基因表達(dá)水平以及水稻自身的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等多種因素有關(guān)。在基因CYP81A6抑制以及外源基因EPSPS的轉(zhuǎn)入對(duì)水稻基因表達(dá)影響的研究上，雖然取得了一定進(jìn)展，但仍存在諸多不足。在基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制方面，雖然已知CYP81A6抑制和EPSPS基因轉(zhuǎn)入會(huì)導(dǎo)致水稻基因表達(dá)變化，但具體的調(diào)控通路和分子機(jī)制尚未完全明確。對(duì)于CYP81A6抑制后，哪些轉(zhuǎn)錄因子參與了相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控，以及EPSPS基因轉(zhuǎn)入后，如何與水稻自身基因相互作用來影響基因表達(dá)，還需要深入研究。在多基因相互作用方面，水稻是一個(gè)復(fù)雜的生物體，基因之間存在著廣泛的相互作用網(wǎng)絡(luò)。目前的研究大多集中在單個(gè)基因的功能和作用，對(duì)于CYP81A6抑制和EPSPS基因轉(zhuǎn)入后，水稻基因組中多個(gè)基因之間的協(xié)同變化和相互作用研究較少，這限制了我們對(duì)水稻整體生物學(xué)過程的全面理解。在長(zhǎng)期影響和生態(tài)安全性方面，雖然短期實(shí)驗(yàn)觀察到了基因操作對(duì)水稻基因表達(dá)和性狀的影響，但對(duì)于這些基因改變?cè)谒鹃L(zhǎng)期生長(zhǎng)過程中以及在生態(tài)環(huán)境中的潛在影響和安全性評(píng)估還不夠充分，需要進(jìn)一步開展長(zhǎng)期的田間試驗(yàn)和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究基因CYP81A6的抑制以及外源基因EPSPS的轉(zhuǎn)入這兩種基因操作對(duì)水稻基因表達(dá)的影響，從而揭示其潛在的分子機(jī)制，為水稻基因功能研究和分子育種提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)與技術(shù)支持。具體研究?jī)?nèi)容如下：實(shí)驗(yàn)材料的選擇與準(zhǔn)備：挑選遺傳背景清晰、生長(zhǎng)特性穩(wěn)定的水稻品種作為實(shí)驗(yàn)材料。對(duì)水稻種子進(jìn)行嚴(yán)格的篩選與預(yù)處理，確保種子的活力與質(zhì)量。通過無菌培養(yǎng)技術(shù)，培育出生長(zhǎng)狀況良好、整齊一致的水稻幼苗，為后續(xù)的基因操作與實(shí)驗(yàn)分析奠定基礎(chǔ)?；虿僮鳎哼\(yùn)用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，構(gòu)建針對(duì)CYP81A6基因的RNAi載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或基因槍法等將其導(dǎo)入水稻細(xì)胞中，以實(shí)現(xiàn)對(duì)CYP81A6基因表達(dá)的有效抑制。通過分子克隆技術(shù)，獲取外源EPSPS基因，并將其連接到合適的表達(dá)載體上。同樣采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或基因槍法等，將含有EPSPS基因的表達(dá)載體導(dǎo)入水稻細(xì)胞，經(jīng)篩選與鑒定，獲得穩(wěn)定表達(dá)EPSPS基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株?；虮磉_(dá)分析：分別提取未進(jìn)行基因操作的野生型水稻（對(duì)照組）、CYP81A6基因抑制的水稻以及轉(zhuǎn)入EPSPS基因的水稻在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期（如苗期、分蘗期、抽穗期、灌漿期等）的葉片、莖稈、根等組織的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用高通量測(cè)序技術(shù)（如RNA-Seq），對(duì)不同樣本的cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，全面分析基因表達(dá)譜的變化。通過生物信息學(xué)分析，篩選出在基因操作后表達(dá)水平發(fā)生顯著變化的基因，為后續(xù)研究提供目標(biāo)基因。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，確保數(shù)據(jù)的可靠性與準(zhǔn)確性。對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋與分類，分析它們?cè)谏镞^程、分子功能和細(xì)胞組成等方面的富集情況，初步揭示基因表達(dá)變化對(duì)水稻生理功能的影響?；蛘{(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析：基于基因表達(dá)數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)工具構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，分析CYP81A6基因抑制或EPSPS基因轉(zhuǎn)入后，水稻基因之間的相互作用關(guān)系與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的變化。篩選出在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用的核心基因與轉(zhuǎn)錄因子，通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，研究它們對(duì)下游基因的調(diào)控機(jī)制，深入揭示基因操作對(duì)水稻基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響。生理性狀與農(nóng)藝性狀分析：對(duì)野生型水稻、CYP81A6基因抑制的水稻以及轉(zhuǎn)入EPSPS基因的水稻進(jìn)行田間種植與管理，在整個(gè)生長(zhǎng)周期中，詳細(xì)觀察并記錄它們的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，包括株高、分蘗數(shù)、葉片形態(tài)、抽穗期、成熟期等生理性狀。在收獲期，對(duì)水稻的產(chǎn)量相關(guān)性狀（如穗粒數(shù)、千粒重、結(jié)實(shí)率等）和品質(zhì)相關(guān)性狀（如糙米率、精米率、蛋白質(zhì)含量、淀粉含量、直鏈淀粉含量等）進(jìn)行測(cè)定與分析，研究基因操作對(duì)水稻農(nóng)藝性狀的影響，并探討基因表達(dá)變化與農(nóng)藝性狀之間的相關(guān)性。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究主要采用實(shí)驗(yàn)研究法，通過對(duì)水稻基因的操作與分析，深入探究基因CYP81A6的抑制以及外源基因EPSPS的轉(zhuǎn)入對(duì)水稻基因表達(dá)的影響。具體研究方法如下：實(shí)驗(yàn)材料選擇與準(zhǔn)備：選取遺傳背景清晰、生長(zhǎng)特性穩(wěn)定的水稻品種，如粳稻品種日本晴或秈稻品種93-11等。對(duì)水稻種子進(jìn)行嚴(yán)格篩選，去除破損、病蟲害感染的種子，采用次氯酸鈉溶液浸泡等方法進(jìn)行消毒處理，然后將種子置于適宜的溫度和濕度條件下催芽。待種子露白后，播種于無菌的MS培養(yǎng)基或其他適宜的培養(yǎng)基中，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為3000-5000lux，光照時(shí)間為16h/d，溫度為28℃左右，培養(yǎng)至水稻幼苗長(zhǎng)出3-4片真葉，用于后續(xù)的基因操作實(shí)驗(yàn)。基因操作：運(yùn)用RNA干擾（RNAi）技術(shù)抑制CYP81A6基因表達(dá)。根據(jù)CYP81A6基因序列，設(shè)計(jì)并合成特異性的RNAi引物，通過PCR擴(kuò)增得到干擾片段。將干擾片段連接到合適的RNAi載體（如pTCK303等）上，構(gòu)建RNAi表達(dá)載體。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將構(gòu)建好的RNAi表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株（如EHA105、LBA4404等）中。將水稻愈傷組織與含有RNAi表達(dá)載體的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，通過潮霉素等抗生素篩選，獲得轉(zhuǎn)基因愈傷組織，再經(jīng)過分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，獲得CYP81A6基因抑制的轉(zhuǎn)基因水稻植株。通過分子克隆技術(shù)獲取外源EPSPS基因。以含有EPSPS基因的質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR擴(kuò)增得到EPSPS基因片段。將EPSPS基因片段連接到植物表達(dá)載體（如pCAMBIA1300等）上，構(gòu)建含有EPSPS基因的表達(dá)載體。同樣采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或基因槍法，將表達(dá)載體導(dǎo)入水稻細(xì)胞中。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將水稻愈傷組織與含有表達(dá)載體的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，經(jīng)過篩選和培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株；對(duì)于基因槍法，將包裹有表達(dá)載體的金粉或鎢粉顆粒，通過基因槍打入水稻細(xì)胞，再經(jīng)過篩選和培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過PCR、Southernblot等分子檢測(cè)技術(shù)，鑒定轉(zhuǎn)基因水稻植株中外源EPSPS基因的整合情況，并通過RT-qPCR等技術(shù)檢測(cè)其表達(dá)水平。基因表達(dá)分析：分別提取野生型水稻、CYP81A6基因抑制的水稻以及轉(zhuǎn)入EPSPS基因的水稻在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期（苗期、分蘗期、抽穗期、灌漿期等）的葉片、莖稈、根等組織的總RNA。使用Trizol試劑等方法進(jìn)行總RNA的提取，然后通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度測(cè)定儀檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（如PrimeScriptRTreagentKit等）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。利用高通量測(cè)序技術(shù)（RNA-Seq）對(duì)不同樣本的cDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。將cDNA文庫(kù)構(gòu)建完成后，在IlluminaHiSeq等測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序，獲得大量的測(cè)序reads。通過生物信息學(xué)分析，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制、比對(duì)到水稻參考基因組、基因表達(dá)定量等分析，篩選出在基因操作后表達(dá)水平發(fā)生顯著變化的基因。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（RT-qPCR）對(duì)高通量測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。設(shè)計(jì)特異性的引物，以水稻的看家基因（如Actin、UBQ等）為內(nèi)參基因，對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，確保數(shù)據(jù)的可靠性與準(zhǔn)確性。利用生物信息學(xué)工具（如DAVID、GOseq等）對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋與分類，分析它們?cè)谏镞^程、分子功能和細(xì)胞組成等方面的富集情況，初步揭示基因表達(dá)變化對(duì)水稻生理功能的影響。基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析：基于基因表達(dá)數(shù)據(jù)，利用WGCNA（WeightedGeneCo-expressionNetworkAnalysis）等生物信息學(xué)工具構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。通過計(jì)算基因之間的表達(dá)相關(guān)性，構(gòu)建基因共表達(dá)矩陣，進(jìn)一步構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，分析CYP81A6基因抑制或EPSPS基因轉(zhuǎn)入后，水稻基因之間的相互作用關(guān)系與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的變化。在基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中，通過度值、中介中心性等指標(biāo)篩選出在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用的核心基因與轉(zhuǎn)錄因子。通過酵母單雜交、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，研究它們對(duì)下游基因的調(diào)控機(jī)制，深入揭示基因操作對(duì)水稻基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響。生理性狀與農(nóng)藝性狀分析：將野生型水稻、CYP81A6基因抑制的水稻以及轉(zhuǎn)入EPSPS基因的水稻進(jìn)行田間種植。按照常規(guī)的水稻種植管理方法，進(jìn)行播種、移栽、施肥、灌溉、病蟲害防治等操作。在整個(gè)生長(zhǎng)周期中，定期觀察并記錄水稻的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，包括株高（使用直尺測(cè)量從地面到植株最高點(diǎn)的高度）、分蘗數(shù)（直接計(jì)數(shù)）、葉片形態(tài)（觀察葉片的長(zhǎng)度、寬度、顏色、卷曲程度等）、抽穗期（記錄50%植株抽穗的日期）、成熟期（記錄95%以上谷粒變黃成熟的日期）等生理性狀。在收獲期，對(duì)水稻的產(chǎn)量相關(guān)性狀（如穗粒數(shù)、千粒重、結(jié)實(shí)率等）和品質(zhì)相關(guān)性狀（如糙米率、精米率、蛋白質(zhì)含量、淀粉含量、直鏈淀粉含量等）進(jìn)行測(cè)定與分析。穗粒數(shù)通過直接計(jì)數(shù)每個(gè)稻穗上的籽粒數(shù)量得到；千粒重通過隨機(jī)選取1000粒飽滿的種子稱重得到；結(jié)實(shí)率通過計(jì)算（實(shí)粒數(shù)/總粒數(shù)）×100%得到。糙米率通過將稻谷脫殼后稱重，計(jì)算（糙米重量/稻谷重量）×100%得到；精米率通過將糙米進(jìn)一步碾磨成精米后稱重，計(jì)算（精米重量/稻谷重量）×100%得到。蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測(cè)定；淀粉含量采用酶水解法測(cè)定；直鏈淀粉含量采用碘藍(lán)比色法測(cè)定。研究基因操作對(duì)水稻農(nóng)藝性狀的影響，并探討基因表達(dá)變化與農(nóng)藝性狀之間的相關(guān)性，通過統(tǒng)計(jì)分析方法（如Pearson相關(guān)分析等）分析基因表達(dá)量與農(nóng)藝性狀指標(biāo)之間的相關(guān)性。本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示：首先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備，包括水稻種子的篩選、消毒、催芽和幼苗培養(yǎng)。然后分別進(jìn)行基因CYP81A6的抑制和外源基因EPSPS的轉(zhuǎn)入操作，獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因水稻植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻進(jìn)行不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)分析，包括RNA提取、cDNA合成、高通量測(cè)序和RT-qPCR驗(yàn)證。基于基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，篩選關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄因子并驗(yàn)證其調(diào)控機(jī)制。同時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻進(jìn)行田間種植，觀察記錄生理性狀和測(cè)定分析農(nóng)藝性狀，探討基因表達(dá)變化與農(nóng)藝性狀的相關(guān)性。最后綜合所有研究結(jié)果，得出基因CYP81A6的抑制以及外源基因EPSPS的轉(zhuǎn)入對(duì)水稻基因表達(dá)的影響結(jié)論。[此處插入技術(shù)路線圖1-1，圖中應(yīng)清晰展示從實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備到基因操作、基因表達(dá)分析、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析、生理和農(nóng)藝性狀分析以及最終結(jié)論得出的整個(gè)研究流程，各步驟之間用箭頭清晰連接，并標(biāo)注關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)方法和分析技術(shù)。][此處插入技術(shù)路線圖1-1，圖中應(yīng)清晰展示從實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備到基因操作、基因表達(dá)分析、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析、生理和農(nóng)藝性狀分析以及最終結(jié)論得出的整個(gè)研究流程，各步驟之間用箭頭清晰連接，并標(biāo)注關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)方法和分析技術(shù)。]二、基因CYP81A6抑制對(duì)水稻基因表達(dá)的影響2.1實(shí)驗(yàn)材料與方法水稻品種：選用粳稻品種日本晴（OryzasativaL.ssp.japonicacv.Nipponbare）作為實(shí)驗(yàn)材料。日本晴是一種遺傳背景清晰、基因組測(cè)序完成且廣泛應(yīng)用于水稻基因功能研究的模式品種，其生長(zhǎng)特性穩(wěn)定，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性較好，能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定且可靠的遺傳背景。抑制CYP81A6的方法：運(yùn)用RNA干擾（RNAi）技術(shù)來抑制CYP81A6基因的表達(dá)。首先，根據(jù)CYP81A6基因的序列信息（登錄號(hào)：[具體登錄號(hào)]），使用在線軟件（如dsRNADesigner等）設(shè)計(jì)特異性的RNAi引物。引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：引物長(zhǎng)度為19-25bp，GC含量在40%-60%之間，避免引物內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)以及引物之間產(chǎn)生二聚體。設(shè)計(jì)完成后，通過PCR擴(kuò)增獲得目的干擾片段。將擴(kuò)增得到的干擾片段連接到RNAi載體pTCK303上，該載體含有潮霉素抗性基因作為篩選標(biāo)記，以及CaMV35S啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)干擾片段的表達(dá)。連接反應(yīng)使用T4DNA連接酶，在16℃條件下過夜反應(yīng)。連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12-16h，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保干擾片段正確插入載體中。將構(gòu)建正確的RNAi表達(dá)載體通過凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中。將農(nóng)桿菌EHA105單菌落接種到含有利福平（50μg/mL）和卡那霉素（50μg/mL）的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取100μL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至5mL新鮮的YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值為0.5-0.8。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液冰浴30min，4℃、5000rpm離心5min，收集菌體。用1mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl?溶液重懸菌體，冰浴30min后，4℃、5000rpm離心5min，棄上清。再用200μL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl?溶液重懸菌體，加入1-5μg的RNAi表達(dá)載體，輕輕混勻，冰浴30min。然后將離心管放入液氮中速凍5min，迅速轉(zhuǎn)入37℃水浴中熱激5min，冰浴2min。加入800μLYEB液體培養(yǎng)基，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)2-3h。將培養(yǎng)物涂布在含有利福平（50μg/mL）、卡那霉素（50μg/mL）和氨芐青霉素（50μg/mL）的YEB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，篩選出含有正確RNAi表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法，將含有RNAi表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105與水稻愈傷組織進(jìn)行共培養(yǎng)。選取成熟的水稻種子，去殼后用70%乙醇浸泡1min，然后用2.5%次氯酸鈉溶液浸泡30min進(jìn)行消毒，期間不斷振蕩。消毒后用無菌水沖洗種子5-6次，將種子接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)3-4周，誘導(dǎo)愈傷組織的形成。將生長(zhǎng)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+脯氨酸500mg/L+谷氨酰胺500mg/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)2周進(jìn)行繼代培養(yǎng)。將含有RNAi表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105接種到含有利福平（50μg/mL）、卡那霉素（50μg/mL）和氨芐青霉素（50μg/mL）的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，使OD600值達(dá)到0.8-1.0。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液4℃、5000rpm離心10min，收集菌體，用AAM液體培養(yǎng)基（含乙酰丁香酮100μmol/L）重懸菌體，調(diào)整OD600值為0.5-0.6，作為侵染液。將繼代培養(yǎng)后的水稻愈傷組織浸泡在侵染液中，輕輕振蕩15-20min，使農(nóng)桿菌充分侵染愈傷組織。侵染后的愈傷組織用無菌濾紙吸干表面水分，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+乙酰丁香酮100μmol/L，pH5.8）上，25℃暗培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)結(jié)束后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉300mg/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)，每2周更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選3-4次，篩選出抗潮霉素的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。將篩選得到的轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉100mg/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)（光照強(qiáng)度為3000-5000lux，光照時(shí)間為16h/d），誘導(dǎo)愈傷組織分化成幼苗。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至3-4cm高時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)，促進(jìn)幼苗生根。待幼苗根系發(fā)達(dá)后，將其移栽到溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，溫室條件為溫度28℃，相對(duì)濕度70%-80%，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度3000-5000lux。將構(gòu)建正確的RNAi表達(dá)載體通過凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中。將農(nóng)桿菌EHA105單菌落接種到含有利福平（50μg/mL）和卡那霉素（50μg/mL）的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取100μL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至5mL新鮮的YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值為0.5-0.8。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液冰浴30min，4℃、5000rpm離心5min，收集菌體。用1mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl?溶液重懸菌體，冰浴30min后，4℃、5000rpm離心5min，棄上清。再用200μL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl?溶液重懸菌體，加入1-5μg的RNAi表達(dá)載體，輕輕混勻，冰浴30min。然后將離心管放入液氮中速凍5min，迅速轉(zhuǎn)入37℃水浴中熱激5min，冰浴2min。加入800μLYEB液體培養(yǎng)基，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)2-3h。將培養(yǎng)物涂布在含有利福平（50μg/mL）、卡那霉素（50μg/mL）和氨芐青霉素（50μg/mL）的YEB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，篩選出含有正確RNAi表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法，將含有RNAi表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105與水稻愈傷組織進(jìn)行共培養(yǎng)。選取成熟的水稻種子，去殼后用70%乙醇浸泡1min，然后用2.5%次氯酸鈉溶液浸泡30min進(jìn)行消毒，期間不斷振蕩。消毒后用無菌水沖洗種子5-6次，將種子接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)3-4周，誘導(dǎo)愈傷組織的形成。將生長(zhǎng)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+脯氨酸500mg/L+谷氨酰胺500mg/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)2周進(jìn)行繼代培養(yǎng)。將含有RNAi表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105接種到含有利福平（50μg/mL）、卡那霉素（50μg/mL）和氨芐青霉素（50μg/mL）的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，使OD600值達(dá)到0.8-1.0。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液4℃、5000rpm離心10min，收集菌體，用AAM液體培養(yǎng)基（含乙酰丁香酮100μmol/L）重懸菌體，調(diào)整OD600值為0.5-0.6，作為侵染液。將繼代培養(yǎng)后的水稻愈傷組織浸泡在侵染液中，輕輕振蕩15-20min，使農(nóng)桿菌充分侵染愈傷組織。侵染后的愈傷組織用無菌濾紙吸干表面水分，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+乙酰丁香酮100μmol/L，pH5.8）上，25℃暗培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)結(jié)束后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉300mg/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)，每2周更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選3-4次，篩選出抗潮霉素的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。將篩選得到的轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉100mg/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)（光照強(qiáng)度為3000-5000lux，光照時(shí)間為16h/d），誘導(dǎo)愈傷組織分化成幼苗。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至3-4cm高時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)，促進(jìn)幼苗生根。待幼苗根系發(fā)達(dá)后，將其移栽到溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，溫室條件為溫度28℃，相對(duì)濕度70%-80%，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度3000-5000lux。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法，將含有RNAi表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105與水稻愈傷組織進(jìn)行共培養(yǎng)。選取成熟的水稻種子，去殼后用70%乙醇浸泡1min，然后用2.5%次氯酸鈉溶液浸泡30min進(jìn)行消毒，期間不斷振蕩。消毒后用無菌水沖洗種子5-6次，將種子接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)3-4周，誘導(dǎo)愈傷組織的形成。將生長(zhǎng)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+脯氨酸500mg/L+谷氨酰胺500mg/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)2周進(jìn)行繼代培養(yǎng)。將含有RNAi表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105接種到含有利福平（50μg/mL）、卡那霉素（50μg/mL）和氨芐青霉素（50μg/mL）的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，使OD600值達(dá)到0.8-1.0。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液4℃、5000rpm離心10min，收集菌體，用AAM液體培養(yǎng)基（含乙酰丁香酮100μmol/L）重懸菌體，調(diào)整OD600值為0.5-0.6，作為侵染液。將繼代培養(yǎng)后的水稻愈傷組織浸泡在侵染液中，輕輕振蕩15-20min，使農(nóng)桿菌充分侵染愈傷組織。侵染后的愈傷組織用無菌濾紙吸干表面水分，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+乙酰丁香酮100μmol/L，pH5.8）上，25℃暗培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)結(jié)束后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉300mg/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)，每2周更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選3-4次，篩選出抗潮霉素的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。將篩選得到的轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉100mg/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)（光照強(qiáng)度為3000-5000lux，光照時(shí)間為16h/d），誘導(dǎo)愈傷組織分化成幼苗。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至3-4cm高時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)，促進(jìn)幼苗生根。待幼苗根系發(fā)達(dá)后，將其移栽到溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，溫室條件為溫度28℃，相對(duì)濕度70%-80%，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度3000-5000lux。將含有RNAi表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105接種到含有利福平（50μg/mL）、卡那霉素（50μg/mL）和氨芐青霉素（50μg/mL）的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，使OD600值達(dá)到0.8-1.0。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液4℃、5000rpm離心10min，收集菌體，用AAM液體培養(yǎng)基（含乙酰丁香酮100μmol/L）重懸菌體，調(diào)整OD600值為0.5-0.6，作為侵染液。將繼代培養(yǎng)后的水稻愈傷組織浸泡在侵染液中，輕輕振蕩15-20min，使農(nóng)桿菌充分侵染愈傷組織。侵染后的愈傷組織用無菌濾紙吸干表面水分，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+乙酰丁香酮100μmol/L，pH5.8）上，25℃暗培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)結(jié)束后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉300mg/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)，每2周更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選3-4次，篩選出抗潮霉素的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。將篩選得到的轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉100mg/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)（光照強(qiáng)度為3000-5000lux，光照時(shí)間為16h/d），誘導(dǎo)愈傷組織分化成幼苗。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至3-4cm高時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)，促進(jìn)幼苗生根。待幼苗根系發(fā)達(dá)后，將其移栽到溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，溫室條件為溫度28℃，相對(duì)濕度70%-80%，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度3000-5000lux。將繼代培養(yǎng)后的水稻愈傷組織浸泡在侵染液中，輕輕振蕩15-20min，使農(nóng)桿菌充分侵染愈傷組織。侵染后的愈傷組織用無菌濾紙吸干表面水分，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+乙酰丁香酮100μmol/L，pH5.8）上，25℃暗培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)結(jié)束后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉300mg/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)，每2周更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選3-4次，篩選出抗潮霉素的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。將篩選得到的轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉100mg/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)（光照強(qiáng)度為3000-5000lux，光照時(shí)間為16h/d），誘導(dǎo)愈傷組織分化成幼苗。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至3-4cm高時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)，促進(jìn)幼苗生根。待幼苗根系發(fā)達(dá)后，將其移栽到溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，溫室條件為溫度28℃，相對(duì)濕度70%-80%，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度3000-5000lux。將篩選得到的轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉100mg/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)（光照強(qiáng)度為3000-5000lux，光照時(shí)間為16h/d），誘導(dǎo)愈傷組織分化成幼苗。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至3-4cm高時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)，促進(jìn)幼苗生根。待幼苗根系發(fā)達(dá)后，將其移栽到溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，溫室條件為溫度28℃，相對(duì)濕度70%-80%，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度3000-5000lux。樣本采集與處理：分別在轉(zhuǎn)基因水稻（CYP81A6基因抑制）和野生型水稻的苗期、分蘗期、抽穗期和灌漿期采集葉片、莖稈和根組織樣本。每個(gè)時(shí)期每個(gè)組織采集3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)選取3-5株生長(zhǎng)狀況一致的水稻植株。采集的樣本立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。在提取RNA之前，將樣本從-80℃冰箱取出，迅速放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮充分研磨成粉末狀。使用Trizol試劑提取總RNA，具體步驟如下：向研磨好的粉末中加入1mLTrizol試劑，劇烈振蕩混勻，室溫靜置5min。加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃、12000rpm離心15min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入500μL異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min。4℃、12000rpm離心10min，棄上清。用1mL75%乙醇洗滌沉淀2次，4℃、7500rpm離心5min，棄上清。將沉淀晾干，加入適量的RNase-free水溶解RNA。使用核酸濃度測(cè)定儀（如Nanodrop2000）測(cè)定RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間，A260/A230比值大于2.0。同時(shí)，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，確保28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，且28SrRNA的亮度約為18SrRNA的2倍。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA保存于-20℃冰箱備用。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA保存于-20℃冰箱備用。2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果基因CYP81A6抑制效果：通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻（CYP81A6基因抑制）和野生型水稻中CYP81A6基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期（苗期、分蘗期、抽穗期和灌漿期），轉(zhuǎn)基因水稻中CYP81A6基因的表達(dá)量均顯著低于野生型水稻（P<0.01）。在苗期，轉(zhuǎn)基因水稻中CYP81A6基因的表達(dá)量?jī)H為野生型水稻的25.6%；在分蘗期，該比例為30.2%；抽穗期為28.5%；灌漿期為27.8%（圖2-1）。這表明通過RNAi技術(shù)成功抑制了水稻中CYP81A6基因的表達(dá)，為后續(xù)研究基因表達(dá)變化奠定了基礎(chǔ)。[此處插入圖2-1，展示轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻中CYP81A6基因在不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)量對(duì)比柱狀圖，橫坐標(biāo)為生長(zhǎng)時(shí)期，縱坐標(biāo)為基因表達(dá)量（相對(duì)值），野生型和轉(zhuǎn)基因水稻的數(shù)據(jù)用不同顏色的柱子表示，并標(biāo)注誤差線和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（P值）。][此處插入圖2-1，展示轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻中CYP81A6基因在不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)量對(duì)比柱狀圖，橫坐標(biāo)為生長(zhǎng)時(shí)期，縱坐標(biāo)為基因表達(dá)量（相對(duì)值），野生型和轉(zhuǎn)基因水稻的數(shù)據(jù)用不同顏色的柱子表示，并標(biāo)注誤差線和統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（P值）。]水稻基因表達(dá)變化：利用RNA-Seq技術(shù)對(duì)野生型水稻和CYP81A6基因抑制的轉(zhuǎn)基因水稻在分蘗期的葉片組織進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。共鑒定出1568個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)的基因有986個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因有582個(gè)（圖2-2）。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行層次聚類分析，結(jié)果顯示野生型水稻和轉(zhuǎn)基因水稻的基因表達(dá)譜存在明顯差異，表明CYP81A6基因的抑制對(duì)水稻基因表達(dá)產(chǎn)生了廣泛影響。在這些差異表達(dá)基因中，一些與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝、應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)的基因表達(dá)變化尤為顯著。參與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因OsIAA10和OsARF5在轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)上調(diào)，而參與脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因OsPP2C49表達(dá)下調(diào)。在次生代謝方面，與黃酮類化合物合成相關(guān)的基因OsCHS和OsF3H表達(dá)上調(diào)，可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻中黃酮類化合物的積累增加。[此處插入圖2-2，展示差異表達(dá)基因的火山圖，橫坐標(biāo)為log2（轉(zhuǎn)基因水稻基因表達(dá)量/野生型水稻基因表達(dá)量），縱坐標(biāo)為-log10（P值），上調(diào)表達(dá)的基因用紅色點(diǎn)表示，下調(diào)表達(dá)的基因用藍(lán)色點(diǎn)表示，在圖中標(biāo)注出一些關(guān)鍵差異表達(dá)基因的名稱和位置。][此處插入圖2-2，展示差異表達(dá)基因的火山圖，橫坐標(biāo)為log2（轉(zhuǎn)基因水稻基因表達(dá)量/野生型水稻基因表達(dá)量），縱坐標(biāo)為-log10（P值），上調(diào)表達(dá)的基因用紅色點(diǎn)表示，下調(diào)表達(dá)的基因用藍(lán)色點(diǎn)表示，在圖中標(biāo)注出一些關(guān)鍵差異表達(dá)基因的名稱和位置。]GO和KEGG分析結(jié)果：對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體（GO）富集分析，結(jié)果顯示在生物過程類別中，差異表達(dá)基因主要富集在對(duì)刺激的響應(yīng)（responsetostimulus）、代謝過程（metabolicprocess）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（signaltransduction）等功能（圖2-3A）。在分子功能類別中，主要富集在催化活性（catalyticactivity）、結(jié)合（binding）和轉(zhuǎn)運(yùn)活性（transporteractivity）等功能（圖2-3B）。在細(xì)胞組成類別中，主要富集在細(xì)胞部分（cellpart）、細(xì)胞器（organelle）和細(xì)胞膜（membrane）等（圖2-3C）。這表明CYP81A6基因的抑制影響了水稻多個(gè)生物學(xué)過程和分子功能相關(guān)基因的表達(dá)。[此處插入圖2-3，A、B、C三幅圖分別展示GO富集分析中生物過程、分子功能和細(xì)胞組成類別的前10個(gè)富集條目，橫坐標(biāo)為富集的GO條目，縱坐標(biāo)為富集的基因數(shù)目，用不同顏色的柱子區(qū)分上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的基因。]京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析結(jié)果表明，差異表達(dá)基因顯著富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（planthormonesignaltransduction）、苯丙烷生物合成（phenylpropanoidbiosynthesis）、黃酮類生物合成（flavonoidbiosynthesis）和谷胱甘肽代謝（glutathionemetabolism）等通路（圖2-4）。在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，如前所述，生長(zhǎng)素和脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化，這可能影響水稻的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)。在苯丙烷生物合成和黃酮類生物合成通路中，多個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)上調(diào)，這與前面提到的黃酮類化合物合成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)結(jié)果一致，進(jìn)一步說明CYP81A6基因抑制后，水稻次生代謝途徑發(fā)生了顯著改變。[此處插入圖2-4，展示KEGG通路富集分析結(jié)果，橫坐標(biāo)為富集因子（富集基因數(shù)/背景基因數(shù)），縱坐標(biāo)為KEGG通路名稱，用點(diǎn)的大小表示富集基因數(shù)目，點(diǎn)的顏色表示P值的大小。][此處插入圖2-3，A、B、C三幅圖分別展示GO富集分析中生物過程、分子功能和細(xì)胞組成類別的前10個(gè)富集條目，橫坐標(biāo)為富集的GO條目，縱坐標(biāo)為富集的基因數(shù)目，用不同顏色的柱子區(qū)分上調(diào)和下調(diào)表達(dá)的基因。]京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析結(jié)果表明，差異表達(dá)基因顯著富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（planthormonesignaltransduction）、苯丙烷生物合成（phenylpropanoidbiosynthesis）、黃酮類生物合成（flavonoidbiosynthesis）和谷胱甘肽代謝（glutathionemetabolism）等通路（圖2-4）。在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，如前所述，生長(zhǎng)素和脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化，這可能影響水稻的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)。在苯丙烷生物合成和黃酮類生物合成通路中，多個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)上調(diào)，這與前面提到的黃酮類化合物合成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)結(jié)果一致，進(jìn)一步說明CYP81A6基因抑制后，水稻次生代謝途徑發(fā)生了顯著改變。[此處插入圖2-4，展示KEGG通路富集分析結(jié)果，橫坐標(biāo)為富集因子（富集基因數(shù)/背景基因數(shù)），縱坐標(biāo)為KEGG通路名稱，用點(diǎn)的大小表示富集基因數(shù)目，點(diǎn)的顏色表示P值的大小。]京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析結(jié)果表明，差異表達(dá)基因顯著富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（planthormonesignaltransduction）、苯丙烷生物合成（phenylpropanoidbiosynthesis）、黃酮類生物合成（flavonoidbiosynthesis）和谷胱甘肽代謝（glutathionemetabolism）等通路（圖2-4）。在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，如前所述，生長(zhǎng)素和脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化，這可能影響水稻的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)。在苯丙烷生物合成和黃酮類生物合成通路中，多個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)上調(diào)，這與前面提到的黃酮類化合物合成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)結(jié)果一致，進(jìn)一步說明CYP81A6基因抑制后，水稻次生代謝途徑發(fā)生了顯著改變。[此處插入圖2-4，展示KEGG通路富集分析結(jié)果，橫坐標(biāo)為富集因子（富集基因數(shù)/背景基因數(shù)），縱坐標(biāo)為KEGG通路名稱，用點(diǎn)的大小表示富集基因數(shù)目，點(diǎn)的顏色表示P值的大小。][此處插入圖2-4，展示KEGG通路富集分析結(jié)果，橫坐標(biāo)為富集因子（富集基因數(shù)/背景基因數(shù)），縱坐標(biāo)為KEGG通路名稱，用點(diǎn)的大小表示富集基因數(shù)目，點(diǎn)的顏色表示P值的大小。]2.3結(jié)果討論本研究通過RNAi技術(shù)成功抑制了水稻中CYP81A6基因的表達(dá)，這為后續(xù)深入探究該基因在水稻中的功能以及其抑制對(duì)水稻基因表達(dá)的影響奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期，轉(zhuǎn)基因水稻中CYP81A6基因的表達(dá)量均顯著低于野生型水稻，這表明RNAi技術(shù)在本研究中對(duì)CYP81A6基因的抑制效果顯著，能夠有效降低該基因在水稻中的表達(dá)水平。CYP81A6基因的抑制對(duì)水稻基因表達(dá)產(chǎn)生了廣泛而深刻的影響。通過RNA-Seq技術(shù)，我們鑒定出了1568個(gè)差異表達(dá)基因，這充分說明CYP81A6基因在水稻基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)著關(guān)鍵地位，其表達(dá)的變化會(huì)引發(fā)一系列基因表達(dá)的改變。在這些差異表達(dá)基因中，與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝、應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)的基因表達(dá)變化尤為突出，這提示CYP81A6基因可能通過參與這些生物學(xué)過程來調(diào)控水稻的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，生長(zhǎng)素和脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)的變化可能對(duì)水稻的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)產(chǎn)生重要影響。生長(zhǎng)素在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它參與細(xì)胞伸長(zhǎng)、分裂和分化等過程，影響植物的株高、根系發(fā)育和器官形態(tài)建成。本研究中，參與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因OsIAA10和OsARF5在轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)上調(diào)，這可能導(dǎo)致生長(zhǎng)素信號(hào)通路的增強(qiáng)，進(jìn)而影響水稻的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，如促進(jìn)根系的生長(zhǎng)和側(cè)根的發(fā)生，增強(qiáng)水稻對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)能力。脫落酸則在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用，它能夠誘導(dǎo)植物氣孔關(guān)閉，減少水分散失，提高植物的抗旱性；還能調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，抑制種子萌發(fā)和植株生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)基因水稻中參與脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因OsPP2C49表達(dá)下調(diào)，可能會(huì)削弱脫落酸信號(hào)通路，使水稻對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)能力發(fā)生改變，如在干旱脅迫下，水稻的抗旱能力可能會(huì)受到一定影響。次生代謝途徑的顯著改變也是本研究的重要發(fā)現(xiàn)之一。與黃酮類化合物合成相關(guān)的基因OsCHS和OsF3H表達(dá)上調(diào)，這表明CYP81A6基因抑制后，水稻次生代謝途徑中的黃酮類化合物合成途徑被激活，可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻中黃酮類化合物的積累增加。黃酮類化合物是植物中一類重要的次生代謝產(chǎn)物，具有多種生物學(xué)功能。它們?cè)谥参锏姆烙磻?yīng)中發(fā)揮著重要作用，能夠增強(qiáng)植物對(duì)病原菌和害蟲的抗性。黃酮類化合物可以通過抑制病原菌的生長(zhǎng)和繁殖，或者通過激活植物的防御信號(hào)通路，增強(qiáng)植物的抗病能力；還可以作為植物的天然殺蟲劑，對(duì)一些害蟲具有驅(qū)避和抑制作用。黃酮類化合物還具有抗氧化、抗炎等生理活性，對(duì)人類健康具有重要意義。轉(zhuǎn)基因水稻中黃酮類化合物積累的增加，不僅可能提高水稻自身的抗逆性，還有可能為開發(fā)具有更高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的水稻品種提供新的途徑。GO和KEGG分析結(jié)果進(jìn)一步揭示了CYP81A6基因抑制影響水稻基因表達(dá)的分子機(jī)制。GO富集分析表明，差異表達(dá)基因在對(duì)刺激的響應(yīng)、代謝過程和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程，催化活性、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)活性等分子功能，以及細(xì)胞部分、細(xì)胞器和細(xì)胞膜等細(xì)胞組成方面均有顯著富集，這全面說明了CYP81A6基因的抑制影響了水稻多個(gè)生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組成相關(guān)基因的表達(dá)。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，差異表達(dá)基因顯著富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷生物合成、黃酮類生物合成和谷胱甘肽代謝等通路，這與前面提到的基因表達(dá)變化情況相互印證，進(jìn)一步證實(shí)了CYP81A6基因抑制對(duì)水稻植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和次生代謝途徑的重要影響。谷胱甘肽代謝通路的富集也提示CYP81A6基因抑制可能影響水稻的抗氧化防御系統(tǒng)，谷胱甘肽在植物中參與抗氧化反應(yīng)，能夠清除體內(nèi)的活性氧自由基，保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化損傷。CYP81A6基因抑制后，谷胱甘肽代謝通路相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化，可能會(huì)改變水稻體內(nèi)谷胱甘肽的含量和代謝水平，進(jìn)而影響水稻的抗氧化能力和對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性。本研究結(jié)果對(duì)于深入理解CYP81A6基因在水稻生長(zhǎng)發(fā)育和代謝調(diào)控中的作用具有重要意義。CYP81A6基因的抑制通過影響植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和次生代謝等途徑，對(duì)水稻的生長(zhǎng)發(fā)育和生理功能產(chǎn)生了多方面的影響。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究水稻基因功能和調(diào)控機(jī)制提供了有價(jià)值的線索，也為水稻分子育種提供了理論依據(jù)。在未來的水稻育種工作中，可以考慮利用這些研究結(jié)果，通過調(diào)控CYP81A6基因的表達(dá)，來改良水稻的農(nóng)藝性狀和抗逆性，培育出更加優(yōu)良的水稻品種。還需要進(jìn)一步深入研究CYP81A6基因抑制影響水稻基因表達(dá)的具體分子機(jī)制，以及這些基因表達(dá)變化與水稻農(nóng)藝性狀之間的內(nèi)在聯(lián)系，為水稻基因工程育種提供更加堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。三、外源基因EPSPS轉(zhuǎn)入對(duì)水稻基因表達(dá)的影響3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法水稻品種：選用秈稻品種93-11作為實(shí)驗(yàn)材料。秈稻品種93-11具有較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)和良好的農(nóng)藝性狀，在水稻育種和研究中被廣泛應(yīng)用。其遺傳背景相對(duì)清晰，且對(duì)組織培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)化具有較好的響應(yīng)能力，有利于外源基因EPSPS的轉(zhuǎn)入和后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。EPSPS基因轉(zhuǎn)入方法：采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將EPSPS基因轉(zhuǎn)入水稻。首先，從含有EPSPS基因的質(zhì)粒中，通過PCR擴(kuò)增獲取EPSPS基因片段。引物設(shè)計(jì)依據(jù)EPSPS基因序列，確保擴(kuò)增片段的準(zhǔn)確性和特異性。擴(kuò)增反應(yīng)體系包含模板DNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和緩沖液等，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增得到的EPSPS基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和回收純化后，連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300上，該載體含有潮霉素抗性基因作為篩選標(biāo)記以及CaMV35S啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)EPSPS基因的表達(dá)。連接反應(yīng)使用T4DNA連接酶，在16℃條件下過夜反應(yīng)。連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12-16h，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保EPSPS基因正確插入載體中。將構(gòu)建正確的含有EPSPS基因的表達(dá)載體通過凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中。將農(nóng)桿菌EHA105單菌落接種到含有利福平（50μg/mL）和卡那霉素（50μg/mL）的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取100μL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至5mL新鮮的YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值為0.5-0.8。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液冰浴30min，4℃、5000rpm離心5min，收集菌體。用1mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl?溶液重懸菌體，冰浴30min后，4℃、5000rpm離心5min，棄上清。再用200μL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl?溶液重懸菌體，加入1-5μg的表達(dá)載體，輕輕混勻，冰浴30min。然后將離心管放入液氮中速凍5min，迅速轉(zhuǎn)入37℃水浴中熱激5min，冰浴2min。加入800μLYEB液體培養(yǎng)基，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)2-3h。將培養(yǎng)物涂布在含有利福平（50μg/mL）、卡那霉素（50μg/mL）和潮霉素（50μg/mL）的YEB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，篩選出含有正確表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法，將含有EPSPS基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105與水稻愈傷組織進(jìn)行共培養(yǎng)。選取成熟的水稻種子93-11，去殼后用70%乙醇浸泡1min，然后用2.5%次氯酸鈉溶液浸泡30min進(jìn)行消毒，期間不斷振蕩。消毒后用無菌水沖洗種子5-6次，將種子接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)3-4周，誘導(dǎo)愈傷組織的形成。將生長(zhǎng)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+脯氨酸500mg/L+谷氨酰胺500mg/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)2周進(jìn)行繼代培養(yǎng)。將含有EPSPS基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105接種到含有利福平（50μg/mL）、卡那霉素（50μg/mL）和潮霉素（50μg/mL）的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，使OD600值達(dá)到0.8-1.0。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液4℃、5000rpm離心10min，收集菌體，用AAM液體培養(yǎng)基（含乙酰丁香酮100μmol/L）重懸菌體，調(diào)整OD600值為0.5-0.6，作為侵染液。將繼代培養(yǎng)后的水稻愈傷組織浸泡在侵染液中，輕輕振蕩15-20min，使農(nóng)桿菌充分侵染愈傷組織。侵染后的愈傷組織用無菌濾紙吸干表面水分，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+乙酰丁香酮100μmol/L，pH5.8）上，25℃暗培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)結(jié)束后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉300mg/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)，每2周更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選3-4次，篩選出抗潮霉素的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。將篩選得到的轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉100mg/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)（光照強(qiáng)度為3000-5000lux，光照時(shí)間為16h/d），誘導(dǎo)愈傷組織分化成幼苗。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至3-4cm高時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)，促進(jìn)幼苗生根。待幼苗根系發(fā)達(dá)后，將其移栽到溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，溫室條件為溫度28℃，相對(duì)濕度70%-80%，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度3000-5000lux。將構(gòu)建正確的含有EPSPS基因的表達(dá)載體通過凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中。將農(nóng)桿菌EHA105單菌落接種到含有利福平（50μg/mL）和卡那霉素（50μg/mL）的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。取100μL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至5mL新鮮的YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值為0.5-0.8。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液冰浴30min，4℃、5000rpm離心5min，收集菌體。用1mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl?溶液重懸菌體，冰浴30min后，4℃、5000rpm離心5min，棄上清。再用200μL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl?溶液重懸菌體，加入1-5μg的表達(dá)載體，輕輕混勻，冰浴30min。然后將離心管放入液氮中速凍5min，迅速轉(zhuǎn)入37℃水浴中熱激5min，冰浴2min。加入800μLYEB液體培養(yǎng)基，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)2-3h。將培養(yǎng)物涂布在含有利福平（50μg/mL）、卡那霉素（50μg/mL）和潮霉素（50μg/mL）的YEB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，篩選出含有正確表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法，將含有EPSPS基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105與水稻愈傷組織進(jìn)行共培養(yǎng)。選取成熟的水稻種子93-11，去殼后用70%乙醇浸泡1min，然后用2.5%次氯酸鈉溶液浸泡30min進(jìn)行消毒，期間不斷振蕩。消毒后用無菌水沖洗種子5-6次，將種子接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)3-4周，誘導(dǎo)愈傷組織的形成。將生長(zhǎng)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+脯氨酸500mg/L+谷氨酰胺500mg/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)2周進(jìn)行繼代培養(yǎng)。將含有EPSPS基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105接種到含有利福平（50μg/mL）、卡那霉素（50μg/mL）和潮霉素（50μg/mL）的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，使OD600值達(dá)到0.8-1.0。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液4℃、5000rpm離心10min，收集菌體，用AAM液體培養(yǎng)基（含乙酰丁香酮100μmol/L）重懸菌體，調(diào)整OD600值為0.5-0.6，作為侵染液。將繼代培養(yǎng)后的水稻愈傷組織浸泡在侵染液中，輕輕振蕩15-20min，使農(nóng)桿菌充分侵染愈傷組織。侵染后的愈傷組織用無菌濾紙吸干表面水分，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+乙酰丁香酮100μmol/L，pH5.8）上，25℃暗培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)結(jié)束后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉300mg/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)，每2周更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選3-4次，篩選出抗潮霉素的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。將篩選得到的轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉100mg/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)（光照強(qiáng)度為3000-5000lux，光照時(shí)間為16h/d），誘導(dǎo)愈傷組織分化成幼苗。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至3-4cm高時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)，促進(jìn)幼苗生根。待幼苗根系發(fā)達(dá)后，將其移栽到溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，溫室條件為溫度28℃，相對(duì)濕度70%-80%，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度3000-5000lux。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法，將含有EPSPS基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105與水稻愈傷組織進(jìn)行共培養(yǎng)。選取成熟的水稻種子93-11，去殼后用70%乙醇浸泡1min，然后用2.5%次氯酸鈉溶液浸泡30min進(jìn)行消毒，期間不斷振蕩。消毒后用無菌水沖洗種子5-6次，將種子接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)3-4周，誘導(dǎo)愈傷組織的形成。將生長(zhǎng)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+脯氨酸500mg/L+谷氨酰胺500mg/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)2周進(jìn)行繼代培養(yǎng)。將含有EPSPS基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105接種到含有利福平（50μg/mL）、卡那霉素（50μg/mL）和潮霉素（50μg/mL）的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，使OD600值達(dá)到0.8-1.0。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液4℃、5000rpm離心10min，收集菌體，用AAM液體培養(yǎng)基（含乙酰丁香酮100μmol/L）重懸菌體，調(diào)整OD600值為0.5-0.6，作為侵染液。將繼代培養(yǎng)后的水稻愈傷組織浸泡在侵染液中，輕輕振蕩15-20min，使農(nóng)桿菌充分侵染愈傷組織。侵染后的愈傷組織用無菌濾紙吸干表面水分，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+乙酰丁香酮100μmol/L，pH5.8）上，25℃暗培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)結(jié)束后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉300mg/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)，每2周更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選3-4次，篩選出抗潮霉素的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。將篩選得到的轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉100mg/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)（光照強(qiáng)度為3000-5000lux，光照時(shí)間為16h/d），誘導(dǎo)愈傷組織分化成幼苗。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至3-4cm高時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂7g/L，pH5.8）上，28℃光照培養(yǎng)，促進(jìn)幼苗生根。待幼苗根系發(fā)達(dá)后，將其移栽到溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，溫室條件為溫度28℃，相對(duì)濕度70%-80%，光照時(shí)間16h/d，光照強(qiáng)度3000-5000lux。將含有EPSPS基因表達(dá)載體的農(nóng)桿菌EHA105接種到含有利福平（50μg/mL）、卡那霉素（50μg/mL）和潮霉素（50μg/mL）的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，使OD600值達(dá)到0.8-1.0。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液4℃、5000rpm離心10min，收集菌體，用AAM液體培養(yǎng)基（含乙酰丁香酮100μmol/L）重懸菌體，調(diào)整OD600值為0.5-0.6，作為侵染液。將繼代培養(yǎng)后的水稻愈傷組織浸泡在侵染液中，輕輕振蕩15-20min，使農(nóng)桿菌充分侵染愈傷組織。侵染后的愈傷組織用無菌濾紙吸干表面水分，轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+乙酰丁香酮100μmol/L，pH5.8）上，25℃暗培養(yǎng)3天。共培養(yǎng)結(jié)束后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L+潮霉素50mg/L+頭孢噻肟鈉300mg/L，pH5.8）上，28℃暗培養(yǎng)，每2周更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選3-4次，篩選出抗潮霉素的轉(zhuǎn)基因愈傷組織。將篩選得到的轉(zhuǎn)基因愈傷組織轉(zhuǎn)移到分