202XLOGO代謝組學(xué)樣本前處理優(yōu)化策略演講人2025-12-08CONTENTS代謝組學(xué)樣本前處理優(yōu)化策略樣本前處理在代謝組學(xué)研究中的核心地位與挑戰(zhàn)樣本采集與保存的標(biāo)準(zhǔn)化策略：源頭把控數(shù)據(jù)質(zhì)量樣本預(yù)處理的核心策略：實現(xiàn)代謝物的有效釋放與分離質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)化：確保前處理流程的可靠性總結(jié)與展望：前處理優(yōu)化是代謝組學(xué)研究的基石目錄01代謝組學(xué)樣本前處理優(yōu)化策略代謝組學(xué)樣本前處理優(yōu)化策略代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要分支，通過高通量分析生物體內(nèi)小分子代謝物（<1500Da）的動態(tài)變化，揭示生命活動的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。其研究結(jié)果的可靠性高度依賴于樣本前處理的科學(xué)性——這一環(huán)節(jié)直接關(guān)系到代謝物的完整性、檢測靈敏度和數(shù)據(jù)可重復(fù)性。在多年的實驗室實踐中，我深刻體會到：樣本前處理是代謝組學(xué)研究的“阿喀琉斯之踵”，任何步驟的疏漏都可能掩蓋真實的生物學(xué)差異，或引入非實驗因素導(dǎo)致的假陽性。本文將從樣本采集到預(yù)處理完成的完整流程出發(fā)，結(jié)合理論與實踐經(jīng)驗，系統(tǒng)闡述代謝組學(xué)樣本前處理的優(yōu)化策略，為同行提供兼具理論深度與操作參考的框架。02樣本前處理在代謝組學(xué)研究中的核心地位與挑戰(zhàn)樣本前處理在代謝組學(xué)研究中的核心地位與挑戰(zhàn)代謝組學(xué)研究的本質(zhì)是通過對生物樣本中代謝物譜的精準(zhǔn)分析，解析生理、病理狀態(tài)下的代謝特征。而生物樣本（血液、尿液、組織、細(xì)胞等）本身是一個高度復(fù)雜的混合體系，除目標(biāo)代謝物外，還包含高濃度蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸及無機(jī)鹽等干擾物質(zhì)。若未經(jīng)過有效前處理，直接進(jìn)行儀器分析，將面臨三大核心挑戰(zhàn)：代謝物穩(wěn)定性問題代謝物具有高度動態(tài)性和不穩(wěn)定性，如ATP、輔酶A等能量代謝物質(zhì)易被酶降解，谷胱甘肽等抗氧化物質(zhì)易被氧化，而某些脂質(zhì)（如多不飽和脂肪酸）對光、氧敏感。若樣本采集后未及時處理或保存不當(dāng)，代謝物將發(fā)生顯著降解或轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致“假低豐度”現(xiàn)象?；|(zhì)干擾與檢測靈敏度限制生物樣本中蛋白質(zhì)濃度可達(dá)30-50mg/mL，其產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)會抑制離子化效率（如質(zhì)譜分析中），導(dǎo)致目標(biāo)代謝物信號降低；高鹽濃度則可能引起離子抑制或儀器污染。此外，不同代謝物的極性、溶解度、揮發(fā)性差異極大（如葡萄糖與膽固醇的理化性質(zhì)截然不同），難以用單一方法實現(xiàn)所有代謝物的有效提取。樣本異質(zhì)性與標(biāo)準(zhǔn)化難題不同個體、不同組織部位或同一組織不同區(qū)域的代謝物分布存在空間異質(zhì)性（如肝臟的肝小葉與匯管區(qū)代謝物差異）；同一樣本的多次采集（如連續(xù)時間點采血）也可能因操作差異引入批次效應(yīng)。若缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的前處理流程，這些異質(zhì)性將掩蓋真實的生物學(xué)變異，降低數(shù)據(jù)可靠性。因此，樣本前處理的優(yōu)化目標(biāo)可概括為：最大程度保留代謝物原始狀態(tài)、有效去除基質(zhì)干擾、實現(xiàn)多類別代謝物的高效提取、確保操作流程的標(biāo)準(zhǔn)化與可重復(fù)性。這一目標(biāo)的實現(xiàn)，需要從樣本采集到預(yù)處理完成的每個環(huán)節(jié)進(jìn)行精細(xì)設(shè)計與嚴(yán)格把控。03樣本采集與保存的標(biāo)準(zhǔn)化策略：源頭把控數(shù)據(jù)質(zhì)量樣本采集與保存的標(biāo)準(zhǔn)化策略：源頭把控數(shù)據(jù)質(zhì)量樣本采集是前處理的“第一道關(guān)口”，其規(guī)范性直接影響后續(xù)所有步驟的有效性。不同生物樣本（血液、組織、尿液、糞便等）的采集與保存策略存在顯著差異，需根據(jù)樣本特性與研究目的定制化設(shè)計。血液樣本采集與保存的優(yōu)化血液是代謝組學(xué)研究中最常用的生物樣本，其成分復(fù)雜且易受生理狀態(tài)（如飲食、運(yùn)動、晝夜節(jié)律）影響。采集時需重點關(guān)注以下環(huán)節(jié)：血液樣本采集與保存的優(yōu)化采集時間與生理狀態(tài)控制代謝物具有明顯的生理節(jié)律性，如皮質(zhì)醇水平在清晨最高、夜間最低，血糖濃度受飲食影響顯著波動。因此，需嚴(yán)格定義采樣時間窗（如“禁食12小時后，上午8:00-10:00采集”），并記錄采樣前72小時的飲食、運(yùn)動、用藥等詳細(xì)信息。對于動態(tài)研究（如藥物代謝動力學(xué)），需設(shè)定多個時間點（如給藥后0、0.5、1、2、4、8、24小時），并確保每次采樣的操作流程（如采血姿勢、止血帶使用時間）一致——止血帶扎縛超過1分鐘可使血漿中乳酸、鉀離子濃度升高15%-20%。血液樣本采集與保存的優(yōu)化抗凝劑與分離劑的選擇血液采集需根據(jù)后續(xù)分析目標(biāo)選擇合適的抗凝劑：-EDTA-K2/EDTA-K3：通過螯合鈣離子抑制凝血酶活性，適用于血漿樣本（尤其適合分析金屬離子相關(guān)代謝物，如轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的鐵）。但EDTA可能某些代謝物（如環(huán)核苷酸）的檢測產(chǎn)生干擾，且血漿中仍含殘留的凝血因子和血小板，可能導(dǎo)致代謝物降解。-肝素鋰/肝素鈉：通過抗凝血酶Ⅲ抑制凝血酶活性，血漿制備速度較快（離心后即可分離），適合快速代謝物分析。但肝素可能抑制質(zhì)譜分析中的離子化效率，需通過后續(xù)凈化步驟去除。-檸檬酸鈉：主要用于凝血功能相關(guān)研究，因其在血漿中殘留的檸檬酸可能參與三羧酸循環(huán)，干擾能量代謝物分析，一般不推薦用于常規(guī)代謝組學(xué)。血液樣本采集與保存的優(yōu)化抗凝劑與分離劑的選擇分離操作：血液采集后需立即離心（4℃，1500-2000g，10分鐘），以分離血漿/血清。離心延遲超過30分鐘會導(dǎo)致紅細(xì)胞代謝物（如血紅素、乳酸）釋放入血漿，造成假陽性；溫度過高（>25℃）則加速酶促反應(yīng)，導(dǎo)致ATP、葡萄糖等代謝物降解。離心后需快速吸取上清液（避免吸取紅細(xì)胞層），分裝至預(yù)冷的EP管中（每管≤500μL，減少凍融次數(shù)），并立即標(biāo)記樣本編號、采集時間、處理人員等信息。血液樣本采集與保存的優(yōu)化保存條件優(yōu)化短期保存（24小時內(nèi)）：血漿/血清應(yīng)置于-80℃冰箱，避免反復(fù)凍融（反復(fù)凍融3次可使代謝物損失率高達(dá)30%）。長期保存（>1個月）：建議添加穩(wěn)定劑（如1%疊氮鈉抑制微生物生長，或0.1%EDTA防止金屬離子催化氧化），并采用液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃長期保存。需注意：某些不穩(wěn)定代謝物（如一氧化氮、硫化氫）需使用專用保存管（如含抗氧化劑的EDTA管），并在-80℃避光保存。組織樣本采集與保存的精細(xì)化操作組織樣本是研究局部代謝特征（如腫瘤微環(huán)境、腦區(qū)代謝差異）的關(guān)鍵材料，但其代謝物穩(wěn)定性受“缺血時間”影響極大——組織離體后，氧氣供應(yīng)中斷，有氧代謝停止，無氧代謝增強(qiáng)，導(dǎo)致乳酸、ATP/ADP比值等迅速變化。因此，組織樣本采集的核心是“快速冷凍”與“準(zhǔn)確定位”。組織樣本采集與保存的精細(xì)化操作缺血時間控制與快速冷凍動物實驗中，需通過斷頭或頸椎脫臼處死動物，快速解剖目標(biāo)組織（如肝臟、腦、腫瘤），并在30秒內(nèi)將組織浸入液氮中預(yù)凍（避免使用干冰，因其溫度（-78℃）高于液氮（-196℃），無法完全抑制酶活性）。對于臨床樣本（如手術(shù)切除組織），需在離體后立即用無菌紗布吸干血液，放入液氮或干冰中轉(zhuǎn)移至實驗室。若液氮運(yùn)輸不便，可使用預(yù)冷的異戊烷（-40℃）進(jìn)行“包埋冷凍”，避免組織因緩慢降溫形成冰晶（冰晶會破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致代謝物泄漏）。組織樣本采集與保存的精細(xì)化操作組織定位與分取精度代謝物在組織中的分布具有空間異質(zhì)性，如肝臟的肝小葉中心區(qū)（Zone1）富含氧化代謝酶，邊緣區(qū)（Zone3）則以糖異生為主，代謝物濃度差異可達(dá)2-5倍。因此，需借助解剖顯微鏡或激光捕獲顯微切割（LCM）技術(shù)，精準(zhǔn)定位目標(biāo)區(qū)域（如腫瘤組織與癌旁組織的交界處），并使用預(yù)冷的手術(shù)刀或活檢鉗分取組織（避免用手直接接觸，防止體溫導(dǎo)致組織融化）。分取后的組織需立即稱重（記錄濕重），并分裝至預(yù)冷的EP管中（每管≤50mg，確保冷凍速度均勻）。組織樣本采集與保存的精細(xì)化操作保存與勻漿前處理組織樣本需在-80℃保存，避免反復(fù)凍融。勻漿前，需將組織在液氮中研磨成粉末（使用預(yù)冷的研缽和杵），或加入預(yù)冷的提取緩沖液（如80%甲醇水溶液，含內(nèi)標(biāo)）進(jìn)行勻漿（勻漿儀溫度控制在4℃以下）。勻漿后需立即離心（4℃，12000g，15分鐘），取上清液進(jìn)行后續(xù)處理——若勻漿后放置超過30分鐘，組織中的磷酸酶、酯酶等會繼續(xù)降解代謝物，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏差。尿液與糞便樣本的采集與保存要點尿液和糞便樣本具有非侵入性、易獲取的優(yōu)勢，但其成分易受飲食、水分、腸道菌群等因素影響，需更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)化處理。尿液與糞便樣本的采集與保存要點尿液樣本-采集時間與方式：推薦首次晨尿（濃縮代謝物，減少飲食干擾），或采用24小時尿（收集全天尿液，混勻后取200mL分裝）。需記錄排尿時間、尿量（24小時尿需計算總尿量，用于代謝物濃度校正）。-保存與預(yù)處理：尿液采集后需立即離心（4℃，3000g，10分鐘）去除細(xì)胞、沉淀物等，取上清液分裝。短期保存（24小時）置于4℃，長期保存加入0.1%疊氮鈉后-80℃保存。需注意：尿液中的尿素易被細(xì)菌分解產(chǎn)生氨，導(dǎo)致pH升高，影響酸性代謝物穩(wěn)定性，因此需在采集后2小時內(nèi)完成離心處理。尿液與糞便樣本的采集與保存要點糞便樣本-采集與固定：使用無菌棉簽采集糞便中心部位（避免接觸馬桶壁或尿液），置于預(yù)冷的cryotube中。為抑制腸道菌群代謝，需立即添加10倍體積的80%甲醇水溶液（含0.1%疊氮鈉），渦旋混勻后-80℃保存。-前處理關(guān)鍵：糞便樣本需先進(jìn)行冷凍干燥（去除水分，避免代謝物降解），然后研磨成粉末。勻漿時使用含內(nèi)標(biāo)的提取緩沖液（如甲醇:水:氯仿=2:1:1，v/v/v），渦旋混勻后超聲破碎（冰水浴中，30秒×3次），離心取上清液。需注意：糞便樣本中含有大量復(fù)雜多糖和蛋白質(zhì)，需通過多次離心（12000g，20分鐘）去除沉淀，避免堵塞色譜柱。04樣本預(yù)處理的核心策略：實現(xiàn)代謝物的有效釋放與分離樣本預(yù)處理的核心策略：實現(xiàn)代謝物的有效釋放與分離樣本采集與保存完成后，需通過預(yù)處理去除干擾物質(zhì)、提取目標(biāo)代謝物，為儀器分析提供“純凈”的樣品。預(yù)處理的核心步驟包括蛋白質(zhì)沉淀、代謝物提取、凈化與濃縮，其優(yōu)化需根據(jù)樣本類型、分析平臺（色譜-質(zhì)譜、核磁共振等）及研究目標(biāo)綜合設(shè)計。蛋白質(zhì)沉淀與代謝物提?。鹤畲蠡x物回收率生物樣本中蛋白質(zhì)含量極高（如血漿中蛋白質(zhì)占干重的90%以上），必須通過沉淀去除，同時釋放與蛋白質(zhì)結(jié)合的代謝物。目前主流的沉淀方法有有機(jī)溶劑沉淀、酸沉淀、超濾等，需根據(jù)代謝物極性選擇最優(yōu)方案。蛋白質(zhì)沉淀與代謝物提?。鹤畲蠡x物回收率有機(jī)溶劑沉淀法：適用廣譜代謝物提取有機(jī)溶劑沉淀是代謝組學(xué)中最常用的方法，其原理是通過降低溶液介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)變性沉淀，同時保持代謝物溶解。常用溶劑包括甲醇、乙腈、丙酮及其混合體系：-甲醇沉淀：對極性代謝物（如氨基酸、有機(jī)酸）提取效率高，但對脂溶性代謝物（如膽固醇、甘油三酯）提取效果較差。操作時通常按樣本體積加入3倍預(yù)冷甲醇（-20℃），渦旋混勻1分鐘，-20℃靜置30分鐘，離心（4℃，12000g，15分鐘），取上清液。-乙腈沉淀：沉淀蛋白質(zhì)的能力強(qiáng)于甲醇（對白蛋白的沉淀率可達(dá)95%），且對脂溶性代謝物的干擾較小，適合血漿/血清樣本。但乙腈易揮發(fā)，需在通風(fēng)櫥中操作，避免濃縮時損失。蛋白質(zhì)沉淀與代謝物提?。鹤畲蠡x物回收率有機(jī)溶劑沉淀法：適用廣譜代謝物提取-甲醇:氯仿混合體系：適用于“兩相提取法”，可同時提取極性代謝物（進(jìn)入上層甲醇相）和非極性代謝物（進(jìn)入下層氯仿相）。操作時按樣本:甲醇:氯仿=1:2:1（v/v/v）混合，渦旋后離心（4℃，3000g，10分鐘），取上層甲醇相（極性代謝物）和下層氯仿相（脂質(zhì)），分別收集后氮氣吹干復(fù)溶。優(yōu)化要點：有機(jī)溶劑的預(yù)冷（-20℃）可提高沉淀效率；沉淀時間需控制在30分鐘以上（確保蛋白質(zhì)完全沉淀）；離心后需立即吸取上清液，避免沉淀物懸浮導(dǎo)致蛋白殘留。2.酸沉淀法：特異性提取酸性/堿性代謝物酸沉淀（如三氯乙酸、高氯酸）通過降低pH值使蛋白質(zhì)帶正電而沉淀，適合提取酸性代謝物（如檸檬酸、琥珀酸）。但酸沉淀可能導(dǎo)致某些不穩(wěn)定代謝物（如糖原）降解，且殘留的酸需中和（如加入碳酸氫鈉），可能引入新的離子干擾。蛋白質(zhì)沉淀與代謝物提?。鹤畲蠡x物回收率超濾法：溫和處理大分子干擾超濾（使用10kDa或30kDa超濾管）通過分子量截留分離蛋白質(zhì)與代謝物，適合處理樣本量少（如微透析液）或需保持蛋白質(zhì)構(gòu)型的研究。但超濾可能因吸附導(dǎo)致小分子代謝物損失（如ATP在超濾膜上的吸附率可達(dá)10%-20%），且操作耗時較長（需離心1-2小時）。代謝物凈化與濃縮：提升檢測靈敏度與特異性經(jīng)蛋白質(zhì)沉淀和初步提取后，樣本中仍可能殘留脂質(zhì)、多糖、鹽類等干擾物質(zhì)，需進(jìn)一步凈化；同時，代謝物濃度可能低于儀器檢測限，需進(jìn)行濃縮處理。代謝物凈化與濃縮：提升檢測靈敏度與特異性固相萃?。⊿PE）：選擇性富集目標(biāo)代謝物SPE是代謝組學(xué)凈化的核心方法，通過吸附劑對代謝物的選擇性吸附與洗脫，實現(xiàn)高純度提取。常用吸附劑包括：-混合型陰離子交換（MAX）柱：適合酸性代謝物（如有機(jī)酸、核苷酸），通過離子交換作用吸附酸性代謝物，再用甲酸銨緩沖液（pH3.0）洗脫。-混合型陽離子交換（MCX）柱：適合堿性代謝物（如兒茶酚胺、氨基酸），通過陽離子交換吸附，再用氨水-甲醇溶液洗脫。-親水作用色譜（HILIC）柱：適合極性代謝物（如糖類、有機(jī)酸），通過親水作用吸附，乙腈-水梯度洗脫。優(yōu)化要點：SPE前需用甲醇和水活化柱子（避免柱床干裂）；上樣量需控制在柱子容量范圍內(nèi)（如MAX柱最大上樣量≤5mg蛋白）；洗脫溶劑需優(yōu)化（如乙腈中添加0.1%甲酸可提高脂溶性代謝物的洗脫效率）。代謝物凈化與濃縮：提升檢測靈敏度與特異性液液萃?。↙LE）：基于極性差異的分離LLE利用代謝物在不同溶劑中溶解度的差異進(jìn)行分離，適合處理組織樣本中的脂質(zhì)去除。如用正己烷萃取脂質(zhì)（非極性），下層水相保留極性代謝物；或用乙酸乙酯萃取中等極性代謝物（如黃酮類）。LPE操作簡單，但溶劑用量大（需3-5倍樣本體積），且易形成乳化層，需通過離心或加入飽和氯化鈉溶液破乳。代謝物凈化與濃縮：提升檢測靈敏度與特異性代謝物濃縮與干燥經(jīng)凈化的樣本通常需濃縮以提高檢測靈敏度。常用方法包括：-氮氣吹干：適用于熱不穩(wěn)定代謝物（如氨基酸、有機(jī)酸），在30-40℃水浴中氮氣吹干，然后用復(fù)溶劑（如100μL80%甲醇水溶液）復(fù)溶。-真空離心濃縮：適用于少量樣本（如<50μL），在真空濃縮儀中（4℃）濃縮，避免代謝物揮發(fā)損失。注意事項：復(fù)溶劑的選擇需與后續(xù)色譜分析匹配（如反相色譜使用含水的甲醇/乙腈，正相色譜使用非極性溶劑）；復(fù)溶后需渦旋混勻，離心（12000g，5分鐘）去除不溶顆粒，避免堵塞色譜柱。衍生化策略：提升檢測穩(wěn)定性與靈敏度對于極性大、揮發(fā)性強(qiáng)或缺乏生色團(tuán)的代謝物（如脂肪酸、氨基酸、有機(jī)酸），需通過衍生化反應(yīng)引入“修飾基團(tuán)”，以提高色譜分離效果、質(zhì)譜檢測靈敏度或穩(wěn)定性。衍生化可分為硅烷化、?；?、酯化等類型，需根據(jù)代謝物特性選擇。衍生化策略：提升檢測穩(wěn)定性與靈敏度硅烷化衍生化：適用于極性代謝物硅烷化（如使用BSTFA、MSTFA）通過引入三甲基硅基（TMS），降低代謝物極性，改善氣相色譜（GC）分離效果。常用于氨基酸、有機(jī)酸、糖類的衍生化。操作時需在無水條件下進(jìn)行（加入吡啶作催化劑，70℃反應(yīng)30分鐘），衍生化后需立即進(jìn)樣（避免TMS基團(tuán)水解）。衍生化策略：提升檢測穩(wěn)定性與靈敏度酰化衍生化：適用于胺類代謝物?；ㄈ缡褂肞FBBr、DNFB）通過引入苯甲?；然鶊F(tuán)，增強(qiáng)胺類代謝物（如兒茶酚胺、多巴胺）的質(zhì)譜響應(yīng)。反應(yīng)條件溫和（室溫，15分鐘），適合不穩(wěn)定代謝物的衍生化。衍生化策略：提升檢測穩(wěn)定性與靈敏度酯化衍生化：適用于脂肪酸酯化（如使用BF3-甲醇）將脂肪酸轉(zhuǎn)化為甲酯（FAME），提高氣相色譜分離效率。需在60℃反應(yīng)30分鐘，衍生化后需用正己烷萃取，去除多余試劑。優(yōu)化要點：衍生化試劑需新鮮配制（避免吸潮）；衍生化時間需嚴(yán)格控制（過長可能導(dǎo)致副反應(yīng)）；衍生化后需通過SPE或LLE去除過量試劑，避免干擾儀器分析。05質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)化：確保前處理流程的可靠性質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)化：確保前處理流程的可靠性前處理流程的標(biāo)準(zhǔn)化是代謝組學(xué)研究數(shù)據(jù)可重復(fù)性的基礎(chǔ)，需通過全程質(zhì)量控制（QC）監(jiān)控每個步驟的穩(wěn)定性，及時發(fā)現(xiàn)并糾正偏差。樣本前處理的質(zhì)量控制體系空白樣本：監(jiān)控交叉污染空白樣本包括溶劑空白（如提取用甲醇）、過程空白（如與樣本同時處理的空管），用于監(jiān)控前處理過程中的交叉污染。若空白樣本中檢測到目標(biāo)代謝物，需排查試劑、容器或操作工具的污染（如移液槍tip污染），并及時更換。樣本前處理的質(zhì)量控制體系質(zhì)控樣本（QC）：監(jiān)控流程穩(wěn)定性QC樣本包括：-混合QC樣本：將所有研究樣本等體積混合，作為“全流程質(zhì)控樣本”，在每個批次樣本處理前、中、后各分析1次，通過QC樣本的代謝物峰面積變化評估前處理穩(wěn)定性（如RSD<20%表明流程穩(wěn)定）。-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)QC：加入已知濃度的代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)品（如氨基酸、有機(jī)酸），通過回收率（實測值/理論值×100%）評估提取效率（理想回收率80%-120%）。樣本前處理的質(zhì)量控制體系內(nèi)標(biāo)（IS）：校正儀器波動與操作誤差內(nèi)標(biāo)是結(jié)構(gòu)或性質(zhì)與目標(biāo)代謝物相似但生物樣本中不存在的化合物，用于校正樣本前處理過程中的損失和儀器分析波動。常用內(nèi)標(biāo)包括：-同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)：如13C-葡萄糖、D4-亮氨酸，其化學(xué)性質(zhì)與目標(biāo)代謝物完全一致，是最理想的內(nèi)標(biāo)，但成本較高。-結(jié)構(gòu)類似物內(nèi)標(biāo)：如氘代甲苯（用于脂類）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（用于抗氧化物質(zhì)），適用于無同位素標(biāo)記的代謝物。添加時機(jī)：內(nèi)標(biāo)需在樣本采集后立即加入（如血液采集時加入抗凝劑的同時加入內(nèi)標(biāo)），或樣本勻漿時加入，確保全程參與前處理過程。標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（SOP）的建立與執(zhí)行為確保不同操作者、不同批次間的一致性，需建立詳細(xì)的SOP，涵蓋樣本采集、保存、預(yù)處理、儀器分析等每個環(huán)節(jié)的參數(shù)（如離心轉(zhuǎn)速、時間、溫度、試劑批號等）。例如，血漿樣本的SOP可定義為：“EDTA-K2抗凝管采集血液→4℃、1500g離心10分鐘→吸取血漿→加入10μL1mg/mL同位素內(nèi)標(biāo)混合溶液→-80℃保存→80%甲醇（含0.1%