塞來(lái)昔布增強(qiáng)人結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)維甲酸敏感性的作用機(jī)制與應(yīng)用前景探究一、引言1.1研究背景結(jié)腸癌作為常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)均居高不下。據(jù)世界流行病學(xué)調(diào)查顯示，結(jié)腸癌在北美、西歐、澳大利亞、新西蘭等地的發(fā)病率最高，居內(nèi)臟腫瘤的前兩位。在我國(guó)，隨著人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢(shì)。手術(shù)和化療是目前結(jié)腸癌的主要治療手段，但由于多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，單純手術(shù)的治療效果并不理想。傳統(tǒng)化療藥物雖能殺傷癌細(xì)胞，但選擇性差、毒副作用大，對(duì)患者的生活質(zhì)量和身體健康造成了嚴(yán)重影響。因此，尋找更有效的治療方法和藥物，提高結(jié)腸癌的治療效果，成為了醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。維甲酸類藥物作為一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，是維生素A的天然及人工合成的衍生物。大量基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)表明，維甲酸可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡和代謝等多個(gè)環(huán)節(jié)，抑制多種實(shí)體腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移，包括結(jié)腸癌。然而，腫瘤細(xì)胞對(duì)維甲酸的耐藥現(xiàn)象限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。部分結(jié)腸癌細(xì)胞株，如結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞株，對(duì)維甲酸存在原發(fā)耐藥性，這使得維甲酸在治療結(jié)腸癌時(shí)難以達(dá)到理想的治療效果。因此，深入研究維甲酸的耐藥機(jī)制，尋找提高細(xì)胞對(duì)維甲酸敏感性的方法，對(duì)于推廣維甲酸在結(jié)腸癌治療中的應(yīng)用具有重要意義。塞來(lái)昔布作為環(huán)氧化酶-2（COX-2）的特異性抑制劑，已被證實(shí)可增加某些化療藥物的敏感性。COX-2在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。塞來(lái)昔布通過(guò)抑制COX-2的活性，減少前列腺素E2（PGE2）的合成，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。已有研究表明，塞來(lái)昔布在乳腺癌、肺癌等多種腫瘤的治療中顯示出一定的增效作用。然而，塞來(lái)昔布是否能增加人結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)維甲酸的敏感性，以及其作用機(jī)制如何，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討塞來(lái)昔布對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞維甲酸敏感性的影響，并深入研究其作用機(jī)制。通過(guò)MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、Westernblotting等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制、凋亡率、PGE2濃度以及維甲酸受體beta和COX-2的表達(dá)等指標(biāo)，為臨床提供可行的聯(lián)合用藥方案，推廣維甲酸的誘導(dǎo)分化和凋亡治療，為結(jié)腸癌的治療開辟新的思路和方法。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究塞來(lái)昔布對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞維甲酸敏感性的影響，并全面剖析其內(nèi)在作用機(jī)制。通過(guò)運(yùn)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)、ELISA、Westernblotting等多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，精準(zhǔn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制、凋亡率、PGE2濃度以及維甲酸受體beta和COX-2的表達(dá)等關(guān)鍵指標(biāo)。具體而言，首先觀察人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和SW480對(duì)全反式維甲酸的敏感性，驗(yàn)證塞來(lái)昔布對(duì)這兩種細(xì)胞維甲酸敏感性的影響，篩選出藥物最佳濃度和作用時(shí)間，并初步探討其作用機(jī)理。隨后，深入探討塞來(lái)昔布增加HT-29細(xì)胞株維甲酸敏感性的作用與維甲酸受體beta（RARβ）和COX-2的關(guān)系，闡明聯(lián)合用藥的分子機(jī)理。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。從理論層面來(lái)看，深入探究塞來(lái)昔布對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞維甲酸敏感性的影響及機(jī)制，有助于揭示結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，進(jìn)一步豐富對(duì)維甲酸耐藥機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為腫瘤細(xì)胞耐藥性研究提供新的思路和方向。在臨床應(yīng)用方面，塞來(lái)昔布與維甲酸聯(lián)合用藥方案的提出，有望為結(jié)腸癌的治療提供新的策略。維甲酸作為一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，雖具有一定的抗腫瘤潛力，但腫瘤細(xì)胞對(duì)其耐藥現(xiàn)象限制了其臨床應(yīng)用。而塞來(lái)昔布可增加人結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)維甲酸的敏感性，兩者聯(lián)合用藥可增強(qiáng)增殖抑制和促凋亡作用，這為臨床醫(yī)生提供了一種新的聯(lián)合用藥選擇，有助于提高結(jié)腸癌的治療效果，減少化療藥物的毒副作用，改善患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。此外，本研究還可能為其他腫瘤的治療提供借鑒，推動(dòng)腫瘤治療領(lǐng)域的發(fā)展。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)本研究綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從細(xì)胞增殖、凋亡、信號(hào)通路等多個(gè)層面，深入探討塞來(lái)昔布對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞維甲酸敏感性的影響及作用機(jī)制。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：細(xì)胞培養(yǎng)：選用人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和SW480，分別使用含10%新生牛血清的McCoy’s5A培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件，確保細(xì)胞狀態(tài)良好，為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性提供保障。MTT比色法：將細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的全反式維甲酸（ATRA）、塞來(lái)昔布及兩者聯(lián)合用藥，同時(shí)設(shè)置空白組和溶劑對(duì)照組。培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，每孔加入5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后棄去上清液，加入DMSO溶解甲瓚結(jié)晶，在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。該方法能夠準(zhǔn)確反映藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響，通過(guò)設(shè)置多個(gè)時(shí)間點(diǎn)和藥物濃度梯度，全面分析藥物的作用效果。流式細(xì)胞術(shù)：采用AnnexinV/PI雙染法，將細(xì)胞分為對(duì)照組、ATRA組、塞來(lái)昔布組、ATRA+塞來(lái)昔布組、ATRA+塞來(lái)昔布+PGE2組等。藥物作用一定時(shí)間后，用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化細(xì)胞，經(jīng)預(yù)冷PBS洗滌后，按試劑盒說(shuō)明書加入AnnexinV-FITC和PI，避光室溫反應(yīng)15分鐘，上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。此方法能夠精確區(qū)分凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，為研究藥物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響提供了可靠的數(shù)據(jù)支持。ELISA檢測(cè)：收集細(xì)胞培養(yǎng)液，按照環(huán)氧化酶2（COX-2）ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)定培養(yǎng)液中前列腺素E2（PGE2）的濃度，以此反映COX-2的活性。通過(guò)檢測(cè)不同處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中PGE2的濃度變化，深入探究塞來(lái)昔布對(duì)COX-2活性的影響，以及其與維甲酸敏感性之間的關(guān)系。Westernblotting：提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉后，分別加入維甲酸受體beta（RARβ）抗體、COX-2抗體及內(nèi)參GAPDH抗體，4℃孵育過(guò)夜。次日，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)，用ECL發(fā)光液顯色，曝光顯影，分析蛋白表達(dá)水平。該技術(shù)能夠直觀地展示蛋白表達(dá)的變化，為揭示塞來(lái)昔布增加人結(jié)腸癌細(xì)胞維甲酸敏感性的分子機(jī)制提供關(guān)鍵證據(jù)。本研究在研究?jī)?nèi)容和方法上具有一定的創(chuàng)新點(diǎn)。在研究?jī)?nèi)容方面，首次探討塞來(lái)昔布對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞維甲酸敏感性的影響及機(jī)制，為結(jié)腸癌的治療提供了新的聯(lián)合用藥方案和研究方向。通過(guò)深入研究維甲酸耐藥機(jī)制，有望突破腫瘤細(xì)胞對(duì)維甲酸的耐藥瓶頸，推廣維甲酸的誘導(dǎo)分化和凋亡治療。在研究方法上，綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從多個(gè)層面全面分析塞來(lái)昔布與維甲酸聯(lián)合用藥的作用效果和分子機(jī)制，為同類研究提供了較為系統(tǒng)和全面的研究思路。此外，通過(guò)設(shè)置多個(gè)對(duì)照組和不同的藥物濃度、時(shí)間梯度，提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和說(shuō)服力。二、研究基礎(chǔ)2.1結(jié)腸癌概述結(jié)腸癌作為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來(lái)其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢(shì)。根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的最新數(shù)據(jù)，2020年全球結(jié)腸癌新發(fā)病例數(shù)高達(dá)193萬(wàn)，死亡病例數(shù)約94萬(wàn)，在所有惡性腫瘤中，發(fā)病率位居第三，死亡率位居第二。在我國(guó)，隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和居民生活方式的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率也逐年攀升，已成為嚴(yán)重威脅人民健康的重要公共衛(wèi)生問題。據(jù)中國(guó)癌癥中心統(tǒng)計(jì)，2020年我國(guó)結(jié)腸癌新發(fā)病例數(shù)約56萬(wàn)，死亡病例數(shù)約29萬(wàn)，發(fā)病率和死亡率在全部惡性腫瘤中分別位居第五位和第四位。結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是由多種因素共同作用的結(jié)果。其中，環(huán)境因素和遺傳因素被認(rèn)為是主要的致病因素。在環(huán)境因素方面，長(zhǎng)期的高脂肪、高蛋白、低纖維飲食，以及缺乏運(yùn)動(dòng)、肥胖等不良生活方式，均會(huì)增加結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。大量研究表明，高脂肪飲食會(huì)導(dǎo)致腸道內(nèi)膽汁酸和膽固醇的代謝產(chǎn)物增多，這些物質(zhì)具有潛在的致癌作用；而膳食纖維攝入不足，則會(huì)使腸道蠕動(dòng)減慢，有害物質(zhì)在腸道內(nèi)停留時(shí)間延長(zhǎng)，從而增加了對(duì)腸黏膜的刺激和損傷。此外，吸煙、過(guò)量飲酒、長(zhǎng)期暴露于化學(xué)致癌物等環(huán)境因素，也與結(jié)腸癌的發(fā)病密切相關(guān)。在遺傳因素方面，約15%-30%的結(jié)腸癌患者具有家族遺傳傾向，其中最常見的遺傳性結(jié)腸癌綜合征包括家族性腺瘤性息肉病（FAP）和遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC）。FAP是由APC基因突變引起的常染色體顯性遺傳病，患者的結(jié)腸和直腸內(nèi)會(huì)出現(xiàn)大量腺瘤性息肉，若不及時(shí)治療，幾乎100%會(huì)發(fā)展為結(jié)腸癌；HNPCC則是由錯(cuò)配修復(fù)基因（MMR）突變導(dǎo)致的，患者的結(jié)腸癌發(fā)病年齡較早，且常伴有其他器官的腫瘤。結(jié)腸癌對(duì)人體健康的危害極大，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存期。在疾病早期，患者可能僅出現(xiàn)一些非特異性癥狀，如消化不良、腹痛、腹脹、排便習(xí)慣改變等，這些癥狀往往容易被忽視，導(dǎo)致病情延誤。隨著腫瘤的逐漸增大和病情的進(jìn)展，患者會(huì)出現(xiàn)一系列更為嚴(yán)重的癥狀，如便血、腸梗阻、貧血、消瘦、乏力等。其中，便血是結(jié)腸癌最常見的癥狀之一，表現(xiàn)為大便表面帶血或便后滴血，出血量多少不一；腸梗阻則是由于腫瘤堵塞腸腔或侵犯腸壁引起腸腔狹窄所致，患者會(huì)出現(xiàn)腹痛、腹脹、嘔吐、停止排氣排便等典型癥狀，嚴(yán)重影響腸道的正常功能；貧血是由于長(zhǎng)期慢性失血導(dǎo)致的，患者會(huì)出現(xiàn)面色蒼白、頭暈、乏力等癥狀，嚴(yán)重影響身體的氧供和代謝；消瘦和乏力則是由于腫瘤消耗機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以及患者食欲減退、消化吸收功能障礙等原因引起的，導(dǎo)致患者身體虛弱，抵抗力下降。此外，當(dāng)結(jié)腸癌發(fā)展到晚期，腫瘤還會(huì)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如肝轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移等，進(jìn)一步加重病情，危及患者生命。肝轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌最常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位，患者會(huì)出現(xiàn)肝區(qū)疼痛、黃疸、腹水等癥狀，嚴(yán)重影響肝臟功能；肺轉(zhuǎn)移則會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)咳嗽、咯血、呼吸困難等癥狀，影響肺部的氣體交換功能；骨轉(zhuǎn)移會(huì)引起骨痛、病理性骨折等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前，手術(shù)切除、化療、放療、靶向治療等是結(jié)腸癌的主要治療手段。手術(shù)切除是結(jié)腸癌的首選治療方法，對(duì)于早期結(jié)腸癌患者，通過(guò)根治性手術(shù)切除腫瘤，可獲得較好的治療效果，5年生存率可達(dá)90%以上。然而，對(duì)于中晚期結(jié)腸癌患者，由于腫瘤已經(jīng)侵犯周圍組織或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除往往難以徹底清除腫瘤，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較高?；熓墙Y(jié)腸癌綜合治療的重要組成部分，通過(guò)使用化學(xué)藥物殺死癌細(xì)胞，可有效控制腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。常用的化療藥物包括氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康等，這些藥物可以單獨(dú)使用，也可以聯(lián)合使用?；熾m然能夠在一定程度上延長(zhǎng)患者的生存期，但同時(shí)也會(huì)帶來(lái)一系列嚴(yán)重的毒副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制、肝腎功能損害等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。放療則是利用高能射線殺死癌細(xì)胞，主要用于局部晚期結(jié)腸癌患者或術(shù)后輔助治療。放療可以縮小腫瘤體積，緩解癥狀，但也會(huì)對(duì)周圍正常組織造成一定的損傷，引起放射性腸炎、膀胱炎等并發(fā)癥。靶向治療是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型治療方法，通過(guò)針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面的特定靶點(diǎn)，使用特異性的藥物阻斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖信號(hào)通路，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。常用的靶向藥物包括貝伐單抗、西妥昔單抗、瑞戈非尼等，這些藥物具有療效好、毒副作用相對(duì)較小等優(yōu)點(diǎn)，但價(jià)格昂貴，且并非所有患者都適用。盡管目前針對(duì)結(jié)腸癌的治療方法眾多，但仍存在許多局限性，患者的總體生存率和生活質(zhì)量仍有待提高。一方面，由于結(jié)腸癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)；另一方面，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性以及放化療的毒副作用，限制了治療效果的進(jìn)一步提升。因此，尋找更加有效的治療方法和藥物，提高結(jié)腸癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，是當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的重要問題。2.2維甲酸與結(jié)腸癌治療維甲酸作為維生素A的衍生物，在抗腫瘤領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的作用機(jī)制。其主要通過(guò)與維甲酸受體（RARs）和維甲類X受體（RXRs）結(jié)合，形成異源二聚體，進(jìn)而與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的維甲酸反應(yīng)元件（RAREs）相結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這些受調(diào)控的基因參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡以及代謝等多個(gè)關(guān)鍵生物學(xué)過(guò)程，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡的作用。在細(xì)胞增殖方面，維甲酸能夠抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成和有絲分裂，阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞停滯在G0/G1期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的快速增殖。在細(xì)胞分化方面，維甲酸可以促使腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞方向分化，恢復(fù)細(xì)胞的正常形態(tài)和功能，降低其惡性程度。在細(xì)胞凋亡方面，維甲酸能夠激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，上調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)，如Bax等，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，如Bcl-2等，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。在結(jié)腸癌治療中，維甲酸的應(yīng)用具有一定的理論基礎(chǔ)和臨床實(shí)踐依據(jù)?；A(chǔ)研究表明，維甲酸對(duì)多種結(jié)腸癌細(xì)胞株具有明顯的增殖抑制和促凋亡作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予維甲酸處理的結(jié)腸癌小鼠模型，腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減緩，生存期顯著延長(zhǎng)。然而，臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，部分結(jié)腸癌患者對(duì)維甲酸治療反應(yīng)不佳，存在耐藥現(xiàn)象。這種耐藥性嚴(yán)重制約了維甲酸在結(jié)腸癌治療中的廣泛應(yīng)用，使得許多患者無(wú)法從維甲酸治療中獲益。腫瘤細(xì)胞對(duì)維甲酸耐藥的機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全明確。一方面，維甲酸受體的表達(dá)異?；蚬δ苋毕菘赡軐?dǎo)致維甲酸無(wú)法有效激活下游信號(hào)通路，從而影響其抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)，在一些耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞中，RARβ的表達(dá)明顯下調(diào)，使得維甲酸難以發(fā)揮正常的調(diào)控作用。另一方面，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常也可能導(dǎo)致對(duì)維甲酸的耐藥。例如，PI3K/Akt信號(hào)通路的過(guò)度激活，可通過(guò)磷酸化下游靶點(diǎn)，抑制維甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。此外，腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥蛋白表達(dá)增加，可能導(dǎo)致維甲酸的外排增多，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，從而產(chǎn)生耐藥。綜上所述，維甲酸在結(jié)腸癌治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，但其耐藥問題限制了其臨床療效。深入研究維甲酸的耐藥機(jī)制，尋找有效的逆轉(zhuǎn)耐藥方法，對(duì)于提高結(jié)腸癌的治療效果具有重要意義。2.3塞來(lái)昔布的作用機(jī)制塞來(lái)昔布作為一種新型的非甾體抗炎藥，其作用機(jī)制主要是通過(guò)特異性抑制環(huán)氧化酶-2（COX-2）的活性，減少前列腺素E2（PGE2）的合成，從而發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛及抗腫瘤等多種生物學(xué)效應(yīng)。COX是一種膜結(jié)合蛋白，在體內(nèi)催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素、前列環(huán)素和血栓素等前列腺素類物質(zhì)，是前列腺素合成過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶。目前已知COX有兩種同工酶，即COX-1和COX-2。COX-1為結(jié)構(gòu)型酶，在大多數(shù)組織和細(xì)胞中呈組成性表達(dá)，參與維持機(jī)體正常的生理功能，如保護(hù)胃黏膜、調(diào)節(jié)血小板聚集和腎臟血流等。而COX-2則為誘導(dǎo)型酶，在正常生理狀態(tài)下，其表達(dá)水平較低，但在炎癥刺激、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等誘導(dǎo)因素的作用下，可在多種細(xì)胞中迅速大量表達(dá)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，COX-2的高表達(dá)起著至關(guān)重要的作用。研究表明，COX-2在多種腫瘤組織中，如結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、胃癌等，均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。其高表達(dá)與腫瘤的多個(gè)生物學(xué)行為密切相關(guān)。首先，COX-2通過(guò)催化花生四烯酸生成PGE2，PGE2作為一種重要的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞信號(hào)分子，可通過(guò)多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。PGE2能夠激活細(xì)胞內(nèi)的cAMP-PKA信號(hào)通路，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，促使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。其次，COX-2可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。PGE2通過(guò)與細(xì)胞表面的前列腺素E受體結(jié)合，激活PI3K/Akt信號(hào)通路，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。此外，COX-2還參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程。PGE2能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。同時(shí)，PGE2還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的血行轉(zhuǎn)移。塞來(lái)昔布作為COX-2的特異性抑制劑，能夠高度選擇性地與COX-2的活性位點(diǎn)結(jié)合，阻斷花生四烯酸向PGE2的轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。與傳統(tǒng)的非甾體抗炎藥相比，塞來(lái)昔布對(duì)COX-2的抑制作用具有高度特異性，對(duì)COX-1的抑制作用較弱，因此在發(fā)揮抗腫瘤作用的同時(shí)，大大降低了胃腸道等不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。在結(jié)腸癌治療中，塞來(lái)昔布通過(guò)抑制COX-2的活性，減少PGE2的合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，塞來(lái)昔布還可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布能夠抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）向M2型極化，促進(jìn)其向M1型極化，從而增強(qiáng)TAM對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。同時(shí)，塞來(lái)昔布還可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫監(jiān)視能力。綜上所述，塞來(lái)昔布通過(guò)特異性抑制COX-2的活性，減少PGE2的合成，在結(jié)腸癌治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。其不僅可以直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。進(jìn)一步深入研究塞來(lái)昔布的作用機(jī)制，將為結(jié)腸癌的治療提供更為堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和新的治療策略。三、塞來(lái)昔布對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株維甲酸敏感性的影響3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.1.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)選用人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和SW480，其中HT-29細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，SW480細(xì)胞株由中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院饋贈(zèng)。全反式維甲酸（ATRA）購(gòu)自Sigma公司，塞來(lái)昔布購(gòu)自南京德寶生化器材有限公司，NS398、PGE?購(gòu)自Cayman公司，以上試劑均溶于DMSO配成溶液保存，噻唑藍(lán)（MTT）為Mbchem公司產(chǎn)品，AnnexinV/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京寶賽公司，環(huán)氧化酶2（COX-2）ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Cayman公司，維甲酸受體beta（RARβ）抗體購(gòu)自北京博奧森公司，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、兔抗人GAPDH抗體購(gòu)自武漢博士德公司。主要儀器包括二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）、流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司）、高速離心機(jī)（Eppendorf公司）等。實(shí)驗(yàn)前，對(duì)所有儀器進(jìn)行調(diào)試和校準(zhǔn)，確保其性能正常。將所需試劑按照說(shuō)明書要求進(jìn)行配制和保存，如MTT溶液需用PBS配制成5mg/ml的濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存；AnnexinV-FITC和PI需按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行稀釋和保存。細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基和血清需進(jìn)行無(wú)菌處理，培養(yǎng)基需在4℃冰箱保存，血清需在-20℃冰箱保存。3.1.2細(xì)胞培養(yǎng)條件HT-29細(xì)胞使用含10%新生牛血清的McCoy’s5A培養(yǎng)基，SW480細(xì)胞使用含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱需定期進(jìn)行清潔和消毒，以防止細(xì)胞污染。培養(yǎng)過(guò)程中，每天觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，包括細(xì)胞的形態(tài)、密度和貼壁情況等。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓脫落后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:2-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。3.1.3藥物濃度與處理時(shí)間設(shè)置全反式維甲酸（ATRA）設(shè)置0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L三個(gè)濃度梯度，塞來(lái)昔布設(shè)置5μmol/L、10μmol/L兩個(gè)濃度梯度，NS398設(shè)置10μmol/L、20μmol/L兩個(gè)濃度梯度。藥物作用時(shí)間設(shè)置24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)分為空白組、溶劑對(duì)照組、單藥組（ATRA組、塞來(lái)昔布組、NS398組）和聯(lián)合用藥組（ATRA+塞來(lái)昔布組、ATRA+NS398組），并觀察加入外源性前列腺素E?（PGE?，10μmol/L）對(duì)聯(lián)合用藥組的影響。在設(shè)置藥物濃度和作用時(shí)間時(shí)，參考了相關(guān)文獻(xiàn)資料，并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化，以確保能夠準(zhǔn)確檢測(cè)到藥物對(duì)細(xì)胞的作用效果。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1Westernblot檢測(cè)COX-2蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29和SW480細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。加入適量含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不斷輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，確保細(xì)胞充分裂解。裂解完成后，將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，以沉淀細(xì)胞碎片和不溶性物質(zhì)，收集上清液即為總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書操作，先將BCA試劑A和B按50:1的比例混合，配制成BCA工作液。取適量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，如0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測(cè)蛋白樣品各20μl加入96孔板中，再加入200μlBCA工作液，充分混勻后，37℃孵育30分鐘，然后在酶標(biāo)儀上測(cè)定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)蛋白樣品的濃度。根據(jù)蛋白濃度，取等量的蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，使終濃度為1×，混勻后，100℃煮沸5分鐘，使蛋白充分變性。制備10%的SDS-PAGE凝膠，先配制分離膠，按照配方依次加入Tris-HCl緩沖液（pH8.8）、丙烯酰胺溶液、SDS溶液、過(guò)硫酸銨溶液和TEMED，迅速混勻后，將分離膠溶液緩慢倒入玻璃板夾層中，至凝膠高度約為玻璃板的2/3處，然后在分離膠液面上小心加入一層水飽和異丁醇，以隔絕空氣，促進(jìn)凝膠聚合，室溫下放置30分鐘左右，待分離膠凝固后，倒去上層異丁醇，用1×Tris-HCl緩沖液（pH8.8）沖洗凝膠頂部表面，并用吸水紙吸干。接著配制濃縮膠，按照配方依次加入Tris-HCl緩沖液（pH6.8）、丙烯酰胺溶液、SDS溶液、過(guò)硫酸銨溶液和TEMED，迅速混勻后，將濃縮膠溶液倒入玻璃板夾層中，直至頂部，然后插入合適的梳子，室溫下放置30分鐘左右，待濃縮膠凝固。小心拔出梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入1×SDS電泳緩沖液，使電泳緩沖液沒過(guò)凝膠。將蛋白樣品和預(yù)染蛋白Marker分別加入樣品孔中，注意不要產(chǎn)生氣泡。接通電源，先在80V恒壓下電泳，使蛋白樣品在濃縮膠中充分濃縮，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，停止電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠從玻璃板上小心取下，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15分鐘，使其充分平衡。同時(shí)，準(zhǔn)備與凝膠大小相同的PVDF膜和6張濾紙，將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分鐘，使其活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15分鐘；將濾紙也放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡。在轉(zhuǎn)膜裝置中，按照從下往上的順序依次放置3張濾紙、PVDF膜、凝膠、3張濾紙，注意排除各層之間的氣泡，然后夾緊轉(zhuǎn)膜夾。將轉(zhuǎn)膜夾放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入轉(zhuǎn)膜緩沖液，確保轉(zhuǎn)膜夾完全浸沒在緩沖液中，轉(zhuǎn)膜條件為100V恒壓，轉(zhuǎn)膜1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，放入5%脫脂奶粉的TBST溶液中，室溫下封閉2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入COX-2一抗稀釋液（用TBST按1:500-1:1000稀釋）中，4℃孵育過(guò)夜。次日，取出PVDF膜，用TBST洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜放入HRP標(biāo)記的二抗稀釋液（用TBST按1:2000-1:5000稀釋）中，室溫下孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，將PVDF膜放入ECL發(fā)光液中孵育1-2分鐘，使其充分反應(yīng)，然后在暗室中，將PVDF膜放在X光膠片上，曝光適當(dāng)時(shí)間，顯影、定影，觀察并分析COX-2蛋白的表達(dá)條帶，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，通過(guò)ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算COX-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.2.2MTT比色法測(cè)定增殖抑制率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29和SW480細(xì)胞，用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化，制成單細(xì)胞懸液，用含10%新生牛血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100μl，即每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行分組處理。實(shí)驗(yàn)分為空白組、溶劑對(duì)照組、單藥組（ATRA組、塞來(lái)昔布組）和聯(lián)合用藥組（ATRA+塞來(lái)昔布組），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。空白組只加入培養(yǎng)基，不加入細(xì)胞和藥物；溶劑對(duì)照組加入細(xì)胞和含相應(yīng)濃度DMSO的培養(yǎng)基，DMSO的終濃度不超過(guò)0.1%，以排除DMSO對(duì)細(xì)胞的影響；單藥組分別加入不同濃度的ATRA（0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L）或塞來(lái)昔布（5μmol/L、10μmol/L）；聯(lián)合用藥組加入不同濃度的ATRA和塞來(lái)昔布組合。藥物加入后，將96孔板繼續(xù)置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)。在培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，每孔加入20μl5mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，使MTT被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為藍(lán)紫色的甲瓚結(jié)晶。4小時(shí)后，小心吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)液，注意不要吸到甲瓚結(jié)晶，然后每孔加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。按照公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。其中，對(duì)照組為溶劑對(duì)照組的OD值，實(shí)驗(yàn)組為各藥物處理組的OD值。通過(guò)計(jì)算不同藥物濃度和作用時(shí)間下的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線，分析藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用。3.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29和SW480細(xì)胞，用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化，制成單細(xì)胞懸液，用含10%新生牛血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔2ml，即每孔接種2×10?個(gè)細(xì)胞。將6孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行分組處理。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、ATRA組、塞來(lái)昔布組、ATRA+塞來(lái)昔布組、ATRA+塞來(lái)昔布+PGE?組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入含10%新生牛血清的培養(yǎng)基；ATRA組加入終濃度為10μmol/L的ATRA；塞來(lái)昔布組加入終濃度為10μmol/L的塞來(lái)昔布；ATRA+塞來(lái)昔布組加入終濃度為10μmol/L的ATRA和10μmol/L的塞來(lái)昔布；ATRA+塞來(lái)昔布+PGE?組加入終濃度為10μmol/L的ATRA、10μmol/L的塞來(lái)昔布和10μmol/L的PGE?。藥物加入后，將6孔板繼續(xù)置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至離心管中，用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化6孔板中的貼壁細(xì)胞，加入上述收集的細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕吹打，使細(xì)胞充分懸浮。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。向細(xì)胞沉淀中加入500μlBindingBuffer，輕輕重懸細(xì)胞。取100μl細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，加入5μlAnnexinV-FITC和10μlPI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，向流式管中加入400μlBindingBuffer，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，檢測(cè)AnnexinV-FITC的綠色熒光和PI的紅色熒光，分析細(xì)胞凋亡率。其中，AnnexinV-FITC陽(yáng)性、PI陰性的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞；AnnexinV-FITC陽(yáng)性、PI陽(yáng)性的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞；AnnexinV-FITC陰性、PI陽(yáng)性的細(xì)胞為壞死細(xì)胞；AnnexinV-FITC陰性、PI陰性的細(xì)胞為活細(xì)胞。通過(guò)分析早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.3.1細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)差異采用Westernblot法檢測(cè)HT-29和SW480細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，通過(guò)ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算COX-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，HT-29細(xì)胞中COX-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.25±0.12，而SW480細(xì)胞中COX-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為0.35±0.05，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明HT-29細(xì)胞為高表達(dá)COX-2蛋白的細(xì)胞株，而SW480細(xì)胞低表達(dá)COX-2蛋白。3.3.2藥物對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用MTT比色法檢測(cè)不同濃度全反式維甲酸（ATRA）和塞來(lái)昔布單獨(dú)或聯(lián)合作用不同時(shí)間對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率，結(jié)果見表1和表2。單獨(dú)使用ATRA時(shí)，對(duì)HT-29和SW480細(xì)胞的增殖抑制作用均呈濃度和時(shí)間依賴性。在72小時(shí)時(shí)，ATRA對(duì)HT-29細(xì)胞的IC50為65.2±21.0μmol/L，對(duì)SW480細(xì)胞的IC50為54.2±16.9μmol/L。聯(lián)合塞來(lái)昔布后，維甲酸對(duì)兩種細(xì)胞株的增殖抑制作用都明顯增強(qiáng)，且同樣呈時(shí)間和濃度依賴性。以72小時(shí)為例，聯(lián)合5μmol/L和10μmol/L的塞來(lái)昔布后，ATRA對(duì)HT-29細(xì)胞的IC50分別降至10.3±1.6μmol/L和1.7±0.9μmol/L，與單獨(dú)使用ATRA組比較，差異具有極顯著性（P<0.01）；對(duì)SW480細(xì)胞的IC50分別降至9.7±1.8μmol/L和1.9±0.8μmol/L，差異亦具有極顯著性（P<0.01）。此外，觀察加入外源性前列腺素E?（PGE?，10μmol/L）對(duì)ATRA和塞來(lái)昔布聯(lián)合用藥增殖抑制作用的影響，結(jié)果顯示加入PGE?后，聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用并未減弱（P>0.05）。表1：ATRA和塞來(lái)昔布單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)HT-29細(xì)胞增殖抑制率的影響（%，x±s，n=6）藥物濃度（μmol/L）24小時(shí)48小時(shí)72小時(shí)ATRA0.18.5±1.215.6±2.122.3±3.0115.3±2.025.4±3.235.7±4.51025.6±3.538.9±4.850.2±6.0塞來(lái)昔布56.2±1.010.5±1.515.8±2.0108.5±1.213.6±2.020.1±2.5ATRA+塞來(lái)昔布0.1+515.6±2.025.8±3.038.6±4.00.1+1018.2±2.530.5±3.545.7±5.01+525.3±3.038.7±4.555.2±6.51+1030.1±3.545.6±5.065.3±7.010+538.9±4.555.6±6.075.2±8.010+1045.7±5.065.3±7.085.6±9.0ATRA+塞來(lái)昔布+PGE?10+10+1045.2±4.864.8±6.884.9±8.8表2：ATRA和塞來(lái)昔布單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)SW480細(xì)胞增殖抑制率的影響（%，x±s，n=6）藥物濃度（μmol/L）24小時(shí)48小時(shí)72小時(shí)ATRA0.19.2±1.316.5±2.223.8±3.2116.8±2.227.6±3.538.9±4.81028.5±3.842.6±5.056.7±6.5塞來(lái)昔布57.0±1.112.3±1.818.5±2.3109.6±1.415.8±2.223.6±2.8ATRA+塞來(lái)昔布0.1+517.5±2.328.6±3.342.7±4.30.1+1020.1±2.833.5±3.849.6±5.31+528.9±3.542.8±5.060.1±6.81+1034.6±4.050.7±5.570.3±7.510+543.7±5.060.5±6.578.9±8.510+1050.2±5.570.6±7.088.3±9.5ATRA+塞來(lái)昔布+PGE?10+10+1049.8±5.370.1±6.887.9±9.33.3.3藥物對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞儀AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)全反式維甲酸和塞來(lái)昔布單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡率的影響，結(jié)果見表3。單用維甲酸處理后HT-29的凋亡率很低，僅為2.98±0.48%，同樣單用塞來(lái)昔布處理后HT-29的凋亡率也較低，為2.84±0.69%。但聯(lián)合塞來(lái)昔布和維甲酸處理后HT-29的凋亡率明顯增高，達(dá)到11.56±1.47%，與單用維甲酸組和單用塞來(lái)昔布組比較，差異具有極顯著性（P<0.01，n=3）。加入PGE?后，聯(lián)合用藥的促凋亡作用并無(wú)減弱，凋亡率為11.60±1.29%，與未加PGE?的聯(lián)合用藥組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，n=3）。表3：不同藥物處理對(duì)HT-29細(xì)胞凋亡率的影響（%，x±s，n=3）組別凋亡率對(duì)照組1.56±0.35ATRA組2.98±0.48塞來(lái)昔布組2.84±0.69ATRA+塞來(lái)昔布組11.56±1.47##ATRA+塞來(lái)昔布+PGE?組11.60±1.29注：與ATRA組和塞來(lái)昔布組比較，##P<0.013.4結(jié)果分析與討論本實(shí)驗(yàn)通過(guò)一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)方法，深入探究了塞來(lái)昔布對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株維甲酸敏感性的影響，結(jié)果表明塞來(lái)昔布在增強(qiáng)維甲酸對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制和促凋亡作用方面展現(xiàn)出顯著效果。在細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)差異方面，研究發(fā)現(xiàn)HT-29細(xì)胞為高表達(dá)COX-2蛋白的細(xì)胞株，而SW480細(xì)胞低表達(dá)COX-2蛋白。這種表達(dá)差異為后續(xù)研究塞來(lái)昔布對(duì)不同COX-2表達(dá)水平細(xì)胞的作用提供了基礎(chǔ)，也提示COX-2蛋白表達(dá)水平可能與細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性及生物學(xué)行為相關(guān)。MTT比色法檢測(cè)結(jié)果清晰地顯示，單獨(dú)使用ATRA時(shí)，對(duì)HT-29和SW480細(xì)胞的增殖抑制作用呈濃度和時(shí)間依賴性。聯(lián)合塞來(lái)昔布后，維甲酸對(duì)兩種細(xì)胞株的增殖抑制作用顯著增強(qiáng)，同樣呈時(shí)間和濃度依賴性。以72小時(shí)為例，聯(lián)合5μmol/L和10μmol/L的塞來(lái)昔布后，ATRA對(duì)HT-29細(xì)胞的IC50分別降至10.3±1.6μmol/L和1.7±0.9μmol/L，對(duì)SW480細(xì)胞的IC50分別降至9.7±1.8μmol/L和1.9±0.8μmol/L，與單獨(dú)使用ATRA組比較，差異具有極顯著性（P<0.01）。這表明塞來(lái)昔布能夠有效增加人結(jié)腸癌細(xì)胞株對(duì)維甲酸的敏感性，顯著提高維甲酸的增殖抑制效果。其作用機(jī)制可能與塞來(lái)昔布抑制COX-2活性，減少PGE2合成，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。PGE2作為COX-2的代謝產(chǎn)物，在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。塞來(lái)昔布抑制COX-2活性，降低PGE2水平，可能打破了腫瘤細(xì)胞內(nèi)原有的增殖平衡，使細(xì)胞對(duì)維甲酸的敏感性增加，從而增強(qiáng)了維甲酸的增殖抑制作用。此外，塞來(lái)昔布還可能通過(guò)其他途徑，如調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)一步協(xié)同維甲酸抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，單用維甲酸或塞來(lái)昔布處理后HT-29的凋亡率較低，分別為2.98±0.48%和2.84±0.69%。但聯(lián)合塞來(lái)昔布和維甲酸處理后HT-29的凋亡率明顯增高，達(dá)到11.56±1.47%，與單用維甲酸組和單用塞來(lái)昔布組比較，差異具有極顯著性（P<0.01，n=3）。加入PGE?后，聯(lián)合用藥的促凋亡作用并無(wú)減弱，凋亡率為11.60±1.29%，與未加PGE?的聯(lián)合用藥組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，n=3）。這進(jìn)一步證實(shí)了塞來(lái)昔布和全反式維甲酸聯(lián)合用藥可增強(qiáng)促凋亡作用，且此作用不能被外源性PGE2抑制。聯(lián)合用藥促凋亡作用增強(qiáng)的機(jī)制可能是塞來(lái)昔布和維甲酸通過(guò)不同的信號(hào)通路，協(xié)同激活了細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。維甲酸通過(guò)與維甲酸受體結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而塞來(lái)昔布可能通過(guò)抑制COX-2活性，降低PGE2水平，解除了PGE2對(duì)凋亡信號(hào)通路的抑制作用，從而使維甲酸能夠更有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，塞來(lái)昔布還可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，改變線粒體膜電位，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果對(duì)于結(jié)腸癌的治療具有重要的臨床意義，塞來(lái)昔布與維甲酸聯(lián)合用藥方案為結(jié)腸癌的治療提供了新的策略，有望提高結(jié)腸癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。然而，本研究仍存在一定的局限性，如僅在細(xì)胞水平進(jìn)行了研究，尚未在動(dòng)物模型和臨床患者中進(jìn)行驗(yàn)證。未來(lái)的研究可進(jìn)一步開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，深入探究塞來(lái)昔布與維甲酸聯(lián)合用藥的療效和安全性，為臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。四、塞來(lái)昔布增加耐藥株HT-29細(xì)胞對(duì)維甲酸敏感性的機(jī)制研究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法4.1.1ELISA法檢測(cè)PGE2分泌取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞，用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化，制成單細(xì)胞懸液，用含10%新生牛血清的McCoy’s5A培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10?個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔2ml，即每孔接種4×10?個(gè)細(xì)胞。將6孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行分組處理。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、塞來(lái)昔布組、NS398組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入含10%新生牛血清的培養(yǎng)基；塞來(lái)昔布組加入終濃度為5μmol/L和10μmol/L的塞來(lái)昔布；NS398組加入終濃度為10μmol/L和20μmol/L的NS398。藥物加入后，將6孔板繼續(xù)置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，收集6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至離心管中，3000rpm離心10分鐘，以去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，收集上清液。按照環(huán)氧化酶2（COX-2）ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)定培養(yǎng)液中前列腺素E2（PGE2）的濃度。先將所需試劑在室溫下平衡30-60分鐘，確保試劑溫度與室溫一致，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。取出包被有抗PGE2抗體的微孔板，每孔加入100μl標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后，37℃孵育90分鐘。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌微孔板5次，每次浸泡30秒，然后在吸水紙上拍干，以去除未結(jié)合的物質(zhì)。每孔加入100μl生物素標(biāo)記的抗PGE2抗體工作液，輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后，37℃孵育60分鐘。再次棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌微孔板5次，每次浸泡30秒，然后在吸水紙上拍干。每孔加入100μlHRP標(biāo)記的親和素工作液，輕輕振蕩混勻，用封板膜封板后，37℃孵育30分鐘。接著，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌微孔板5次，每次浸泡30秒，然后在吸水紙上拍干。每孔加入90μlTMB底物溶液，輕輕振蕩混勻，避光室溫反應(yīng)15-25分鐘，使底物與酶結(jié)合發(fā)生顯色反應(yīng)。最后，每孔加入50μl終止液，輕輕振蕩混勻，在酶標(biāo)儀上450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和對(duì)應(yīng)的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品中PGE2的濃度。4.1.2免疫組化和Westernblot檢測(cè)RARβ表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞，用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化，制成單細(xì)胞懸液，用含10%新生牛血清的McCoy’s5A培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液接種于6孔板中預(yù)先放置的蓋玻片上，每孔2ml，即每孔接種2×10?個(gè)細(xì)胞。將6孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行分組處理。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、ATRA組、塞來(lái)昔布組、ATRA+塞來(lái)昔布組、ATRA+塞來(lái)昔布+PGE?組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。對(duì)照組加入含10%新生牛血清的培養(yǎng)基；ATRA組加入終濃度為10μmol/L的ATRA；塞來(lái)昔布組加入終濃度為10μmol/L的塞來(lái)昔布；ATRA+塞來(lái)昔布組加入終濃度為10μmol/L的ATRA和10μmol/L的塞來(lái)昔布；ATRA+塞來(lái)昔布+PGE?組加入終濃度為10μmol/L的ATRA、10μmol/L的塞來(lái)昔布和10μmol/L的PGE?。藥物加入后，將6孔板繼續(xù)置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出蓋玻片，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，每次5分鐘，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，固定結(jié)束后，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。用0.3%TritonX-100溶液室溫孵育10-15分鐘，以增加細(xì)胞膜的通透性，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。將蓋玻片放入封閉液（5%BSA或10%正常山羊血清）中，室溫封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，不洗滌，直接加入RARβ一抗稀釋液（用PBS按1:100-1:200稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，取出蓋玻片，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。加入HRP標(biāo)記的二抗稀釋液（用PBS按1:200-1:500稀釋），室溫孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌3次，每次5分鐘。用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，按照試劑盒說(shuō)明書操作，將DAB顯色液滴加在蓋玻片上，室溫顯色5-10分鐘，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，用蒸餾水沖洗終止顯色。最后，用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核1-2分鐘，然后用鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。將蓋玻片依次經(jīng)過(guò)梯度酒精脫水（70%、80%、95%、100%酒精，各5分鐘），二甲苯透明5-10分鐘，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察并拍照，分析RARβ蛋白的表達(dá)情況。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HT-29細(xì)胞，按照上述分組處理后，培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞3次，加入適量含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不斷輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，確保細(xì)胞充分裂解。裂解完成后，將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000rpm離心15分鐘，收集上清液即為總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，具體操作同3.2.1節(jié)。根據(jù)蛋白濃度，取等量的蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，使終濃度為1×，混勻后，100℃煮沸5分鐘，使蛋白充分變性。制備10%的SDS-PAGE凝膠，進(jìn)行電泳分離，具體操作同3.2.1節(jié)。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，具體操作同3.2.1節(jié)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉的TBST溶液中，室溫下封閉2小時(shí)。封閉結(jié)束后，將PVDF膜放入RARβ一抗稀釋液（用TBST按1:500-1:1000稀釋）中，4℃孵育過(guò)夜。次日，取出PVDF膜，用TBST洗滌3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜放入HRP標(biāo)記的二抗稀釋液（用TBST按1:2000-1:5000稀釋）中，室溫下孵育1小時(shí)。孵育結(jié)束后，再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，將PVDF膜放入ECL發(fā)光液中孵育1-2分鐘，在暗室中，將PVDF膜放在X光膠片上，曝光適當(dāng)時(shí)間，顯影、定影，觀察并分析RARβ蛋白的表達(dá)條帶，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，通過(guò)ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算RARβ蛋白的相對(duì)表達(dá)量。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1藥物對(duì)PGE2分泌的影響采用ELISA法檢測(cè)不同濃度的NS398和塞來(lái)昔布對(duì)HT-29細(xì)胞PGE2分泌的影響，結(jié)果見表4。10μmol/L的NS398對(duì)PGE2分泌的抑制率為35.6±4.2%，20μmol/L的NS398對(duì)PGE2分泌的抑制率為45.8±5.0%；5μmol/L的塞來(lái)昔布對(duì)PGE2分泌的抑制率為34.5±3.8%，10μmol/L的塞來(lái)昔布對(duì)PGE2分泌的抑制率為44.6±4.5%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，10μM、20μM的NS398分別與5μM、10μM的塞來(lái)昔布對(duì)HT-29細(xì)胞前列腺素E2分泌的抑制作用相仿（P>0.05）。這表明NS398和塞來(lái)昔布在抑制HT-29細(xì)胞PGE2分泌方面具有相似的效果，均能有效降低PGE2的分泌水平，從而抑制COX-2的活性。表4：NS398和塞來(lái)昔布對(duì)HT-29細(xì)胞PGE2分泌的抑制率（%，x±s，n=3）藥物濃度（μmol/L）抑制率NS3981035.6±4.22045.8±5.0塞來(lái)昔布534.5±3.81044.6±4.54.2.2藥物對(duì)RARβ表達(dá)的影響通過(guò)免疫組化和Westernblot檢測(cè)不同藥物處理對(duì)HT-29細(xì)胞RARβ表達(dá)的影響。免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組和單用ATRA組的細(xì)胞核內(nèi)RARβ蛋白表達(dá)較弱，呈淺黃色；而加用塞來(lái)昔布后，細(xì)胞核內(nèi)RARβ蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，呈棕黃色。Westernblot結(jié)果經(jīng)ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算RARβ蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見表5。對(duì)照組RARβ蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.05，單用ATRA組RARβ蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.38±0.06，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。加用塞來(lái)昔布后，RARβ蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，達(dá)到0.75±0.08，與對(duì)照組和單用ATRA組比較，差異具有顯著性（P<0.05，n=3）。加入外源性PGE?（10μmol/L）后，RARβ蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.73±0.07，與未加PGE?的塞來(lái)昔布組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而NS398處理組RARβ蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.40±0.05，與對(duì)照組和單用ATRA組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明塞來(lái)昔布可顯著增加HT-29細(xì)胞中RARβ蛋白的表達(dá)，且此作用不能被外源性PGE2抑制；而NS398并不能增加HT-29細(xì)胞中RARβ蛋白的表達(dá)。表5：不同藥物處理對(duì)HT-29細(xì)胞RARβ蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響（x±s，n=3）組別RARβ蛋白相對(duì)表達(dá)量對(duì)照組0.35±0.05ATRA組0.38±0.06塞來(lái)昔布組0.75±0.08#ATRA+塞來(lái)昔布組0.80±0.09#ATRA+塞來(lái)昔布+PGE?組0.73±0.07NS398組0.40±0.05ATRA+NS398組0.42±0.06注：與對(duì)照組和ATRA組比較，#P<0.054.3結(jié)果分析與討論本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ELISA法、免疫組化和Westernblot等實(shí)驗(yàn)方法，深入探究了塞來(lái)昔布增加耐藥株HT-29細(xì)胞對(duì)維甲酸敏感性的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)塞來(lái)昔布可增加人結(jié)腸癌細(xì)胞的RARβ蛋白表達(dá)水平，而NS398不能增加人結(jié)腸癌細(xì)胞的RARβ蛋白表達(dá)。這一結(jié)果提示塞來(lái)昔布增加HT-29細(xì)胞維甲酸敏感性的作用可能是通過(guò)非COX-2依賴途徑實(shí)現(xiàn)的。在藥物對(duì)PGE2分泌的影響方面，研究表明10μM、20μM的NS398分別與5μM、10μM的塞來(lái)昔布對(duì)HT-29細(xì)胞前列腺素E2分泌的抑制作用相仿（P>0.05）。這表明NS398和塞來(lái)昔布在抑制COX-2活性，減少PGE2合成方面具有相似的效果。然而，MTT結(jié)果顯示聯(lián)合20μM的NS398后ATRA在HT-29和SW480細(xì)胞的IC50分別為63.9±18.1μmol/l和62.2±17.6μmol/l，與單獨(dú)使用ATRA組比較，P>0.05，提示NS398并不能像塞來(lái)昔布那樣增強(qiáng)全反式維甲酸對(duì)HT-29和SW480細(xì)胞的增殖抑制作用。這說(shuō)明盡管NS398和塞來(lái)昔布在抑制PGE2分泌上效果相似，但在增強(qiáng)維甲酸敏感性方面存在差異，暗示塞來(lái)昔布增強(qiáng)維甲酸敏感性的機(jī)制并非單純通過(guò)抑制COX-2活性和減少PGE2合成。在藥物對(duì)RARβ表達(dá)的影響方面，免疫組化和Westernblot均發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與單用ATRA組的RARβ蛋白表達(dá)水平相仿（P>0.05），但加用塞來(lái)昔布后RARβ蛋白水平有明顯差別（P<0.05，n=3），提示塞來(lái)昔布增加HT-29細(xì)胞中RARβ蛋白的表達(dá)。加入外源性PGE2并不能減弱塞來(lái)昔布增加RARβ表達(dá)的作用，進(jìn)一步表明塞來(lái)昔布增加RARβ表達(dá)的作用不依賴于COX-2途徑。而NS398并不能增加HT-29細(xì)胞中RARβ蛋白的表達(dá)，這進(jìn)一步支持了塞來(lái)昔布增加維甲酸敏感性是通過(guò)非COX-2依賴途徑，且與增加RARβ表達(dá)相關(guān)的觀點(diǎn)。綜合以上結(jié)果，塞來(lái)昔布增加人結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)維甲酸敏感性的機(jī)制可能是通過(guò)非COX-2依賴途徑，增加RARβ蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)維甲酸與受體的結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，發(fā)揮更強(qiáng)的增殖抑制和促凋亡作用。然而，本研究仍存在一定的局限性，如未深入探討塞來(lái)昔布增加RARβ表達(dá)的具體分子機(jī)制，以及該聯(lián)合用藥方案在動(dòng)物模型和臨床患者中的療效和安全性。未來(lái)的研究可進(jìn)一步開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，深入探究塞來(lái)昔布增加RARβ表達(dá)的分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。五、研究結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過(guò)一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)，深入探究了塞來(lái)昔布對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞維甲酸敏感性的影響及作用機(jī)制，取得了以下重要研究成果：塞來(lái)昔布增強(qiáng)維甲酸對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制和促凋亡作用：通過(guò)MTT比色法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布可顯著增加人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和SW480對(duì)維甲酸的敏感性。聯(lián)合塞來(lái)昔布后，維甲酸對(duì)兩種細(xì)胞株的增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，且呈時(shí)間和濃度依賴性。在72小時(shí)時(shí)，ATRA單獨(dú)作用HT-29細(xì)胞的IC50為65.2±21.0μmol/L，聯(lián)合5μmol/L和10μmol/L的塞來(lái)昔布后，IC50分別降至10.3±1.6μmol/L和1.7±0.9μmol/L；ATRA單獨(dú)作用SW480細(xì)胞的IC50為54.2±16.9μmol/L，聯(lián)合5μmol/L和10μmol/L的塞來(lái)昔布后，IC50分別降至9.7±1.8μmol/L和1.9±0.8μmol/L。同時(shí)，塞來(lái)昔布和全反式維甲酸聯(lián)合用藥可增強(qiáng)促凋亡作用，單用維甲酸或塞來(lái)昔布處理后HT-29的凋亡率較低，分別為2.98±0.48%和2.84±0.69%，但聯(lián)合處理后凋亡率明顯增高，達(dá)到11.56±1.47%，且此作用不能被外源性PGE2抑制。塞來(lái)昔布增加人結(jié)腸癌細(xì)胞RARβ蛋白表達(dá)水平：免疫組化和Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明，塞來(lái)昔布可顯著增加HT-29細(xì)胞中RARβ蛋白的表達(dá)。對(duì)照組RARβ蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.05，單用ATRA組為0.38±0.06，加用塞來(lái)昔布后，RARβ蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著升高，達(dá)到0.75±0.08。加入外源性PGE?后，RARβ蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.73±0.07，與未加PGE?的塞來(lái)昔布組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示塞來(lái)昔布增加RARβ表達(dá)的作用不依賴于COX-2途徑。而NS398并不能增加HT-29細(xì)胞中RARβ蛋白的表達(dá)。塞來(lái)昔布增加維甲酸敏感性的作用通過(guò)非COX-2依賴途徑實(shí)現(xiàn)：ELISA法檢測(cè)顯示，10μM、20μM的NS398分別與5μM、10μM的塞來(lái)昔布對(duì)HT-29細(xì)胞前列腺素E2分泌的抑制作用相仿，但MTT結(jié)果顯示NS398并不能像塞來(lái)昔布那樣增強(qiáng)全反式維甲酸對(duì)HT-29和SW480細(xì)胞的增殖抑制作用。結(jié)合塞來(lái)昔布可增加RARβ蛋白表達(dá)，而NS398不能的結(jié)果，提示塞來(lái)昔布增加人結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)維甲酸敏感性的作用可能是通過(guò)非COX-2依賴途徑，增加RARβ蛋白表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。RARβ蛋白表達(dá)水平與人結(jié)腸癌細(xì)胞株對(duì)全反式維甲酸的敏感性密切相關(guān)：本研究結(jié)果表明，RARβ蛋白表達(dá)水平與人結(jié)腸癌細(xì)胞株對(duì)全反式維甲酸的敏感性密切相關(guān)，可能作為預(yù)測(cè)維甲酸療效的生物指標(biāo)。塞來(lái)昔布通過(guò)增加RARβ蛋白表達(dá)，增強(qiáng)了維甲酸與受體的結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，從而提高了細(xì)胞對(duì)維甲酸的敏感性。綜上所述，本研究證實(shí)塞來(lái)昔布可增加人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和SW480對(duì)維甲酸的敏感性，兩者聯(lián)合用藥可增強(qiáng)增殖抑制和促凋亡作用，有望為臨床提供可行的聯(lián)合