細(xì)胞制劑質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程一、目的為規(guī)范細(xì)胞制劑質(zhì)量檢測(cè)流程，確保檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、可追溯，保障細(xì)胞制劑的安全性、有效性及質(zhì)量一致性，滿足臨床應(yīng)用或研究用細(xì)胞制劑的質(zhì)量控制要求，特制定本標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）。二、適用范圍本規(guī)程適用于自體/異體來(lái)源的干細(xì)胞（如間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞）、免疫細(xì)胞（如CAR-T細(xì)胞、CIK細(xì)胞）及其他類型細(xì)胞制劑的質(zhì)量檢測(cè)。涉及部門包括質(zhì)量控制部、細(xì)胞制備部，相關(guān)崗位為檢測(cè)人員、質(zhì)量負(fù)責(zé)人、設(shè)備管理員等。三、職責(zé)分工1.檢測(cè)人員：嚴(yán)格按照本規(guī)程操作，如實(shí)記錄檢測(cè)過(guò)程與結(jié)果，及時(shí)報(bào)告異常情況；定期參與技能培訓(xùn)與考核，確保操作規(guī)范性。2.質(zhì)量負(fù)責(zé)人：審核檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與合規(guī)性，批準(zhǔn)檢測(cè)報(bào)告；監(jiān)督檢測(cè)流程的合規(guī)執(zhí)行，處理質(zhì)量偏差事件。3.設(shè)備管理員：負(fù)責(zé)檢測(cè)儀器（如流式細(xì)胞儀、生物安全柜、酶標(biāo)儀等）的日常維護(hù)、校準(zhǔn)與驗(yàn)證，確保設(shè)備性能符合要求。4.試劑管理員：負(fù)責(zé)試劑耗材的采購(gòu)、驗(yàn)收、儲(chǔ)存與發(fā)放，確保試劑在有效期內(nèi)且性能穩(wěn)定（如無(wú)菌培養(yǎng)基、熒光抗體、鱟試劑等）。四、檢測(cè)項(xiàng)目及操作流程（一）細(xì)胞鑒別檢測(cè)（以流式細(xì)胞術(shù)為例）檢測(cè)目的：確認(rèn)細(xì)胞的表型特征，與預(yù)期細(xì)胞類型一致。試劑與設(shè)備：熒光標(biāo)記的特異性抗體（如CD34、CD45、CD90等）、同型對(duì)照抗體、流式細(xì)胞儀（如BDFACSCanto）、PBS緩沖液、4%多聚甲醛固定液。操作流程：1.樣本制備：取待檢細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至合適水平，分裝至流式管（每管100μL）。2.抗體孵育：加入適量熒光抗體（濃度參考試劑說(shuō)明書(shū)），同時(shí)設(shè)置同型對(duì)照管，4℃避光孵育30分鐘。3.洗滌與固定：加入2mLPBS洗滌，300×g離心5分鐘，棄上清；加入200μL4%多聚甲醛固定，4℃避光保存（≤24小時(shí)）。4.上機(jī)檢測(cè)：使用流式細(xì)胞儀采集至少一定數(shù)量細(xì)胞，通過(guò)專業(yè)軟件分析陽(yáng)性細(xì)胞比例。判定要點(diǎn)：目標(biāo)標(biāo)志物陽(yáng)性率≥95%，同型對(duì)照陽(yáng)性率≤5%（具體參考細(xì)胞類型的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或注冊(cè)要求）。（二）細(xì)胞純度檢測(cè)檢測(cè)目的：評(píng)估細(xì)胞制劑中目標(biāo)細(xì)胞的占比，排除污染細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞、紅細(xì)胞等）。方法選擇：流式細(xì)胞術(shù)：同“細(xì)胞鑒別”流程，通過(guò)特異性標(biāo)志物區(qū)分目標(biāo)細(xì)胞與雜細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)結(jié)合細(xì)胞計(jì)數(shù)：若需快速評(píng)估，取細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)按1:1混合，靜置2分鐘后，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)活細(xì)胞（拒染）與死細(xì)胞（藍(lán)染），同時(shí)觀察是否存在非目標(biāo)細(xì)胞形態(tài)（如成纖維細(xì)胞的梭形結(jié)構(gòu)）。判定標(biāo)準(zhǔn)：目標(biāo)細(xì)胞純度≥95%（特殊細(xì)胞類型可根據(jù)法規(guī)或方案調(diào)整）。（三）細(xì)胞活性檢測(cè)（臺(tái)盼藍(lán)拒染法）檢測(cè)目的：評(píng)估細(xì)胞的存活狀態(tài)，反映制劑的生物學(xué)功能潛力。試劑與設(shè)備：0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、光學(xué)顯微鏡。操作流程：1.樣本稀釋：取待檢細(xì)胞懸液，用PBS稀釋至適宜濃度。2.染色與計(jì)數(shù)：取10μL稀釋液與10μL臺(tái)盼藍(lán)溶液混合，靜置2分鐘后，滴加至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)數(shù)四個(gè)大方格內(nèi)的活細(xì)胞（透明、拒染）與死細(xì)胞（藍(lán)色、被染）。3.活性計(jì)算：細(xì)胞活性（%）=（活細(xì)胞總數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞活性≥90%（臨床用細(xì)胞制劑通常要求≥85%，具體依細(xì)胞類型調(diào)整）。（四）無(wú)菌檢測(cè)（依據(jù)《中國(guó)藥典》無(wú)菌檢查法）檢測(cè)目的：排除細(xì)菌、真菌污染，保障制劑安全性。試劑與設(shè)備：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（需氧/厭氧菌）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（需氧菌/真菌）、生物安全柜、培養(yǎng)箱（30-35℃、20-25℃）。操作流程：1.樣本處理：取待檢細(xì)胞制劑（體積≥10mL時(shí)，取10mL；＜10mL則全量），按0.2μm濾膜過(guò)濾（或直接接種，依制劑特性選擇）。2.培養(yǎng)基接種：將濾膜或樣本分別接種至硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（10mL）和胰酪大豆胨培養(yǎng)基（10mL），同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（接種一定量的金黃色葡萄球菌）和陰性對(duì)照（僅接種培養(yǎng)基）。3.培養(yǎng)與觀察：需氧/厭氧培養(yǎng)基置30-35℃培養(yǎng)14天，真菌培養(yǎng)基置20-25℃培養(yǎng)14天；每日觀察培養(yǎng)基是否渾濁、有無(wú)菌膜或菌落形成。判定標(biāo)準(zhǔn)：若陰性對(duì)照無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，且待檢樣本培養(yǎng)基無(wú)微生物生長(zhǎng)，判定為“無(wú)菌”；若待檢樣本培養(yǎng)基出現(xiàn)微生物生長(zhǎng)，需復(fù)試（復(fù)試流程同前，若仍陽(yáng)性則判定為“污染”）。（五）支原體檢測(cè)（PCR法）檢測(cè)目的：排除支原體污染（支原體可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、影響功能）。試劑與設(shè)備：支原體PCR檢測(cè)試劑盒（含引物、酶、dNTP等）、PCR儀、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)。操作流程：1.樣本處理：取細(xì)胞培養(yǎng)上清（或細(xì)胞裂解液）200μL，____×g離心5分鐘，取上清備用。2.PCR擴(kuò)增：按試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，設(shè)置擴(kuò)增程序（如95℃預(yù)變性5分鐘；95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10分鐘）。3.結(jié)果判定：取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳（1.5%凝膠，120V電泳30分鐘），若出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照一致的條帶，則判定為“支原體陽(yáng)性”；無(wú)條帶且陰性對(duì)照無(wú)條帶，判定為“陰性”。（六）內(nèi)毒素檢測(cè)（鱟試驗(yàn)?zāi)z法）檢測(cè)目的：評(píng)估細(xì)菌內(nèi)毒素含量，避免引發(fā)發(fā)熱、休克等不良反應(yīng)。試劑與設(shè)備：鱟試劑（凝膠法）、內(nèi)毒素檢查用水、無(wú)熱原試管、37℃恒溫箱。操作流程：1.樣本預(yù)處理：取待檢細(xì)胞制劑，用無(wú)熱原水稀釋至適宜濃度（如1:10稀釋，避免干擾）。2.試劑平衡：將鱟試劑與樣本置37℃平衡30分鐘。3.加樣反應(yīng)：取0.1mL樣本加入鱟試劑安瓿中，輕輕混勻，置37℃恒溫箱孵育60分鐘。4.結(jié)果觀察：垂直提起安瓿，若凝膠不滑動(dòng)，判定為“陽(yáng)性”（內(nèi)毒素≥0.5EU/mL，具體限值依制劑類型調(diào)整）；若凝膠滑動(dòng)，判定為“陰性”。判定標(biāo)準(zhǔn)：內(nèi)毒素含量＜5EU/kg（臨床用細(xì)胞制劑通常要求更嚴(yán)格，如＜0.5EU/mL，需符合注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)）。（七）生物學(xué)效力檢測(cè)（以CAR-T細(xì)胞殺傷活性為例）檢測(cè)目的：評(píng)估細(xì)胞的功能活性，反映治療潛力。方法選擇：LDH釋放法（乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)）。試劑與設(shè)備：LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、靶細(xì)胞（如K562細(xì)胞）、96孔板、酶標(biāo)儀。操作流程：1.效靶比設(shè)置：將CAR-T細(xì)胞與靶細(xì)胞按不同效靶比（如10:1、5:1、2.5:1）接種于96孔板，每孔總體積200μL，設(shè)置效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照（僅CAR-T細(xì)胞）、靶細(xì)胞對(duì)照（僅靶細(xì)胞）、最大釋放孔（靶細(xì)胞+裂解液）、自然釋放孔（靶細(xì)胞+培養(yǎng)基）。2.共培養(yǎng)：置37℃、5%CO?培養(yǎng)箱孵育4小時(shí)。3.檢測(cè)：吸取上清50μL，加入底物液50μL，室溫避光反應(yīng)30分鐘；加入終止液50μL，酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)讀取吸光度（OD值）。4.殺傷率計(jì)算：殺傷率（%）=[(實(shí)驗(yàn)孔OD-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照OD-自然釋放孔OD)/(最大釋放孔OD-自然釋放孔OD)]×100%。判定標(biāo)準(zhǔn)：在特定效靶比下，殺傷率≥70%（具體依產(chǎn)品特性與臨床要求調(diào)整）。五、結(jié)果判定與報(bào)告1.單項(xiàng)判定：各檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果需滿足“四、檢測(cè)項(xiàng)目及操作流程”中對(duì)應(yīng)的判定標(biāo)準(zhǔn)，否則判定為“不合格”，需啟動(dòng)偏差調(diào)查（如復(fù)試、追溯樣本來(lái)源、核查操作流程等）。2.綜合判定：所有檢測(cè)項(xiàng)目均合格后，方可判定細(xì)胞制劑“質(zhì)量合格”；若任一項(xiàng)目不合格，需分析原因并采取整改措施（如重新制備、更換試劑等），整改后需重新檢測(cè)。3.報(bào)告出具：檢測(cè)報(bào)告需包含樣本信息（編號(hào)、來(lái)源、制備日期）、檢測(cè)項(xiàng)目、方法、結(jié)果、判定結(jié)論、檢測(cè)人員與審核人員簽名、報(bào)告日期等，確保數(shù)據(jù)可追溯。六、注意事項(xiàng)1.人員資質(zhì)：檢測(cè)人員需經(jīng)“細(xì)胞培養(yǎng)與檢測(cè)”專項(xiàng)培訓(xùn)，考核合格后方可上崗；每年需復(fù)訓(xùn)，確保操作規(guī)范性。2.環(huán)境控制：檢測(cè)操作需在B+A級(jí)生物安全柜或萬(wàn)級(jí)潔凈室（局部百級(jí)）中進(jìn)行，定期監(jiān)測(cè)環(huán)境微粒與浮游菌（每月1次）。3.試劑與耗材：新批次試劑需進(jìn)行性能驗(yàn)證（如流式抗體需驗(yàn)證特異性與重復(fù)性，鱟試劑需驗(yàn)證靈敏度）；耗材需經(jīng)“無(wú)熱原、無(wú)菌”驗(yàn)證（如離心管、移液槍頭）。4.儀器校準(zhǔn)：流式細(xì)胞儀、酶標(biāo)儀、PCR儀等需每年校準(zhǔn)（委托第三方或廠家），生物安全柜需每半年檢測(cè)氣流與過(guò)濾效率。5.生物安全：檢測(cè)后樣本、廢液需經(jīng)高壓滅菌（121℃，30分鐘）處理，醫(yī)療廢物按《醫(yī)療廢物管理?xiàng)l例》處置。七、變更與修訂本