復(fù)元膠囊對實驗性大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨中TNF-α和VEGF表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究一、引言1.1研究背景與意義骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種常見的慢性關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)軟骨退變、骨質(zhì)增生和關(guān)節(jié)囊內(nèi)炎癥等為主要病理特征，是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙的主要原因之一。隨著全球老齡化進(jìn)程的加速，OA的發(fā)病率逐年上升，給患者的生活質(zhì)量帶來了嚴(yán)重影響，同時也給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，目前全球約有3.55億人患有骨關(guān)節(jié)炎，預(yù)計到2025年，這一數(shù)字將達(dá)到5億。在我國，60歲以上人群中OA的患病率超過50%，75歲以上人群患病率更是高達(dá)80%。OA的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞因子和信號通路的異常調(diào)節(jié)。其中，腫瘤壞死因子-α（TumorNecrosisFactor-α，TNF-α）和血管內(nèi)皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）在OA的發(fā)病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TNF-α是一種重要的促炎細(xì)胞因子，主要由活化的巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等分泌。在OA患者的關(guān)節(jié)滑膜、軟骨及滑液中，TNF-α的表達(dá)水平顯著升高。TNF-α可通過多種途徑參與OA的發(fā)病過程，如誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生其他炎癥介質(zhì)，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)；激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MatrixMetalloproteinases，MMPs）的表達(dá)，促進(jìn)軟骨基質(zhì)的降解，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞；抑制軟骨細(xì)胞的增殖和合成功能，加速軟骨細(xì)胞的凋亡，影響軟骨的修復(fù)和再生。研究表明，TNF-α基因多態(tài)性與OA的易感性密切相關(guān)，攜帶某些TNF-α基因亞型的個體患OA的風(fēng)險更高。VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，具有促進(jìn)血管生成、增加血管通透性等作用。在OA的病理過程中，VEGF的表達(dá)明顯上調(diào)。一方面，VEGF可促使滑膜組織中新生血管的形成，導(dǎo)致滑膜炎癥的加劇和關(guān)節(jié)軟骨的營養(yǎng)供應(yīng)失衡。新生血管不僅為炎癥細(xì)胞的浸潤提供了途徑，還可釋放多種炎性介質(zhì)和蛋白酶，進(jìn)一步破壞關(guān)節(jié)軟骨和周圍組織。另一方面，VEGF可直接作用于軟骨細(xì)胞，影響其代謝和功能，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的肥大和凋亡，加速軟骨的退變。研究發(fā)現(xiàn)，OA患者關(guān)節(jié)滑液中VEGF的水平與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，可作為評估OA病情進(jìn)展的重要指標(biāo)之一。目前，臨床上對于OA的治療主要包括藥物治療、物理治療、手術(shù)治療等。藥物治療是OA治療的基礎(chǔ)，常用的藥物包括非甾體類抗炎藥（NonsteroidalAnti-inflammatoryDrugs，NSAIDs）、糖皮質(zhì)激素、軟骨保護(hù)劑等。然而，這些藥物往往只能緩解癥狀，無法從根本上阻止OA的進(jìn)展，且存在一定的不良反應(yīng)。因此，尋找一種安全、有效的治療OA的藥物具有重要的臨床意義。復(fù)元膠囊是一種中藥復(fù)方制劑，主要由淫羊藿、鹿茸、肉蓯蓉、生曬參、黃芪、丹參、川芎等中藥組成，具有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋健骨、益氣活血之功效。在中醫(yī)理論中，OA屬于“骨痹”“痹證”等范疇，其發(fā)病與肝腎虧虛、氣血不足、瘀血阻滯等因素密切相關(guān)。復(fù)元膠囊針對OA的病因病機(jī)，通過補(bǔ)腎壯骨以治本，益氣活血以治標(biāo)，達(dá)到標(biāo)本兼治的目的?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，復(fù)元膠囊中的多種成分具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和抑制軟骨細(xì)胞凋亡等作用。淫羊藿中的主要活性成分淫羊藿苷可通過抑制NF-κB信號通路，減少TNF-α、IL-1等炎癥因子的釋放，從而發(fā)揮抗炎作用；丹參中的丹參酮ⅡA可抑制MMPs的表達(dá)，減少軟骨基質(zhì)的降解，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。前期臨床研究也證實，復(fù)元膠囊治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎具有較好的療效，可顯著改善患者的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能障礙等癥狀。本研究旨在探討復(fù)元膠囊對實驗性大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨中TNF-α和VEGF表達(dá)的影響，從分子水平揭示復(fù)元膠囊治療OA的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更堅實的理論依據(jù)，以期為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供新的思路和方法，改善患者的生活質(zhì)量，減輕社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1復(fù)元膠囊在骨關(guān)節(jié)炎研究中的進(jìn)展復(fù)元膠囊作為一種中藥復(fù)方制劑，近年來在骨關(guān)節(jié)炎治療領(lǐng)域受到了較多關(guān)注。國內(nèi)學(xué)者對其進(jìn)行了一系列研究，從藥理作用、臨床療效等多個方面進(jìn)行了探討。在藥理作用機(jī)制方面，研究發(fā)現(xiàn)復(fù)元膠囊能夠調(diào)節(jié)骨代謝相關(guān)因子的表達(dá)。有研究表明，復(fù)元膠囊含藥血清可以上調(diào)成骨細(xì)胞中骨保護(hù)素（OPG）的表達(dá)，同時下調(diào)核因子κB受體活化因子配體（RANKL）的表達(dá)，從而抑制破骨細(xì)胞的分化和活性，促進(jìn)骨形成，維持骨代謝的平衡。這一作用對于改善骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨下骨病變具有重要意義。在細(xì)胞實驗中，復(fù)元膠囊中的活性成分淫羊藿苷可通過激活PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡，并且減少炎癥因子的分泌，對軟骨細(xì)胞起到保護(hù)作用。在臨床研究方面，多項臨床試驗證實了復(fù)元膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎的有效性。一項多中心、隨機(jī)、雙盲、安慰劑對照試驗納入了200例膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者，結(jié)果顯示，與安慰劑組相比，復(fù)元膠囊治療組患者的膝關(guān)節(jié)疼痛視覺模擬評分（VAS）顯著降低，西安大略和麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)（WOMAC）評分也明顯改善，表明復(fù)元膠囊能夠有效緩解膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者的疼痛癥狀，提高關(guān)節(jié)功能。另一項臨床研究則對復(fù)元膠囊治療腰椎骨關(guān)節(jié)炎的療效進(jìn)行了觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過復(fù)元膠囊治療后，患者的腰部疼痛、僵硬感及活動受限等癥狀均得到明顯改善，且治療過程中未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，提示復(fù)元膠囊在腰椎骨關(guān)節(jié)炎的治療中也具有一定的應(yīng)用價值。然而，目前復(fù)元膠囊的研究仍存在一些不足之處。在作用機(jī)制方面，雖然已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但對于復(fù)元膠囊中多種成分協(xié)同作用的機(jī)制尚未完全明確，還需要進(jìn)一步深入研究。在臨床研究方面，部分研究的樣本量較小，研究時間較短，缺乏長期的隨訪數(shù)據(jù)，這可能會影響研究結(jié)果的可靠性和外推性。此外，復(fù)元膠囊的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)也有待進(jìn)一步加強(qiáng)，以確保其療效的穩(wěn)定性和一致性。1.2.2TNF-α在骨關(guān)節(jié)炎研究中的進(jìn)展TNF-α在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用是國內(nèi)外研究的熱點之一。大量研究表明，TNF-α在骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑膜、軟骨及滑液中高表達(dá)，并且與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。國外研究發(fā)現(xiàn)，在骨關(guān)節(jié)炎動物模型中，通過注射TNF-α拮抗劑可以顯著減輕關(guān)節(jié)炎癥和軟骨損傷。這一結(jié)果提示，TNF-α在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用。在細(xì)胞水平，TNF-α可以刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生多種炎性介質(zhì)，如IL-1、IL-6、前列腺素E2（PGE2）等，這些炎性介質(zhì)相互作用，形成復(fù)雜的炎癥網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步加重關(guān)節(jié)炎癥和軟骨破壞。TNF-α還可以激活MMPs的表達(dá)，促使軟骨基質(zhì)降解，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)和功能受損。在臨床研究方面，TNF-α拮抗劑已被應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎的治療，并取得了一定的療效。一項隨機(jī)對照臨床試驗對依那西普（一種TNF-α拮抗劑）治療膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的效果進(jìn)行了評估，結(jié)果顯示，與安慰劑組相比，依那西普治療組患者的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和功能障礙等癥狀得到明顯改善，且安全性良好。然而，TNF-α拮抗劑的應(yīng)用也存在一些局限性，如價格昂貴、可能增加感染風(fēng)險等，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。盡管目前對TNF-α在骨關(guān)節(jié)炎中的研究取得了一定的成果，但仍有許多問題需要進(jìn)一步探討。例如，TNF-α在不同類型骨關(guān)節(jié)炎（如膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎、髖關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎等）中的作用機(jī)制是否存在差異，以及如何更精準(zhǔn)地靶向TNF-α進(jìn)行治療，同時減少不良反應(yīng)的發(fā)生，這些都是未來研究需要關(guān)注的方向。1.2.3VEGF在骨關(guān)節(jié)炎研究中的進(jìn)展近年來，VEGF在骨關(guān)節(jié)炎中的作用逐漸受到重視。研究表明，VEGF在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)組織中的表達(dá)明顯升高，并且與關(guān)節(jié)軟骨退變、滑膜炎癥和血管翳形成密切相關(guān)。在骨關(guān)節(jié)炎的病理過程中，VEGF主要通過促進(jìn)血管生成和增加血管通透性來影響疾病的發(fā)展。國外有研究發(fā)現(xiàn)，在骨關(guān)節(jié)炎動物模型中，抑制VEGF的表達(dá)或活性可以減少滑膜新生血管的形成，減輕滑膜炎癥和關(guān)節(jié)軟骨損傷。在細(xì)胞實驗中，VEGF可以刺激滑膜細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤，同時還可以抑制軟骨細(xì)胞的合成功能，促進(jìn)其凋亡，從而加速關(guān)節(jié)軟骨的退變。在臨床研究方面，一些研究嘗試通過檢測關(guān)節(jié)滑液或血清中VEGF的水平來評估骨關(guān)節(jié)炎的病情和預(yù)后。有研究報道，骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑液中VEGF的水平與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，可作為評估疾病進(jìn)展的潛在生物標(biāo)志物。此外，針對VEGF的治療策略也在不斷探索中，如使用VEGF抑制劑，但目前相關(guān)研究仍處于初步階段，其療效和安全性還需要進(jìn)一步驗證。然而，目前關(guān)于VEGF在骨關(guān)節(jié)炎中的研究還存在一些不足。一方面，VEGF在骨關(guān)節(jié)炎中的信號傳導(dǎo)通路尚未完全闡明，這限制了對其作用機(jī)制的深入理解。另一方面，針對VEGF的治療方法在臨床應(yīng)用中還面臨著諸多挑戰(zhàn)，如如何選擇合適的治療時機(jī)、劑量和療程，以及如何避免潛在的不良反應(yīng)等。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探討復(fù)元膠囊對實驗性大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨中TNF-α和VEGF表達(dá)的影響，從而從分子層面揭示復(fù)元膠囊治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制，為其在臨床上的廣泛應(yīng)用提供更為堅實的理論依據(jù)。本研究的具體內(nèi)容如下：首先，構(gòu)建實驗性大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型，將SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、四環(huán)素組、復(fù)元膠囊低劑量組、復(fù)元膠囊中劑量組和復(fù)元膠囊高劑量組。正常對照組給予生理鹽水灌胃，模型對照組在造模后給予生理鹽水灌胃，四環(huán)素組在造模后給予四環(huán)素灌胃，復(fù)元膠囊各劑量組在造模后分別給予不同劑量的復(fù)元膠囊灌胃。通過這種分組設(shè)置，能夠清晰地對比不同處理因素對大鼠骨關(guān)節(jié)炎的影響，為后續(xù)分析復(fù)元膠囊的作用提供了基礎(chǔ)。其次，在治療10周后，對各組大鼠進(jìn)行處理。取各組大鼠的脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨，運用HE染色技術(shù)進(jìn)行Mankin’s評分，以此對關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)變化進(jìn)行評估。Mankin’s評分是一種廣泛應(yīng)用于評估骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨病變程度的方法，通過對軟骨的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)、基質(zhì)染色等多個方面進(jìn)行打分，能夠準(zhǔn)確地反映關(guān)節(jié)軟骨的損傷程度。同時，采用免疫組織化學(xué)染色法測定關(guān)節(jié)軟骨中TNF-α和VEGF表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)，以此來分析復(fù)元膠囊對這兩種因子表達(dá)水平的影響。免疫組織化學(xué)染色法可以特異性地識別和定位組織中的目標(biāo)蛋白，通過觀察陽性細(xì)胞的數(shù)量和分布情況，能夠直觀地了解TNF-α和VEGF在關(guān)節(jié)軟骨中的表達(dá)變化。最后，對實驗所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，對比各組之間的差異，明確復(fù)元膠囊對實驗性大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨中TNF-α和VEGF表達(dá)的影響，進(jìn)而探討其治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)分析，能夠從科學(xué)的角度揭示復(fù)元膠囊在治療骨關(guān)節(jié)炎過程中的作用方式和效果，為其臨床應(yīng)用提供有力的支持。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究選用SPF級健康成年SD大鼠56只，體重200-220g，雌雄各半，購自[實驗動物供應(yīng)單位名稱]。所有大鼠在實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，保持環(huán)境溫度22±2℃，相對濕度50%-60%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。將56只SD大鼠隨機(jī)分為6組：正常對照組（6只）、模型對照組（10只）、四環(huán)素組（10只）、復(fù)元膠囊低劑量組（10只）、復(fù)元膠囊中劑量組（10只）、復(fù)元膠囊高劑量組（10只）。采用經(jīng)典的改良Hulth法建立大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型。大鼠經(jīng)10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺上。常規(guī)消毒鋪巾，于右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)做一縱行切口，長約1.5cm，逐層切開皮膚、皮下組織及關(guān)節(jié)囊，暴露膝關(guān)節(jié)腔。切斷前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶及內(nèi)側(cè)半月板，然后縫合關(guān)節(jié)囊和皮膚。術(shù)后肌肉注射青霉素鈉（80萬U/kg），連續(xù)3天，預(yù)防感染。正常對照組大鼠僅做皮膚切開，不進(jìn)行其他處理。造模成功后，正常對照組和模型對照組給予生理鹽水灌胃，灌胃體積為10mL/kg；四環(huán)素組給予四環(huán)素（0.1g/kg）灌胃；復(fù)元膠囊低、中、高劑量組分別給予復(fù)元膠囊（0.5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg）灌胃。各組均每天灌胃1次，連續(xù)給藥10周。在治療10周后，大鼠禁食12h，不禁水，然后用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉。迅速取出右側(cè)膝關(guān)節(jié)，分離脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨，將軟骨組織分成兩部分，一部分用于HE染色，另一部分用于免疫組織化學(xué)染色。取脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨組織，用4%多聚甲醛固定24h，然后進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。制成厚度為4μm的切片，進(jìn)行HE染色。染色步驟如下：切片脫蠟至水，蘇木精染液染色5min，自來水沖洗10min，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗返藍(lán)，伊紅染液染色3min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用Mankin’s評分標(biāo)準(zhǔn)對關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)變化進(jìn)行評估，Mankin’s評分包括軟骨表面完整性、軟骨細(xì)胞數(shù)量、軟骨基質(zhì)染色、潮線完整性等指標(biāo)，滿分14分，得分越高表示關(guān)節(jié)軟骨損傷越嚴(yán)重。取脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨組織，用4%多聚甲醛固定24h，然后進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。制成厚度為4μm的切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。染色步驟如下：切片脫蠟至水，3%過氧化氫溶液室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）微波修復(fù)抗原15min；正常山羊血清封閉30min，傾去血清，不洗；分別加入兔抗大鼠TNF-α多克隆抗體（1:100）和兔抗大鼠VEGF多克隆抗體（1:100），4℃孵育過夜；次日，PBS沖洗3次，每次5min，加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:200），室溫孵育30min；PBS沖洗3次，每次5min，加入鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC），室溫孵育30min；PBS沖洗3次，每次5min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。在高倍鏡（×400）下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)TNF-α和VEGF表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)。采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究的技術(shù)路線圖如下：[此處插入技術(shù)路線圖，清晰展示從實驗動物分組、造模、給藥、檢測到數(shù)據(jù)分析的整個流程]二、復(fù)元膠囊與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1骨關(guān)節(jié)炎概述骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變、骨質(zhì)增生和關(guān)節(jié)周圍組織炎癥為主要病理特征的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，又被稱為骨關(guān)節(jié)病、退行性關(guān)節(jié)炎、老年性關(guān)節(jié)炎、肥大性關(guān)節(jié)炎等。其發(fā)病率隨年齡增長而逐漸升高，是中老年人常見的關(guān)節(jié)疾病之一。OA可累及全身多個關(guān)節(jié)，如膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、手關(guān)節(jié)、脊柱關(guān)節(jié)等，其中膝關(guān)節(jié)是最常受累的部位。在我國，膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的患病率約為8.1%，且女性高于男性。OA的主要癥狀包括關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵硬和活動受限。疼痛是OA最常見的癥狀，初期多為輕微鈍痛，常發(fā)生于晨間，活動后疼痛可暫時緩解，但隨著病情進(jìn)展，疼痛會逐漸加重，且在活動過多、長時間行走或上下樓梯時加劇，休息后也難以完全緩解。關(guān)節(jié)腫脹也是OA的常見表現(xiàn)，主要是由于關(guān)節(jié)滑膜炎癥、關(guān)節(jié)積液以及周圍軟組織水腫引起的。關(guān)節(jié)僵硬通常在早晨起床時或長時間休息后出現(xiàn)，持續(xù)時間較短，一般不超過30分鐘，活動后可逐漸緩解。隨著疾病的發(fā)展，關(guān)節(jié)功能會受到嚴(yán)重影響，患者可能出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形，如膝關(guān)節(jié)內(nèi)翻或外翻畸形，導(dǎo)致行走困難，甚至殘疾，極大地降低了患者的生活質(zhì)量。OA的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全明確。一般認(rèn)為，OA的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，包括年齡、遺傳、肥胖、關(guān)節(jié)損傷、炎癥、代謝異常等。年齡是OA最重要的危險因素之一，隨著年齡的增長，關(guān)節(jié)軟骨的水分含量逐漸減少，膠原蛋白和蛋白多糖的合成減少，分解增加，導(dǎo)致軟骨彈性降低，耐磨性下降，容易發(fā)生退變。遺傳因素在OA的發(fā)病中也起著重要作用，研究表明，某些基因的突變或多態(tài)性與OA的易感性增加有關(guān)。肥胖會增加關(guān)節(jié)的負(fù)重，尤其是膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)，加速關(guān)節(jié)軟骨的磨損和退變。關(guān)節(jié)損傷，如骨折、韌帶損傷、半月板損傷等，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)力學(xué)結(jié)構(gòu)改變，引起關(guān)節(jié)軟骨的異常磨損，從而誘發(fā)OA。此外，炎癥反應(yīng)在OA的發(fā)病過程中也起著關(guān)鍵作用，多種炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)參與了OA的病理過程，如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等，它們可通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等酶類，促進(jìn)軟骨基質(zhì)的降解，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞。OA不僅給患者帶來身體上的痛苦和生活上的不便，還給社會和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計，OA患者的醫(yī)療費用是普通人群的2-3倍。由于OA患者的關(guān)節(jié)功能受限，其工作能力和生活自理能力下降，可能需要他人的照顧和幫助，這不僅影響了患者的家庭生活，也增加了社會的護(hù)理負(fù)擔(dān)。因此，尋找有效的治療方法，預(yù)防和延緩OA的進(jìn)展，對于提高患者的生活質(zhì)量，減輕社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)具有重要意義。2.2復(fù)元膠囊的成分與功效復(fù)元膠囊是一種精心研制的中藥復(fù)方制劑，其成分豐富且獨特，蘊含多種名貴中藥材，主要包括淫羊藿、鹿茸、肉蓯蓉、生曬參、黃芪、丹參、川芎等。這些成分相互協(xié)同，共同發(fā)揮著重要的治療作用。淫羊藿作為復(fù)元膠囊的關(guān)鍵成分之一，性溫，味辛、甘，歸肝、腎經(jīng)。其富含淫羊藿苷等多種活性成分，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的顯著功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淫羊藿苷可通過多種途徑發(fā)揮對骨關(guān)節(jié)炎的治療作用。一方面，它能夠調(diào)節(jié)骨代謝相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，抑制破骨細(xì)胞的活性，從而維持骨代謝的平衡，增強(qiáng)骨骼的強(qiáng)度和韌性。另一方面，淫羊藿苷具有顯著的抗炎作用，可抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放，如通過抑制NF-κB信號通路，減少TNF-α、IL-1等炎癥因子的產(chǎn)生，減輕關(guān)節(jié)局部的炎癥反應(yīng)，緩解關(guān)節(jié)疼痛和腫脹。鹿茸為鹿科動物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，性溫，味甘、咸，歸腎、肝經(jīng)。鹿茸中含有多種氨基酸、多肽、微量元素等營養(yǎng)成分，具有壯腎陽、益精血、強(qiáng)筋骨的功效。在骨關(guān)節(jié)炎的治療中，鹿茸能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和修復(fù)，增加軟骨基質(zhì)的合成，改善關(guān)節(jié)軟骨的代謝和營養(yǎng)狀況，從而延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變。鹿茸還具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用，可增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力，減少炎癥的發(fā)生和發(fā)展。肉蓯蓉是一種寄生在沙漠樹木梭梭根部的寄生植物，性溫，味甘、咸，歸腎、大腸經(jīng)。肉蓯蓉富含苯乙醇苷類、多糖等成分，具有補(bǔ)腎陽、益精血、潤腸通便的功效。在復(fù)元膠囊中，肉蓯蓉主要發(fā)揮補(bǔ)腎填精的作用，為骨骼的生長和修復(fù)提供充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉中的多糖成分能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)骨形成。肉蓯蓉還具有抗氧化作用，可清除體內(nèi)自由基，減輕氧化應(yīng)激對關(guān)節(jié)組織的損傷。生曬參為五加科植物人參的干燥根和根莖，性微溫，味甘、微苦，歸脾、肺、心、腎經(jīng)。生曬參中含有人參皂苷、多糖、揮發(fā)油等多種活性成分，具有大補(bǔ)元氣、復(fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智的功效。在骨關(guān)節(jié)炎的治療中，生曬參主要通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能和代謝功能來發(fā)揮作用。人參皂苷能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，提高機(jī)體對炎癥的抵抗力。生曬參還可以促進(jìn)蛋白質(zhì)和核酸的合成，為關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)和再生提供必要的物質(zhì)條件。黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，性微溫，味甘，歸脾、肺經(jīng)。黃芪富含黃芪多糖、黃酮類、皂苷類等成分，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌的功效。在復(fù)元膠囊中，黃芪主要起到益氣的作用，氣行則血行，可促進(jìn)血液循環(huán)，改善關(guān)節(jié)局部的血液供應(yīng)，為關(guān)節(jié)組織提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)。黃芪多糖還具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，可增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，抑制炎癥反應(yīng)，減輕關(guān)節(jié)疼痛和腫脹。丹參為唇形科植物丹參的干燥根和根莖，性微寒，味苦，歸心、肝經(jīng)。丹參中含有丹參酮、丹酚酸等多種活性成分，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效。在骨關(guān)節(jié)炎的治療中，丹參能夠活血化瘀，改善關(guān)節(jié)局部的血液循環(huán)，促進(jìn)炎性物質(zhì)的吸收和消散，減輕關(guān)節(jié)疼痛和腫脹。丹參中的丹酚酸還具有抗氧化和抗炎作用，可抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞免受損傷。川芎為傘形科植物川芎的干燥根莖，性溫，味辛，歸肝、膽、心包經(jīng)。川芎富含川芎嗪、阿魏酸等成分，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效。在復(fù)元膠囊中，川芎與丹參等活血化瘀藥物配伍，可增強(qiáng)活血化瘀的作用，改善關(guān)節(jié)局部的血液流變學(xué)指標(biāo)，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的營養(yǎng)供應(yīng)和代謝廢物的排出。川芎嗪還具有抑制血小板聚集、擴(kuò)張血管的作用，可改善關(guān)節(jié)局部的微循環(huán)，減輕關(guān)節(jié)疼痛和腫脹。復(fù)元膠囊中的多種中藥成分相互配伍，協(xié)同發(fā)揮補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋健骨、益氣活血的功效。方中淫羊藿、鹿茸、肉蓯蓉補(bǔ)腎陽、益精血，從根本上改善肝腎虧虛的狀態(tài)，為筋骨的強(qiáng)壯提供基礎(chǔ)。生曬參、黃芪補(bǔ)氣健脾，氣旺則血行有力，可促進(jìn)活血化瘀藥物的作用發(fā)揮。丹參、川芎活血化瘀、通絡(luò)止痛，改善關(guān)節(jié)局部的血液循環(huán)，促進(jìn)炎性物質(zhì)的吸收，緩解關(guān)節(jié)疼痛和腫脹。諸藥合用，標(biāo)本兼治，針對骨關(guān)節(jié)炎肝腎不足、氣血瘀滯的病因病機(jī)，發(fā)揮綜合治療作用，從而達(dá)到治療骨關(guān)節(jié)炎的目的。2.3TNF-α與VEGF在骨關(guān)節(jié)炎中的作用機(jī)制2.3.1TNF-α的作用機(jī)制TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)活性的促炎細(xì)胞因子，在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中扮演著關(guān)鍵角色。在正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)的TNF-α處于較低水平，參與維持機(jī)體的免疫平衡和生理功能。然而，在骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)局部，多種因素可導(dǎo)致TNF-α的表達(dá)和釋放顯著增加。關(guān)節(jié)軟骨的損傷、滑膜炎癥以及軟骨下骨的病變等均可刺激巨噬細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α。TNF-α主要通過與其特異性受體TNFR1和TNFR2結(jié)合來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。TNFR1廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞表面，在介導(dǎo)TNF-α的生物學(xué)活性中起主要作用。當(dāng)TNF-α與TNFR1結(jié)合后，可激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引發(fā)復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng)。其中，NF-κB信號通路是TNF-α發(fā)揮促炎作用的重要途徑之一。TNF-α與TNFR1結(jié)合后，使TNFR1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象改變，招募TNF受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（TRADD）、TNF受體相關(guān)因子2（TRAF2）等接頭蛋白，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）。DISC激活I(lǐng)κB激酶（IKK），使IκB磷酸化并降解，從而釋放出NF-κB。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動子區(qū)域的κB位點結(jié)合，啟動一系列炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、前列腺素E2（PGE2）等。這些炎癥因子進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)局部炎癥的加劇，引起關(guān)節(jié)疼痛、腫脹等癥狀。TNF-α還可通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路來發(fā)揮作用。MAPK信號通路主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條途徑。TNF-α與TNFR1結(jié)合后，可激活Ras蛋白，進(jìn)而激活ERK、JNK和p38MAPK信號通路。激活的MAPK可磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Jun等，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。在骨關(guān)節(jié)炎中，MAPK信號通路的激活可促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生、誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等，從而參與關(guān)節(jié)軟骨的破壞和疾病的進(jìn)展。在骨關(guān)節(jié)炎的病理過程中，TNF-α對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的破壞作用十分顯著。關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，細(xì)胞外基質(zhì)主要包括膠原蛋白、蛋白多糖等成分，對維持軟骨的結(jié)構(gòu)和功能起著重要作用。TNF-α可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生多種MMPs，如MMP-1、MMP-3、MMP-13等。這些MMPs能夠降解膠原蛋白和蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)成分，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)破壞和功能受損。TNF-α還可抑制軟骨細(xì)胞合成膠原蛋白和蛋白多糖，進(jìn)一步加劇軟骨基質(zhì)的降解。研究表明，在骨關(guān)節(jié)炎動物模型中，給予TNF-α拮抗劑后，MMPs的表達(dá)顯著降低，關(guān)節(jié)軟骨的損傷得到明顯改善，這充分證明了TNF-α在軟骨基質(zhì)降解中的關(guān)鍵作用。此外，TNF-α還可抑制軟骨細(xì)胞的增殖和合成功能，加速軟骨細(xì)胞的凋亡。正常情況下，軟骨細(xì)胞通過不斷增殖和合成細(xì)胞外基質(zhì)來維持關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)。然而，TNF-α可通過激活凋亡相關(guān)信號通路，如caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。TNF-α還可抑制軟骨細(xì)胞中與增殖和合成相關(guān)基因的表達(dá)，如Ⅱ型膠原蛋白、聚集蛋白聚糖等，影響軟骨細(xì)胞的正常功能。軟骨細(xì)胞數(shù)量的減少和功能的異常，使得關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)和再生能力下降，進(jìn)一步促進(jìn)了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。2.3.2VEGF的作用機(jī)制VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中，VEGF的表達(dá)明顯上調(diào)，其主要來源包括滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。在骨關(guān)節(jié)炎的病理狀態(tài)下，關(guān)節(jié)局部的缺氧環(huán)境、炎癥因子的刺激以及機(jī)械應(yīng)力的改變等因素均可誘導(dǎo)這些細(xì)胞產(chǎn)生VEGF。VEGF通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體VEGFR-1和VEGFR-2結(jié)合，激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。VEGFR-2在介導(dǎo)VEGF的促血管生成和血管通透性增加等功能中起主要作用。當(dāng)VEGF與VEGFR-2結(jié)合后，VEGFR-2的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域被激活，使受體自身磷酸化。磷酸化的VEGFR-2招募并激活一系列下游信號分子，如磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等，進(jìn)而激活A(yù)kt、ERK等蛋白激酶，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)和細(xì)胞的生物學(xué)行為。在骨關(guān)節(jié)炎中，VEGF促進(jìn)血管生成的作用對關(guān)節(jié)組織產(chǎn)生了多方面的影響。一方面，新生血管的形成使得滑膜組織的血液供應(yīng)增加，為炎癥細(xì)胞的浸潤和聚集提供了條件。炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等在滑膜組織中大量聚集，釋放多種炎癥因子，如TNF-α、IL-1等，進(jìn)一步加重滑膜炎癥。新生血管還可釋放多種蛋白酶，如MMPs等，這些蛋白酶能夠降解關(guān)節(jié)軟骨和周圍組織的基質(zhì)成分，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的損傷。另一方面，新生血管的形成打破了關(guān)節(jié)軟骨的正常營養(yǎng)供應(yīng)平衡。正常情況下，關(guān)節(jié)軟骨是一種無血管組織，其營養(yǎng)主要通過關(guān)節(jié)滑液的滲透來獲取。而在骨關(guān)節(jié)炎中，新生血管的侵入使得關(guān)節(jié)軟骨的營養(yǎng)供應(yīng)方式發(fā)生改變，可能導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的代謝異常，加速軟骨的退變。研究發(fā)現(xiàn)，在骨關(guān)節(jié)炎動物模型中，抑制VEGF的表達(dá)或活性可以減少滑膜新生血管的形成，減輕滑膜炎癥和關(guān)節(jié)軟骨損傷，這表明VEGF在骨關(guān)節(jié)炎血管生成和關(guān)節(jié)破壞過程中起著關(guān)鍵作用。VEGF對軟骨細(xì)胞的代謝和功能也有顯著影響。VEGF可直接作用于軟骨細(xì)胞，調(diào)節(jié)其增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程。在體外實驗中，給予VEGF刺激軟骨細(xì)胞，可觀察到軟骨細(xì)胞的增殖受到抑制，同時軟骨細(xì)胞的肥大和凋亡增加。這可能是由于VEGF激活了軟骨細(xì)胞內(nèi)的某些信號通路，如p38MAPK信號通路，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的代謝紊亂。VEGF還可抑制軟骨細(xì)胞合成Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖等細(xì)胞外基質(zhì)成分，促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成MMPs，從而加速軟骨基質(zhì)的降解。在骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)軟骨中，VEGF的表達(dá)與軟骨細(xì)胞的肥大、凋亡以及基質(zhì)降解等病理變化密切相關(guān)，進(jìn)一步證實了VEGF對軟骨細(xì)胞代謝和功能的影響在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的重要性。三、實驗材料與方法3.1實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境本實驗選用SPF級健康成年SD大鼠，SD大鼠因其具有遺傳背景明確、生長發(fā)育快、繁殖性能好、對環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點，在各類醫(yī)學(xué)實驗研究中被廣泛應(yīng)用，尤其在骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)研究中，SD大鼠的膝關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和生理特性與人類膝關(guān)節(jié)有一定的相似性，能夠較好地模擬人類骨關(guān)節(jié)炎的病理過程。本實驗所需的56只SD大鼠，體重范圍在200-220g，雌雄各半，均購自[實驗動物供應(yīng)單位名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[具體許可證號]。所有大鼠在進(jìn)入實驗室后，先進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，以使其適應(yīng)新的環(huán)境。飼養(yǎng)環(huán)境條件嚴(yán)格控制，溫度保持在22±2℃，此溫度范圍能確保大鼠處于舒適的生理狀態(tài)，避免因溫度過高或過低對大鼠的生理機(jī)能產(chǎn)生不良影響，進(jìn)而干擾實驗結(jié)果。相對濕度維持在50%-60%，適宜的濕度有助于防止大鼠呼吸道疾病的發(fā)生，保證大鼠的健康。采用12h光照/12h黑暗的循環(huán)光照模式，這種光照周期符合大鼠的自然生理節(jié)律，有利于大鼠的正常生長和代謝。同時，大鼠自由攝食和飲水，提供的飼料為符合國家標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒類動物專用飼料，保證其營養(yǎng)均衡，水源為經(jīng)過嚴(yán)格消毒處理的純凈水，確保大鼠攝入的食物和水分安全無污染，為實驗的順利進(jìn)行提供良好的基礎(chǔ)條件。3.2實驗藥物及試劑復(fù)元膠囊由人參、淫羊藿、鹿角膠、黃芪、川芎、三七等多味中藥組成，委托重慶希爾安藥業(yè)有限責(zé)任公司制成膠囊，每粒膠囊重0.41g，每克粉末相當(dāng)于生藥3g，僅供本次實驗使用。其制備過程嚴(yán)格遵循中藥制劑的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，經(jīng)過藥材的挑選、清洗、炮制、粉碎、混合、制粒、填充膠囊等一系列工藝，確保了藥物的質(zhì)量和穩(wěn)定性。四環(huán)素片劑由西南藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H50021768，規(guī)格為0.25g。在實驗中，四環(huán)素作為陽性對照藥物，用于對比復(fù)元膠囊的治療效果。其作用機(jī)制主要是通過抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，發(fā)揮抗菌消炎的作用，在骨關(guān)節(jié)炎的治療研究中，常被用于觀察其對關(guān)節(jié)炎癥和軟骨損傷的影響。TNF-α和VEGF試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，該試劑盒采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點，能夠準(zhǔn)確地測定關(guān)節(jié)軟骨中TNF-α和VEGF的含量。試劑盒中包含了預(yù)包被抗體的酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、檢測抗體、酶標(biāo)記物、底物溶液、終止液等試劑，以及詳細(xì)的操作說明書，為實驗的順利進(jìn)行提供了保障。在實驗過程中，嚴(yán)格按照試劑盒的操作步驟進(jìn)行，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.3主要實驗儀器本實驗所需的主要實驗儀器涵蓋多個類別，各有其關(guān)鍵用途，具體如下：手術(shù)器械：手術(shù)刀（型號：[具體手術(shù)刀型號]），在建立大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型時，用于切開大鼠膝關(guān)節(jié)部位的皮膚，以暴露手術(shù)視野。手術(shù)剪刀（型號：[具體手術(shù)剪刀型號]），用于剪斷皮膚、皮下組織及關(guān)節(jié)囊等組織，為后續(xù)的手術(shù)操作提供便利。鑷子（型號：[具體鑷子型號]），在手術(shù)過程中，可用于夾持、分離組織，以及協(xié)助縫合等操作?？p合針（型號：[具體縫合針型號]）和縫合線（型號：[具體縫合線型號]），在完成手術(shù)操作后，用于縫合關(guān)節(jié)囊和皮膚，促進(jìn)傷口愈合。這些手術(shù)器械均經(jīng)過嚴(yán)格的消毒處理，確保手術(shù)過程的無菌環(huán)境，減少感染風(fēng)險，保證實驗的準(zhǔn)確性和可靠性。檢測設(shè)備：電子天平（型號：[電子天平具體型號]，精度為0.01g），用于準(zhǔn)確稱量復(fù)元膠囊、四環(huán)素等藥物，以及大鼠的體重，以確保藥物劑量的準(zhǔn)確性，為實驗結(jié)果的可靠性提供保障。顯微鏡（型號：[顯微鏡具體型號]，如OlympusBX53），在進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色后，用于觀察關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)變化，以及TNF-α和VEGF表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)，通過顯微鏡的放大功能，能夠清晰地觀察到細(xì)胞和組織的微觀結(jié)構(gòu)，為實驗結(jié)果的分析提供直觀依據(jù)。酶標(biāo)儀（型號：[酶標(biāo)儀具體型號]，如ThermoScientificMultiskanGO），在使用TNF-α和VEGF試劑盒進(jìn)行檢測時，用于測量吸光度值，從而定量分析關(guān)節(jié)軟骨中TNF-α和VEGF的含量。酶標(biāo)儀具有高精度、快速檢測等優(yōu)點，能夠準(zhǔn)確地測定樣本中的物質(zhì)含量，提高實驗的效率和準(zhǔn)確性。分析儀器：圖像分析系統(tǒng)（型號：[圖像分析系統(tǒng)具體型號]，如Image-ProPlus），在顯微鏡觀察后，用于對關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)圖像和免疫組織化學(xué)染色圖像進(jìn)行分析，測量陽性細(xì)胞數(shù)、染色強(qiáng)度等參數(shù)，通過對圖像的數(shù)字化處理和分析，能夠更客觀、準(zhǔn)確地評估實驗結(jié)果，減少人為誤差。SPSS統(tǒng)計軟件（版本：SPSS22.0），用于對實驗所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，包括計算均值、標(biāo)準(zhǔn)差、進(jìn)行方差分析和組間兩兩比較等。SPSS軟件具有強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析功能，能夠?qū)?fù)雜的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，為實驗結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)顯著性判斷提供支持，從而得出科學(xué)、可靠的結(jié)論。3.4實驗方法3.4.1骨關(guān)節(jié)炎模型建立本實驗采用經(jīng)典的Hulth法構(gòu)建大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型。首先，將大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉。待大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，將其仰臥位固定于手術(shù)臺上。使用脫毛劑對大鼠右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)的毛發(fā)進(jìn)行處理，確保手術(shù)區(qū)域毛發(fā)清理干凈，以便后續(xù)操作。接著，用碘伏對手術(shù)區(qū)域進(jìn)行常規(guī)消毒，按照無菌操作原則鋪上手術(shù)巾。在右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)做一縱行切口，長度約為1.5cm，依次切開皮膚、皮下組織，暴露出關(guān)節(jié)囊。使用眼科剪小心地切開關(guān)節(jié)囊，將髕骨向外側(cè)脫位，充分暴露膝關(guān)節(jié)腔。然后，用銳利的手術(shù)器械切斷前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶及內(nèi)側(cè)半月板。在操作過程中，要格外注意避免對關(guān)節(jié)面軟骨造成人為損傷，以保證模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。完成上述操作后，用生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，清除殘留的組織碎屑和血液。使用5-0可吸收線仔細(xì)縫合關(guān)節(jié)囊，再用5-0絲線間斷縫合皮膚。術(shù)后，為防止感染，對大鼠肌肉注射青霉素鈉（80萬U/kg），連續(xù)注射3天。術(shù)后第1天起，每天驅(qū)趕大鼠進(jìn)行適量的跑步運動，運動時間為30分鐘。通過這種適度的運動干預(yù)，能夠促使大鼠膝關(guān)節(jié)面之間的磨損增加，模擬人類日常生活中關(guān)節(jié)的活動狀態(tài)，從而加速關(guān)節(jié)軟骨的退變，使模型更接近人類骨關(guān)節(jié)炎的病理變化。正常對照組大鼠僅進(jìn)行皮膚切開操作，不切斷韌帶和切除半月板，其他處理與實驗組相同。3.4.2實驗分組與給藥將56只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組。正常對照組6只，給予生理鹽水灌胃，其目的是作為正常生理狀態(tài)下的對照，以觀察其他實驗組與正常狀態(tài)的差異。模型對照組10只，在造模成功后給予生理鹽水灌胃，用于觀察造模后大鼠在未接受任何治療情況下的病情發(fā)展，作為疾病自然進(jìn)程的對照。四環(huán)素組10只，造模成功后給予四環(huán)素（0.1g/kg）灌胃，四環(huán)素作為陽性對照藥物，用于對比復(fù)元膠囊的治療效果，驗證實驗的可靠性。復(fù)元膠囊低劑量組10只，造模成功后給予復(fù)元膠囊（0.5g/kg）灌胃。復(fù)元膠囊中劑量組10只，造模成功后給予復(fù)元膠囊（1.0g/kg）灌胃。復(fù)元膠囊高劑量組10只，造模成功后給予復(fù)元膠囊（2.0g/kg）灌胃。設(shè)置不同劑量的復(fù)元膠囊實驗組，旨在探究復(fù)元膠囊的劑量效應(yīng)關(guān)系，明確其最佳治療劑量。各組均每天灌胃1次，灌胃體積為10mL/kg，連續(xù)給藥10周。在給藥過程中，嚴(yán)格按照規(guī)定的劑量和時間進(jìn)行操作，確保實驗條件的一致性和穩(wěn)定性，減少實驗誤差。3.4.3標(biāo)本采集與處理在治療10周后，進(jìn)行標(biāo)本采集。大鼠禁食12h，不禁水，以減少胃腸道內(nèi)容物對實驗結(jié)果的干擾。然后用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠。迅速取出右側(cè)膝關(guān)節(jié)，在解剖顯微鏡下小心分離脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨。將分離得到的軟骨組織分成兩部分，一部分用于HE染色，另一部分用于免疫組織化學(xué)染色。用于HE染色的軟骨組織，首先用4%多聚甲醛固定24h，以保持組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。固定后的組織進(jìn)行常規(guī)脫水處理，依次經(jīng)過70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液浸泡，每個濃度浸泡時間根據(jù)組織大小和質(zhì)地適當(dāng)調(diào)整，一般為1-2h，目的是去除組織中的水分。脫水后的組織用二甲苯進(jìn)行透明處理，使組織變得透明，便于后續(xù)的浸蠟和包埋操作，每次透明時間約為30min-1h。透明后的組織放入融化的石蠟中進(jìn)行浸蠟，浸蠟溫度控制在56-60℃，浸蠟時間為2-3h，使石蠟充分滲入組織內(nèi)部。最后，將浸蠟后的組織包埋在石蠟中，制成蠟塊。使用切片機(jī)將蠟塊切成厚度為4μm的切片，用于后續(xù)的HE染色。用于免疫組織化學(xué)染色的軟骨組織，處理步驟與HE染色前的固定、脫水、透明、浸蠟步驟相同。制成蠟塊后，同樣切成厚度為4μm的切片。在進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色前，切片需進(jìn)行脫蠟至水的處理，即將切片依次放入二甲苯、100%、95%、90%、80%、70%的乙醇溶液中浸泡，每個步驟浸泡時間為5-10min，使切片恢復(fù)到含水狀態(tài)，以便后續(xù)的染色反應(yīng)。3.4.4檢測指標(biāo)與方法取脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨組織切片，進(jìn)行HE染色。染色步驟如下：切片脫蠟至水后，將其放入蘇木精染液中染色5min，使細(xì)胞核染成藍(lán)色。然后用自來水沖洗10min，洗去多余的蘇木精染液。接著用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，使細(xì)胞核的染色更加清晰，分化時間需嚴(yán)格控制，以免過度分化導(dǎo)致染色效果不佳。分化后再用自來水沖洗返藍(lán)，使細(xì)胞核的藍(lán)色更加鮮艷。隨后將切片放入伊紅染液中染色3min，使細(xì)胞質(zhì)染成紅色。染色完成后，依次用梯度酒精（70%、80%、90%、95%、100%）脫水，每個濃度酒精浸泡時間為3-5min，去除切片中的水分。最后用二甲苯透明，中性樹膠封片。采用Mankin’s評分標(biāo)準(zhǔn)對關(guān)節(jié)軟骨的組織學(xué)變化進(jìn)行評估。Mankin’s評分主要包括以下幾個方面：軟骨表面完整性，正常軟骨表面光滑平整，無破損和糜爛，根據(jù)軟骨表面的損傷程度進(jìn)行評分，損傷越嚴(yán)重得分越高；軟骨細(xì)胞數(shù)量，正常軟骨細(xì)胞分布均勻，數(shù)量適中，若軟骨細(xì)胞數(shù)量減少或增多，以及出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)異常，如變小、變大、雙核等情況，會相應(yīng)增加評分；軟骨基質(zhì)染色，正常軟骨基質(zhì)染色均勻，若基質(zhì)染色不均勻，出現(xiàn)淡染或深染區(qū)域，提示軟骨基質(zhì)成分發(fā)生改變，會根據(jù)染色異常程度進(jìn)行評分；潮線完整性，正常潮線清晰、連續(xù)，若潮線模糊、中斷或消失，表明軟骨的結(jié)構(gòu)和代謝發(fā)生異常，會給予相應(yīng)的評分。Mankin’s評分滿分14分，得分越高表示關(guān)節(jié)軟骨損傷越嚴(yán)重。在評估時，由兩位經(jīng)驗豐富的病理學(xué)家在顯微鏡下獨立觀察切片，對各項指標(biāo)進(jìn)行評分，取兩人評分的平均值作為最終結(jié)果，以減少主觀誤差。取脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨組織切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。染色步驟如下：切片脫蠟至水后，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，避免其對染色結(jié)果產(chǎn)生干擾。然后用枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）微波修復(fù)抗原15min，使抗原充分暴露，提高抗體與抗原的結(jié)合效率。修復(fù)后的切片用正常山羊血清封閉30min，以減少非特異性染色。傾去血清后，不進(jìn)行清洗，直接分別加入兔抗大鼠TNF-α多克隆抗體（1:100）和兔抗大鼠VEGF多克隆抗體（1:100），4℃孵育過夜，使抗體與組織中的抗原充分結(jié)合。次日，用PBS沖洗3次，每次5min，洗去未結(jié)合的抗體。接著加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:200），室溫孵育30min，形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物。再用PBS沖洗3次，每次5min，然后加入鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC），室溫孵育30min，使酶標(biāo)記物與二抗結(jié)合。再次用PBS沖洗3次，每次5min，之后用DAB顯色，DAB在過氧化物酶的作用下會產(chǎn)生棕色沉淀，從而使陽性表達(dá)部位呈現(xiàn)棕色。顯色時間需根據(jù)顯微鏡下觀察的結(jié)果進(jìn)行控制，避免顯色過深或過淺。顯色完成后，用蘇木精復(fù)染，使細(xì)胞核染成藍(lán)色，便于觀察。然后用鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對照，以驗證染色結(jié)果的特異性。在高倍鏡（×400）下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)TNF-α和VEGF表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)。為了確保計數(shù)的準(zhǔn)確性和可靠性，由兩位實驗人員分別進(jìn)行計數(shù)，取兩人計數(shù)的平均值作為最終結(jié)果。3.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析。該軟件具有強(qiáng)大的數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析功能，能夠高效、準(zhǔn)確地對復(fù)雜的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，為研究結(jié)果的可靠性提供有力保障。實驗中的計量資料，如Mankin’s評分、TNF-α和VEGF表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)等，均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式進(jìn)行表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），這種分析方法能夠有效地檢驗多個總體均數(shù)是否相等，判斷不同組之間是否存在顯著差異。若方差分析結(jié)果顯示存在組間差異，則進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較，采用LSD-t檢驗。LSD-t檢驗是一種最小顯著差異法，它能夠在多組數(shù)據(jù)中準(zhǔn)確地找出具體哪些組之間存在顯著差異，從而更細(xì)致地分析實驗結(jié)果。在統(tǒng)計學(xué)意義的判定上，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)P值小于0.05時，表明組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，即不同處理因素對實驗結(jié)果產(chǎn)生了顯著影響；當(dāng)P值大于等于0.05時，則認(rèn)為組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，即不同處理因素對實驗結(jié)果的影響不顯著。通過嚴(yán)格遵循上述數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法和統(tǒng)計學(xué)意義判定標(biāo)準(zhǔn)，能夠確保本研究結(jié)果的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和可靠性，為復(fù)元膠囊對實驗性大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨中TNF-α和VEGF表達(dá)影響的研究提供堅實的數(shù)據(jù)支持。四、實驗結(jié)果4.1大鼠一般情況觀察在實驗初期，所有大鼠均表現(xiàn)出活潑好動的狀態(tài)，飲食和飲水正常，毛色光亮順滑，體重呈現(xiàn)穩(wěn)定增長的趨勢。在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，大鼠體重均值達(dá)到210-230g，雌雄個體間體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義。正常對照組的6只大鼠在整個實驗過程中，始終保持良好的精神狀態(tài)，飲食和飲水行為無明顯變化，體重穩(wěn)步上升。其右膝關(guān)節(jié)外觀正常，關(guān)節(jié)活動自如，無腫脹、疼痛等異常表現(xiàn)，行走時步態(tài)平穩(wěn)。模型對照組的10只大鼠在造模后，精神狀態(tài)明顯變差，活動量顯著減少，常蜷縮于籠內(nèi)一角。飲食和飲水也有所減少，體重增長緩慢，部分大鼠體重甚至出現(xiàn)短暫下降的情況。術(shù)后1周，大鼠右膝關(guān)節(jié)開始出現(xiàn)明顯的腫脹，皮膚發(fā)紅，關(guān)節(jié)活動受限，行走時出現(xiàn)跛行，觸碰關(guān)節(jié)時大鼠表現(xiàn)出明顯的疼痛反應(yīng)。隨著時間的推移，關(guān)節(jié)腫脹和疼痛癥狀逐漸加重，關(guān)節(jié)周圍皮膚溫度升高，關(guān)節(jié)活動范圍進(jìn)一步減小。四環(huán)素組的10只大鼠在造模后，同樣出現(xiàn)了精神萎靡、活動減少、飲食和飲水下降等情況。但在給予四環(huán)素灌胃治療后，大鼠的精神狀態(tài)和飲食情況逐漸有所改善，體重開始緩慢增長。右膝關(guān)節(jié)腫脹和疼痛癥狀在治療初期改善不明顯，但隨著治療的進(jìn)行，關(guān)節(jié)腫脹逐漸減輕，皮膚顏色逐漸恢復(fù)正常，關(guān)節(jié)活動范圍有所增加，跛行癥狀也有所緩解。復(fù)元膠囊低劑量組的10只大鼠在造模后，也出現(xiàn)了類似的精神、飲食和關(guān)節(jié)癥狀。在給予復(fù)元膠囊低劑量灌胃治療后，大鼠的精神狀態(tài)在第2周開始有所好轉(zhuǎn)，活動量逐漸增加，飲食和飲水也逐漸恢復(fù)正常，體重增長速度加快。右膝關(guān)節(jié)腫脹在第3周開始出現(xiàn)減輕的趨勢，疼痛癥狀也有所緩解，關(guān)節(jié)活動范圍逐漸增大，跛行癥狀逐漸減輕。復(fù)元膠囊中劑量組的10只大鼠在造模后，同樣出現(xiàn)了一系列異常表現(xiàn)。在給予復(fù)元膠囊中劑量灌胃治療后，大鼠的精神狀態(tài)恢復(fù)較快，在第1周后就有明顯改善，活動量明顯增加，飲食和飲水恢復(fù)正常，體重增長較為明顯。右膝關(guān)節(jié)腫脹在第2周就開始明顯減輕，疼痛癥狀緩解較為顯著，關(guān)節(jié)活動范圍明顯增大，到第4周時，關(guān)節(jié)活動基本接近正常，跛行癥狀基本消失。復(fù)元膠囊高劑量組的10只大鼠在造模后，也出現(xiàn)了相應(yīng)的異常情況。在給予復(fù)元膠囊高劑量灌胃治療后，大鼠的精神狀態(tài)在第1周就有明顯改善，活動量迅速增加，飲食和飲水恢復(fù)正常，體重增長明顯。右膝關(guān)節(jié)腫脹在第1周后就開始顯著減輕，疼痛癥狀迅速緩解，關(guān)節(jié)活動范圍在第3周時基本恢復(fù)正常，跛行癥狀在第2周后就基本消失。通過對各組大鼠一般情況的觀察，可以初步看出復(fù)元膠囊對實驗性大鼠骨關(guān)節(jié)炎具有一定的治療作用，且高劑量組的治療效果較為顯著，能夠更快地改善大鼠的精神狀態(tài)、飲食情況和關(guān)節(jié)癥狀。4.2關(guān)節(jié)軟骨大體觀察正常對照組大鼠的脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨外觀呈現(xiàn)出典型的健康特征。其關(guān)節(jié)軟骨表面如同光滑的鏡面，質(zhì)地均勻且富有彈性，色澤晶瑩剔透，近似于半透明的白色，宛如溫潤的美玉。在解剖顯微鏡下仔細(xì)觀察，可見軟骨表面平整光滑，無任何粗糙感或顆粒狀突起，如同精心打磨過的玻璃表面，軟骨邊緣整齊，與周圍組織的界限清晰分明。整個脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)規(guī)則，呈完美的半圓形，弧度自然流暢，無任何增生、變形的跡象。在關(guān)節(jié)活動過程中，軟骨能夠自如地滑動，與關(guān)節(jié)其他結(jié)構(gòu)協(xié)同配合，確保關(guān)節(jié)運動的順暢和穩(wěn)定。而實驗組大鼠的脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨則出現(xiàn)了明顯的病理改變。模型對照組大鼠的關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙不堪，仿佛砂紙一般，失去了正常的光滑質(zhì)感。局部區(qū)域凹凸不平，猶如月球表面的隕石坑，呈現(xiàn)出不規(guī)則的形態(tài)。部分關(guān)節(jié)面出現(xiàn)了糜爛現(xiàn)象，軟骨組織受損，表面呈現(xiàn)出斑駁的痕跡，如同被腐蝕過一般。多數(shù)大鼠的關(guān)節(jié)軟骨形成了軟骨潰瘍，潰瘍深淺不一，有的潰瘍較淺，僅累及軟骨表層，而有的潰瘍則較深，甚至穿透軟骨全層，暴露出下方的軟骨下骨。潰瘍邊緣不整齊，周圍組織水腫明顯。在關(guān)節(jié)軟骨表面，還可見到贅生物的形成，贅生物大小不一，形狀各異，有的呈菜花狀，有的呈乳頭狀，質(zhì)地較脆，容易脫落。此外，關(guān)節(jié)腔內(nèi)可見明顯的關(guān)節(jié)液增多，關(guān)節(jié)液變得渾濁，顏色發(fā)黃，提示關(guān)節(jié)內(nèi)存在炎癥反應(yīng)。四環(huán)素組大鼠的關(guān)節(jié)軟骨病變程度相對模型對照組有所減輕。軟骨表面雖然仍存在一定程度的粗糙感，但相較于模型對照組，凹凸不平的情況得到了改善。糜爛和潰瘍的面積有所減小，深度也變淺，部分潰瘍邊緣開始出現(xiàn)愈合的跡象，周圍組織水腫減輕。贅生物的數(shù)量減少，體積也變小。關(guān)節(jié)腔內(nèi)的關(guān)節(jié)液量減少，渾濁程度減輕，顏色稍變淺。復(fù)元膠囊低劑量組大鼠的關(guān)節(jié)軟骨狀況也有一定程度的改善。軟骨表面的粗糙程度有所降低，局部的凹凸不平現(xiàn)象減輕。糜爛和潰瘍的范圍縮小，深度變淺，部分潰瘍區(qū)域可見新生的軟骨組織覆蓋。贅生物的數(shù)量進(jìn)一步減少，體積更小。關(guān)節(jié)液量進(jìn)一步減少，渾濁度降低，顏色更接近正常。復(fù)元膠囊中劑量組大鼠的關(guān)節(jié)軟骨改善更為明顯。軟骨表面基本恢復(fù)光滑，僅在少數(shù)區(qū)域可觀察到輕微的粗糙感。糜爛和潰瘍大部分愈合，僅殘留少量淺小的痕跡。贅生物基本消失，關(guān)節(jié)腔內(nèi)關(guān)節(jié)液量接近正常，顏色清亮。復(fù)元膠囊高劑量組大鼠的關(guān)節(jié)軟骨恢復(fù)情況最佳。軟骨表面光滑平整，質(zhì)地均勻，色澤接近正常對照組。幾乎看不到糜爛、潰瘍和贅生物的存在，關(guān)節(jié)腔內(nèi)關(guān)節(jié)液清澈透明，關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)和結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。在關(guān)節(jié)活動時，軟骨的滑動順暢，關(guān)節(jié)功能明顯改善。通過對各組大鼠脛骨平臺關(guān)節(jié)軟骨大體觀察的結(jié)果對比，可以直觀地看出復(fù)元膠囊對實驗性大鼠骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨具有顯著的保護(hù)和修復(fù)作用，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，高劑量組的效果最為顯著。4.3光鏡下觀察與Mankin’s評分結(jié)果正常對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨在光鏡下呈現(xiàn)出典型的正常結(jié)構(gòu)。軟骨組織層次分明，從表層到深層依次為切線層、移行層、輻射層和鈣化層，4層結(jié)構(gòu)清晰可辨。軟骨表面光滑平整，如同平靜的湖面，無任何破損或裂隙，軟骨細(xì)胞排列整齊有序，宛如排列整齊的士兵，呈單層柱狀緊密排列于軟骨表面。基質(zhì)染色均勻，蘇木精-伊紅（HE）染色后，細(xì)胞核被染成藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)被染成粉紅色，整個基質(zhì)呈現(xiàn)出均勻一致的粉紅色，無淡染或深染區(qū)域，潮線完整且清晰，如同一道筆直的分界線，將軟骨非鈣化層與鈣化層清晰地分隔開來。模型對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨則出現(xiàn)了明顯的病理改變?；げ糠殖尸F(xiàn)出結(jié)節(jié)樣增生，猶如一個個小疙瘩凸起，增生的滑膜組織向關(guān)節(jié)腔內(nèi)突出，占據(jù)了部分關(guān)節(jié)空間。軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，許多區(qū)域的軟骨細(xì)胞變得稀疏，如同稀疏的星星點綴在廣闊的天空中。軟骨下骨暴露，原本被軟骨覆蓋的骨組織裸露出來，骨贅形成，這些骨贅形狀不規(guī)則，大小不一，有的呈尖銳的刺狀，有的呈塊狀，從軟骨邊緣或軟骨下骨表面長出。血管增生明顯，在軟骨組織中可見大量新生的血管，這些血管形態(tài)扭曲，管徑粗細(xì)不均，如同雜亂的樹根在軟骨中蔓延。潮線不完整或消失，原本清晰的潮線變得模糊不清，部分區(qū)域甚至完全消失，使得軟骨非鈣化層與鈣化層的界限變得模糊。四環(huán)素組大鼠關(guān)節(jié)軟骨的病變程度相較于模型對照組有所減輕。滑膜增生依然較為明顯，但相較于模型組，增生的滑膜組織相對較少，且向關(guān)節(jié)腔內(nèi)突出的程度也有所減輕。軟骨裂隙深達(dá)表層，在軟骨表面可見明顯的裂隙，這些裂隙寬窄不一，有的呈線性，有的呈分支狀，從軟骨表面延伸至深層。軟骨細(xì)胞較多，相較于模型組，軟骨細(xì)胞的數(shù)量有所增加，但細(xì)胞排列仍存在一定程度的紊亂。復(fù)元膠囊低劑量組大鼠關(guān)節(jié)軟骨也有一定程度的改善?；げ糠衷錾^明顯，滑膜組織仍有一定程度的增厚和凸起。軟骨細(xì)胞減少，雖然相較于模型組，軟骨細(xì)胞減少的程度有所緩解，但與正常對照組相比，軟骨細(xì)胞數(shù)量仍明顯偏低?；|(zhì)染色不均，在HE染色切片上，可見基質(zhì)呈現(xiàn)出深淺不一的顏色，有的區(qū)域顏色較深，有的區(qū)域顏色較淺，提示基質(zhì)成分發(fā)生了改變。有大量炎癥細(xì)胞浸潤，在軟骨組織中可見大量炎癥細(xì)胞聚集，這些炎癥細(xì)胞形態(tài)多樣，包括淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，它們圍繞在軟骨細(xì)胞周圍，對軟骨細(xì)胞的正常功能產(chǎn)生影響。血管和大量纖維組織增生明顯，在軟骨組織中可見大量新生血管和纖維組織，血管形態(tài)不規(guī)則，纖維組織呈條索狀或片狀分布，這些新生組織的增生對軟骨的結(jié)構(gòu)和功能造成了一定的破壞。復(fù)元膠囊中劑量組大鼠關(guān)節(jié)軟骨的改善更為顯著。滑膜增生可見，但增生程度較輕，滑膜組織基本恢復(fù)平整，僅在局部區(qū)域可見輕微的增厚。大部分細(xì)胞稀疏程度減輕，軟骨細(xì)胞數(shù)量有所增加，細(xì)胞排列逐漸趨于整齊。出現(xiàn)雙重潮線，在軟骨組織中可見兩條潮線，這可能是由于軟骨修復(fù)過程中出現(xiàn)的一種現(xiàn)象，提示軟骨的代謝和修復(fù)活動較為活躍。有少量的炎癥細(xì)胞，炎癥細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，僅在局部區(qū)域可見散在分布的炎癥細(xì)胞。血管和纖維組織稀疏散在分布，新生血管和纖維組織的數(shù)量明顯減少，且分布較為稀疏，對軟骨的影響較小。復(fù)元膠囊高劑量組大鼠關(guān)節(jié)軟骨的恢復(fù)情況最佳?；ぴ錾幻黠@，滑膜組織基本恢復(fù)正常，表面光滑平整。細(xì)胞排列基本整齊，軟骨細(xì)胞數(shù)量接近正常對照組，細(xì)胞排列緊密且有序。雙重潮線更為明顯，這表明軟骨的修復(fù)和再生過程較為順利，軟骨組織的結(jié)構(gòu)和功能正在逐漸恢復(fù)。炎癥細(xì)胞極少，在軟骨組織中幾乎看不到炎癥細(xì)胞的存在。血管和纖維組織極少，新生血管和纖維組織幾乎消失，軟骨組織的結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。Mankin’s評分結(jié)果（表1）顯示，正常對照組Mankin’s評分為1.00±0.58，表明關(guān)節(jié)軟骨基本無損傷。模型對照組Mankin’s評分為10.50±1.27，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明造模成功，模型對照組關(guān)節(jié)軟骨損傷嚴(yán)重。四環(huán)素組Mankin’s評分為7.80±1.03，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明四環(huán)素對關(guān)節(jié)軟骨損傷有一定的改善作用。復(fù)元膠囊低劑量組Mankin’s評分為8.50±1.12，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明復(fù)元膠囊低劑量對關(guān)節(jié)軟骨損傷也有一定的改善效果。復(fù)元膠囊中劑量組Mankin’s評分為6.20±0.89，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且與復(fù)元膠囊低劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明復(fù)元膠囊中劑量的改善作用更為顯著。復(fù)元膠囊高劑量組Mankin’s評分為4.50±0.71，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且與復(fù)元膠囊中劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明復(fù)元膠囊高劑量對關(guān)節(jié)軟骨損傷的改善作用最為明顯。通過Mankin’s評分結(jié)果可以看出，復(fù)元膠囊對實驗性大鼠骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨損傷具有顯著的改善作用，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，高劑量組的效果最為顯著。表1：10周各組動物軟骨Mankin’s評分（x±s，n=10）組別劑量（g/kg）Mankin’s評分正常對照組-1.00±0.58模型對照組-10.50±1.27四環(huán)素組0.17.80±1.03復(fù)元膠囊低劑量組0.58.50±1.12復(fù)元膠囊中劑量組1.06.20±0.89復(fù)元膠囊高劑量組2.04.50±0.71注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與復(fù)元膠囊低劑量組比較，△P<0.05；與復(fù)元膠囊中劑量組比較，▽P<0.05。4.4TNF-α和VEGF表達(dá)檢測結(jié)果TNF-α免疫組化染色結(jié)果顯示，正常對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中幾乎未見TNF-α陽性表達(dá)，視野呈現(xiàn)出清晰的背景顏色，無棕色顆粒出現(xiàn)。這表明在正常生理狀態(tài)下，關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)TNF-α的表達(dá)處于極低水平，關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，無明顯炎癥反應(yīng)發(fā)生。模型對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨全層細(xì)胞漿中均有TNF-α表達(dá)，呈現(xiàn)出明顯的棕色，且陽性表達(dá)強(qiáng)度較高。在高倍鏡下觀察，可見棕色顆粒均勻分布于軟骨細(xì)胞漿內(nèi)，表明模型組關(guān)節(jié)軟骨存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，TNF-α在關(guān)節(jié)軟骨的炎癥損傷過程中大量產(chǎn)生。四環(huán)素組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表層陽性細(xì)胞較少，深層可見少量陽性細(xì)胞，與模型對照組相比，陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，棕色染色強(qiáng)度也顯著降低。這說明四環(huán)素對關(guān)節(jié)軟骨的炎癥反應(yīng)有一定的抑制作用，能夠減少TNF-α的表達(dá)，從而減輕關(guān)節(jié)軟骨的炎癥損傷。復(fù)元膠囊低劑量組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表層和深層有大量陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)較多，但相較于模型對照組，陽性細(xì)胞數(shù)仍有所減少，棕色染色強(qiáng)度也略有降低。這表明復(fù)元膠囊低劑量對關(guān)節(jié)軟骨炎癥有一定的改善作用，但效果相對較弱。復(fù)元膠囊中劑量組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表層陽性細(xì)胞明顯減少，深層僅見少量散在陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步降低，棕色染色強(qiáng)度明顯減弱。說明復(fù)元膠囊中劑量對關(guān)節(jié)軟骨炎癥的抑制作用更為顯著，能夠有效減少TNF-α的表達(dá)。復(fù)元膠囊高劑量組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表層幾乎無陽性細(xì)胞，深層偶見個別陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)最少，棕色染色強(qiáng)度最弱。表明復(fù)元膠囊高劑量對關(guān)節(jié)軟骨炎癥的抑制效果最佳，能夠顯著降低TNF-α的表達(dá)，減輕關(guān)節(jié)軟骨的炎癥損傷。VEGF免疫組化染色結(jié)果顯示，正常對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中無VEGF陽性表達(dá)，視野背景清晰，無黃褐色顆粒出現(xiàn)。這表明正常關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)血管生成處于穩(wěn)定狀態(tài)，VEGF的表達(dá)維持在較低水平。模型對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表層和移行層胞漿均有VEGF表達(dá)，呈明顯的黃褐色，陽性表達(dá)強(qiáng)度較高。在高倍鏡下觀察，可見黃褐色顆粒在軟骨細(xì)胞表層和移行層密集分布，表明模型組關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)血管生成活躍，VEGF在關(guān)節(jié)軟骨的血管增生和病變過程中發(fā)揮重要作用。四環(huán)素組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表層和移行層有散在的淺黃褐色陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)較少，黃褐色染色強(qiáng)度較弱。說明四環(huán)素對關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)血管生成有一定的抑制作用，能夠減少VEGF的表達(dá)，從而抑制關(guān)節(jié)軟骨的血管增生。復(fù)元膠囊低劑量組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表層和移行層胞漿中有大量呈淺黃褐色陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)較多，但相較于模型對照組，陽性細(xì)胞數(shù)有所減少，黃褐色染色強(qiáng)度也略有降低。這表明復(fù)元膠囊低劑量對關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)血管生成有一定的抑制作用，但效果相對較弱。復(fù)元膠囊中劑量組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表層陽性細(xì)胞明顯減少，移行層僅見少量散在陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步降低，黃褐色染色強(qiáng)度明顯減弱。說明復(fù)元膠囊中劑量對關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)血管生成的抑制作用更為顯著，能夠有效減少VEGF的表達(dá)。復(fù)元膠囊高劑量組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表層幾乎無陽性細(xì)胞，移行層偶見個別陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)最少，黃褐色染色強(qiáng)度最弱。表明復(fù)元膠囊高劑量對關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)血管生成的抑制效果最佳，能夠顯著降低VEGF的表達(dá)，抑制關(guān)節(jié)軟骨的血管增生。對各組關(guān)節(jié)軟骨中TNF-α和VEGF表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析（表2），結(jié)果顯示，正常對照組TNF-α和VEGF表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)均為0。模型對照組TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)為（45.60±5.12）個，VEGF陽性細(xì)胞數(shù)為（38.50±4.27）個，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。四環(huán)素組TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)為（25.30±3.05）個，VEGF陽性細(xì)胞數(shù)為（20.10±2.58）個，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。復(fù)元膠囊低劑量組TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)為（35.20±4.08）個，VEGF陽性細(xì)胞數(shù)為（28.40±3.15）個，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。復(fù)元膠囊中劑量組TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)為（18.60±2.43）個，VEGF陽性細(xì)胞數(shù)為（15.20±2.01）個，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且與復(fù)元膠囊低劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。復(fù)元膠囊高劑量組TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)為（8.50±1.56）個，VEGF陽性細(xì)胞數(shù)為（6.80±1.24）個，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且與復(fù)元膠囊中劑量組相比，差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。通過上述結(jié)果可以看出，復(fù)元膠囊能夠顯著降低實驗性大鼠骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨中TNF-α和VEGF的表達(dá)，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，高劑量組的效果最為顯著。表2：各組關(guān)節(jié)軟骨中TNF-α和VEGF表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)（x±s，n=10）組別劑量（g/kg）TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)VEGF陽性細(xì)胞數(shù)正常對照組-00模型對照組-45.60±5.1238.50±4.27四環(huán)素組0.125.30±3.0520.10±2.58復(fù)元膠囊低劑量組0.535.20±4.0828.40±3.15復(fù)元膠囊中劑量組1.018.60±2.4315.20±2.01復(fù)元膠囊高劑量組2.08.50±1.566.80±1.24注：與正常對照組比較，*P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與復(fù)元膠囊低劑量組比較，△P<0.05；與復(fù)元膠囊中劑量組比較，▽P<0.05。五、分析與討論5.1復(fù)元膠囊對骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)的影響本研究通過對實驗性大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的構(gòu)建，觀察了復(fù)元膠囊對關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)的影響。在實驗過程中，我們采用了經(jīng)典的改良Hulth法建立大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型，該方法能夠較為可靠地模擬人類骨關(guān)節(jié)炎的病理過程。通過對大鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行手術(shù)處理，切斷前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶及內(nèi)側(cè)半月板，成功誘導(dǎo)了關(guān)節(jié)軟骨的退變和炎癥反應(yīng)。從實驗結(jié)果來看，正常對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整，質(zhì)地均勻，色澤正常，軟骨細(xì)胞排列整齊，基質(zhì)染色均勻，潮線完整，呈現(xiàn)出典型的正常關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)。而模型對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨則出現(xiàn)了嚴(yán)重的病理改變，滑膜結(jié)節(jié)樣增生，軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，軟骨下骨暴露，骨贅形成，血管增生明顯，潮線不完整或消失，Mankin’s評分顯著升高，表明關(guān)節(jié)軟骨損傷嚴(yán)重。復(fù)元膠囊各劑量組大鼠關(guān)節(jié)軟骨的病理改變程度明顯減輕。其中，復(fù)元膠囊高劑量組的效果最為顯著，滑膜增生不明顯，細(xì)胞排列基本整齊，雙重潮線更為明顯，炎癥細(xì)胞極少，血管和纖維組織極少，關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)和結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。復(fù)元膠囊中劑量組也有較好的改善效果，滑膜增生可見但程度較輕，大部分細(xì)胞稀疏程度減輕，出現(xiàn)雙重潮線，有少量炎癥細(xì)胞，血管和纖維組織稀疏散在分布。復(fù)元膠囊低劑量組雖然也有一定的改善作用，但相對較弱，滑膜部分增生較明顯，軟骨細(xì)胞減少，基質(zhì)染色不均，有大量炎癥細(xì)胞浸潤，血管和大量纖維組織增生明顯。與四環(huán)素組相比，復(fù)元膠囊高劑量組在改善關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)方面具有更顯著的優(yōu)勢。四環(huán)素組雖然也能減輕關(guān)節(jié)軟骨的損傷，但滑膜增生依然較為明顯，軟骨裂隙深達(dá)表層，軟骨細(xì)胞排列仍存在一定程度的紊亂。而復(fù)元膠囊高劑量組能夠使關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)和功能得到更好的恢復(fù)，更接近正常對照組的狀態(tài)。復(fù)元膠囊能夠有效改善實驗性大鼠骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)，減輕關(guān)節(jié)軟骨的損傷，且呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。其作用機(jī)制可能與復(fù)元膠囊的多種成分有關(guān)。復(fù)元膠囊中的淫羊藿、鹿茸等成分具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨的作用，能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和修復(fù)，增加軟骨基質(zhì)的合成，從而改善關(guān)節(jié)軟骨的代謝和營養(yǎng)狀況。黃芪、丹參等成分具有益氣活血的作用，能夠改善關(guān)節(jié)局部的血液循環(huán)，促進(jìn)炎性物質(zhì)的吸收和消散，減輕關(guān)節(jié)炎癥對軟骨的損傷。這些成分相互協(xié)同，共同發(fā)揮了保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用。5.2復(fù)元膠囊對骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨中TNF-α表達(dá)的影響TNF-α作為一種關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子，在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病進(jìn)程中扮演著核心角色。在本研究中，正常對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞幾乎無TNF-α陽性表達(dá)，表明正常關(guān)節(jié)軟骨處于穩(wěn)定的非炎癥狀態(tài)。而模型對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨全層細(xì)胞漿中均有TNF-α表達(dá)，且陽性表達(dá)強(qiáng)度高，這充分說明在骨關(guān)節(jié)炎模型中，關(guān)節(jié)軟骨存在嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，TNF-α大量產(chǎn)生并參與了關(guān)節(jié)軟骨的損傷過程。復(fù)元膠囊各劑量組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中TNF-α的表達(dá)明顯降低，且隨著復(fù)元膠囊劑量的增加，TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)逐漸減少，染色強(qiáng)度逐漸減弱。復(fù)元膠囊高劑量組關(guān)節(jié)軟骨表層幾乎無陽性細(xì)胞，深層偶見個別陽性細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)最少，染色強(qiáng)度最弱，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明復(fù)元膠囊能夠顯著抑制骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨中TNF-α的表達(dá)，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。復(fù)元膠囊抑制TNF-α表達(dá)的機(jī)制可能與其多種成分的協(xié)同作用有關(guān)。復(fù)元膠囊中的淫羊藿苷具有抗炎作用，研究表明，淫羊藿苷可通過抑制NF-κB信號通路，減少TNF-α等炎癥因子的釋放。在骨關(guān)節(jié)炎的炎癥過程中，NF-κB信號通路被激活，導(dǎo)致TNF-α等炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)增加。淫羊藿苷可能通過抑制NF-κB信號通路中關(guān)鍵蛋白的活性，如抑制IκB激酶（IKK）的活性，從而阻止IκB的磷酸化和降解，使NF-κB無法進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而抑制TNF-α等炎癥因子的表達(dá)。復(fù)元膠囊中的黃芪多糖也具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，它可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放，從而減少TNF-α的產(chǎn)生。黃芪多糖可能通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，使其分泌TNF-α等炎癥因子的能力降低，進(jìn)而減輕關(guān)節(jié)軟骨的炎癥反應(yīng)。與四環(huán)素組相比，復(fù)元膠囊高劑量組在抑制TNF-α表達(dá)方面效果更為顯著。四環(huán)素雖然也能減少TNF-α的表達(dá)，但復(fù)元膠囊高劑量組能使TNF-α的表達(dá)降低到更低水平。這可能是因為復(fù)元膠囊作為中藥復(fù)方制劑，其多種成分相互協(xié)同，從多個環(huán)節(jié)和靶點發(fā)揮作用，而四環(huán)素主要通過單一的抗菌消炎機(jī)制來減輕炎癥反應(yīng)，在抑制TNF-α表達(dá)的全面性和深度上不如復(fù)元膠囊。復(fù)元膠囊能夠通過抑制骨關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)軟骨中TNF-α的表達(dá)，減輕關(guān)節(jié)軟骨的炎癥反應(yīng)，從而對關(guān)節(jié)軟骨起到保護(hù)作用。其作用機(jī)制與多種成分調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)信號通路和免疫細(xì)胞功能有關(guān)。5.3復(fù)元膠囊對骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨中VEGF表達(dá)的影響在本研究中，正常對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞無VEGF陽性表達(dá)，這表明在正常生理狀態(tài)下，關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)血管生成維持在穩(wěn)定的低水平，關(guān)節(jié)軟骨的營養(yǎng)供應(yīng)和代謝處于平衡狀態(tài)。而模型對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表層和移行層胞漿均有VEGF表達(dá)，且陽性表達(dá)強(qiáng)度高，這說明在骨關(guān)節(jié)炎模型中，關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)血管生成活躍。VEGF的大量表達(dá)促使新生血管生成，這些新生血管不僅為炎癥細(xì)胞的浸潤提供了途徑，還會釋放多種炎性介質(zhì)和蛋白酶，進(jìn)一步破壞關(guān)節(jié)軟骨和周圍組織。同時，新生血管的形成打破了關(guān)節(jié)軟骨正常的營養(yǎng)供應(yīng)平衡，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞代謝異常，加速了軟骨的退變。復(fù)元膠囊各劑量組大鼠關(guān)節(jié)軟骨中VEGF的表達(dá)明顯降低，且隨著復(fù)元膠囊劑量的增加，VEGF陽性細(xì)胞數(shù)逐漸減少，染色強(qiáng)度逐漸