目錄96_WPSOffice_Level11引言 29560_WPSOffice_Level12實驗試劑及儀器 228361_WPSOffice_Level22.1主要試劑 218138_WPSOffice_Level22.2實驗儀器 318724_WPSOffice_Level22.3海帶多糖降解工藝研究 327582_WPSOffice_Level32.3.1試劑的配制 327835_WPSOffice_Level32.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 416344_WPSOffice_Level32.3.3ACE抑制活性的體外檢測方法 521236_WPSOffice_Level32.3.4海帶多糖降解程度計算 52102_WPSOffice_Level32.3.5超聲輔助酸水解條件下對海帶多糖降解的影響 68422_WPSOffice_Level32.3.6響應(yīng)面法優(yōu)化海帶多糖的降解工藝設(shè)計 724803_WPSOffice_Level32.3.7數(shù)據(jù)處理 710353_WPSOffice_Level13.實驗結(jié)果與討論 72596_WPSOffice_Level23.1標(biāo)準(zhǔn)曲線 73882_WPSOffice_Level33.1.1還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 718475_WPSOffice_Level33.1.2總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 812702_WPSOffice_Level23.2超聲輔助酸水解條件下對海帶多糖降解的影響 812755_WPSOffice_Level33.2.1液固比對海帶多糖降解的影響 819896_WPSOffice_Level33.2.2超聲功率對海帶多糖降解的影響 928141_WPSOffice_Level33.2.3時間對海帶多糖降解的影響 105455_WPSOffice_Level33.2.4鹽酸濃度對于海帶多糖降解的影響 107191_WPSOffice_Level33.2.5溫度對于海帶多糖降解的影響 114645_WPSOffice_Level23.3海帶多糖降解的響應(yīng)面分析 1119772_WPSOffice_Level33.3.1水解度響應(yīng)面分析因素水平的確定 1120191_WPSOffice_Level33.3.2多糖降解的響應(yīng)面方案結(jié)果與分析 1220784_WPSOffice_Level33.3.3多糖降解工藝優(yōu)化與分析 135310_WPSOffice_Level33.3.4多糖降解最佳工藝條件的確定及驗證實驗 152561_WPSOffice_Level14結(jié)論 1619490_WPSOffice_Level1參考文獻(xiàn) 1615090_WPSOffice_Level1致謝 17摘要：海帶是我國重要的海洋藻類，中國北部沿海及浙江、福建沿海大量栽培，養(yǎng)殖面積、產(chǎn)量均居世界第一。如今對海帶的研究與加工大多側(cè)重于褐藻酸鈉及甘露醇的提取，而海帶富含粘性多糖的特性,阻礙了蛋白質(zhì)的水解進(jìn)而制約了海帶蛋白的研究與應(yīng)用，造成海帶蛋白資源的大量浪費。本試驗以出產(chǎn)于中國青島的海帶為原材料，結(jié)合超聲波物理作用和強(qiáng)酸化學(xué)降解作用，即利用超聲輔助酸預(yù)處理海帶，為下一步具有降血壓功效的海帶活性肽的酶法制備提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為生產(chǎn)以海帶為原材料的降血壓產(chǎn)品提供了理論指導(dǎo)。結(jié)果表明：當(dāng)液固比為20:1（mL/g），鹽酸濃度為2mol/L，超聲功率為300W、溫度為50℃、時間為6h時，海帶多糖水解度達(dá)45.36%，其ACE抑制活性IC50值為15.08mg/mL，說明預(yù)處理降低了溶液粘度，減少多糖的抑制作用，為下一步海帶降血壓肽的酶法制備奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵字：海帶降血壓肽，超聲輔助酸解，預(yù)處理Abstract:KelpisanimportantmarinealgaeinChina.ItiscultivatedonthecoastsofnorthernChina,ZhejiangandFujian,anditsaquacultureareaandyieldrankfirstintheworld.Mostresearchandprocessingofkelpnowfocusesontheextractionofsodiumalginateandmannitol.Thecharacteristicsofkelp,whichisrichinviscouspolysaccharides,impedesthehydrolysisofproteinsandconstrainstheresearchandapplicationofkelpproteins,resultinginahugewasteofkelpproteinresources..ThisexperimentusesseaweedproducedinQingdao,Chinaasrawmaterial,combinedwithultrasonicphysicalactionandstrongacidchemicaldegradation,thatis,ultrasonicassistedacidpretreatmentofkelptoprovideacertainbasisforenzymaticpreparationofkelpactivepeptideswithbloodpressureloweringeffect.Thedataprovidedtheoreticalguidancefortheproductionofhypotensiveproductsusingkelpasarawmaterial.Theuseofresponsesurfacemethodologytooptimizetheprocessparametersshowedthat:whentheliquid-solidratiois20:1(mL/g),thehydrochloricacidconcentrationis2mol/L,theultrasonicpoweris300W,thetemperatureis50°C,andthetimeis6hAtthetime,thedegreeofhydrolysisofLaminariajaponicapolysaccharidesreached45.36%,andtheIC50valueofACEinhibitoryactivitywas15.08mg/mL,indicatingthatthepretreatmentreducedtheviscosityofthesolutionandreducedtheinhibitoryeffectofpolysaccharides,layingthefoundationfortheenzymaticpreparationofhypotensivepeptidesinthefollowingstep.Keywords:antihypertensivepeptidesfromlaminariajaponica,ultrasound-assistedaciddegration,pretreatment1引言海帶(Laminariajaponica)，屬海藻類，又叫其為江白菜、綸布、海馬藺，當(dāng)拿來做為藥物時稱其為昆布，隸屬于褐藻門海帶目海帶科海帶屬[1-4]。海帶藻體為深褐色或者褐綠色，作為生活在海洋里的一類蔬菜，擁有著較高的營養(yǎng)價值[5]，在沿海地區(qū)分布廣，主要方式為人工養(yǎng)殖，是我國重要的經(jīng)濟(jì)藻類[6]。富含褐藻膠和碘質(zhì)，可食用及提取碘、褐藻膠、甘露醇等工業(yè)原料。其葉狀體可入藥[7]。雖然ACE抑制活性的降血壓肽來源廣泛，但是至今還有患者對于藥物所帶來的副作用問題感到擔(dān)憂，更偏向使用于吸收快、安全性高、副作用小的食源性降血壓產(chǎn)品。因此，食源性降血壓肽海帶產(chǎn)品的研發(fā)具有廣大的應(yīng)用前景。然而，由于海帶富含粘性多糖的特性，一定程度上阻礙了海帶蛋白的溶出，使得蛋白質(zhì)的降解率較低，對海帶蛋白的研究與應(yīng)用產(chǎn)生較大程度上的影響。我們可以通過降低多糖分子量來提高蛋白質(zhì)的降解率，利用新型的超聲波輔助酸降解技術(shù)所帶來的空化作用，增大液體與固體樣品的接觸程度，有利于所需物的溶出；同時，所產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)與熱效應(yīng)，可以提高非混相物質(zhì)的傳質(zhì)作用，破壞細(xì)胞的組織，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)流出與降解，并且超聲波輔助降解技術(shù)可減少溶劑的使用量，縮短降解時間，避免污染與縮減成本。本研究針對以上技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，探求最佳工藝條件，以便為后期從海帶中高效制備ACE抑制活性液提供預(yù)處理方案。2實驗試劑及儀器2.1主要試劑2.2實驗儀器2.3海帶多糖降解工藝研究2.3.1試劑的配制5%苯酚：稱取100g苯酚，加鋁片0.1g和碳酸氫鈉0.05g，蒸餾，收集182℃餾分。稱取5g，置于容量瓶中，加蒸餾水，使液體體積定容于100mL，即可得到50g/L苯酚試劑，將配制完的試劑用棕色試劑瓶裝以備用（用前新配）。稱取苯酚（C6H6O）80g，置于100mL燒杯中，加蒸餾水，使液體體積定容于100mL，之后將其倒入棕色瓶中，置于4℃環(huán)境中避光儲存（80%），吸取5mL苯酚溶液，溶于75mL水中，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。100mg/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（C6H12O6）：葡萄糖使用前于105℃恒溫烘干至恒重，稱取葡萄糖0.1000g，置于于100mL燒杯中，加蒸餾水，使液體體積定容至1000mL，完成后置4℃環(huán)境中儲存。DNS溶液:準(zhǔn)備500mL蒸餾水，稱取3，5-二硝基水楊酸6.3g，將其溶于水中，待加熱之后，在于熱溶液中，分別依次加入酒石酸鉀鈉182g，氫氧化鈉21g，苯酚5g，亞硫酸鈉5g，充分?jǐn)嚢杈鶆颍雇耆芙?，冷卻之后，加入蒸餾水，使溶液體積定容于1000mL，貯于棕色瓶中備用，在室溫環(huán)境下放置7d后使用。pH8.3的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取硼酸0.6183g，NaCl1.7532g，定容至100mL，配制為濃度為0.1mol/L（含有0.3mol/LNaCl）的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液。ACE儲備液：將ACE溶解于pH8.3的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液的溶劑中，配制成濃度為0.1U/mL的儲備液，按照200μL分裝，放置在-20℃溫度下保存?zhèn)溆?。HHL儲備液：將HHL溶解于pH8.3的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液的溶劑中，配制濃度為5mmol/L的儲備液，按照1000μL分裝，放置在-20℃溫度下保存?zhèn)溆谩A標(biāo)準(zhǔn)品儲備液：將HA溶解于pH8.3的硼酸-硼酸鈉緩沖溶液的溶劑中，配制濃度為5mmol/L的儲備液，按照1000μL分裝，放置在-20℃溫度下保存?zhèn)溆谩?.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制2.3.2.1總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制取6根具塞玻璃試管，分別依次加入0、0.2、0.6、0.8、1.0mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。添加蒸餾水，使每根試管的溶液體積都為1.0mL。向試管中加入1.0mL苯酚溶液之后迅速加入5.0mL硫酸（為了使所加溶劑能夠充分的與反應(yīng)液混合，在添加苯酚溶液和硫酸時，應(yīng)注意與液面垂直，避免接觸到試管內(nèi)壁），靜置10min。將反應(yīng)液用渦旋振動器充分混合后，再將試管放置于30℃水浴中反應(yīng)20min，490nm測吸光度。制動標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為葡萄糖或者葡萄糖質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為吸光度值。原理：因為在濃硫酸的作用下，總糖會水解成單糖，進(jìn)而迅速脫水成糠醛衍生物。在強(qiáng)酸環(huán)境下，該衍生物會與苯酚縮合生成橙黃色物質(zhì)，在波長為490nm和一定范圍內(nèi)，其吸光度與糖濃度呈線性關(guān)系，可通過分光光度法測定其含量。2.3.2.2還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精確稱量烘干至橫重的無水葡萄糖100mg，加入蒸餾水，配制成1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液100mL以備用。精確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于25mL的具塞試管中，添加蒸餾水，使每根試管的溶液體積都為2mL，再向試管中加入1.5mL的DNS溶液，將試管中溶液充分混合均勻后，沸水浴5min，迅速流水冷卻，加水至刻度線，室溫下放置20min后，540nm測量?？瞻渍{(diào)零，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度，縱坐標(biāo)為吸收度。原理：在中性和偏堿性的條件下，3,5-二硝基水楊酸在與多糖水解的還原糖共熱后，3,5-二硝基水楊酸會被還原成氨基化合物3-氨基-5-硝基水楊酸，該氨基化合物顏色為棕紅色。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和反應(yīng)液的顏色呈正比[8,9]。2.3.3ACE抑制活性的體外檢測方法血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制活性是在Cushman和Cheung等[10]人研究的測定方法上加以適當(dāng)改進(jìn)。首先，利用微量振動器將10μLACE與40μL樣品攪拌5min，使之充分混合均勻。然后，在37℃環(huán)境下保溫5min之后，加入50μL底物HHL混合均勻。最后，在相同溫度環(huán)境下，待反應(yīng)0.5小時之后，再加入1.0mol/L的HCl溶液200μL終止反應(yīng)，混合均勻，過0.22μm濾膜后通過HPLC法測定在228nm處反應(yīng)生成馬尿酸（HA,Hippuricacid）的吸收值。ACE抑制活性計算：(2-1)式中：I——抑制率，%A——不加入抑制劑時液相圖譜中馬尿酸的峰面積B——加入抑制劑時液相圖譜中馬尿酸的峰面積2.3.4海帶多糖降解程度計算(2-2)式中：H——水解度，%R1——還原糖，mgR0——初始還原糖，mgT——總糖，μg2.3.5超聲輔助酸水解條件下對海帶多糖降解的影響考慮到海帶中的多糖對于最后的成品品質(zhì)以及功能性有影響，因此要先將多糖降解，本實驗采用超聲輔助酸解法對海帶進(jìn)行處理，設(shè)置酸解時間（2h、4h、6h、8h、10h、12h）、超聲功率（200W、250W、300W、350W、400W、450W、500W）、液固比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30）、鹽酸濃度（0.5mol/L、1mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L、3mol/L）、溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）為自變量進(jìn)行單因素試驗，探究不同條件對海帶多糖降解的影響。2.3.5.1液固比對海帶多糖降解的影響將其他因素固定：超聲功率為300W，酸解溫度50℃，酸解時間為4h，往海帶脫膠粉中加入不同的1.5mol/L鹽酸含量（海帶粉/g:鹽酸/mL）=1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，進(jìn)行單因素試驗，探究液固比對海帶蛋白降解的影響。將樣品進(jìn)行離心10min，要求轉(zhuǎn)速為4000r/min，之后提取上清液進(jìn)行備用。2.3.5.2超聲功率對海帶多糖降解的影響將其他因素固定：酸解溫度50℃，酸解時間為4h，往海帶脫膠粉中按1:20加入1.5mol/L鹽酸（海帶粉/g:鹽酸/mL=1:20)，設(shè)置不同超聲功率（200W、250W、300W、350W、400W、450W、500W）進(jìn)行單因素試驗，探究超聲功率不同對海帶蛋白降解的影響。將樣品進(jìn)行離心10min，要求轉(zhuǎn)速為4000r/min，之后提取上清液進(jìn)行備用。2.3.5.3時間對海帶多糖降解的影響將其他因素固定：酸解溫度50℃，超聲功率300W，往海帶脫膠粉中按1:20加入1.5mol/L鹽酸（海帶粉/g:鹽酸/mL=1:20)，設(shè)置不同時間（2h、4h、6h、8h、10h、12h）進(jìn)行單因素試驗，探究時間不同對海帶多糖降解的影響。將樣品進(jìn)行離心10min，要求轉(zhuǎn)速為4000r/min，之后提取上清液進(jìn)行備用。2.3.5.4鹽酸濃度對于海帶多糖降解的影響將其他因素固定：超聲功率為200W，酸解溫度為50℃，降解時間4h，往海帶脫膠粉中按1:20加入不同濃度鹽酸（海帶粉/g:鹽酸/mL=1:20)，設(shè)置不同濃度（0.5mol/L、1mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L、3mol/L）進(jìn)行單因素試驗，探究濃度不同對海帶多糖降解的影響。將樣品進(jìn)行離心10min，要求轉(zhuǎn)速為4000r/min，之后提取上清液進(jìn)行備用。2.3.5.5溫度對于海帶多糖降解的影響將其他因素固定：超聲功率為300W，酸解時間為4h，鹽酸濃度為1.5mol/L，往海帶脫膠粉中按1:20加入1.5mol/L鹽酸（海帶粉/g:鹽酸/mL=1:20)，設(shè)置不同溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）進(jìn)行單因素試驗，探究濃度不同對海帶多糖降解的影響。將樣品進(jìn)行離心10min，要求轉(zhuǎn)速為4000r/min，之后提取上清液進(jìn)行備用。2.3.6響應(yīng)面法優(yōu)化海帶多糖的降解工藝設(shè)計根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取超聲時間（A）、超聲功率(B)、鹽酸濃度(C)三個對海帶多糖降解的影響較為顯著的因素為考察變量，采用Box-BehnkenDesign中心實驗組合設(shè)計方案，以多糖的水解度Y值為響應(yīng)值，在單因素實驗基礎(chǔ)上對降解工藝進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析。2.3.7數(shù)據(jù)處理采用Design-Expert8.0軟件對響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，并同時作出方差分析以及顯著性分析等，采用SPSS20.0分析處理ACE抑制活性的半數(shù)抑制率IC50值數(shù)據(jù)。3.實驗結(jié)果與討論3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線3.1.1還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線從圖2-1可看出葡萄糖濃度與吸光度之間的關(guān)系為：y=0.8105x-0.0699，R2=0.9984。表明呈良好的線性關(guān)系，方程可用于還原糖的定量測定。圖2-1還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2-1Reducingsugarstandardcurve3.1.2總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線從圖2-2可看出葡萄糖濃度與吸光度之間的關(guān)系為：y=0.737x+0.0116，R2=0.9981。表明呈良好的線性關(guān)系，方程可用于總糖的定量測定。圖2-2總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2-2Totalsugarstandardcurve3.2超聲輔助酸水解條件下對海帶多糖降解的影響3.2.1液固比對海帶多糖降解的影響根據(jù)圖2-3可知，隨著液固比的增加，海帶多糖水解度逐漸提高，在20:1以后開始下降。當(dāng)較低的液固比時，兩個體系的傳質(zhì)動力較差，水解度較低，隨著液固比的增加，傳質(zhì)動力慢慢增強(qiáng)，水解度上升，當(dāng)液固比較高時，由于溶質(zhì)濃度的降低會使空化作用減少,從而使得超聲降解作用減少。從鹽酸的減少污染、降低成本來選擇，多糖的適宜降解液固比為20:1。圖2-3液固比對海帶多糖降解的影響Fig.2-3Effectofliquidsolidratioondegradationoflaminariajaponicapolysaccharide3.2.2超聲功率對海帶多糖降解的影響根據(jù)圖2-4可知，在一定的超聲功率范圍內(nèi)，海帶多糖降解反應(yīng)的速率會隨著超聲功率的增強(qiáng)而變快，當(dāng)超聲功率超過了一定的水平時，降解反應(yīng)速率反而會下降。陳偉等人以及鐘愛國分別利用超聲波降解4－氯酚和誘導(dǎo)甲胺磷進(jìn)行研究，得到的結(jié)果與上述結(jié)論一致。會出現(xiàn)這種現(xiàn)象極有可能的原因在于：當(dāng)超聲波的功率較大時，聲強(qiáng)較大，空化泡在負(fù)聲壓相位內(nèi)增長過大，以至于在正聲壓相位內(nèi)，很難被壓縮至崩潰；同時，在聲強(qiáng)較大的情況下，會有大量空化泡被激活，而大量的空氣泡會對超聲波產(chǎn)生較強(qiáng)的散射衰減，從而很大程度的影響了降解率，導(dǎo)致降解率不再增長[11]。所以選擇250W進(jìn)行實驗優(yōu)化。圖2-4超聲功率對海帶多糖降解的影響Fig.2-4Effectofultrasonicpowerondegradationoflaminariajaponicapolysaccharide3.2.3時間對海帶多糖降解的影響根據(jù)圖2-5可知，剛開始隨著時間的上升，水解度提高，超過4h后，水解度下降。主要原因在于，在剛開始4h水解過程之內(nèi)，海帶多糖的糖苷鍵會被酸溶液中的氫離子破壞釋放出低聚糖、單糖等還原糖。然而，隨著水解時間的不斷增加，釋放出來的還原糖會與酸進(jìn)一步發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，并產(chǎn)生小分子有機(jī)酸、5-羥甲基糠醛（5-HMF）等化合物，使得水解度下降。因此水解反應(yīng)時間控制在4h之內(nèi)最佳。圖2-5超聲時間對于海帶多糖降解的影響Fig.2-5Effectofultrasonictimeonthedegradationoflaminariajaponicapolysaccharide3.2.4鹽酸濃度對于海帶多糖降解的影響由圖2-6所示，在酸濃度達(dá)到1.5mol/L之前，隨著濃度的提高，水解度提高，超過1.5mol/L之后，水解度下降。這是因為，在一定的酸濃度下，酸濃度越高，氫離子越容易滲入海帶多糖的內(nèi)部，破壞糖苷鍵，從而釋放出低聚糖、單糖等還原糖。但當(dāng)酸濃度過高時，釋放出來的還原糖會被進(jìn)一步降解為糠醛，水解液中的還原糖濃度隨之下降了。同時，較高的酸濃度也會加快造成設(shè)備的腐蝕，增大后期處理成本。綜上，選擇1.5mol/L的酸濃度進(jìn)行后期參數(shù)優(yōu)化。圖2-6鹽酸濃度對海帶多糖降解的影響Fig.2-6Effectofhydrochloricacidconcentrationonthedegradationoflaminariajaponicapolysaccharide3.2.5溫度對于海帶多糖降解的影響根據(jù)圖2-7可知，剛開始，升高溫度的同時，多糖水解度亦隨之增加，這是因為溫度的上升，分子運動加劇，而溫度達(dá)到50℃以上時，多糖水解度下降。這是由于多糖是活性物質(zhì)，當(dāng)溫度超過一定的范圍后，多糖結(jié)構(gòu)很容易被破壞，生物活性受到影響，這也是產(chǎn)生后面試驗影響降解的不利因素。故其降解溫度以50℃為宜。圖2-7溫度對于海帶多糖降解的影響Fig.2-7Effectoftemperatureondegradationoflaminariajaponicapolysaccharide3.3海帶多糖降解的響應(yīng)面分析3.3.1水解度響應(yīng)面分析因素水平的確定由單因素實驗結(jié)果可知，在五個影響因素中，溫度和固液比對多糖降解的影響較少，故選取超聲時間、超聲功率、鹽酸濃度三個對多糖降解較為顯著的因素進(jìn)行分析。根據(jù)Box-BehnkenDesign中心實驗組合設(shè)計原理，以水解度值作為響應(yīng)值，對水解工藝進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析，具體的試驗因素及水平設(shè)計如表2-1。表2-1多糖降解的響應(yīng)面設(shè)計因素及水平Tab.2-1Thefactorsandlevelsofresponsesurfacedesignonthedegradationofpolyscccharide因素水平-101超聲時間A/h246超聲功率B/W200250300鹽酸濃度C/（mol/L）11.523.3.2多糖降解的響應(yīng)面方案結(jié)果與分析表2-2多糖降解的響應(yīng)面分析方案與結(jié)果Tab.2-2Theresultandanalysisofresponsesurfaceonthedegradationofpolyscccharide試驗號超聲時間A/h超聲功率B/W鹽酸濃度C/（mol/L）多糖水解度（%）14.00250.001.5038.1924.00250.001.5038.3936.00200.001.5035.1344.00300.001.0031.1454.00250.001.5038.2364.00200.001.0028.8974.00300.002.0044.1582.00200.001.5024.4892.00250.001.0025.52106.00300.001.5039.04114.00200.002.0034.18124.00250.001.5038.15132.00250.002.0032.39146.00250.002.0042.66152.00300.001.5032.47166.00250.001.0032.05174.00250.001.5038.42實驗安排及結(jié)果如表2-2所示，應(yīng)用DesignExpert8.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到水解度（Y）對超聲時間（A）、超聲功率（B）、鹽酸濃度（C）的三元二次回歸方程為：Y=＋38.28＋4.25×A＋3.02×B＋4.47×C－1.02×A×B＋0.94×A×C＋1.93×B×C－3.47×A2－2.03×B2－1.66×C2對整體模型進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到模型的F值等于2129.92，P值更是小于0.0001，可以得出該模型具有極顯著性，預(yù)測值與實驗值高度相關(guān)。失擬差項為0.1822，說明不顯著，模型的相關(guān)系數(shù)R2=99.59%,校正決定系數(shù)R2Adj=99.92%,CV%=0.46，說明模型能夠反應(yīng)相應(yīng)值的變化，說明使用該方法模擬真實的三因素三水平的分析可行，且該方法可靠性強(qiáng)。由表2-3可知，A、B、C、A2、B2、C2、AB、AC、BC對多糖的降解影響顯著，因此，可以用此模型來分析和預(yù)測超聲波輔助酸降解海帶中多糖的工藝條件。表2-3多糖降解的響應(yīng)面回歸系數(shù)顯著性檢驗表Tab.2-3Thesignificancetesttableforresponsesurfaceregressionfactoronthedegradationofpolyscccharide方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性回歸模型487.50954.172129.92<0.0001**A144.671144.675688.63<0.0001**B72.72172.722859.52<0.0001**C160.031160.036292.45<0.0001**AB4.1614.16163.64<0.0001**AC3.5013.50137.50<0.0001**BC14.90114.90585.87<0.0001**A250.57150.571988.37<0.0001**B217.36117.36682.61<0.0001**C211.54111.54453.76<0.0001**殘差0.1870.025失擬項0.1230.0402.680.1822凈誤差0.05940.015總和487.6816注：**表示極顯著（P<0.01）；*表示顯著（P<0.05）。3.3.3多糖降解工藝優(yōu)化與分析根據(jù)響應(yīng)曲面可以分析得出在一個因素去零點水平時，另外兩因素之間的交互作用對多糖降解的影響情況。響應(yīng)曲面越陡，對多糖降解的影響越顯著，越平緩影響越不顯著。等高線形狀越趨向橢圓，則兩因素交互作用越強(qiáng)，越趨向圓則交互作用越弱。等高線越密集，則影響越大，越稀疏影響越小。由圖2-8可知，超聲功率與超聲時間形成的曲面都較陡，表明超聲功率與超聲時間對多糖降解影響顯著。等高線趨向圓形，表明超聲功率與超聲時間交互作用不是很顯著。等高線在沿超聲時間軸比較密集，說明多糖降解工藝中超聲時間比對水解度的影響較大。a）響應(yīng)面b）等高線圖2-8超聲時間與超聲功率對多糖降解交互作用的響應(yīng)面曲面和等高線圖Fig.2-8Theresponsesurfaceandcontourplotofultrasonictimeandultrasonicpoweronthedegradationofpolyscccharide圖2-9可以看出，濃度形成的曲面相對平穩(wěn)，而超聲時間形成的曲面相對陡峭。從等高線密集度上看，在沿超聲時間軸方向也比較密集，說明在該多糖降解工藝中，超聲時間對多糖降解的影響顯著高于鹽酸濃度的影響；從等高線線形狀比較接近圓形，說明超聲時間與鹽酸濃度交互作用不強(qiáng)，對水解度影響不顯著。a）響應(yīng)面b）等高線圖2-9鹽酸濃度和超聲時間對多糖降解交互作用的響應(yīng)面曲面和等高線圖Fig.2-9Theresponsesurfaceandcontourplotofhydrochloricacidconcentrationandultrasoundtimeonthedegradationofpolyscccharide圖2-10的曲面中濃度形成的曲面與超聲功率形成的曲面相比較為平緩，說明濃度對多糖降解的影響高于超聲功率對多糖降解的影響，根據(jù)等高線可知，濃度與超聲功率有一定的交互作用。a）響應(yīng)面b）等高線圖2-10鹽酸濃度和超聲功率對多糖降解交互作用的響應(yīng)面曲面和等高線圖Fig.2-10Thesurfaceandcontourplotsofhydrochloricacidconcentrationandultrasoundpoweronthedegradationofpolyscccharide3.3.4多糖降解最佳工藝條件的確定及驗證實驗實驗結(jié)果表明，超聲時間、功率、濃度三因數(shù)對海帶中多糖降解影響的強(qiáng)弱順序是：超聲時間>功率>濃度。并通過對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，根據(jù)擬合函數(shù)分析得到，在液固比為20:1（mL/g），超聲溫度為50℃的條件下，超聲輔助酸法降解海帶中的多糖的最佳工藝條件為：超聲時