演講人：日期:高效液相基礎(chǔ)知識(shí)目錄CATALOGUE01基本原理02核心組件03分析方法04操作流程05典型應(yīng)用06維護(hù)要點(diǎn)PART01基本原理色譜分離基礎(chǔ)理論基于溶質(zhì)在流動(dòng)相與固定相之間的分配系數(shù)差異實(shí)現(xiàn)分離，分配系數(shù)大的組分在固定相中保留時(shí)間更長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)分離。分配平衡理論固定相表面活性位點(diǎn)與溶質(zhì)分子間通過范德華力、氫鍵等相互作用產(chǎn)生選擇性吸附，不同組分因吸附能力差異被分離。吸附作用理論固定相孔徑對(duì)溶質(zhì)分子的空間排阻作用，大分子無法進(jìn)入孔徑而被快速洗脫，小分子因進(jìn)入孔道而延遲洗脫。分子篩效應(yīng)流動(dòng)相與固定相作用流動(dòng)相流速與柱效關(guān)系流動(dòng)相極性與選擇性調(diào)控C18、C8等反相固定相通過疏水作用分離非極性化合物；氨基柱、氰基柱等正相固定相適用于極性化合物分離。通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相中有機(jī)溶劑比例、pH值或離子強(qiáng)度，改變?nèi)苜|(zhì)在兩相中的分配行為，優(yōu)化分離效果。流速過高導(dǎo)致傳質(zhì)阻力增大、峰展寬；流速過低可能延長(zhǎng)分析時(shí)間，需根據(jù)范第姆特方程優(yōu)化流速。123固定相化學(xué)鍵合類型保留時(shí)間與峰形概念溶質(zhì)性質(zhì)（極性、分子量）、固定相類型、流動(dòng)相組成及溫度均會(huì)改變保留時(shí)間，是定性分析的重要參數(shù)。保留時(shí)間影響因素通過拖尾因子（T）或不對(duì)稱因子（As）量化峰形，理想峰形T≈1，拖尾峰（T>1）可能由死體積或次級(jí)吸附作用導(dǎo)致。峰對(duì)稱性評(píng)價(jià)包括渦流擴(kuò)散、縱向擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力，三者共同構(gòu)成塔板高度（H）的理論基礎(chǔ)，直接影響分離效率。峰展寬機(jī)制PART02核心組件高壓輸液泵系統(tǒng)梯度混合技術(shù)采用低壓混合（前置混合）時(shí)通過比例閥調(diào)節(jié)溶劑比例，高壓混合（后置混合）則通過多臺(tái)泵協(xié)同工作。前者成本低但易產(chǎn)生氣泡，后者精度高但系統(tǒng)復(fù)雜，需配合脫氣裝置使用。密封與維護(hù)要點(diǎn)藍(lán)寶石柱塞桿配合石墨-陶瓷復(fù)合密封圈可承受40MPa壓力，需定期用異丙醇清洗并更換密封組件。系統(tǒng)需每日進(jìn)行壓力測(cè)試，流速偏差超過5%即需排查單向閥污染或柱塞磨損問題。恒流泵與恒壓泵的區(qū)別恒流泵通過精確控制柱塞運(yùn)動(dòng)速度維持恒定流速，適用于梯度洗脫；恒壓泵則依賴背壓調(diào)節(jié)，多用于等度分析。現(xiàn)代HPLC多采用雙柱塞串聯(lián)式往復(fù)泵，可消除脈動(dòng)并提供0.001-10mL/min的精準(zhǔn)流速。030201六通閥工作原理XYZ三軸機(jī)械臂定位精度需達(dá)±0.1mm，進(jìn)樣針具有樣品沖洗和針外壁清洗功能?，F(xiàn)代系統(tǒng)支持96/384孔板進(jìn)樣，交叉污染率控制在0.005%以下，溫控范圍4-40℃。自動(dòng)進(jìn)樣器關(guān)鍵技術(shù)流路設(shè)計(jì)要點(diǎn)進(jìn)樣閥至色譜柱的連接管線應(yīng)<15cm且內(nèi)徑≤0.13mm，死體積控制在10μL以內(nèi)。針式進(jìn)樣器需配備針導(dǎo)向器確保穿刺定位準(zhǔn)確，避免隔墊碎屑產(chǎn)生。通過轉(zhuǎn)子/定子精密配合實(shí)現(xiàn)定量環(huán)（5-100μL）裝載與注入。耐壓需達(dá)60MPa，切換時(shí)間<100ms。閥體材料多為PEEK或316L不銹鋼，生物兼容性版本配備鈦合金流路。進(jìn)樣器結(jié)構(gòu)與類型紫外-可見檢測(cè)器光學(xué)路徑氘燈（190-400nm）與鎢燈（400-800nm）通過切光輪交替照射樣品池，光柵單色器帶寬可達(dá)1nm，二極管陣列檢測(cè)器（DAD）可同時(shí)采集全光譜數(shù)據(jù)，波長(zhǎng)準(zhǔn)確度±1nm。示差折光檢測(cè)器溫控要求檢測(cè)池與參比池需維持±0.001℃恒溫，因折射率溫度系數(shù)達(dá)10^-4RIU/℃?，F(xiàn)代設(shè)計(jì)采用雙光束補(bǔ)償消除流動(dòng)相波動(dòng)影響，檢測(cè)限可達(dá)1×10^-7RIU。熒光檢測(cè)器靈敏度優(yōu)化氙燈脈沖頻率應(yīng)與光電倍增管（PMT）增益同步，激發(fā)/發(fā)射單色器帶通可調(diào)（5-20nm），三維掃描模式可自動(dòng)優(yōu)化λex/λem。部分型號(hào)配備低溫PMT將暗電流降至0.1nA以下。檢測(cè)器工作原理PART03分析方法等度與梯度洗脫等度洗脫特點(diǎn)選擇依據(jù)梯度洗脫特點(diǎn)流動(dòng)相組成在分析過程中保持恒定，適用于分離簡(jiǎn)單樣品或組分極性差異較小的體系，具有方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性高的優(yōu)勢(shì)，但可能面臨分離度不足或分析時(shí)間過長(zhǎng)的問題。流動(dòng)相比例按程序隨時(shí)間變化，可高效分離復(fù)雜樣品或?qū)挊O性范圍組分，顯著縮短強(qiáng)保留物質(zhì)的出峰時(shí)間并提高峰形對(duì)稱性，但對(duì)設(shè)備性能和方法開發(fā)要求較高。需根據(jù)樣品復(fù)雜度、目標(biāo)物極性分布及檢測(cè)靈敏度要求綜合判斷，常規(guī)質(zhì)量控制推薦等度洗脫，中藥指紋圖譜等復(fù)雜體系通常采用梯度洗脫。方法開發(fā)關(guān)鍵參數(shù)色譜柱篩選需考慮固定相類型（C18、苯基柱等）、粒徑（1.7-5μm）及柱長(zhǎng)（50-250mm），親水性化合物推薦HILIC柱，大分子物質(zhì)需選擇寬孔徑填料。檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定通過DAD掃描確定最大吸收波長(zhǎng)，多組分檢測(cè)時(shí)需權(quán)衡各物質(zhì)響應(yīng)值，必要時(shí)采用波長(zhǎng)切換或全波長(zhǎng)采集模式。流動(dòng)相優(yōu)化有機(jī)相比例（乙腈/甲醇）影響保留時(shí)間，pH值調(diào)節(jié)劑（磷酸鹽/甲酸鹽）可改善峰形，離子對(duì)試劑（三氟乙酸）適用于帶電化合物分離。系統(tǒng)適用性驗(yàn)證理論塔板數(shù)測(cè)試通過特定化合物（如萘）計(jì)算色譜柱效率，要求符合藥典規(guī)定（通常＞2000），反映色譜柱性能及裝填質(zhì)量。拖尾因子評(píng)估連續(xù)進(jìn)樣6次標(biāo)準(zhǔn)品溶液，保留時(shí)間RSD需＜1.0%，峰面積RSD＜2.0%，確保系統(tǒng)穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)可靠性。測(cè)量峰前峰后寬度比值（標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)＜2.0），異常值提示可能存在柱效下降或流動(dòng)相pH不匹配問題。重復(fù)性驗(yàn)證PART04操作流程流動(dòng)相配制規(guī)范1234溶劑純度要求流動(dòng)相配制必須使用色譜級(jí)溶劑，避免雜質(zhì)干擾分析結(jié)果，水相需使用超純水（電阻率≥18.2MΩ·cm），有機(jī)相應(yīng)通過0.22μm濾膜過濾。采用高精度移液器或天平配制流動(dòng)相，混合比例誤差需小于0.5%，梯度洗脫時(shí)需確保不同溶劑間的互溶性和穩(wěn)定性。比例精確控制脫氣處理配制完成的流動(dòng)相需經(jīng)超聲脫氣或在線脫氣裝置處理，消除溶解氧和氣泡，防止基線波動(dòng)和柱效下降，脫氣時(shí)間不少于15分鐘。pH值調(diào)節(jié)對(duì)于緩沖鹽流動(dòng)相，需使用pH計(jì)精確調(diào)節(jié)至目標(biāo)值（±0.02范圍內(nèi)），調(diào)節(jié)后需重新過濾，避免鹽析堵塞系統(tǒng)流路。色譜柱活化平衡初始活化程序新色譜柱首次使用前應(yīng)以10%柱體積的低流速（0.2mL/min）沖洗，逐步提高至工作流速，有機(jī)相比例從5%階梯式增加至分析方法設(shè)定值。保存液處理長(zhǎng)期停用色譜柱應(yīng)使用指定保存液（反相柱存于甲醇/乙腈，正相柱存于正己烷），兩端密封保存，避免固定相干涸或微生物滋生。平衡標(biāo)準(zhǔn)判定柱壓波動(dòng)需小于±1%，基線漂移控制在0.5mAU/min內(nèi)，連續(xù)3次進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間偏差不超過0.1分鐘視為平衡完成。過渡溶劑選擇當(dāng)更換流動(dòng)相體系時(shí)，需使用與新舊溶劑均互溶的過渡溶劑（如甲醇-乙腈混合液）進(jìn)行梯度過渡，避免固定相塌陷或沉淀析出。樣品前處理要求基質(zhì)干擾消除生物樣品需進(jìn)行蛋白沉淀（乙腈/甲醇沉淀法）、液液萃取或固相萃取處理，復(fù)雜基質(zhì)樣品建議采用QuEChERS或分子印跡技術(shù)凈化。濾膜選擇標(biāo)準(zhǔn)最終進(jìn)樣溶液必須通過0.22μm有機(jī)系/水系濾膜過濾，尼龍膜適用于pH2-9的樣品，PTFE膜耐受強(qiáng)酸強(qiáng)堿但需注意吸附效應(yīng)。濃度優(yōu)化原則目標(biāo)物響應(yīng)值應(yīng)落在標(biāo)準(zhǔn)曲線中段（30%-70%量程），過高濃度需稀釋后進(jìn)樣，避免柱超載或檢測(cè)器信號(hào)飽和。穩(wěn)定性驗(yàn)證處理后的樣品需考察室溫、4℃冷藏及多次凍融條件下的穩(wěn)定性，易降解樣品應(yīng)添加穩(wěn)定劑或立即分析，確保數(shù)據(jù)可靠性。PART05典型應(yīng)用藥物含量測(cè)定高效液相色譜（HPLC）廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)和生產(chǎn)過程中，用于測(cè)定原料藥純度、制劑中活性成分含量以及相關(guān)雜質(zhì)分析，確保藥品質(zhì)量符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。01040302原料藥及制劑分析HPLC可用于血液、尿液等生物樣品中藥物及其代謝產(chǎn)物的定量分析，為臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究和治療藥物監(jiān)測(cè)提供可靠數(shù)據(jù)支持。生物樣品藥物濃度監(jiān)測(cè)通過HPLC技術(shù)可對(duì)中藥材及中成藥中的有效成分（如黃酮類、生物堿類）進(jìn)行定性定量分析，為中藥質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。中藥成分分析采用手性固定相的HPLC能夠有效分離藥物對(duì)映異構(gòu)體，用于手性藥物的純度檢查和藥效學(xué)研究。手性藥物分離食品添加劑檢測(cè)HPLC可準(zhǔn)確測(cè)定食品中苯甲酸、山梨酸等防腐劑以及BHA、BHT等抗氧化劑的含量，確保其使用符合食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。防腐劑與抗氧化劑分析通過HPLC-UV/DAD聯(lián)用技術(shù)，能夠同時(shí)分離和定量食品中多種合成色素（如檸檬黃、胭脂紅），有效監(jiān)控非法添加行為。HPLC可用于食品中維生素（如VC、VB族）、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑的含量測(cè)定，驗(yàn)證產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)標(biāo)簽真實(shí)性。人工合成色素檢測(cè)采用離子對(duì)色譜或反相色譜法可精確檢測(cè)食品中糖精鈉、阿斯巴甜等人工甜味劑的殘留量，保障消費(fèi)者健康。甜味劑含量測(cè)定01020403營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑分析環(huán)境污染物分析HPLC結(jié)合熒光檢測(cè)器可高靈敏度測(cè)定環(huán)境樣品（水、土壤）中16種優(yōu)先控制PAHs，評(píng)估環(huán)境污染程度和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。多環(huán)芳烴（PAHs）檢測(cè)通過HPLC-MS/MS技術(shù)能夠同時(shí)檢測(cè)數(shù)百種農(nóng)藥殘留，滿足農(nóng)產(chǎn)品、飲用水等基質(zhì)中痕量農(nóng)藥的監(jiān)測(cè)需求，靈敏度可達(dá)ppb級(jí)。農(nóng)藥殘留分析采用HPLC串聯(lián)質(zhì)譜可準(zhǔn)確測(cè)定環(huán)境樣品中雙酚A、烷基酚等內(nèi)分泌干擾物，研究其在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律。內(nèi)分泌干擾物篩查結(jié)合HPLC與ICP-MS可進(jìn)行砷、汞等重金屬的形態(tài)分析（如As(III)/As(V)），比總量測(cè)定更能反映環(huán)境毒理風(fēng)險(xiǎn)。重金屬形態(tài)分析PART06維護(hù)要點(diǎn)流動(dòng)相沖洗每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后需用高純度水或甲醇/乙腈（比例根據(jù)流動(dòng)相調(diào)整）沖洗系統(tǒng)至少30分鐘，以清除管路和泵內(nèi)殘留的緩沖鹽或樣品基質(zhì)，防止結(jié)晶堵塞。沖洗流速建議設(shè)為1.0mL/min，沖洗時(shí)需切換所有流路通道。日常系統(tǒng)沖洗規(guī)程進(jìn)樣器清洗拆卸進(jìn)樣針后用異丙醇超聲清洗15分鐘，再用超純水沖洗；進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)子密封面需定期涂抹專用潤(rùn)滑脂，每月至少執(zhí)行一次六通閥的"Load-Inject"循環(huán)沖洗200次以上。檢測(cè)器流通池維護(hù)UV檢測(cè)器需每周用0.1M硝酸溶液反向沖洗流通池10分鐘，光電二極管陣列檢測(cè)器則需每月用6M尿素溶液清除蛋白質(zhì)沉積物，沖洗后必須用超純水徹底沖洗至中性pH。色譜柱保存條件010203反相柱保存長(zhǎng)期保存時(shí)需用甲醇或乙腈置換柱內(nèi)流動(dòng)相（含水量<10%），保存溫度應(yīng)控制在4-25℃；C18柱需特別注意避免pH>8的緩沖液殘留，保存前需用20柱體積的甲醇/水（95:5）沖洗。離子交換柱處理陰離子柱需用0.1MNaOH+20%乙腈保存，陽(yáng)離子柱則用0.1MH2SO4保存，保存前必須用10柱體積的儲(chǔ)存液過渡。所有離子柱保存時(shí)需確保系統(tǒng)壓力<1000psi。HILIC柱特殊要求需在乙腈/水（90:10）中含3%甲酸的溶液中保存，且必須每周用新鮮保存液置換一次，防止固定相水解。保存環(huán)境濕度應(yīng)控制在40%以下。壓力異常升高基線噪音處理峰形異常解決方案常見故障排除首先排查過濾白頭堵塞（更換0.2μm鈦合金濾片），其次檢查保護(hù)柱篩板是否堵塞（超聲處理或更換）；若保留時(shí)間漂移伴隨壓力波動(dòng)，需檢查泵頭