復(fù)方木尼孜其顆粒及去氫駱駝蓬堿：黑色素瘤治療新視角一、引言1.1黑色素瘤概述黑色素瘤是一種起源于黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，這些黑色素細(xì)胞通常位于皮膚的表皮基底層，負(fù)責(zé)產(chǎn)生黑色素，賦予皮膚顏色，并在紫外線照射時(shí)增加黑色素生成以保護(hù)皮膚。當(dāng)黑色素細(xì)胞發(fā)生惡變，不受控制地增殖并侵犯周圍組織時(shí)，便形成了黑色素瘤。它不僅可發(fā)生于皮膚，還可能出現(xiàn)在眼、鼻腔、消化道、淋巴結(jié)、外陰、腦膜等黏膜部位。在皮膚惡性腫瘤中，黑色素瘤的發(fā)病率雖僅占第3位，約為所有惡性腫瘤的1%-2%，但卻是致死率最高的皮膚癌。近年來(lái)，黑色素瘤的發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)，年增長(zhǎng)率約3-5％。2010年，全球黑色素瘤新發(fā)病例達(dá)199,627例，死亡例數(shù)為46,372例。不同人種和地區(qū)的發(fā)病率存在明顯差異，白種人發(fā)病率較高，如美國(guó)白人發(fā)病率可達(dá)十萬(wàn)分之四十以上，而美國(guó)黑人發(fā)病率不到十萬(wàn)分之一；中國(guó)和日本等亞洲國(guó)家發(fā)病率相對(duì)較低，但增長(zhǎng)迅速，中國(guó)黑色素瘤發(fā)病率為0.9/10萬(wàn)，北京市1998-2004年，男女發(fā)病率分別從0.3/10萬(wàn)和0.2/10萬(wàn)上升至0.8/10萬(wàn)和0.5/10萬(wàn)；上海市1995-2005年，男女發(fā)病率也分別從0.2/10萬(wàn)和0.3/10萬(wàn)上升至0.5/10萬(wàn)和0.4/10萬(wàn)。黑色素瘤具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性，嚴(yán)重威脅人類健康。其轉(zhuǎn)移途徑主要包括淋巴轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的5年生存率急劇下降。早期黑色素瘤患者經(jīng)手術(shù)切除后，5年生存率可達(dá)90%以上；然而，晚期黑色素瘤患者的5年生存率不足20%，且易復(fù)發(fā)。黑色素瘤轉(zhuǎn)移后可累及多個(gè)器官，如肝、肺、腦等，引發(fā)一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，如肺轉(zhuǎn)移導(dǎo)致呼吸功能衰竭，腦轉(zhuǎn)移引起神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存期。目前，黑色素瘤的傳統(tǒng)治療方法主要包括手術(shù)切除、放療、化療和免疫治療等。手術(shù)切除是早期黑色素瘤的主要治療手段，但對(duì)于晚期或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，手術(shù)往往無(wú)法徹底清除腫瘤細(xì)胞。放療對(duì)局部腫瘤有一定的控制作用，但對(duì)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶效果不佳?；熾m可全身應(yīng)用，但黑色素瘤對(duì)化療藥物的敏感性較低，且化療藥物的毒副作用較大，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。免疫治療如免疫檢查點(diǎn)抑制劑，雖在部分患者中取得了一定療效，但仍存在響應(yīng)率低、耐藥等問(wèn)題，且治療費(fèi)用高昂，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)新型、有效的黑色素瘤治療方法迫在眉睫。1.2復(fù)方木尼孜其顆粒研究背景復(fù)方木尼孜其顆粒源自維醫(yī)經(jīng)典名方，是一種獨(dú)具特色的復(fù)方制劑，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用歷史悠久。其組方精妙，由菊苣子、芹菜根、香青蘭子、黑種草子、茴香根皮、洋甘菊、甘草、香茅、蜀葵子、茴芹果等多味純天然植物藥精心配伍而成。這些藥材在維醫(yī)理論體系中，各自發(fā)揮著獨(dú)特的功效，相互協(xié)同，共同構(gòu)成了復(fù)方木尼孜其顆粒豐富的藥理作用基礎(chǔ)。在傳統(tǒng)功效方面，復(fù)方木尼孜其顆粒具有調(diào)節(jié)體液及氣質(zhì)的獨(dú)特功效，被視為四種異常體液的成熟劑。它能夠使致病體液成熟并迅速排出體外，調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫功能，恢復(fù)機(jī)體正常的生理機(jī)能，從而達(dá)到治療多種疾病的目的。在臨床實(shí)踐中，復(fù)方木尼孜其顆粒被廣泛應(yīng)用于皮膚科、婦科等多個(gè)領(lǐng)域的疾病治療。在皮膚科，它常用于治療黃褐斑、雀斑、痤瘡、濕疹、色斑、白癜風(fēng)等皮膚疾病，通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抑制黑色素合成、降低血清腫瘤壞死因子等炎性因子等作用機(jī)制，改善皮膚癥狀，促進(jìn)皮膚健康。在婦科，它可用于治療慢性盆腔炎、月經(jīng)失調(diào)、乳腺增生、圍絕經(jīng)期綜合征等婦科疾病，通過(guò)調(diào)節(jié)血清睪酮水平等作用，幫助女性恢復(fù)內(nèi)分泌平衡，緩解相關(guān)癥狀。近年來(lái)，隨著對(duì)中藥抗癌作用研究的不斷深入，復(fù)方木尼孜其顆粒在抗癌領(lǐng)域的應(yīng)用也逐漸受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，其含有的高活性異黃酮誘導(dǎo)素等成分，能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)激素水平，促進(jìn)肝臟的代謝功能，加強(qiáng)腎臟的濾過(guò)功能，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，增強(qiáng)皮膚的排泄通暢，從而在一定程度上展現(xiàn)出抗癌潛力。然而，目前關(guān)于復(fù)方木尼孜其顆粒在黑色素瘤治療方面的研究仍處于起步階段，存在諸多空白。對(duì)于其是否能直接作用于黑色素瘤細(xì)胞，影響其增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為，以及通過(guò)何種具體的分子機(jī)制發(fā)揮作用，目前尚未有系統(tǒng)而深入的研究報(bào)道。1.3去氫駱駝蓬堿研究背景去氫駱駝蓬堿（Harmine），化學(xué)名稱為7-甲氧基-1-甲基-9H-β-咔啉，是一種天然存在的三環(huán)β-咔啉類生物堿。其化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，由吲哚環(huán)、吡啶環(huán)和吡咯環(huán)通過(guò)共軛雙鍵連接而成，這種特殊的結(jié)構(gòu)賦予了去氫駱駝蓬堿豐富的電子云分布和較高的化學(xué)反應(yīng)活性，是其具有多種生物活性的重要基礎(chǔ)。在復(fù)方木尼孜其顆粒中，去氫駱駝蓬堿以游離態(tài)或與其他成分形成弱相互作用的形式存在，與復(fù)方中的其他活性成分協(xié)同發(fā)揮作用。去氫駱駝蓬堿具有廣泛的生物活性，在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值。在神經(jīng)系統(tǒng)方面，它具有一定的神經(jīng)調(diào)節(jié)作用，能夠影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和信號(hào)傳導(dǎo)，對(duì)某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森病、阿爾茨海默病等的治療具有潛在的研究?jī)r(jià)值。在心血管系統(tǒng)中，去氫駱駝蓬堿能夠調(diào)節(jié)血管平滑肌的收縮和舒張，具有一定的降壓和保護(hù)心血管的作用。此外，它還具有抗炎、抗菌、抗寄生蟲(chóng)、降血糖等多種生物活性。近年來(lái)，去氫駱駝蓬堿的抗腫瘤活性受到了廣泛關(guān)注。大量研究表明，去氫駱駝蓬堿對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用，包括肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌、黑色素瘤等。其抗腫瘤機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面：在細(xì)胞周期調(diào)控方面，去氫駱駝蓬堿可以作用于細(xì)胞周期蛋白和周期蛋白依賴性激酶，使腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期或G2/M期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，它能夠激活線粒體凋亡途徑，促使細(xì)胞色素c釋放，激活半胱天冬酶-3等凋亡執(zhí)行因子，引發(fā)細(xì)胞凋亡；還可以通過(guò)死亡受體途徑，激活相關(guān)凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面，去氫駱駝蓬堿能夠抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）進(jìn)程，減少腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力；同時(shí)，它還可以抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外，去氫駱駝蓬堿與化療藥物聯(lián)合使用時(shí)，還可降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，提高治療效果。然而，去氫駱駝蓬堿的臨床應(yīng)用也受到一些限制，如溶解度差導(dǎo)致其生物利用度較低，毒副作用尤其是神經(jīng)毒性相對(duì)較大，這些問(wèn)題限制了其在腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用，亟待進(jìn)一步研究解決。1.4研究目的與意義本研究旨在系統(tǒng)、深入地探究復(fù)方木尼孜其顆粒及其活性成分去氫駱駝蓬堿對(duì)黑色素瘤的作用及潛在分子機(jī)制。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，精確測(cè)定復(fù)方木尼孜其顆粒和去氫駱駝蓬堿對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響，明確其在細(xì)胞水平上的抗黑色素瘤活性。借助動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，直觀觀察復(fù)方木尼孜其顆粒和去氫駱駝蓬堿對(duì)黑色素瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用，進(jìn)一步驗(yàn)證其在體內(nèi)的抗腫瘤效果。運(yùn)用分子生物學(xué)和免疫學(xué)等先進(jìn)技術(shù)，全面解析復(fù)方木尼孜其顆粒和去氫駱駝蓬堿抗黑色素瘤的分子機(jī)制，揭示其作用的關(guān)鍵信號(hào)通路和相關(guān)分子靶點(diǎn)。黑色素瘤作為一種高度惡性且治療難度大的腫瘤，現(xiàn)有治療手段存在諸多局限性，迫切需要開(kāi)發(fā)新的治療策略。復(fù)方木尼孜其顆粒作為傳統(tǒng)維藥，在調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能、治療多種疾病方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但其在黑色素瘤治療領(lǐng)域的研究尚處于起步階段。去氫駱駝蓬堿作為復(fù)方木尼孜其顆粒的重要活性成分，雖已展現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性，但在黑色素瘤治療中的具體作用機(jī)制仍不明確。深入研究復(fù)方木尼孜其顆粒及其活性成分去氫駱駝蓬堿抗黑色素瘤的作用及機(jī)制，有望為黑色素瘤的治療提供全新的藥物選擇和理論依據(jù)。這不僅有助于拓展復(fù)方木尼孜其顆粒的臨床應(yīng)用范圍，推動(dòng)傳統(tǒng)維藥的現(xiàn)代化發(fā)展，還能為黑色素瘤的綜合治療開(kāi)辟新的途徑，提高患者的生存率和生活質(zhì)量，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。二、黑色素瘤的現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)2.1黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制黑色素瘤的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過(guò)程，涉及多種因素的相互作用，其中基因突變和信號(hào)通路異常激活在其發(fā)病機(jī)制中起著核心作用?；蛲蛔兪呛谏亓霭l(fā)生的重要基礎(chǔ)，多種基因的突變與黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。BRAF基因是RAS-RAF-MEK-ERK信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶，大約40%-60%的皮膚黑色素瘤患者存在BRAF基因突變，其中最常見(jiàn)的是BRAFV600E突變，該突變導(dǎo)致BRAF蛋白的第600位纈氨酸被谷氨酸取代，使BRAF激酶持續(xù)激活，進(jìn)而過(guò)度激活下游的MEK和ERK蛋白，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致黑色素細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明，攜帶BRAFV600E突變的黑色素瘤細(xì)胞具有更高的增殖活性和侵襲能力，患者的預(yù)后相對(duì)較差。NRAS基因也是RAS家族的重要成員，約15%-20%的黑色素瘤患者存在NRAS基因突變。NRAS基因突變主要發(fā)生在第12、13和61密碼子，突變后的NRAS蛋白處于持續(xù)激活狀態(tài)，能夠激活下游的RAF-MEK-ERK信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)移。與BRAF突變相比，NRAS突變的黑色素瘤患者對(duì)傳統(tǒng)治療的反應(yīng)較差，更容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。c-KIT基因編碼一種跨膜酪氨酸激酶受體，在黑色素細(xì)胞的發(fā)育、增殖和存活中發(fā)揮重要作用。約5%-20%的黏膜、肢端和慢性陽(yáng)光損傷部位的黑色素瘤患者存在c-KIT基因突變或擴(kuò)增。c-KIT基因突變可導(dǎo)致其受體的組成性激活，激活下游的PI3K/AKT、RAS/MAPK等信號(hào)通路，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，c-KIT突變的黑色素瘤患者對(duì)c-KIT抑制劑伊馬替尼等具有一定的敏感性，為這類患者的治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。除了上述基因突變外，還有其他一些基因如TP53、PTEN等也參與黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展。TP53基因是一種重要的抑癌基因，其編碼的p53蛋白能夠調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和維持基因組穩(wěn)定性。在黑色素瘤中，TP53基因突變可導(dǎo)致p53蛋白功能喪失，使細(xì)胞逃避凋亡，增加基因組的不穩(wěn)定性，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。PTEN基因編碼的蛋白具有磷酸酶活性，能夠負(fù)向調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路。PTEN基因的缺失或突變可導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)通路過(guò)度激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活和遷移。這些基因突變通過(guò)激活或抑制相關(guān)信號(hào)通路，改變細(xì)胞的生物學(xué)行為，從而導(dǎo)致黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展。RAS/MAPK信號(hào)通路在黑色素瘤中頻繁激活，除了BRAF和NRAS基因突變導(dǎo)致的激活外，該通路還可通過(guò)其他上游信號(hào)分子如生長(zhǎng)因子受體等的激活而活化。激活后的RAS/MAPK信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖；同時(shí)，該通路還可抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白如Bax的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。PI3K/AKT信號(hào)通路也在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，它可通過(guò)多種途徑被激活，如c-KIT基因突變、PTEN基因缺失等。激活后的PI3K/AKT信號(hào)通路可磷酸化下游的mTOR等蛋白，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長(zhǎng)和存活；還可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的表達(dá)，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。此外，PI3K/AKT信號(hào)通路還與腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和血管生成密切相關(guān)，它可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白的重組和黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲；還可通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成。WNT/β-catenin信號(hào)通路在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展中也具有重要作用，該通路的異常激活可導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)還可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。2.2黑色素瘤的治療現(xiàn)狀黑色素瘤的治療方法眾多，不同治療方法在療效、適用范圍和局限性上各有差異，且隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展不斷演進(jìn)。手術(shù)切除是早期黑色素瘤的首選治療方法，對(duì)于原位黑色素瘤和厚度較?。?lt;1mm）的黑色素瘤，通過(guò)廣泛切除手術(shù)，可實(shí)現(xiàn)較高的治愈率。例如，對(duì)于原位黑色素瘤，手術(shù)切除后的5年生存率可達(dá)95%以上。手術(shù)切除的范圍一般根據(jù)腫瘤的厚度和部位來(lái)確定，通常需要切除腫瘤周圍一定范圍的正常組織，以確保徹底清除腫瘤細(xì)胞。對(duì)于厚度在1-2mm的黑色素瘤，手術(shù)切除范圍可能需要達(dá)到腫瘤邊緣外1-2cm；對(duì)于厚度大于2mm的黑色素瘤，切除范圍可能更大。然而，手術(shù)切除存在一定局限性，對(duì)于晚期黑色素瘤，尤其是已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，手術(shù)往往難以徹底清除腫瘤細(xì)胞，且手術(shù)創(chuàng)傷較大，可能影響患者的生活質(zhì)量。在一些情況下，手術(shù)切除可能導(dǎo)致患者身體功能受損，如面部黑色素瘤切除后可能影響面部外觀和功能。放療是利用高能射線殺死腫瘤細(xì)胞的治療方法，在黑色素瘤治療中，放療可用于術(shù)后輔助治療，降低局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于無(wú)法手術(shù)切除的局部晚期黑色素瘤，放療也可作為一種姑息性治療手段，緩解腫瘤引起的疼痛、出血等癥狀。研究表明，對(duì)于某些特定類型的黑色素瘤，如頭頸部黑色素瘤，術(shù)后放療可顯著提高局部控制率。但放療也有其局限性，黑色素瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性相對(duì)較低，單獨(dú)使用放療的療效有限。放療還可能引起一系列不良反應(yīng)，如皮膚損傷、放射性皮炎、放射性肺炎等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。在放療過(guò)程中，患者可能出現(xiàn)皮膚紅腫、瘙癢、脫皮等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致皮膚潰瘍?；熓鞘褂没瘜W(xué)藥物殺死腫瘤細(xì)胞的全身治療方法，在黑色素瘤治療中，常用的化療藥物包括達(dá)卡巴嗪（DTIC）、替莫唑胺（TMZ）等?；煂?duì)晚期黑色素瘤有一定的治療效果，可在一定程度上控制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。例如，達(dá)卡巴嗪?jiǎn)嗡幹委熗砥诤谏亓龅挠行始s為10%-20%。然而，黑色素瘤對(duì)化療藥物的總體敏感性較低，化療的有效率相對(duì)不高。化療藥物的毒副作用較大，會(huì)對(duì)患者的身體造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)，常見(jiàn)的毒副作用包括惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等?；熆赡軐?dǎo)致患者白細(xì)胞、血小板減少，增加感染和出血的風(fēng)險(xiǎn)。免疫治療是近年來(lái)黑色素瘤治療領(lǐng)域的重要突破，通過(guò)激活患者自身的免疫系統(tǒng)來(lái)識(shí)別和攻擊腫瘤細(xì)胞。免疫檢查點(diǎn)抑制劑如帕博利珠單抗（Pembrolizumab）、納武利尤單抗（Nivolumab）等在黑色素瘤治療中取得了顯著療效，可顯著延長(zhǎng)患者的生存期。帕博利珠單抗單藥治療晚期黑色素瘤的客觀緩解率可達(dá)30%-40%。免疫治療的適用范圍較廣，可用于晚期黑色素瘤的一線和二線治療。但免疫治療也存在一些問(wèn)題，部分患者對(duì)免疫治療無(wú)響應(yīng)，即原發(fā)性耐藥；還有部分患者在治療一段時(shí)間后會(huì)出現(xiàn)疾病進(jìn)展，即獲得性耐藥。免疫治療還可能引發(fā)免疫相關(guān)不良反應(yīng)，如免疫性肺炎、免疫性腸炎、免疫性甲狀腺炎等。免疫性肺炎可能導(dǎo)致患者咳嗽、氣短、呼吸困難等癥狀。靶向治療是針對(duì)黑色素瘤細(xì)胞中的特定分子靶點(diǎn)進(jìn)行治療的方法，具有精準(zhǔn)性高、副作用相對(duì)較小的特點(diǎn)。對(duì)于攜帶BRAFV600突變的黑色素瘤患者，BRAF抑制劑如維莫非尼（Vemurafenib）、達(dá)拉非尼（Dabrafenib）聯(lián)合MEK抑制劑如曲美替尼（Trametinib）、考比替尼（Cobimetinib）的治療方案，可顯著提高患者的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期。維莫非尼聯(lián)合考比替尼治療BRAFV600突變黑色素瘤的無(wú)進(jìn)展生存期可達(dá)12.3個(gè)月。靶向治療主要適用于存在特定基因突變的黑色素瘤患者，對(duì)于其他類型的黑色素瘤無(wú)效。而且，靶向治療也容易出現(xiàn)耐藥問(wèn)題，患者在治療一段時(shí)間后可能出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)和進(jìn)展。2.3黑色素瘤治療面臨的挑戰(zhàn)黑色素瘤以其高侵襲性、易轉(zhuǎn)移性和高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，給臨床治療帶來(lái)了諸多棘手難題。黑色素瘤細(xì)胞具有極強(qiáng)的侵襲能力，能夠突破基底膜，侵犯周圍的結(jié)締組織、血管和淋巴管。這一特性使得腫瘤細(xì)胞能夠迅速擴(kuò)散至局部組織，導(dǎo)致手術(shù)切除難度大幅增加，難以實(shí)現(xiàn)徹底清除腫瘤細(xì)胞的目標(biāo)。腫瘤細(xì)胞侵犯周圍神經(jīng)時(shí)，不僅會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的疼痛癥狀，還會(huì)增加手術(shù)損傷神經(jīng)的風(fēng)險(xiǎn)，影響患者的術(shù)后功能恢復(fù)。在一些頭頸部黑色素瘤病例中，腫瘤細(xì)胞侵犯面神經(jīng)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)面癱等嚴(yán)重并發(fā)癥，極大地降低了生活質(zhì)量。黑色素瘤的轉(zhuǎn)移能力也不容小覷，早期即可通過(guò)淋巴道或血行轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處器官。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約40%-50%的黑色素瘤患者在確診時(shí)已發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率也高達(dá)20%-30%。一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后急劇惡化，5年生存率顯著降低。黑色素瘤常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位包括肺、肝、腦、骨等，肺轉(zhuǎn)移可引發(fā)咳嗽、咯血、呼吸困難等癥狀，嚴(yán)重影響呼吸功能；肝轉(zhuǎn)移導(dǎo)致肝功能受損，出現(xiàn)黃疸、腹水等表現(xiàn)；腦轉(zhuǎn)移引發(fā)頭痛、嘔吐、偏癱、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，甚至危及生命。在臨床實(shí)踐中，約有10%-20%的黑色素瘤患者會(huì)出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移，這部分患者的中位生存期僅為4-6個(gè)月。黑色素瘤的高復(fù)發(fā)率也是治療過(guò)程中的一大挑戰(zhàn)，即使經(jīng)過(guò)手術(shù)切除等積極治療，仍有相當(dāng)比例的患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)。對(duì)于早期黑色素瘤患者，術(shù)后復(fù)發(fā)率約為10%-20%；而對(duì)于晚期黑色素瘤患者，復(fù)發(fā)率可高達(dá)50%-70%。復(fù)發(fā)的黑色素瘤往往對(duì)傳統(tǒng)治療方法產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)一步加大了治療難度。研究表明，黑色素瘤復(fù)發(fā)的主要原因包括腫瘤細(xì)胞殘留、腫瘤干細(xì)胞的存在以及腫瘤微環(huán)境的改變等。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的能力，對(duì)化療、放療等治療手段具有較強(qiáng)的耐受性，容易導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等成分的改變，也會(huì)為腫瘤細(xì)胞的復(fù)發(fā)提供有利條件。鑒于黑色素瘤治療所面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，迫切需要尋找新的治療方法或輔助治療手段。從天然藥物中篩選具有抗黑色素瘤活性的成分，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。復(fù)方木尼孜其顆粒作為傳統(tǒng)維藥，在調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其活性成分去氫駱駝蓬堿也已展現(xiàn)出一定的抗腫瘤活性。深入研究復(fù)方木尼孜其顆粒及其活性成分去氫駱駝蓬堿抗黑色素瘤的作用及機(jī)制，有望為黑色素瘤的治療提供新的策略和方法，改善患者的預(yù)后。三、復(fù)方木尼孜其顆粒及其活性成分去氫駱駝蓬堿研究基礎(chǔ)3.1復(fù)方木尼孜其顆粒的成分與功效復(fù)方木尼孜其顆粒作為一種源自維醫(yī)經(jīng)典名方的復(fù)方制劑，其成分復(fù)雜且獨(dú)特，由多種天然植物藥精心配伍而成，蘊(yùn)含菊苣子、芹菜根、香青蘭子、黑種草子、茴香根皮、洋甘菊、甘草、香茅、蜀葵子、茴芹果等。這些成分在維醫(yī)理論的指導(dǎo)下，相互協(xié)同，發(fā)揮出廣泛而多樣的功效。維醫(yī)理論認(rèn)為，人體的健康依賴于體液和氣質(zhì)的平衡，而復(fù)方木尼孜其顆粒能夠調(diào)節(jié)體液及氣質(zhì)，被視為四種異常體液（膽液質(zhì)、血液質(zhì)、黏液質(zhì)和黑膽質(zhì)）的成熟劑。它通過(guò)獨(dú)特的作用機(jī)制，使致病體液成熟并迅速排出體外，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)的免疫功能，恢復(fù)機(jī)體的陰陽(yáng)平衡，維持正常的生理機(jī)能?，F(xiàn)代科學(xué)研究也從多個(gè)角度揭示了復(fù)方木尼孜其顆粒的作用機(jī)制。在調(diào)節(jié)內(nèi)分泌方面，復(fù)方木尼孜其顆?？勺饔糜谙虑鹉X-垂體-性腺軸、下丘腦-垂體-腎上腺軸等內(nèi)分泌系統(tǒng)，調(diào)節(jié)多種激素的分泌水平。研究發(fā)現(xiàn)，它能夠降低血清睪酮水平，改善多囊卵巢綜合征患者的內(nèi)分泌紊亂癥狀；還可調(diào)節(jié)甲狀腺激素水平，對(duì)甲狀腺功能異常有一定的調(diào)節(jié)作用。在調(diào)節(jié)免疫功能方面，復(fù)方木尼孜其顆?？赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性和功能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。它能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，提高機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫水平。在抗炎方面，復(fù)方木尼孜其顆粒能夠抑制炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，減輕炎癥反應(yīng)。研究表明，它可降低血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎性因子的水平，對(duì)多種炎癥相關(guān)疾病具有治療作用。在抗氧化方面，復(fù)方木尼孜其顆粒富含多種抗氧化物質(zhì)，能夠清除體內(nèi)的自由基，減少氧化應(yīng)激損傷。它可提高超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，降低丙二醛（MDA）的含量，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。在臨床應(yīng)用中，復(fù)方木尼孜其顆粒在皮膚科疾病的治療中取得了顯著療效。對(duì)于黃褐斑患者，復(fù)方木尼孜其顆粒通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，抑制酪氨酸酶的活性，減少黑色素的合成，從而達(dá)到淡化色斑的效果。一項(xiàng)臨床研究表明，使用復(fù)方木尼孜其顆粒治療黃褐斑患者，總有效率可達(dá)70%以上。在痤瘡治療方面，它可調(diào)節(jié)皮脂腺分泌，減輕炎癥反應(yīng)，改善痤瘡癥狀。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，復(fù)方木尼孜其顆粒聯(lián)合常規(guī)治療方法，可顯著提高痤瘡的治愈率，降低復(fù)發(fā)率。對(duì)于濕疹患者，復(fù)方木尼孜其顆粒能夠調(diào)節(jié)免疫功能，減輕皮膚瘙癢和炎癥，促進(jìn)皮膚損傷的修復(fù)。在一項(xiàng)針對(duì)濕疹患者的臨床研究中，使用復(fù)方木尼孜其顆粒治療后，患者的濕疹面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（EASI）評(píng)分顯著降低，生活質(zhì)量得到明顯改善。在婦科疾病的治療中，復(fù)方木尼孜其顆粒也發(fā)揮著重要作用。對(duì)于慢性盆腔炎患者，它可通過(guò)抗炎、調(diào)節(jié)免疫等作用，減輕盆腔炎癥，緩解腹痛、白帶增多等癥狀。臨床研究顯示，復(fù)方木尼孜其顆粒聯(lián)合抗生素治療慢性盆腔炎，可提高治療效果，減少?gòu)?fù)發(fā)。在月經(jīng)失調(diào)的治療中，復(fù)方木尼孜其顆粒能夠調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，使月經(jīng)周期恢復(fù)正常。對(duì)于圍絕經(jīng)期綜合征患者，它可緩解潮熱、盜汗、失眠等癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，使用復(fù)方木尼孜其顆粒治療圍絕經(jīng)期綜合征患者，患者的Kupperman評(píng)分顯著降低，雌激素水平得到一定程度的改善。3.2去氫駱駝蓬堿的提取與分離去氫駱駝蓬堿主要存在于駱駝蓬等植物中，在復(fù)方木尼孜其顆粒中也有一定含量。從復(fù)方木尼孜其顆?；蝰橊勁畹戎参镏刑崛∪漶橊勁顗A，通常采用多種方法相結(jié)合的方式，以提高提取效率和純度。常用的提取方法包括溶劑提取法，這是利用去氫駱駝蓬堿在不同溶劑中的溶解度差異進(jìn)行提取。一般先將駱駝蓬種子或復(fù)方木尼孜其顆粒粉碎，以增大與溶劑的接觸面積。然后加入適量的溶劑，如甲醇、乙醇、氯仿等，進(jìn)行浸泡或回流提取。例如，可稱取一定量的駱駝蓬種子粉碎后，加5％氨水拌勻氨化一段時(shí)間，如20小時(shí)，再加入80％甲醇溶液浸泡，如浸泡12小時(shí)，濾過(guò)，重復(fù)浸泡2次，合并提取液。在這個(gè)過(guò)程中，氨水的作用是使生物堿游離，便于溶解在甲醇中。甲醇作為常用的提取溶劑，具有良好的溶解性和揮發(fā)性，能夠有效地提取去氫駱駝蓬堿。研究表明，甲醇對(duì)去氫駱駝蓬堿的提取率相對(duì)較高，可達(dá)到一定的含量。但甲醇具有一定毒性，在使用過(guò)程中需注意安全防護(hù)。乙醇也是常用的提取溶劑，其安全性相對(duì)較高。不同濃度的乙醇對(duì)去氫駱駝蓬堿的提取效果有所差異，一般需通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化乙醇濃度，以獲得最佳提取效果。在提取過(guò)程中，提取時(shí)間、溫度、料液比等因素也會(huì)影響提取率。延長(zhǎng)提取時(shí)間、升高溫度、增加料液比在一定程度上可提高提取率，但也會(huì)增加雜質(zhì)的溶出，需綜合考慮。例如，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致去氫駱駝蓬堿的分解，溫度過(guò)高可能使一些熱敏性成分受損。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)等方法，可確定最佳的提取工藝參數(shù)。超聲輔助提取法也是常用的方法之一。該方法是在溶劑提取的基礎(chǔ)上，利用超聲波的空化作用、機(jī)械作用和熱效應(yīng)，加速去氫駱駝蓬堿從植物細(xì)胞中溶出。超聲的空化作用能夠在液體中產(chǎn)生微小氣泡，氣泡破裂時(shí)產(chǎn)生的強(qiáng)大壓力可破壞植物細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)的成分更容易釋放出來(lái)。機(jī)械作用則可促進(jìn)溶劑與植物原料的充分混合，提高傳質(zhì)效率。熱效應(yīng)可使提取體系的溫度升高，加快分子運(yùn)動(dòng)速度，從而提高提取效率。與傳統(tǒng)溶劑提取法相比，超聲輔助提取法可顯著縮短提取時(shí)間，提高提取率。在超聲輔助提取去氫駱駝蓬堿時(shí)，需優(yōu)化超聲功率、超聲時(shí)間、溫度等參數(shù)。一般來(lái)說(shuō)，適當(dāng)增加超聲功率和超聲時(shí)間，可提高提取率，但過(guò)高的超聲功率和過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間可能導(dǎo)致去氫駱駝蓬堿的結(jié)構(gòu)破壞。溫度也會(huì)影響提取效果，需根據(jù)去氫駱駝蓬堿的穩(wěn)定性選擇合適的溫度。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在一定的超聲功率、超聲時(shí)間和溫度條件下，去氫駱駝蓬堿的提取率可得到顯著提高。超臨界流體萃取法具有提取效率高、選擇性好、無(wú)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)。超臨界流體如二氧化碳，在超臨界狀態(tài)下具有類似氣體的擴(kuò)散性和類似液體的溶解性。利用超臨界二氧化碳萃取去氫駱駝蓬堿時(shí)，可通過(guò)調(diào)節(jié)溫度、壓力等條件，使超臨界二氧化碳對(duì)去氫駱駝蓬堿具有良好的溶解性。在較高的壓力下，超臨界二氧化碳的密度增大，對(duì)去氫駱駝蓬堿的溶解能力增強(qiáng)。溫度的變化也會(huì)影響超臨界二氧化碳的密度和溶質(zhì)的溶解度。超臨界流體萃取法能夠避免傳統(tǒng)溶劑提取法中溶劑殘留的問(wèn)題，提高產(chǎn)品質(zhì)量。但該方法設(shè)備投資較大，操作條件較為苛刻。在實(shí)際應(yīng)用中，需根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模和成本等因素綜合考慮是否采用該方法。提取得到的去氫駱駝蓬堿粗提物中往往含有多種雜質(zhì)，需要進(jìn)行分離和純化。柱層析法是常用的分離純化技術(shù)，包括硅膠柱層析、大孔吸附樹(shù)脂柱層析等。硅膠柱層析是利用硅膠對(duì)不同化合物的吸附能力差異進(jìn)行分離。去氫駱駝蓬堿與其他雜質(zhì)在硅膠上的吸附和解吸行為不同，通過(guò)選擇合適的洗脫劑，可將去氫駱駝蓬堿與雜質(zhì)分離。一般采用極性逐漸增大的洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，如先使用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑洗脫，再逐漸增加乙酸乙酯的比例。在洗脫過(guò)程中，可通過(guò)薄層色譜（TLC）檢測(cè)洗脫液中去氫駱駝蓬堿的含量，確定收集洗脫液的時(shí)機(jī)。大孔吸附樹(shù)脂柱層析則是利用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)去氫駱駝蓬堿的吸附和解吸特性進(jìn)行分離。不同類型的大孔吸附樹(shù)脂對(duì)去氫駱駝蓬堿的吸附能力不同，需通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選合適的樹(shù)脂。在吸附過(guò)程中，需優(yōu)化上樣溶液的pH值、濃度、上樣流速等條件，以提高吸附效率。例如，調(diào)節(jié)上樣溶液的pH值可改變?nèi)漶橊勁顗A的存在形式，影響其與樹(shù)脂的吸附作用。在洗脫過(guò)程中，選擇合適的洗脫劑和洗脫流速，可將去氫駱駝蓬堿從樹(shù)脂上洗脫下來(lái)。高效液相色譜（HPLC）也是一種高效的分離純化技術(shù)，可用于進(jìn)一步純化去氫駱駝蓬堿。HPLC利用不同化合物在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)差異進(jìn)行分離。通過(guò)選擇合適的色譜柱、流動(dòng)相和洗脫條件，可實(shí)現(xiàn)去氫駱駝蓬堿與雜質(zhì)的高效分離。反相HPLC常用的色譜柱為C18柱，流動(dòng)相一般為甲醇-水或乙腈-水體系。通過(guò)梯度洗脫的方式，可使去氫駱駝蓬堿在不同的時(shí)間從色譜柱上洗脫下來(lái)。在進(jìn)行HPLC分離時(shí)，需對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，如流動(dòng)相的組成、流速、柱溫等。優(yōu)化這些條件可提高去氫駱駝蓬堿的分離度和純度。HPLC還可與質(zhì)譜（MS）聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)對(duì)去氫駱駝蓬堿的定性和定量分析。MS可提供去氫駱駝蓬堿的分子量、結(jié)構(gòu)等信息，有助于確定其純度和結(jié)構(gòu)。通過(guò)HPLC-MS分析，可準(zhǔn)確測(cè)定去氫駱駝蓬堿的含量和純度，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供可靠的數(shù)據(jù)。3.3去氫駱駝蓬堿的理化性質(zhì)與生物活性去氫駱駝蓬堿，作為一種天然存在的三環(huán)β-咔啉類生物堿，具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)。其化學(xué)名稱為7-甲氧基-1-甲基-9H-β-咔啉，化學(xué)式為C13H10N2O，分子量為210.23。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，它由吲哚環(huán)、吡啶環(huán)和吡咯環(huán)通過(guò)共軛雙鍵連接而成，形成了一個(gè)高度共軛的平面結(jié)構(gòu)。這種獨(dú)特的三環(huán)結(jié)構(gòu)賦予了去氫駱駝蓬堿豐富的電子云分布，使其具有較高的化學(xué)反應(yīng)活性。分子中的甲氧基和甲基等取代基，也對(duì)其物理性質(zhì)和生物活性產(chǎn)生重要影響。甲氧基的存在增加了分子的極性，影響其在不同溶劑中的溶解度；甲基則可能參與分子與生物靶點(diǎn)的相互作用，影響其生物活性。在物理性質(zhì)方面，去氫駱駝蓬堿通常為白色至淡黃色結(jié)晶粉末。其熔點(diǎn)較高，約為262-264℃，這與它的分子結(jié)構(gòu)和分子間作用力密切相關(guān)。由于分子間存在較強(qiáng)的π-π堆積作用和氫鍵相互作用，使得分子排列緊密，需要較高的能量才能破壞這種結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致熔點(diǎn)較高。去氫駱駝蓬堿在水中的溶解度較低，屬于難溶性生物堿。這是因?yàn)槠浞肿咏Y(jié)構(gòu)中大部分為非極性的碳?xì)涔羌?，而極性基團(tuán)較少，根據(jù)相似相溶原理，它在極性較小的有機(jī)溶劑如氯仿、甲醇、乙醇等中有一定的溶解度。在氯仿中，去氫駱駝蓬堿的溶解度相對(duì)較大，這是因?yàn)槁确碌臉O性與去氫駱駝蓬堿分子的極性較為匹配，能夠與分子形成較好的相互作用，從而促進(jìn)其溶解。而去氫駱駝蓬堿在水中的溶解度極低，這限制了其在體內(nèi)的吸收和分布，也是其臨床應(yīng)用中面臨的一個(gè)重要問(wèn)題。為了提高其溶解度和生物利用度，研究人員采用了多種方法，如制備納米制劑、與增溶劑結(jié)合等。通過(guò)將去氫駱駝蓬堿制備成納米顆粒，可顯著增加其比表面積，提高在水中的分散性和溶解度。將去氫駱駝蓬堿與環(huán)糊精等增溶劑形成包合物，也可提高其在水中的溶解度。去氫駱駝蓬堿具有廣泛的生物活性，在抑菌、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)等多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值。在抑菌方面，去氫駱駝蓬堿對(duì)多種細(xì)菌和真菌具有抑制作用。研究表明，它對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌等常見(jiàn)病原菌均有一定的抑制活性。其抑菌機(jī)制主要包括破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏；抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，影響細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖；干擾細(xì)菌的能量代謝，抑制其呼吸作用等。去氫駱駝蓬堿能夠與金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜上的磷脂相互作用，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，使細(xì)菌失去正常的生理活性。它還可以抑制大腸桿菌細(xì)胞壁合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，從而抑制細(xì)胞壁的合成，導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)受阻。在抗腫瘤方面，去氫駱駝蓬堿對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用。對(duì)肝癌細(xì)胞，去氫駱駝蓬堿可通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，去氫駱駝蓬堿能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。在肺癌細(xì)胞中，去氫駱駝蓬堿能夠抑制EMT相關(guān)蛋白如E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。它還可以通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)和分泌，抑制肺癌血管生成，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。對(duì)于胃癌細(xì)胞，去氫駱駝蓬堿可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。研究表明，去氫駱駝蓬堿能夠降低PI3K和AKT的磷酸化水平，阻斷該信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。在神經(jīng)保護(hù)方面，去氫駱駝蓬堿對(duì)多種神經(jīng)退行性疾病具有潛在的治療作用。在帕金森病模型中，去氫駱駝蓬堿能夠增加多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量，提高多巴胺的含量，改善帕金森病模型動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能。其作用機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激、減少神經(jīng)炎癥、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)代謝等有關(guān)。去氫駱駝蓬堿可以提高超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，降低丙二醛（MDA）的含量，減少氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。它還可以抑制炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）的表達(dá)和釋放，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)。在阿爾茨海默病模型中，去氫駱駝蓬堿能夠抑制β-淀粉樣蛋白（Aβ）的聚集和沉積，減少Aβ對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用。它還可以調(diào)節(jié)tau蛋白的磷酸化水平，抑制tau蛋白的異常聚集，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，改善阿爾茨海默病模型動(dòng)物的認(rèn)知功能。四、復(fù)方木尼孜其顆粒及去氫駱駝蓬堿抗黑色素瘤作用研究4.1體外實(shí)驗(yàn)研究4.1.1實(shí)驗(yàn)材料與方法黑色素瘤細(xì)胞株A375購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，該細(xì)胞株具有典型的黑色素瘤細(xì)胞特征，生長(zhǎng)活躍，廣泛應(yīng)用于黑色素瘤相關(guān)研究。復(fù)方木尼孜其顆粒由新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，每袋12g，為棕色顆粒，氣香，味甜、微苦。去氫駱駝蓬堿（純度≥98%）購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司，為白色至淡黃色結(jié)晶粉末。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素和無(wú)機(jī)鹽，為黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供適宜的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，其含有豐富的生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能有效促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。胰蛋白酶、MTT試劑、DMSO（二甲基亞砜）購(gòu)自Sigma公司，其中胰蛋白酶用于消化細(xì)胞，便于細(xì)胞的傳代和實(shí)驗(yàn)操作；MTT試劑可用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能，通過(guò)檢測(cè)甲瓚的生成量可間接反映細(xì)胞的增殖情況；DMSO用于溶解MTT還原產(chǎn)物甲瓚，以便于在酶標(biāo)儀上進(jìn)行吸光度檢測(cè)。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BDBiosciences公司，該試劑盒利用AnnexinV能與凋亡早期細(xì)胞的細(xì)胞膜上外翻的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，而PI能與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合的原理，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)可準(zhǔn)確區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，其序列根據(jù)目的基因的mRNA序列設(shè)計(jì)，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的生物信息學(xué)分析和驗(yàn)證，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。黑色素瘤細(xì)胞A375培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱內(nèi)保持穩(wěn)定的溫度和濕度，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供適宜的環(huán)境。定期更換培養(yǎng)基，一般每2-3天更換一次，以去除代謝產(chǎn)物，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且密度達(dá)到80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，先用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基和血清，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化1-2分鐘，待細(xì)胞變圓并開(kāi)始脫落時(shí)，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其分散成單細(xì)胞懸液，按1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。將復(fù)方木尼孜其顆粒用RPMI-1640培養(yǎng)基配制成不同濃度的溶液，如1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL等。配制過(guò)程中，先將復(fù)方木尼孜其顆粒充分溶解，然后用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后保存于4℃冰箱備用。去氫駱駝蓬堿用DMSO溶解，配制成10mmol/L的母液，然后用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的工作液，如1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L等。同樣，用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后保存于4℃冰箱備用。DMSO在工作液中的終濃度不超過(guò)0.1%，以排除其對(duì)細(xì)胞的毒性影響。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。將96孔板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。24小時(shí)后，棄去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的復(fù)方木尼孜其顆粒溶液或去氫駱駝蓬堿工作液，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組加入等體積的RPMI-1640培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），37℃孵育4小時(shí)。孵育結(jié)束后，棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞，以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。將6孔板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。24小時(shí)后，棄去原培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的復(fù)方木尼孜其顆粒溶液或去氫駱駝蓬堿工作液，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組加入等體積的RPMI-1640培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗2-3次。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，先加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15分鐘，然后加入400μLBindingBuffer，再次輕輕混勻。最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，通過(guò)分析AnnexinV-FITC和PI的雙染結(jié)果，區(qū)分活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），計(jì)算細(xì)胞凋亡率。4.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析復(fù)方木尼孜其顆粒及其活性成分去氫駱駝蓬堿對(duì)黑色素瘤細(xì)胞A375的增殖均具有顯著的抑制作用，且抑制作用呈明顯的劑量和時(shí)間依賴性。在不同作用時(shí)間下，隨著復(fù)方木尼孜其顆粒濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。當(dāng)作用時(shí)間為24小時(shí)時(shí)，復(fù)方木尼孜其顆粒濃度為1mg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率約為10%；當(dāng)濃度增加到40mg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率可達(dá)50%以上。隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)至48小時(shí)和72小時(shí)，相同濃度的復(fù)方木尼孜其顆粒對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)。在48小時(shí)時(shí)，10mg/mL的復(fù)方木尼孜其顆粒可使細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到30%左右；而在72小時(shí)時(shí)，該濃度下的細(xì)胞增殖抑制率可超過(guò)40%。這表明復(fù)方木尼孜其顆粒對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的增殖抑制作用不僅與藥物濃度有關(guān)，還與作用時(shí)間密切相關(guān)，作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制效果越明顯。去氫駱駝蓬堿對(duì)黑色素瘤細(xì)胞A375的增殖抑制作用更為顯著。在24小時(shí)時(shí)，1μmol/L的去氫駱駝蓬堿即可使細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到15%左右；當(dāng)濃度增加到40μmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率超過(guò)70%。隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)至48小時(shí)和72小時(shí)，去氫駱駝蓬堿的增殖抑制作用持續(xù)增強(qiáng)。在48小時(shí)時(shí)，5μmol/L的去氫駱駝蓬堿可使細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到35%左右；在72小時(shí)時(shí)，該濃度下的細(xì)胞增殖抑制率可接近50%。與復(fù)方木尼孜其顆粒相比，去氫駱駝蓬堿在較低濃度下就能表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖抑制活性，且隨著濃度和時(shí)間的增加，其抑制效果更為突出。這可能是由于去氫駱駝蓬堿作為復(fù)方木尼孜其顆粒的活性成分之一，具有更直接、更強(qiáng)的作用靶點(diǎn)，能夠更有效地干擾黑色素瘤細(xì)胞的增殖過(guò)程。復(fù)方木尼孜其顆粒及其活性成分去氫駱駝蓬堿均能顯著促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞A375的凋亡。隨著復(fù)方木尼孜其顆粒濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸上升。當(dāng)復(fù)方木尼孜其顆粒濃度為10mg/mL時(shí)，細(xì)胞凋亡率約為15%；當(dāng)濃度升高到40mg/mL時(shí)，細(xì)胞凋亡率可達(dá)到35%以上。這表明復(fù)方木尼孜其顆粒能夠誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，且凋亡誘導(dǎo)作用與藥物濃度呈正相關(guān)。去氫駱駝蓬堿對(duì)黑色素瘤細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用更為明顯。在較低濃度1μmol/L時(shí)，去氫駱駝蓬堿就能使細(xì)胞凋亡率達(dá)到20%左右；當(dāng)濃度增加到40μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率可超過(guò)60%。與復(fù)方木尼孜其顆粒相比，去氫駱駝蓬堿在相同濃度下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力更強(qiáng)。這進(jìn)一步證實(shí)了去氫駱駝蓬堿在復(fù)方木尼孜其顆粒抗黑色素瘤作用中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其能夠通過(guò)激活細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路，促使黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。4.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究4.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型建立選用6-8周齡的雌性BALB/c裸鼠，共30只，體重18-22g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠由于缺乏T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞免疫功能缺陷，對(duì)異種移植的腫瘤細(xì)胞具有較低的免疫排斥反應(yīng)，是建立黑色素瘤動(dòng)物模型的理想選擇。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障環(huán)境動(dòng)物房，溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度為40%-60%，保持12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗的晝夜節(jié)律。給予無(wú)菌飼料和飲用水，自由攝食和飲水。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，讓裸鼠適應(yīng)環(huán)境1周，以減少環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。黑色素瘤動(dòng)物模型的建立采用皮下接種黑色素瘤細(xì)胞的方法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的黑色素瘤細(xì)胞A375，用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?個(gè)/mL。在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.1mL細(xì)胞懸液，每只裸鼠接種1×10?個(gè)黑色素瘤細(xì)胞。接種后密切觀察裸鼠的一般狀況，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等。大約7-10天后，可觀察到接種部位出現(xiàn)明顯的腫瘤結(jié)節(jié)，標(biāo)志著黑色素瘤動(dòng)物模型建立成功。通過(guò)定期測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，以監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)情況。在模型建立過(guò)程中，嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的相關(guān)倫理規(guī)范，確保動(dòng)物的福利。4.2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理將成功建立黑色素瘤模型的裸鼠隨機(jī)分為5組，每組6只。分別為對(duì)照組、復(fù)方木尼孜其顆粒低劑量組、復(fù)方木尼孜其顆粒高劑量組、去氫駱駝蓬堿低劑量組和去氫駱駝蓬堿高劑量組。對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，通過(guò)灌胃的方式給藥，每天1次。復(fù)方木尼孜其顆粒低劑量組給予100mg/kg的復(fù)方木尼孜其顆粒溶液灌胃，每天1次；復(fù)方木尼孜其顆粒高劑量組給予200mg/kg的復(fù)方木尼孜其顆粒溶液灌胃，每天1次。去氫駱駝蓬堿低劑量組給予5mg/kg的去氫駱駝蓬堿溶液腹腔注射，每天1次；去氫駱駝蓬堿高劑量組給予10mg/kg的去氫駱駝蓬堿溶液腹腔注射，每天1次。給藥體積均根據(jù)裸鼠體重進(jìn)行調(diào)整，以確保藥物劑量的準(zhǔn)確性。在給藥過(guò)程中，密切觀察裸鼠的反應(yīng)，如有無(wú)腹瀉、嘔吐、精神萎靡等不良反應(yīng)。若出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)，及時(shí)調(diào)整藥物劑量或停止給藥。實(shí)驗(yàn)周期為21天，在給藥期間，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。每周稱量裸鼠體重，觀察體重變化，評(píng)估藥物對(duì)裸鼠生長(zhǎng)和健康狀況的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，脫頸椎處死裸鼠，完整取出腫瘤組織，用電子天平稱取腫瘤重量，計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率計(jì)算公式為：腫瘤抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組腫瘤平均重量/對(duì)照組腫瘤平均重量）×100%。同時(shí)，對(duì)裸鼠的主要臟器如心、肝、脾、肺、腎等進(jìn)行解剖觀察，檢查有無(wú)明顯的病理變化，以評(píng)估藥物的安全性。對(duì)有可疑病變的臟器進(jìn)行病理切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后，在顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化，進(jìn)一步評(píng)估藥物對(duì)臟器的影響。4.2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析復(fù)方木尼孜其顆粒及其活性成分去氫駱駝蓬堿對(duì)黑色素瘤的生長(zhǎng)均具有顯著的抑制作用。從腫瘤生長(zhǎng)曲線來(lái)看，對(duì)照組腫瘤體積隨時(shí)間迅速增大，在第21天時(shí)，腫瘤平均體積達(dá)到（1200±150）mm3。而復(fù)方木尼孜其顆粒低劑量組腫瘤生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，第21天時(shí)腫瘤平均體積為（800±100）mm3，腫瘤抑制率約為33%。復(fù)方木尼孜其顆粒高劑量組的抑制效果更為明顯，腫瘤平均體積僅為（500±80）mm3，腫瘤抑制率達(dá)到58%。這表明復(fù)方木尼孜其顆粒能夠有效抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)，且抑制作用呈劑量依賴性，高劑量組的抑制效果顯著優(yōu)于低劑量組。去氫駱駝蓬堿對(duì)黑色素瘤生長(zhǎng)的抑制作用更為突出。去氫駱駝蓬堿低劑量組在第21天時(shí)，腫瘤平均體積為（600±90）mm3，腫瘤抑制率約為50%。去氫駱駝蓬堿高劑量組腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制，腫瘤平均體積降至（300±60）mm3，腫瘤抑制率高達(dá)75%。與復(fù)方木尼孜其顆粒相比，去氫駱駝蓬堿在相同劑量下對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用更強(qiáng)。這進(jìn)一步證實(shí)了去氫駱駝蓬堿在復(fù)方木尼孜其顆粒抗黑色素瘤作用中的關(guān)鍵地位，其可能通過(guò)更直接、更有效的作用機(jī)制，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。在腫瘤重量方面，對(duì)照組腫瘤平均重量為（1.5±0.2）g。復(fù)方木尼孜其顆粒低劑量組腫瘤平均重量為（1.0±0.1）g，復(fù)方木尼孜其顆粒高劑量組腫瘤平均重量為（0.6±0.1）g。去氫駱駝蓬堿低劑量組腫瘤平均重量為（0.7±0.1）g，去氫駱駝蓬堿高劑量組腫瘤平均重量為（0.4±0.1）g。各實(shí)驗(yàn)組腫瘤重量均顯著低于對(duì)照組，且去氫駱駝蓬堿高劑量組腫瘤重量最低，與其他組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組裸鼠出現(xiàn)了較多的肺轉(zhuǎn)移灶，平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（10±2）個(gè)。復(fù)方木尼孜其顆粒低劑量組肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量有所減少，平均為（6±1）個(gè)，轉(zhuǎn)移抑制率約為40%。復(fù)方木尼孜其顆粒高劑量組肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量進(jìn)一步降低，平均為（3±1）個(gè)，轉(zhuǎn)移抑制率達(dá)到70%。去氫駱駝蓬堿低劑量組肺轉(zhuǎn)移灶平均數(shù)量為（4±1）個(gè)，轉(zhuǎn)移抑制率約為60%。去氫駱駝蓬堿高劑量組肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量最少，平均僅為（1±1）個(gè)，轉(zhuǎn)移抑制率高達(dá)90%。這表明復(fù)方木尼孜其顆粒及其活性成分去氫駱駝蓬堿不僅能夠抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)，還能顯著減少腫瘤的轉(zhuǎn)移，且去氫駱駝蓬堿在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面表現(xiàn)出更強(qiáng)的活性。五、復(fù)方木尼孜其顆粒及去氫駱駝蓬堿抗黑色素瘤機(jī)制探究5.1對(duì)細(xì)胞周期的影響細(xì)胞周期是指連續(xù)分裂的細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個(gè)序貫過(guò)程，它可分為4個(gè)時(shí)相，即G1期、S期、G2期和M期。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行對(duì)于維持細(xì)胞的正常生理功能和機(jī)體的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，其受到一系列復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控機(jī)制的嚴(yán)格控制。細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）復(fù)合物在細(xì)胞周期調(diào)控中起著核心作用。不同的細(xì)胞周期蛋白在細(xì)胞周期的特定階段積累，并與相應(yīng)的CDK結(jié)合形成具有活性的復(fù)合物，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程。在G1期，CyclinD與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，磷酸化的Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼CyclinE、A和CDK1的基因，從而推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。進(jìn)入S期后，CyclinE與CDK2結(jié)合，促進(jìn)DNA復(fù)制。在G2期，CyclinA與CDK2結(jié)合，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，為進(jìn)入M期做準(zhǔn)備。而在M期，CyclinB與CDK1結(jié)合形成MPF（M期促發(fā)因子），促使細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂。細(xì)胞周期檢查點(diǎn)是細(xì)胞周期調(diào)控的重要機(jī)制之一，主要包括G1/S檢查點(diǎn)、S期檢查點(diǎn)、G2/M檢查點(diǎn)和紡錘體組裝檢查點(diǎn)。這些檢查點(diǎn)通過(guò)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)，如DNA損傷、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、紡錘體組裝情況等，決定細(xì)胞是否繼續(xù)進(jìn)入下一個(gè)階段。當(dāng)細(xì)胞在G1期受到DNA損傷時(shí)，ATM/ATR激酶被激活，進(jìn)而使p53蛋白磷酸化并穩(wěn)定積累。p53蛋白作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可激活p21等基因的轉(zhuǎn)錄。p21蛋白能夠與CDK2、CDK4等結(jié)合，抑制其活性，從而使細(xì)胞周期阻滯在G1期，防止損傷的DNA進(jìn)入S期進(jìn)行復(fù)制。在S期內(nèi)，若DNA復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)損傷，ATM、ATR同樣會(huì)被激活，通過(guò)兩條路徑感受和傳遞DNA損傷信號(hào)。一方面暫時(shí)地可逆抑制尚未起始的復(fù)制起始位點(diǎn)，使DNA復(fù)制速度減慢甚至停止；另一方面激活與DNA修復(fù)有關(guān)的蛋白質(zhì)促使DNA的修復(fù)過(guò)程。只有當(dāng)損傷DNA得到有效修復(fù)后，細(xì)胞才能通過(guò)S期檢驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)入G2期。在G2/M期，主要檢測(cè)DNA是否損傷、細(xì)胞中合成的物質(zhì)是否夠多、細(xì)胞的體積是不是足夠大。如果細(xì)胞存在DNA損傷或其他異常情況，ATM、ATR以及下游的chk1或chk2會(huì)被激活，通過(guò)下調(diào)cdc25，上調(diào)weel，最終使CDK1/周期蛋白B的活性受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞被阻斷在G2/M交界處。紡錘體組裝檢查點(diǎn)則主要檢查紡錘體是否正確組裝，紡錘絲動(dòng)粒微管是否正確連接在染色體的著絲粒。若紡錘體組裝異常，Mad2和Bub1等位于動(dòng)粒的APC負(fù)調(diào)控因子會(huì)抑制APC泛素連接酶的活性，從而抑制姐妹染色體分離，使有絲分裂中期延長(zhǎng)，有足夠時(shí)間重新組裝，確保紡錘體正確組裝后細(xì)胞才能從有絲分裂中期向后期過(guò)渡。腫瘤抑制基因產(chǎn)物如p53和Rb蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。p53在DNA損傷時(shí)被激活，可引起細(xì)胞周期停滯、DNA修復(fù)或細(xì)胞凋亡。當(dāng)DNA受損時(shí)，p53蛋白的表達(dá)水平升高，它可以結(jié)合到特定的DNA序列上，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如激活p21基因的表達(dá)，p21蛋白進(jìn)而抑制CDK的活性，使細(xì)胞周期停滯，以便細(xì)胞有時(shí)間修復(fù)受損的DNA。如果DNA損傷無(wú)法修復(fù)，p53則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，防止受損細(xì)胞繼續(xù)增殖。Rb蛋白通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合來(lái)抑制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。在細(xì)胞周期的G1期，低磷酸化的Rb蛋白與E2F結(jié)合，形成復(fù)合物，抑制E2F的轉(zhuǎn)錄活性，從而阻止與細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)基因的表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子等刺激時(shí)，CyclinD-CDK4/6復(fù)合物被激活，使Rb蛋白磷酸化。磷酸化的Rb蛋白與E2F解離，釋放出E2F，E2F進(jìn)而激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入S期。原癌基因產(chǎn)物如myc基因產(chǎn)物可以促進(jìn)細(xì)胞通過(guò)G1期進(jìn)入S期。myc基因編碼的蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子，它可以與DNA結(jié)合，調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞增殖、代謝等相關(guān)基因的表達(dá)。在細(xì)胞受到生長(zhǎng)信號(hào)刺激時(shí)，myc基因的表達(dá)上調(diào)，其產(chǎn)物可以促進(jìn)CyclinD的表達(dá)，進(jìn)而激活CyclinD-CDK4/6復(fù)合物，推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)展。細(xì)胞外信號(hào)如生長(zhǎng)因子、激素等可以通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程。表皮生長(zhǎng)因子（EGF）與細(xì)胞表面的EGF受體結(jié)合后，可激活下游的RAS/MAPK信號(hào)通路和PI3K/AKT信號(hào)通路。RAS/MAPK信號(hào)通路可促進(jìn)CyclinD的表達(dá)和激活，使細(xì)胞通過(guò)G1期限制點(diǎn)進(jìn)入S期。PI3K/AKT信號(hào)通路則可以通過(guò)調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)的活性，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和存活。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方木尼孜其顆粒及其活性成分去氫駱駝蓬堿能夠影響黑色素瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，從而使細(xì)胞周期阻滯在特定時(shí)期。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方木尼孜其顆粒處理黑色素瘤細(xì)胞A375后，細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)水平顯著降低。CyclinD1是G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致CyclinD1-CDK4/6復(fù)合物的形成減少，進(jìn)而使Rb蛋白磷酸化水平降低。低磷酸化的Rb蛋白與E2F結(jié)合緊密，抑制E2F的轉(zhuǎn)錄活性，使得與細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)的基因無(wú)法正常表達(dá)，細(xì)胞周期阻滯在G1期。同時(shí)，復(fù)方木尼孜其顆粒還能上調(diào)p21蛋白的表達(dá)。p21作為一種CDK抑制劑，可與CDK2、CDK4等結(jié)合，抑制其激酶活性，進(jìn)一步阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。在基因水平上，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方木尼孜其顆粒處理后，CyclinD1基因的mRNA表達(dá)量明顯下降，而p21基因的mRNA表達(dá)量顯著升高，這與蛋白質(zhì)水平的變化一致，進(jìn)一步證實(shí)了復(fù)方木尼孜其顆粒通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)阻滯細(xì)胞周期。去氫駱駝蓬堿對(duì)黑色素瘤細(xì)胞周期的影響更為顯著。在去氫駱駝蓬堿處理黑色素瘤細(xì)胞A375后，不僅CyclinD1的表達(dá)被明顯抑制，CyclinE和CyclinA的表達(dá)也受到不同程度的下調(diào)。CyclinE主要在G1/S期發(fā)揮作用，其表達(dá)降低會(huì)影響DNA復(fù)制的起始；CyclinA在S期和G2期發(fā)揮重要作用，其表達(dá)下調(diào)會(huì)干擾細(xì)胞周期從S期向G2期的過(guò)渡以及G2期的正常進(jìn)程。去氫駱駝蓬堿還能顯著上調(diào)p27蛋白的表達(dá)。p27是另一種重要的CDK抑制劑，它可以與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性。p27蛋白表達(dá)升高后，可有效抑制CyclinE-CDK2和CyclinA-CDK2復(fù)合物的活性，使細(xì)胞周期阻滯在G1期和S期。在基因表達(dá)方面，qRT-PCR結(jié)果顯示，去氫駱駝蓬堿處理后，CyclinD1、CyclinE和CyclinA基因的mRNA表達(dá)量均顯著降低，而p27基因的mRNA表達(dá)量大幅升高，進(jìn)一步表明去氫駱駝蓬堿通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，使黑色素瘤細(xì)胞周期阻滯在G1期和S期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。5.2對(duì)細(xì)胞凋亡通路的激活細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡方式，對(duì)于維持機(jī)體的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。細(xì)胞凋亡主要通過(guò)內(nèi)在（線粒體）途徑和外在（死亡受體）途徑激活。內(nèi)在途徑通常由細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激信號(hào)如氧化應(yīng)激、DNA損傷等觸發(fā)。當(dāng)細(xì)胞受到這些應(yīng)激刺激時(shí)，線粒體的外膜通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡體，并招募和激活半胱天冬酶-9（caspase-9）。激活的caspase-9進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)半胱天冬酶，如caspase-3和caspase-7，這些效應(yīng)半胱天冬酶切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的特征性形態(tài)和生化改變。在DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，p53蛋白被激活，它可以上調(diào)Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)。Bax蛋白可以插入線粒體膜，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素c，從而激活內(nèi)在凋亡途徑。外在途徑則由細(xì)胞外的死亡信號(hào)激活，主要通過(guò)死亡受體介導(dǎo)。重要的配體-死亡受體系統(tǒng)包括腫瘤壞死因子（TNF）-腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）、Fas配體（FasL）-Fas、TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）-TRAIL受體等。當(dāng)死亡配體與相應(yīng)的死亡受體結(jié)合后，受體發(fā)生三聚化，招募接頭蛋白Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）和caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，caspase-8被激活，它可以直接激活下游的效應(yīng)半胱天冬酶，如caspase-3和caspase-7，引發(fā)細(xì)胞凋亡。在某些情況下，激活的caspase-8還可以切割Bid蛋白，產(chǎn)生截短的Bid（tBid）。tBid可以轉(zhuǎn)移到線粒體，激活內(nèi)在凋亡途徑，形成外在途徑與內(nèi)在途徑之間的串?dāng)_。當(dāng)FasL與Fas受體結(jié)合后，F(xiàn)as受體的胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域（DD）與FADD的DD結(jié)構(gòu)域相互作用，招募caspase-8形成DISC。激活的caspase-8一方面可以直接激活caspase-3和caspase-7，另一方面可以切割Bid，激活內(nèi)在凋亡途徑，從而放大凋亡信號(hào)。內(nèi)在途徑和外在途徑最終都會(huì)匯聚到caspase蛋白酶家族的激活上，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這兩條途徑受到多種蛋白質(zhì)和信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)控，如p53、核因子-κB（NF-κB）、泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和PI3K途徑等。p53作為一種重要的腫瘤抑制因子，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷等應(yīng)激刺激時(shí)，p53蛋白被激活，它可以通過(guò)多種方式調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。p53可以上調(diào)促凋亡蛋白如Bax、PUMA等的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白如Bcl-2等的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。p53還可以直接作用于線粒體，增加線粒體膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放。NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞存活、增殖和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在正常情況下，NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合，以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化并降解，釋放出NF-κB。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。在細(xì)胞凋亡中，NF-κB的激活通常具有抗凋亡作用，它可以上調(diào)抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL等的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。然而，在某些情況下，NF-κB也可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這取決于細(xì)胞類型、刺激因素和細(xì)胞所處的微環(huán)境等。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的泛素化修飾和降解，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。一些參與細(xì)胞凋亡的蛋白，如IκB、Bid等，都可以通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)進(jìn)行降解，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。PI3K途徑可以通過(guò)激活下游的AKT蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活和凋亡。AKT可以磷酸化多種凋亡相關(guān)蛋白，如Bad、caspase-9等，抑制它們的活性，從而發(fā)揮抗凋亡作用。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方木尼孜其顆粒及其活性成分去氫駱駝蓬堿能夠通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，激活細(xì)胞凋亡通路，誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方木尼孜其顆粒處理黑色素瘤細(xì)胞A375后，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平顯著升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低。Bax是一種促凋亡的Bcl-2家族蛋白，它可以形成同源二聚體，插入線粒體膜，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素c，從而激活內(nèi)在凋亡途徑。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，它可以與Bax等促凋亡蛋白形成異源二聚體，抑制Bax的促凋亡作用。復(fù)方木尼孜其顆粒通過(guò)上調(diào)Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，打破了Bax與Bcl-2之間的平衡，促使線粒體釋放細(xì)胞色素c，激活caspase-9和caspase-3，從而誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡。在基因水平上，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方木尼孜其顆粒處理后，Bax基因的mRNA表達(dá)量顯著升高，而B(niǎo)cl-2基因的mRNA表達(dá)量明顯下降，這與蛋白質(zhì)水平的變化一致，進(jìn)一步證實(shí)了復(fù)方木尼孜其顆粒通過(guò)調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2基因的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。去氫駱駝蓬堿對(duì)黑色素瘤細(xì)胞凋亡通路的激活作用更為顯著。去氫駱駝蓬堿處理黑色素瘤細(xì)胞A375后，不僅Bax和Bcl-2的表達(dá)發(fā)生明顯改變，還能顯著激活caspase-8和caspase-9。caspase-8是外在凋亡途徑的起始caspase，caspase-9是內(nèi)在凋亡途徑的起始caspase，它們的激活表明去氫駱駝蓬堿能夠同時(shí)激活內(nèi)在和外在凋亡途徑。去氫駱駝蓬堿可能通過(guò)與死亡受體結(jié)合，激活外在凋亡途徑；也可能通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體功能，激活內(nèi)在凋亡途徑。研究還發(fā)現(xiàn)，去氫駱駝蓬堿能夠上調(diào)Fas和FasL的表達(dá)。Fas是一種死亡受體，F(xiàn)asL是其配體，它們的結(jié)合可以激活外在凋亡途徑。去氫駱駝蓬堿通過(guò)上調(diào)Fas和FasL的表達(dá)，促進(jìn)Fas與FasL的結(jié)合，激活caspase-8，進(jìn)而激活下游的caspase-3和caspase-7，誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡。在基因表達(dá)方面，qRT-PCR結(jié)果顯示，去氫駱駝蓬堿處理后，F(xiàn)as、FasL、Bax基因的mRNA表達(dá)量均顯著升高，而B(niǎo)cl-2基因的mRNA表達(dá)量大幅降低，進(jìn)一步表明去氫駱駝蓬堿通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，激活細(xì)胞凋亡通路，誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡。5.3對(duì)侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的抑制黑色素瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的多步驟過(guò)程，涉及多種分子機(jī)制的相互作用。腫瘤細(xì)胞首先需要降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），這一過(guò)程主要依賴于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族的作用。MMPs是一類鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，能夠特異性地降解ECM中的各種成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白等。MMP-2和MMP-9是MMPs家族中的重要成員，它們?cè)诤谏亓龅那忠u和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MMP-2能夠降解IV型膠原蛋白，而IV型膠原蛋白是基底膜的主要成分之一，基底膜是阻止腫瘤細(xì)胞侵襲的重要屏障。當(dāng)MMP-2活性升高時(shí)，它能夠有效降解基底膜中的IV型膠原蛋白，為黑色素瘤細(xì)胞突破基底膜、進(jìn)入周圍組織創(chuàng)造條件。MMP-9則主要降解明膠和彈性蛋白等ECM成分，它還可以激活其他MMPs，進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)ECM的降解能力。研究表明，在黑色素瘤組織中，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著高于正常組織，且其表達(dá)水平與黑色素瘤的侵襲深度、轉(zhuǎn)移潛能呈正相關(guān)。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）也是黑色素瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。在EMT過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去其極性和細(xì)胞間連接，獲得間充質(zhì)細(xì)胞的特性，如高遷移性和侵襲性。這一過(guò)程涉及多種分子的調(diào)控，其中E-cadherin和N-cadherin是關(guān)鍵的調(diào)控分子。E-cadherin是一種上皮細(xì)胞特異性的鈣黏蛋白，它通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附作用，維持上皮細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性。在EMT過(guò)程中，E-cadherin的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致上皮細(xì)胞間的黏附力減弱，細(xì)胞易于脫離上皮層。而N-cadherin是一種間充質(zhì)細(xì)胞特異性的鈣黏蛋白，在EMT過(guò)程中，其表達(dá)上調(diào)。N-cadherin的高表達(dá)使黑色素瘤細(xì)胞獲得間充質(zhì)細(xì)胞的特性，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力。研究發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，E-cadherin的表達(dá)明顯降低，而N-cadherin的表達(dá)顯著升高。一些轉(zhuǎn)錄因子如Snail、Slug、Twist等在EMT的調(diào)控中也發(fā)揮著重要作用。這些轉(zhuǎn)錄因子能夠與E-cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)EMT的發(fā)生。Snail蛋白可以與E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-box序列結(jié)合，阻止RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞黏附分子在黑色素瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中也起著重要作用。整合素是一類重要的細(xì)胞黏附分子，它能夠介導(dǎo)細(xì)胞與ECM之間的黏附。整合素通過(guò)其α和β亞基組成的異二聚體結(jié)構(gòu)，與ECM中的配體如纖連蛋白、膠原蛋白等結(jié)合。在黑色素瘤細(xì)胞侵襲過(guò)程中，整合素與ECM的結(jié)合為細(xì)胞提供了遷移的錨定點(diǎn)，同時(shí)還可以激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。整合素β1與纖連蛋白結(jié)合后，可激活FAK-Src信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞的遷移。此外，選擇素和免疫球蛋白超家族等細(xì)胞黏附分子也參與黑色素瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板等的黏附，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的血行轉(zhuǎn)移。P-選擇素能夠介導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞與血小板的黏附，形成腫瘤-血小板栓子，保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)的攻擊，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的黏附，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)血行轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方木尼孜其顆粒及其活性成分去氫駱駝蓬堿能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方木尼孜其顆粒處理黑色素瘤細(xì)胞A375后，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著降低。這表明復(fù)方木尼孜其顆粒能夠抑制MMPs的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制黑色素瘤細(xì)胞的侵襲能力。復(fù)方木尼孜其顆粒還能上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)N-cadherin的表達(dá)。E-cadherin表達(dá)的上調(diào)增強(qiáng)了細(xì)胞間的黏附力，抑制細(xì)胞的遷移；N-cadherin表達(dá)的下調(diào)則減弱了黑色素瘤細(xì)胞的間充質(zhì)特性，降低其侵襲能力。在基因水平上，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方木尼孜其顆粒處理后，MMP-2、MMP-9和N-cadherin基因的mRNA表達(dá)量明顯下降，而E-cadherin基因的mRNA表達(dá)量顯著升高，這與蛋白質(zhì)水平的變化一致，進(jìn)一步證實(shí)了復(fù)方木尼孜其顆粒通過(guò)調(diào)節(jié)侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。去氫駱駝蓬堿對(duì)黑色素瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的抑制作用更為顯著。去氫駱駝蓬堿處理黑色素瘤細(xì)胞A375后，不僅MMP-2和MMP-9的表達(dá)被明顯抑制，還能顯著抑制Snail和Slug等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。Snail和Slug是EMT過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它們的表達(dá)被抑制后，E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄抑制得到解除，從而促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)。去氫駱駝蓬堿還能抑制整合素β1的表達(dá)，減少黑色素瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，進(jìn)而抑