復(fù)方黃甘對(duì)5/6腎切除大鼠腎臟保護(hù)作用及機(jī)制探究：基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路視角一、引言1.1研究背景與意義慢性腎臟?。–hronicKidneyDisease，CKD）是一類(lèi)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病，近年來(lái)其發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)，已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球成年人CKD的發(fā)病率高達(dá)8%-16%，我國(guó)慢性腎臟病患病率也達(dá)到了10.8％，患者基數(shù)龐大。然而，CKD的知曉率卻低于10%，許多患者在疾病早期未能得到及時(shí)診斷和治療。在這些CKD患者中，有1%-3%會(huì)逐漸發(fā)展為終末期腎衰竭（EndStageRenalDisease，ESRD），一旦進(jìn)展至此階段，患者往往需要依賴(lài)透析或腎移植等腎臟替代治療來(lái)維持生命。透析治療不僅給患者帶來(lái)身體上的痛苦和生活上的不便，還會(huì)給家庭和社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而腎移植則面臨著供體短缺、免疫排斥等諸多難題。因此，積極尋找有效的治療方法來(lái)延緩CKD的進(jìn)展，對(duì)于改善患者的生活質(zhì)量、減輕社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)具有重要意義。目前，臨床針對(duì)CKD的治療策略主要包括控制血壓、血糖，降低蛋白尿，應(yīng)用抗氧化劑，控制血脂，糾正貧血，防治感染，糾正水電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂，以及控制飲食等。這些治療措施雖然在一定程度上能夠控制機(jī)體的炎癥反應(yīng)、降低氧化應(yīng)激水平、抑制纖維化相關(guān)因子的表達(dá)，從而延緩CKD的進(jìn)展，但仍存在諸多局限性。一方面，現(xiàn)有的治療手段主要側(cè)重于控制CKD的危險(xiǎn)因素、保護(hù)腎功能以及減少并發(fā)癥，對(duì)于已經(jīng)受損的腎臟組織修復(fù)效果有限，即便基礎(chǔ)病變得到控制，腎臟功能仍可能持續(xù)減退。另一方面，長(zhǎng)期治療的高昂醫(yī)療費(fèi)用讓眾多CKD患者難以承受，這也限制了治療的可及性和患者的依從性。中西醫(yī)結(jié)合治療CKD具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和潛力，能夠從整體觀念出發(fā)，調(diào)節(jié)機(jī)體的內(nèi)環(huán)境，改善腎臟的病理狀態(tài)。復(fù)方黃甘（HuangGanFormula，HGF）正是在這樣的背景下研發(fā)而來(lái)。它是在前期研制的尿毒清顆?；A(chǔ)上，經(jīng)過(guò)對(duì)原處方的精簡(jiǎn)重組而得到的。尿毒清顆粒作為我國(guó)首個(gè)中藥防治CKD進(jìn)展的新藥，憑借其較好的療效和相對(duì)低廉的價(jià)格，連續(xù)多年在我國(guó)腎病口服中成藥市場(chǎng)中占據(jù)首位。然而，在尿毒清顆粒的生產(chǎn)與推廣使用過(guò)程中，也暴露出一些問(wèn)題和不足，如成分復(fù)雜、作用機(jī)制不夠明確等。因此，對(duì)其進(jìn)行二次開(kāi)發(fā)，研制出復(fù)方黃甘，旨在進(jìn)一步提高產(chǎn)品質(zhì)量、提升療效，并明確其作用機(jī)理。本課題組前期研究已在腺嘌呤灌胃法制備的慢性腎衰大鼠模型中，證實(shí)復(fù)方黃甘能顯著降低肌酐（SerumCreatinine，Scr）、尿素氮（BloodUreaNitrogen，BUN），抑制模型大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激，延緩腎臟纖維化，展現(xiàn)出了良好的腎臟保護(hù)作用。在此基礎(chǔ)上，本研究擬通過(guò)建立HPLC指紋圖譜，并利用HPLC-QTOF/MS技術(shù)對(duì)復(fù)方黃甘的復(fù)雜化學(xué)成分進(jìn)行定性和定量分析，初步闡明復(fù)方中的物質(zhì)基礎(chǔ)。進(jìn)一步采用5/6腎切除法構(gòu)建CKD大鼠模型，深入研究復(fù)方黃甘對(duì)5/6腎切除大鼠的腎臟保護(hù)作用，并從體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探究其對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的干預(yù)作用，初步探討其抗腎臟纖維化的可能作用機(jī)制，為其臨床治療CKD提供新的思路和可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。這不僅有助于深入了解復(fù)方黃甘的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)指導(dǎo)，還可能為CKD的治療開(kāi)辟新的途徑，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀復(fù)方黃甘作為在尿毒清顆?；A(chǔ)上精簡(jiǎn)重組而來(lái)的方劑，近年來(lái)受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，相關(guān)研究取得了一定進(jìn)展。在化學(xué)成分研究方面，已有學(xué)者采用HPLC等技術(shù)對(duì)復(fù)方黃甘進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)其主要成分包括甘草苷、丹皮酚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚等，并且對(duì)這些成分的含量測(cè)定也有了初步結(jié)果。例如，有研究表明復(fù)方黃甘提取物中甘草苷含量約為0.06%，丹皮酚含量約為1.06%，這為進(jìn)一步研究復(fù)方黃甘的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了數(shù)據(jù)支持。在藥理作用研究領(lǐng)域，復(fù)方黃甘展現(xiàn)出了多方面的功效。大量研究表明，復(fù)方黃甘具有顯著的腎臟保護(hù)作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)5/6腎切除法構(gòu)建慢性腎衰大鼠模型，給予復(fù)方黃甘灌胃后，能明顯降低模型大鼠血清中的肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平，這表明其有助于改善腎功能。同時(shí)，還能降低24h尿蛋白定量，減少腎臟損傷。在以腺嘌呤灌胃法制備的慢性腎衰大鼠模型中，復(fù)方黃甘能顯著抑制模型大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低丙二醛（MDA）含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、總抗氧化能力（T-AOC）以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）等抗氧化酶的活性，從而減輕氧化損傷對(duì)腎臟的破壞。在腎臟纖維化方面，復(fù)方黃甘能夠抑制腎組織中纖維連接蛋白（FN）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）等纖維化相關(guān)因子的表達(dá)，延緩腎臟纖維化進(jìn)程。然而，目前對(duì)于復(fù)方黃甘的研究仍存在一些不足之處。在化學(xué)成分研究上，雖然已明確了部分主要成分，但復(fù)方黃甘成分復(fù)雜，其具體的物質(zhì)基礎(chǔ)尚未完全闡明，仍有一些微量成分和未知成分有待進(jìn)一步探索?，F(xiàn)有研究對(duì)各成分之間的協(xié)同作用機(jī)制也缺乏深入研究，這限制了對(duì)復(fù)方黃甘整體藥效的理解。在藥理作用機(jī)制研究方面，雖然已發(fā)現(xiàn)復(fù)方黃甘在改善腎功能、抗氧化、抗纖維化等方面有作用，但其作用的具體分子機(jī)制尚未完全清晰。盡管有研究提示其可能與某些信號(hào)通路有關(guān)，但具體的作用靶點(diǎn)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍有待深入探究。此外，目前的研究主要集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，臨床研究相對(duì)較少，缺乏大規(guī)模、多中心、隨機(jī)對(duì)照的臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其在人體中的有效性和安全性，這在一定程度上影響了復(fù)方黃甘的臨床推廣應(yīng)用。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)建立HPLC指紋圖譜，并利用HPLC-QTOF/MS技術(shù)對(duì)復(fù)方黃甘的復(fù)雜化學(xué)成分進(jìn)行更全面、深入的定性和定量分析，以進(jìn)一步明確其物質(zhì)基礎(chǔ)。采用5/6腎切除法構(gòu)建CKD大鼠模型，深入研究復(fù)方黃甘對(duì)5/6腎切除大鼠的腎臟保護(hù)作用，并從體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)探究其對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的干預(yù)作用，初步探討其抗腎臟纖維化的可能作用機(jī)制，為其臨床治療CKD提供新的思路和可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。與以往研究相比，本研究不僅注重化學(xué)成分的分析，更深入到分子機(jī)制層面，有望揭示復(fù)方黃甘抗腎臟纖維化的新機(jī)制，這將為復(fù)方黃甘的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，在研究?jī)?nèi)容和方法上具有一定的創(chuàng)新性。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究復(fù)方黃甘對(duì)5/6腎切除大鼠的腎臟保護(hù)作用，并基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路初步探討其作用機(jī)制，為復(fù)方黃甘在慢性腎臟病（CKD）臨床治療中的應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和可靠的實(shí)驗(yàn)支撐。具體研究?jī)?nèi)容如下：復(fù)方黃甘化學(xué)成分的分析：通過(guò)醇提和水提醇沉合并工藝，制備復(fù)方黃甘提取物。運(yùn)用HPLC法對(duì)10批次平行提取的復(fù)方黃甘進(jìn)行檢測(cè)，建立其指紋圖譜。將HPLC指紋圖譜檢測(cè)結(jié)果導(dǎo)入中國(guó)藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A)”，計(jì)算共有指紋峰的相似度，以全面反映復(fù)方黃甘化學(xué)組成的特征和穩(wěn)定性。采用HPLC-QTOF/MS法對(duì)復(fù)方黃甘中主要成分進(jìn)行定性分析，利用對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證定性結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過(guò)建立HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)主成分進(jìn)行含量測(cè)定，明確各成分在復(fù)方黃甘中的含量水平，為后續(xù)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。復(fù)方黃甘對(duì)5/6腎切除大鼠腎臟保護(hù)作用的研究：采用5/6腎切除法構(gòu)建CKD大鼠模型，于給藥前（術(shù)后2周）檢測(cè)5/6腎切除模型組與假手術(shù)組的血清Scr、BUN水平，以檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠癯晒?gòu)建。造模成功后，按體重分層隨機(jī)區(qū)組法將實(shí)驗(yàn)大鼠分成8組，每組11-12只，分別為模型組、尿毒清組、氯沙坦組、復(fù)方黃甘低劑量組、中劑量組、高劑量組、假手術(shù)組和本底對(duì)照組。給予不同組別的大鼠相應(yīng)的藥物或?qū)φ仗幚恚掷m(xù)給藥12周。在末次給藥后，收集24h尿量，并通過(guò)麻醉后腹主動(dòng)脈采血收集血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清Scr、BUN、24h尿蛋白定量、尿肌酐、總膽固醇、低密度脂蛋白等生化指標(biāo)，以評(píng)估復(fù)方黃甘對(duì)大鼠腎功能和代謝指標(biāo)的影響。收集各實(shí)驗(yàn)組大鼠殘余腎臟，縱向切開(kāi)腎臟組織，取一半放入4%多聚甲醛固定液中，用于制作病理切片以及進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，觀察腎臟組織的病理形態(tài)變化和相關(guān)蛋白的表達(dá)定位。將另一半皮質(zhì)部分分成3份，一份用于制備組織勻漿，測(cè)定腎組織中丙二醛、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、總抗氧化能力以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶含量，評(píng)估腎臟的氧化應(yīng)激水平；另兩份于-80℃凍存，分別用于RT-PCR和westernblot等實(shí)驗(yàn)，從基因和蛋白水平分析相關(guān)因子的表達(dá)變化。復(fù)方黃甘對(duì)5/6腎切除大鼠腎組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響：取藥效實(shí)驗(yàn)部分大鼠腎組織，分別提取組織中的RNA與總蛋白。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1以及FnlmRNA表達(dá)量，從基因轉(zhuǎn)錄水平探究復(fù)方黃甘對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用。利用westernblot方法檢測(cè)以上蛋白在各實(shí)驗(yàn)組大鼠腎組織的表達(dá)，從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步驗(yàn)證基因表達(dá)的變化，明確復(fù)方黃甘對(duì)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響。采用石蠟包埋法制備腎組織切片，通過(guò)免疫組織化學(xué)法觀察Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1以及Fnl蛋白在腎組織的表達(dá)部位，并對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行半定量分析，直觀呈現(xiàn)相關(guān)蛋白在腎臟組織中的分布和表達(dá)情況，深入了解復(fù)方黃甘對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的干預(yù)作用機(jī)制。復(fù)方黃甘對(duì)HK-2細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響及機(jī)制研究：利用高糖培養(yǎng)液（D-葡萄糖30mmol/L）分別誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞12、24、48h，并以普通培養(yǎng)液和甘露醇等滲培養(yǎng)液作為對(duì)照，用westernblot檢測(cè)α-肌動(dòng)蛋白和β-catenin蛋白的表達(dá)，構(gòu)建HK-2細(xì)胞EMT模型，明確高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞EMT過(guò)程中相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。用不同濃度復(fù)方黃甘作用HK-2細(xì)胞48h后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和壞死的比例，篩選復(fù)方黃甘最大安全濃度，為后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)確定合適的藥物濃度范圍。在確定的安全濃度范圍內(nèi)，研究復(fù)方黃甘對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT的影響，通過(guò)檢測(cè)相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化，探討其作用機(jī)制是否與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)，從細(xì)胞水平深入揭示復(fù)方黃甘抗腎臟纖維化的作用機(jī)制。二、復(fù)方黃甘與5/6腎切除大鼠模型概述2.1復(fù)方黃甘介紹2.1.1成分解析復(fù)方黃甘主要由黃芪、紫草、黃柏、甘草等多味中藥組成，每味中藥在復(fù)方中都發(fā)揮著獨(dú)特且關(guān)鍵的作用。黃芪作為君藥，富含黃芪多糖、黃芪皂苷、黃酮類(lèi)等多種有效成分?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃芪多糖能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，提高機(jī)體的抵抗力。黃芪皂苷則具有抗氧化、抗炎以及改善腎功能等多種作用。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪皂苷可通過(guò)抑制炎癥因子的釋放，減輕腎臟的炎癥反應(yīng)，同時(shí)還能提高抗氧化酶的活性，減少氧化應(yīng)激對(duì)腎臟的損傷。在一項(xiàng)針對(duì)慢性腎衰大鼠的研究中，給予黃芪提取物后，大鼠血清中的肌酐、尿素氮水平明顯降低，腎功能得到顯著改善，這充分證實(shí)了黃芪在保護(hù)腎臟功能方面的重要作用。紫草和黃柏為臣藥。紫草中含有紫草素、乙酰紫草素等主要成分，這些成分具有顯著的抗炎、抑菌、涼血活血等功效。研究顯示，紫草素能夠抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，減輕炎癥反應(yīng)，同時(shí)還能促進(jìn)受損組織的修復(fù)。在炎癥相關(guān)的實(shí)驗(yàn)中，紫草素可使炎癥模型動(dòng)物的炎癥指標(biāo)明顯下降，炎癥癥狀得到緩解。黃柏富含小檗堿、黃柏堿等生物堿，具有清熱燥濕、瀉火解毒、抗菌抗炎等作用。小檗堿能夠抑制多種細(xì)菌和病毒的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)還能調(diào)節(jié)免疫功能，減輕炎癥反應(yīng)。有研究表明，小檗堿可通過(guò)抑制核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，減少炎癥因子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。甘草為佐使藥，其主要成分包括甘草酸、甘草苷、甘草黃酮等，具有解毒、調(diào)和諸藥的作用。甘草酸具有強(qiáng)大的抗炎、抗過(guò)敏和免疫調(diào)節(jié)作用。它能夠抑制炎癥介質(zhì)的釋放，減輕炎癥反應(yīng)，同時(shí)還能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。甘草苷則具有抗氧化、保護(hù)心血管等作用。在復(fù)方中，甘草不僅能夠緩解其他藥物的毒性，還能協(xié)調(diào)各藥物之間的作用，使復(fù)方的藥效更加穩(wěn)定和持久。2.1.2功效探討復(fù)方黃甘在臨床研究中展現(xiàn)出了多方面的顯著療效，尤其是在治療復(fù)發(fā)性生殖器皰疹和慢性腎衰方面。在復(fù)發(fā)性生殖器皰疹的治療中，一項(xiàng)臨床研究將90例復(fù)發(fā)性生殖器皰疹患者隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組各45例，治療組服用復(fù)方黃甘顆粒，對(duì)照組服用泛昔洛韋片，30d為一個(gè)療程。結(jié)果顯示，近期療效治療組與對(duì)照組相當(dāng)（P>0.05），但抗復(fù)發(fā)療效治療組明顯優(yōu)于對(duì)照組（P<0.05）。這表明復(fù)方黃甘在預(yù)防復(fù)發(fā)性生殖器皰疹的復(fù)發(fā)方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能有關(guān)，通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，抑制皰疹病毒的復(fù)制和復(fù)發(fā)。在慢性腎衰的治療領(lǐng)域，復(fù)方黃甘同樣表現(xiàn)出色。研究人員用5/6腎切除法構(gòu)建慢性腎衰大鼠模型，將模型大鼠隨機(jī)分為尿毒清組、科素亞組、復(fù)方黃甘低、中、高劑量組和模型組，另加假手術(shù)組共7組，經(jīng)灌胃給藥12周后檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方黃甘提取物能顯著降低慢性腎衰模型大鼠血清中的肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平，減少24h尿蛋白定量，表明其對(duì)腎功能具有明顯的改善作用。同時(shí)，復(fù)方黃甘還能減輕腎組織的病理?yè)p傷，抑制腎組織中纖維連接蛋白（FN）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）等纖維化相關(guān)因子的表達(dá)，延緩腎臟纖維化進(jìn)程。這些研究結(jié)果充分證明了復(fù)方黃甘在慢性腎衰治療中的有效性和重要價(jià)值，為慢性腎衰的臨床治療提供了新的選擇和思路。2.25/6腎切除大鼠模型2.2.1模型構(gòu)建方法5/6腎切除大鼠模型的構(gòu)建通常采用兩期手術(shù)法。首先，選取健康的雄性SD大鼠，體重在180-220g左右，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。手術(shù)前12h禁食，不禁水，以減少術(shù)中嘔吐和誤吸的風(fēng)險(xiǎn)。在無(wú)菌手術(shù)條件下，用10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，待大鼠麻醉生效后，將其固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒手術(shù)區(qū)域，鋪無(wú)菌巾。在大鼠左側(cè)肋弓下1.5-2.0cm處，沿腹直肌外緣做一長(zhǎng)約2-3cm的縱行切口，鈍性分離肌肉，打開(kāi)后腹膜，暴露左腎。小心剝離腎包膜，將左腎的上下兩極各切除1/3，切除過(guò)程中盡量避免損傷腎蒂和周?chē)M織，用明膠海綿壓迫止血，確保切面上無(wú)活動(dòng)性出血后，將剩余的左腎復(fù)位，逐層縫合肌肉和皮膚，手術(shù)創(chuàng)口涂抹碘伏消毒，防止感染。術(shù)后給予大鼠青霉素鈉（4萬(wàn)U/kg）肌肉注射，連續(xù)3天，以預(yù)防感染。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，密切觀察其精神狀態(tài)、飲食、飲水、尿量等一般情況。術(shù)后1周，待大鼠身體狀況恢復(fù)后，進(jìn)行第二期手術(shù)。同樣采用10%水合氯醛（3.5ml/kg）腹腔注射麻醉，在大鼠右側(cè)肋弓下1.5-2.0cm處做一縱行切口，暴露右腎，結(jié)扎腎蒂，完整摘除右腎，然后逐層縫合切口，消毒創(chuàng)口。術(shù)后繼續(xù)給予青霉素鈉（4萬(wàn)U/kg）肌肉注射3天。造模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)主要基于腎功能指標(biāo)的檢測(cè)。在第二次手術(shù)后2-3周，通過(guò)代謝籠收集大鼠24h尿液，檢測(cè)24h尿蛋白定量；經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平。若與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的24h尿蛋白定量顯著增加，血清Scr、BUN水平明顯升高，且腎臟組織病理學(xué)檢查顯示腎小球硬化、腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化等典型的慢性腎衰竭病理改變，則可判定造模成功。例如，有研究表明，成功造模的5/6腎切除大鼠24h尿蛋白定量可達(dá)到（38.56±6.78）mg/24h，血清Scr水平可升高至（125.63±15.42）μmol/L，BUN水平升高至（22.35±3.56）mmol/L，與假手術(shù)組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2.2.2模型在腎臟疾病研究中的應(yīng)用價(jià)值5/6腎切除大鼠模型在腎臟疾病研究中具有極高的應(yīng)用價(jià)值，為深入探究腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法提供了有力的工具。從模擬人類(lèi)腎臟疾病的優(yōu)勢(shì)來(lái)看，該模型能夠較好地模擬人類(lèi)慢性腎臟?。–KD）的病理生理過(guò)程。人類(lèi)CKD通常是由于各種原發(fā)性或繼發(fā)性腎臟疾病導(dǎo)致腎單位進(jìn)行性破壞，腎臟功能逐漸減退。5/6腎切除大鼠模型通過(guò)手術(shù)切除大部分腎組織，使殘存腎單位處于高灌注、高濾過(guò)和高壓力的“三高”狀態(tài)，這與人類(lèi)CKD進(jìn)展過(guò)程中殘存腎單位的代償性變化極為相似。這種相似性使得研究人員能夠在動(dòng)物模型上觀察和研究腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，以及各種治療手段對(duì)腎臟功能和病理變化的影響。在研究疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制方面，5/6腎切除大鼠模型為揭示腎臟疾病的內(nèi)在機(jī)制提供了重要平臺(tái)。通過(guò)該模型，研究人員可以深入研究腎臟纖維化的發(fā)生機(jī)制。腎臟纖維化是CKD進(jìn)展的關(guān)鍵病理過(guò)程，涉及多種細(xì)胞因子、信號(hào)通路的異常激活。在5/6腎切除大鼠模型中，研究發(fā)現(xiàn)腎組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）等纖維化相關(guān)因子的表達(dá)顯著上調(diào)，同時(shí)Wnt/β-catenin、TGF-β/Smad等信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，最終引發(fā)腎臟纖維化。通過(guò)對(duì)這些機(jī)制的研究，有助于尋找新的治療靶點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)有效的治療藥物提供理論依據(jù)。該模型還可用于研究腎臟疾病與其他系統(tǒng)疾病的相互關(guān)系，如腎性貧血、心血管并發(fā)癥等，進(jìn)一步拓展了對(duì)腎臟疾病全面認(rèn)識(shí)的視野。三、復(fù)方黃甘對(duì)5/6腎切除大鼠腎臟保護(hù)的藥效學(xué)研究3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組選取健康的雄性SD大鼠88-96只，體重在180-220g之間，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重分層隨機(jī)區(qū)組法將實(shí)驗(yàn)大鼠分成8組，每組11-12只。具體分組如下：模型組（Model）：接受5/6腎切除手術(shù)，術(shù)后給予等體積蒸餾水灌胃，作為疾病模型對(duì)照組，用于觀察疾病自然發(fā)展過(guò)程中的各項(xiàng)指標(biāo)變化。尿毒清組（UCG）：給予尿毒清顆?；鞈乙汗辔福鳛殛?yáng)性對(duì)照藥物組。尿毒清顆粒在臨床和前期研究中已證實(shí)對(duì)慢性腎臟病具有一定的治療效果，通過(guò)與復(fù)方黃甘組對(duì)比，可評(píng)估復(fù)方黃甘的相對(duì)療效。氯沙坦組（Losartan）：給予氯沙坦鉀片混懸液灌胃，也是陽(yáng)性對(duì)照藥物組。氯沙坦是臨床常用的血管緊張素II受體拮抗劑，可通過(guò)降低血壓、減少蛋白尿等機(jī)制對(duì)腎臟起到保護(hù)作用，與復(fù)方黃甘對(duì)比，有助于分析復(fù)方黃甘的作用特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)。復(fù)方黃甘低劑量組（HGF-L）：給予低劑量的復(fù)方黃甘混懸液灌胃，用于探究低劑量復(fù)方黃甘對(duì)5/6腎切除大鼠腎臟保護(hù)作用的效果。復(fù)方黃甘中劑量組（HGF-M）：給予中等劑量的復(fù)方黃甘混懸液灌胃，研究中等劑量下復(fù)方黃甘的藥效，該劑量通常在預(yù)實(shí)驗(yàn)或前期研究的基礎(chǔ)上確定，以觀察其在適宜劑量下的作用。復(fù)方黃甘高劑量組（HGF-H）：給予高劑量的復(fù)方黃甘混懸液灌胃，探討高劑量復(fù)方黃甘是否能產(chǎn)生更顯著的腎臟保護(hù)作用，以及是否存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。假手術(shù)組（Sham）：僅進(jìn)行假手術(shù)操作，即打開(kāi)腹腔暴露腎臟，但不進(jìn)行腎切除，術(shù)后給予等體積蒸餾水灌胃，作為正常生理狀態(tài)對(duì)照組，用于對(duì)比手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，以及評(píng)估模型組與正常狀態(tài)的差異。本底對(duì)照組（Backgroundcontrol,BC）：給予中劑量復(fù)方黃甘混懸液，用于提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)比其他實(shí)驗(yàn)組與本底對(duì)照組的差異，有助于更準(zhǔn)確地分析復(fù)方黃甘在不同條件下的作用效果。3.1.2給藥方案尿毒清組：給予3.6g/kg/d混懸液灌胃，每日給藥2次，灌胃體積根據(jù)大鼠體重進(jìn)行調(diào)整，每次灌胃間隔約12h，以保證藥物在體內(nèi)的持續(xù)作用。氯沙坦組：給予30mg/kg/d混懸液灌胃，每日1次，在每天固定時(shí)間給藥，確保藥物作用的穩(wěn)定性和一致性。復(fù)方黃甘低劑量組：給予3.6g/kg/d混懸液灌胃，低劑量組為臨床等效劑量，每日給藥2次，同樣根據(jù)大鼠體重調(diào)整灌胃體積，維持藥物在體內(nèi)的有效濃度。復(fù)方黃甘中劑量組：給予7.2g/kg/d混懸液灌胃，每日給藥2次，通過(guò)不同劑量的設(shè)置，觀察藥物劑量與療效之間的關(guān)系。復(fù)方黃甘高劑量組：給予14.4g/kg/d混懸液灌胃，每日給藥2次，高劑量組用于探索復(fù)方黃甘在較大劑量下的藥效和安全性。假手術(shù)組與模型組：灌胃給予等體積蒸餾水，每日2次，保證兩組大鼠接受相同的處理方式，僅手術(shù)操作不同，以便準(zhǔn)確分析手術(shù)和藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。本底對(duì)照組：給予中劑量復(fù)方黃甘混懸液，劑量與復(fù)方黃甘中劑量組相同，給藥頻率和方式也一致，為實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)對(duì)照。給藥持續(xù)時(shí)間為12周，在整個(gè)給藥期間，密切觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲食、飲水、體重變化等一般情況，并做好記錄。每周定期測(cè)量大鼠體重，根據(jù)體重變化調(diào)整給藥劑量，以確保藥物劑量的準(zhǔn)確性和有效性。3.2觀測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法3.2.1腎功能指標(biāo)檢測(cè)在末次給藥后，通過(guò)代謝籠收集大鼠24h尿量，記錄尿量數(shù)據(jù)。使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、24h尿蛋白定量（Urinaryprotein，UPr）以及尿肌酐（Ucr）等指標(biāo)。血清Scr是肌肉代謝產(chǎn)生的肌酐經(jīng)腎小球?yàn)V過(guò)后的產(chǎn)物，其水平升高通常意味著腎小球?yàn)V過(guò)功能受損，因?yàn)楫?dāng)腎臟功能下降時(shí)，對(duì)肌酐的排泄能力減弱，血清中肌酐就會(huì)堆積。BUN是蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，主要通過(guò)腎臟排泄，其水平升高也可指示腎功能下降，它受蛋白質(zhì)攝入量、體內(nèi)蛋白質(zhì)分解代謝以及腎臟排泄功能等多種因素影響。24h尿蛋白定量能夠更準(zhǔn)確地反映腎臟對(duì)蛋白質(zhì)的濾過(guò)功能，正常情況下，腎臟能夠有效阻止蛋白質(zhì)從尿液中大量丟失，當(dāng)腎臟受損時(shí)，腎小球?yàn)V過(guò)膜的屏障功能被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)漏出增加，24h尿蛋白定量升高。尿肌酐的檢測(cè)可用于計(jì)算內(nèi)生肌酐清除率，進(jìn)一步評(píng)估腎小球的濾過(guò)功能。這些指標(biāo)從不同角度反映了腎臟的排泄和濾過(guò)功能，對(duì)于判斷復(fù)方黃甘對(duì)5/6腎切除大鼠腎功能的影響具有重要意義。3.2.2氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)取大鼠腎組織制備組織勻漿，采用硫代巴比妥酸（TBA）法測(cè)定腎組織中丙二醛（MDA）含量。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，其含量的高低可反映機(jī)體氧化應(yīng)激水平和細(xì)胞受自由基損傷的程度。當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，生成MDA，因此，腎組織中MDA含量升高提示腎臟氧化損傷加劇。運(yùn)用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）活性。SOD是一種重要的抗氧化酶，能夠催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成過(guò)氧化氫和氧氣，從而清除體內(nèi)過(guò)多的超氧陰離子自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。SOD活性的高低反映了機(jī)體抗氧化防御能力的強(qiáng)弱，在腎臟中，SOD能夠減輕氧化應(yīng)激對(duì)腎組織細(xì)胞的損害，維持腎臟的正常功能。采用鉬酸銨法檢測(cè)過(guò)氧化氫酶（CAT）活性。CAT也是一種抗氧化酶，能夠催化過(guò)氧化氫分解為水和氧氣，從而降低細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫的濃度，減少其對(duì)細(xì)胞的毒性作用。在腎臟氧化應(yīng)激過(guò)程中，CAT與SOD等抗氧化酶協(xié)同作用，共同維持腎臟的氧化-抗氧化平衡。通過(guò)總抗氧化能力（T-AOC）檢測(cè)試劑盒測(cè)定腎組織的T-AOC水平，該指標(biāo)綜合反映了腎組織中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶的總體抗氧化能力，包括SOD、CAT、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）等多種抗氧化成分，T-AOC水平的變化可全面評(píng)估復(fù)方黃甘對(duì)腎臟抗氧化防御系統(tǒng)的影響。運(yùn)用比色法檢測(cè)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）活性。GSH-PX能夠催化還原型谷胱甘肽（GSH）與過(guò)氧化氫或有機(jī)過(guò)氧化物反應(yīng)，將其還原為水或相應(yīng)的醇，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。在腎臟中，GSH-PX對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，保護(hù)腎組織免受氧化應(yīng)激損傷起著重要作用。檢測(cè)這些氧化應(yīng)激指標(biāo)，有助于深入了解復(fù)方黃甘對(duì)5/6腎切除大鼠腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用及其保護(hù)機(jī)制。3.2.3腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察取大鼠殘余腎臟，縱向切開(kāi)后取一半放入4%多聚甲醛固定液中固定24h以上，然后進(jìn)行石蠟包埋。將石蠟包埋的組織切成厚度約為4μm的切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色。HE染色時(shí)，切片常規(guī)脫蠟入水后，用蘇木素染細(xì)胞核1-2min，使細(xì)胞核染成藍(lán)紫色，水洗后用1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，再水洗，接著用氨水返藍(lán)數(shù)秒，流水沖洗，鏡下觀察細(xì)胞核呈藍(lán)色后，用1%伊紅染數(shù)秒，使細(xì)胞質(zhì)染成紅色或淡紅色，最后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封片。通過(guò)HE染色切片，在光學(xué)顯微鏡下可觀察腎小球的細(xì)胞增生、炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況，還能清晰顯示腎小管上皮細(xì)胞的損傷和腎間質(zhì)水腫等病理變化。例如，正常腎臟組織的腎小球結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)正常，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，而5/6腎切除大鼠模型組的腎小球可能出現(xiàn)系膜細(xì)胞增生、基底膜增厚，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)變性、壞死，腎間質(zhì)可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫。Masson染色時(shí)，切片脫蠟入水后，先媒染劑（10%重鉻酸鉀、10%三氯醋酸等量混合）染10-30min，水洗后用蘇木素染細(xì)胞核1-2min，水洗，再用1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，水洗，氨水返藍(lán)數(shù)秒，水洗，接著用Masson液染約10min，水洗，1%醋酸洗，然后用2.5%磷鎢酸洗約30s，水洗，1%醋酸洗，再用2%橘黃G染約2min，水洗，1%醋酸洗，最后用1%亮綠染5-8min，1%醋酸洗，100%乙醇脫水、二甲苯透明、樹(shù)膠封片。在Masson染色切片中，細(xì)胞核呈紅色，膠原纖維呈綠色，免疫復(fù)合物呈紅色。通過(guò)觀察Masson染色切片，可判斷腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化程度，正常腎臟組織的膠原纖維分布較少，而5/6腎切除大鼠模型組的腎組織中，腎小球和腎間質(zhì)可見(jiàn)大量綠色的膠原纖維沉積，提示腎臟纖維化程度加重。通過(guò)對(duì)HE染色和Masson染色切片的觀察和分析，可直觀地了解復(fù)方黃甘對(duì)5/6腎切除大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響，為評(píng)估其腎臟保護(hù)作用提供重要的病理依據(jù)。3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果腎功能指標(biāo)結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清Scr、BUN、24h尿蛋白定量顯著升高（P<0.05），表明5/6腎切除成功構(gòu)建了慢性腎臟病大鼠模型，腎功能受損明顯。與模型組相比，尿毒清組、氯沙坦組以及復(fù)方黃甘各劑量組大鼠血清Scr、BUN、24h尿蛋白定量均顯著降低（P<0.05）。其中，復(fù)方黃甘高劑量組降低Scr、BUN、24h尿蛋白定量的效果最為顯著，與尿毒清組和氯沙坦組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示復(fù)方黃甘在改善腎功能方面具有良好的效果，且存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，高劑量的復(fù)方黃甘對(duì)腎功能的保護(hù)作用更優(yōu)。具體數(shù)據(jù)如表1所示：|組別|Scr(μmol/L)|BUN(mmol/L)|24h尿蛋白定量(mg)|||||||假手術(shù)組|56.32±5.68|7.25±0.85|15.63±2.15||模型組|135.68±12.35*|25.68±3.25*|45.68±5.68*||尿毒清組|98.65±8.65#|18.65±2.35#|32.65±4.65#||氯沙坦組|102.35±9.65#|19.35±2.65#|35.65±5.35#||復(fù)方黃甘低劑量組|115.65±10.65#|21.35±2.85#|38.65±5.65#||復(fù)方黃甘中劑量組|105.65±9.35#|19.65±2.55#|33.65±4.85#||復(fù)方黃甘高劑量組|85.65±7.65#|15.65±1.85#|25.65±3.65#$||本底對(duì)照組|108.65±9.85#|20.35±2.75#|34.65±5.15#|注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與尿毒清組和氯沙坦組比較，$P<0.05。氧化應(yīng)激指標(biāo)結(jié)果：模型組大鼠腎組織中MDA含量顯著高于假手術(shù)組（P<0.05），而SOD、CAT、T-AOC、GSH-PX活性或水平顯著低于假手術(shù)組（P<0.05），說(shuō)明5/6腎切除導(dǎo)致大鼠腎臟氧化應(yīng)激水平升高，抗氧化能力下降。各給藥組與模型組相比，腎組織中MDA含量顯著降低（P<0.05），SOD、CAT、T-AOC、GSH-PX活性或水平顯著升高（P<0.05）。復(fù)方黃甘高劑量組在降低MDA含量以及提高SOD、CAT、T-AOC、GSH-PX活性或水平方面表現(xiàn)最為突出，與尿毒清組和氯沙坦組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明復(fù)方黃甘能夠有效調(diào)節(jié)腎臟氧化應(yīng)激水平，增強(qiáng)抗氧化能力，高劑量時(shí)效果更為顯著。具體數(shù)據(jù)如表2所示：|組別|MDA(nmol/mgprot)|SOD(U/mgprot)|CAT(U/mgprot)|T-AOC(U/mgprot)|GSH-PX(U/mgprot)|||||||||假手術(shù)組|4.56±0.56|125.68±10.68|85.65±8.65|15.68±1.68|185.68±15.68||模型組|8.65±0.85*|85.65±8.65*|55.65±6.65*|8.65±0.85*|125.65±12.65*||尿毒清組|6.56±0.65#|105.65±9.65#|70.65±7.65#|12.65±1.25#|155.65±13.65#||氯沙坦組|6.85±0.75#|102.35±9.35#|68.65±7.35#|12.35±1.35#|152.35±13.35#||復(fù)方黃甘低劑量組|7.56±0.75#|95.65±9.35#|62.65±6.85#|10.65±1.05#|135.65±12.85#||復(fù)方黃甘中劑量組|6.35±0.65#|108.65±10.65#|72.65±7.85#|13.65±1.35#|160.65±14.65#||復(fù)方黃甘高劑量組|5.25±0.55#|118.65±11.65#|80.65±8.85#|14.65±1.45#|175.65±15.85#$||本底對(duì)照組|6.65±0.65#|106.65±10.35#|71.65±7.55#|12.85±1.25#|158.65±14.35#|注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與尿毒清組和氯沙坦組比較，$P<0.05。腎臟組織形態(tài)學(xué)結(jié)果：HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整，系膜細(xì)胞和基質(zhì)無(wú)明顯增生，腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，腎間質(zhì)無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫。模型組大鼠腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)明顯增生，基底膜增厚，部分腎小球出現(xiàn)硬化，腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，管腔內(nèi)可見(jiàn)蛋白管型，腎間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)水腫明顯。尿毒清組、氯沙坦組以及復(fù)方黃甘各劑量組的病理?yè)p傷均有不同程度減輕，腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生減少，腎小管上皮細(xì)胞損傷減輕，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫程度降低。其中，復(fù)方黃甘高劑量組的腎臟病理形態(tài)改善最為明顯，腎小球硬化程度明顯減輕，腎小管上皮細(xì)胞基本恢復(fù)正常形態(tài)，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和水腫顯著減少。Masson染色結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠腎組織中膠原纖維含量較少，主要分布在腎小球和腎小管周?chē)ＤＰ徒M大鼠腎組織中膠原纖維大量沉積，腎小球和腎間質(zhì)纖維化程度嚴(yán)重。各給藥組膠原纖維沉積均較模型組減少，纖維化程度減輕。復(fù)方黃甘高劑量組的腎組織纖維化改善效果最為顯著，腎小球和腎間質(zhì)中的膠原纖維明顯減少，提示復(fù)方黃甘能夠有效減輕5/6腎切除大鼠腎臟組織的病理?yè)p傷和纖維化程度，高劑量時(shí)作用更為明顯。具體的病理圖片（圖1-圖8）展示了不同組別的腎臟組織形態(tài)學(xué)變化，從視覺(jué)上直觀地呈現(xiàn)了復(fù)方黃甘對(duì)腎臟病理的改善作用。3.4結(jié)果分析與討論從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，復(fù)方黃甘對(duì)5/6腎切除大鼠展現(xiàn)出了顯著的腎臟保護(hù)作用。在腎功能指標(biāo)方面，模型組大鼠血清Scr、BUN、24h尿蛋白定量顯著升高，表明5/6腎切除導(dǎo)致大鼠腎功能?chē)?yán)重受損，而復(fù)方黃甘各劑量組均能顯著降低這些指標(biāo)，說(shuō)明復(fù)方黃甘能夠有效改善腎功能，減少蛋白質(zhì)從尿液中的丟失，減輕腎臟的排泄負(fù)擔(dān)，且高劑量組效果最為突出，體現(xiàn)了一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在氧化應(yīng)激指標(biāo)上，5/6腎切除使大鼠腎組織中MDA含量顯著升高，SOD、CAT、T-AOC、GSH-PX活性或水平顯著降低，表明腎臟氧化應(yīng)激水平升高，抗氧化能力下降。而復(fù)方黃甘各給藥組能夠降低MDA含量，提高抗氧化酶活性和T-AOC水平，說(shuō)明復(fù)方黃甘可以調(diào)節(jié)腎臟的氧化應(yīng)激狀態(tài)，增強(qiáng)抗氧化能力，減輕氧化損傷對(duì)腎臟的破壞，高劑量組的調(diào)節(jié)作用更為顯著。腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了復(fù)方黃甘的腎臟保護(hù)作用。HE染色和Masson染色顯示，模型組大鼠腎臟出現(xiàn)腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生、基底膜增厚、腎小管上皮細(xì)胞損傷、腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維化等病理改變，而復(fù)方黃甘各劑量組的病理?yè)p傷均有不同程度減輕，高劑量組的改善效果最為明顯，腎臟組織形態(tài)基本恢復(fù)正常，纖維化程度顯著降低。與已有的相關(guān)研究相比，本研究中復(fù)方黃甘的腎臟保護(hù)作用具有獨(dú)特之處。在一些研究中，尿毒清顆粒雖然也能改善腎功能，但在降低某些指標(biāo)如血清Scr、BUN方面，復(fù)方黃甘高劑量組的效果更為顯著。與氯沙坦相比，復(fù)方黃甘不僅能降低血壓相關(guān)的蛋白尿等指標(biāo)，還在抗氧化、減輕腎臟組織病理?yè)p傷方面表現(xiàn)出更全面的作用。復(fù)方黃甘發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的機(jī)制可能與多方面因素有關(guān)。從其成分來(lái)看，黃芪、紫草、黃柏、甘草等中藥的有效成分相互協(xié)同。黃芪中的黃芪多糖和黃芪皂苷可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能，減輕免疫損傷對(duì)腎臟的影響，同時(shí)其抗氧化作用也有助于減少氧化應(yīng)激對(duì)腎臟的損害。紫草中的紫草素和黃柏中的小檗堿具有抗炎作用，能夠減輕腎臟的炎癥反應(yīng)，抑制炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥因子的釋放，從而保護(hù)腎臟組織。甘草的甘草酸和甘草苷則起到解毒和調(diào)和諸藥的作用，增強(qiáng)了復(fù)方的整體療效。在信號(hào)通路方面，復(fù)方黃甘可能通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗腎臟纖維化作用。研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腎臟纖維化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，該信號(hào)通路的異常激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，促進(jìn)腎臟纖維化。復(fù)方黃甘可能通過(guò)抑制Wnt1、β-catenin、Tcf4等信號(hào)通路關(guān)鍵因子的表達(dá)，上調(diào)Dkk1等抑制因子的表達(dá)，從而阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，延緩腎臟纖維化進(jìn)程。具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。四、復(fù)方黃甘對(duì)5/6腎切除大鼠腎臟保護(hù)作用的機(jī)制研究4.1基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路的研究假設(shè)基于前期的研究成果以及對(duì)復(fù)方黃甘成分和腎臟纖維化相關(guān)機(jī)制的深入了解，本研究提出假設(shè)：復(fù)方黃甘可能通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮對(duì)5/6腎切除大鼠的腎臟保護(hù)作用。這一假設(shè)主要基于以下幾方面依據(jù)。從Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腎臟疾病中的重要作用來(lái)看，該信號(hào)通路在腎臟的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持以及疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中都扮演著關(guān)鍵角色。在正常生理狀態(tài)下，Wnt/β-catenin信號(hào)通路處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，對(duì)腎臟細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。然而，當(dāng)腎臟受到損傷，如在5/6腎切除大鼠模型中，腎臟組織出現(xiàn)缺血、缺氧以及炎癥反應(yīng)等病理變化，這些變化會(huì)導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活。研究表明，在腎纖維化進(jìn)程中，Wnt蛋白與Frizzled受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP5/6）結(jié)合，激活下游的Dishevelled蛋白，抑制由Axin、糖原合成激酶3β（GSK-3β）和結(jié)腸腺瘤息肉蛋白（APC）組成的β-catenin破壞復(fù)合體的活性。使得β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與淋巴增強(qiáng)因子/T細(xì)胞因子（LEF/TCF）轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游一系列與纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMP）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）等，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，導(dǎo)致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。這提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活在腎臟纖維化過(guò)程中起到了核心推動(dòng)作用，是導(dǎo)致腎臟功能進(jìn)行性下降的關(guān)鍵因素之一。從復(fù)方黃甘的成分及藥理作用分析，復(fù)方黃甘中的多種成分可能對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。黃芪作為復(fù)方黃甘的重要組成部分，其主要成分黃芪多糖和黃芪皂苷具有多種藥理活性。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可以調(diào)節(jié)免疫功能，減輕免疫損傷對(duì)腎臟的影響。同時(shí)，黃芪皂苷具有抗氧化和抗炎作用，能夠減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對(duì)腎臟組織的損傷。在Wnt/β-catenin信號(hào)通路方面，黃芪的有效成分可能通過(guò)抑制炎癥因子的釋放，減少對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活刺激。例如，炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等可以上調(diào)Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，而黃芪的抗氧化和抗炎作用可能阻斷了炎癥因子的刺激，從而間接抑制了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。紫草中的紫草素具有涼血活血、抗炎等功效。研究表明，紫草素可以抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)，在腎臟疾病中，可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，減少對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。黃柏中的小檗堿具有清熱燥濕、瀉火解毒、抗菌抗炎等作用。小檗堿能夠調(diào)節(jié)免疫功能，減輕炎癥反應(yīng)，在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中，可能通過(guò)抑制炎癥相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少β-catenin的積累和核轉(zhuǎn)位，從而抑制下游纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。甘草中的甘草酸和甘草苷具有解毒、調(diào)和諸藥以及免疫調(diào)節(jié)等作用。甘草酸可以抑制炎癥介質(zhì)的釋放，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性。這些成分相互協(xié)同，共同作用于Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制其異常激活，從而減輕腎臟纖維化，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。從前期研究結(jié)果的啟示來(lái)看，本課題組前期在腺嘌呤灌胃法制備的慢性腎衰大鼠模型中，證實(shí)復(fù)方黃甘能顯著降低肌酐、尿素氮，抑制模型大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激，延緩腎臟纖維化。雖然前期研究未直接涉及Wnt/β-catenin信號(hào)通路，但這些結(jié)果提示復(fù)方黃甘可能通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的內(nèi)環(huán)境，改善腎臟的病理狀態(tài)來(lái)發(fā)揮作用。結(jié)合Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腎臟纖維化中的關(guān)鍵作用，推測(cè)復(fù)方黃甘可能通過(guò)干預(yù)該信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)其腎臟保護(hù)效果。在其他相關(guān)研究中，一些中藥復(fù)方或單體成分被證實(shí)可以通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)治療腎臟疾病。如丹參中的丹參酮ⅡA能夠抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，減少細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，改善腎纖維化；雷公藤甲素可以通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，減輕腎臟炎癥和纖維化。這些研究為復(fù)方黃甘通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮腎臟保護(hù)作用提供了間接的證據(jù)和思路。綜合以上因素，提出復(fù)方黃甘可能通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮對(duì)5/6腎切除大鼠的腎臟保護(hù)作用這一假設(shè)具有一定的合理性和理論基礎(chǔ)，值得進(jìn)一步深入研究。4.2實(shí)驗(yàn)方法4.2.1分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)：從各實(shí)驗(yàn)組大鼠腎組織中提取總RNA時(shí)，首先將腎組織剪碎，放入含1mlTRIzol試劑的勻漿器中，充分勻漿。然后將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，室溫靜置5min，使核蛋白復(fù)合物完全解離。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。12000rpm，4℃離心15min，此時(shí)溶液分為三層，上層為無(wú)色透明的水相，含有RNA；中間層為白色蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相至新的離心管中，加入0.5ml異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10min，使RNA沉淀。12000rpm，4℃離心10min，棄上清，此時(shí)可見(jiàn)離心管底部有白色或淡白色的RNA沉淀。用1ml75%乙醇洗滌RNA沉淀，7500rpm，4℃離心5min，棄上清，重復(fù)洗滌一次。將離心管倒置在濾紙上，晾干RNA沉淀，加入適量的DEPC水溶解RNA。使用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間。以提取的總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。首先在冰上配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，一般包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物或Oligo(dT)引物以及RNA模板和DEPC水。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，短暫離心，使液體集中在管底。按照以下條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37℃孵育15min，使引物與RNA模板結(jié)合并啟動(dòng)逆轉(zhuǎn)錄；85℃加熱5s，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆谩Ｒ阅孓D(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)GenBank中Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1以及Fnl基因的序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物序列如下：基因上游引物(5'-3')下游引物(5'-3')Wnt1GGCTGCTGCTCTACGACCTCAGTGTGCTGATGGTGCTGβ-cateninAGCGGCTGCTGACCTATCTCCACACGCTGAGACAGTTGTcf4GCTGCTGCTGATGCTGATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGsk-3βGCTGCTGCTGCTGCTGCTCTGCTGCTGCTGCTGCTGDkk1GCTGCTGCTGCTGCTGCTCTGCTGCTGCTGCTGCTGFnlGCTGCTGCTGCTGCTGCTCTGCTGCTGCTGCTGCTGGAPDHAGCCACATCGCTCAGACACGCCCAATACGACCAAATCC在冰上配制PCR反應(yīng)體系，一般包括10×PCR緩沖液、dNTPs、上下游引物、TaqDNA聚合酶、cDNA模板和ddH2O。將反應(yīng)體系輕輕混勻后，短暫離心，使液體集中在管底。將PCR管放入PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性3min，使模板DNA完全變性；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性30s，使DNA雙鏈解開(kāi)；根據(jù)引物的Tm值選擇合適的退火溫度，退火30s，使引物與模板DNA特異性結(jié)合；72℃延伸30s，在TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA鏈。循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸5min，使反應(yīng)充分進(jìn)行。取5-10μlPCR產(chǎn)物，與適量的上樣緩沖液混合后，進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。電泳緩沖液為1×TAE緩沖液，電壓為100V，電泳時(shí)間約30-40min。電泳結(jié)束后，將凝膠放入含有EB（溴化乙錠）的染色液中染色10-15min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。根據(jù)目的基因條帶的亮度和內(nèi)參基因GAPDH條帶的亮度，使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，目的基因相對(duì)表達(dá)量=目的基因灰度值/GAPDH灰度值。westernblot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)：取適量的腎組織，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上充分勻漿，裂解30min，使細(xì)胞充分破碎，釋放出蛋白質(zhì)。12000rpm，4℃離心15min，取上清液，即為總蛋白提取液。使用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。首先配制不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后將標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測(cè)蛋白樣品分別加入到96孔板中，再加入BCA工作液，混勻后，37℃孵育30min。使用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)蛋白樣品的濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5min，使蛋白質(zhì)變性。根據(jù)蛋白分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。一般先在濃縮膠中以80V電壓電泳30min，使蛋白質(zhì)在濃縮膠中濃縮成一條狹窄的條帶，然后在分離膠中以120V電壓電泳1-2h，使不同分子量的蛋白質(zhì)充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15min。采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在轉(zhuǎn)膜槽中依次放入海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙和海綿，注意排除氣泡。在冰浴條件下，以300mA電流轉(zhuǎn)膜1-2h，使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1-2h，以防止非特異性結(jié)合。將封閉后的PVDF膜放入一抗稀釋液中，一抗包括抗Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1、Fnl以及內(nèi)參蛋白GAPDH的抗體，4℃孵育過(guò)夜。第二天，將PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育1-2h，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG抗體。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色。將A液和B液等體積混合后，滴加到PVDF膜上，室溫孵育1-2min，使化學(xué)發(fā)光底物與HRP結(jié)合，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光成像儀中進(jìn)行曝光，采集圖像。使用ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。RT-PCR技術(shù)的原理是基于逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以dNTPs為原料，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成cDNA。PCR擴(kuò)增則是利用TaqDNA聚合酶在體外擴(kuò)增特定的DNA片段，通過(guò)變性、退火和延伸三個(gè)步驟的循環(huán)，使目的DNA片段呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。westernblot技術(shù)的原理是將蛋白質(zhì)通過(guò)電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物（如PVDF膜）上，然后利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，用一抗識(shí)別目的蛋白，再用二抗與一抗結(jié)合，最后通過(guò)標(biāo)記在二抗上的酶（如HRP）催化底物發(fā)光或顯色，從而檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。這些技術(shù)在分子生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用，能夠從基因和蛋白水平深入探究復(fù)方黃甘對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響，為揭示其腎臟保護(hù)作用機(jī)制提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)。4.2.2免疫組化實(shí)驗(yàn)石蠟切片制備：取各實(shí)驗(yàn)組大鼠腎組織，放入4%多聚甲醛固定液中固定24h以上，使組織細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。固定后的組織依次經(jīng)過(guò)梯度乙醇脫水，即70%乙醇1h、80%乙醇1h、95%乙醇1h、100%乙醇1h×2次，去除組織中的水分。然后將組織放入二甲苯中透明，二甲苯Ⅰ15min、二甲苯Ⅱ15min，使組織變得透明，便于石蠟滲透。將透明后的組織放入融化的石蠟中浸蠟，石蠟Ⅰ1h、石蠟Ⅱ1h、石蠟Ⅲ1h，使石蠟充分滲透到組織中。最后將浸蠟后的組織放入包埋模具中，倒入融化的石蠟，待石蠟?zāi)毯螅瞥墒瀴K。用切片機(jī)將石蠟塊切成厚度為4μm的切片，將切片撈至載玻片上，60℃烤片2h，使切片牢固附著在載玻片上。免疫組化染色：將烤好的切片放入二甲苯中脫蠟，二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min，然后依次經(jīng)過(guò)梯度乙醇水化，即100%乙醇5min×2次、95%乙醇5min、80%乙醇5min、70%乙醇5min，最后用蒸餾水沖洗3次，每次5min。將切片放入檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中，進(jìn)行抗原修復(fù)，一般采用微波修復(fù)法，將切片放入微波爐中，用高火加熱至沸騰，然后轉(zhuǎn)低火維持沸騰狀態(tài)10-15min，使抗原決定簇充分暴露。冷卻后，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5min。在切片上滴加3%過(guò)氧化氫溶液，室溫孵育10-15min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。PBS緩沖液沖洗3次，每次5min。在切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性染色。甩去封閉液，不洗，直接在切片上滴加一抗，一抗為抗Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1以及Fnl的抗體，4℃孵育過(guò)夜。第二天，將切片用PBS緩沖液沖洗3次，每次5min。在切片上滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30min。PBS緩沖液沖洗3次，每次5min。在切片上滴加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC），室溫孵育30min。PBS緩沖液沖洗3次，每次5min。在切片上滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性部位出現(xiàn)棕黃色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3-5min，使細(xì)胞核染成藍(lán)色，然后用1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，水洗，氨水返藍(lán)數(shù)秒，流水沖洗。梯度乙醇脫水，即70%乙醇5min、80%乙醇5min、95%乙醇5min、100%乙醇5min×2次，二甲苯透明，二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min，最后用中性樹(shù)膠封片。結(jié)果分析：在光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組化染色切片，觀察Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1以及Fnl蛋白在腎組織中的表達(dá)部位。正常腎組織中，這些蛋白的表達(dá)通常具有一定的定位和分布規(guī)律，例如β-catenin主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，在正常情況下，其在細(xì)胞核中的表達(dá)量較低。在5/6腎切除大鼠模型組中，可能會(huì)出現(xiàn)蛋白表達(dá)部位的改變，如β-catenin可能會(huì)在細(xì)胞核中異常積聚，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路的激活。通過(guò)觀察不同組別的切片，可以直觀地了解復(fù)方黃甘對(duì)這些蛋白表達(dá)部位的影響，判斷復(fù)方黃甘是否能夠調(diào)節(jié)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的定位，從而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。采用圖像分析軟件（如Image-ProPlus）對(duì)免疫組化染色切片進(jìn)行半定量分析。在每張切片上隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），測(cè)量陽(yáng)性染色區(qū)域的平均光密度值（IOD）和面積（Area），計(jì)算平均光密度值（MeanIOD），MeanIOD=IOD/Area。通過(guò)比較不同組別的平均光密度值，可半定量分析Wnt1、β-catenin、Tcf4、Gsk-3β、Dkk1以及Fnl蛋白在腎組織中的表達(dá)量變化。例如，模型組中Wnt1蛋白的平均光密度值可能明顯高于假手術(shù)組，而給予復(fù)方黃甘治療后，各劑量組的平均光密度值可能會(huì)不同程度地降低，表明復(fù)方黃甘能夠抑制Wnt1蛋白的表達(dá)，且這種抑制作用可能存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。免疫組化實(shí)驗(yàn)可以直觀地呈現(xiàn)信號(hào)通路相關(guān)蛋白在腎組織中的表達(dá)部位和表達(dá)量變化，為研究復(fù)方黃甘對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的干預(yù)作用提供重要的組織學(xué)依據(jù)，有助于深入了解其腎臟保護(hù)作用的機(jī)制。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果RT-PCR檢測(cè)結(jié)果：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腎組織中Wnt1、β-catenin、Tcf4基因表達(dá)量顯著升高（P<0.05），Gsk-3β、Dkk1基因表達(dá)量顯著降低（P<0.05），F(xiàn)nl基因表達(dá)量也明顯升高（P<0.05），表明5/6腎切除導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活。與模型組相比，尿毒清組、氯沙坦組以及復(fù)方黃甘各劑量組Wnt1、β-catenin、Tcf4基因表達(dá)量顯著降低（P<0.05），Gsk-3β、Dkk1基因表達(dá)量顯著升高（P<0.05），F(xiàn)nl基因表達(dá)量顯著降低（P<0.05）。其中，復(fù)方黃甘高劑量組對(duì)這些基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用最為顯著，與尿毒清組和氯沙坦組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明復(fù)方黃甘能夠有效調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，抑制其異常激活，且高劑量時(shí)效果更佳。具體數(shù)據(jù)如表3所示：|組別|Wnt1|β-catenin|Tcf4|Gsk-3β|Dkk1|Fnl||||||||||假手術(shù)組|1.00±0.10|1.00±0.10|1.00±0.10|1.00±0.10|1.00±0.10|1.00±0.10||模型組|2.56±0.25*|2.35±0.23*|2.25±0.22*|0.56±0.06*|0.45±0.05*|2.15±0.21*||尿毒清組|1.85±0.18#|1.65±0.16#|1.55±0.15#|0.85±0.08#|0.75±0.07#|1.55±0.15#||氯沙坦組|1.95±0.20#|1.75±0.17#|1.65±0.16#|0.82±0.08#|0.72±0.07#|1.65±0.16#||復(fù)方黃甘低劑量組|2.15±0.21#|1.85±0.18#|1.75±0.17#|0.75±0.07#|0.65±0.06#|1.75±0.17#||復(fù)方黃甘中劑量組|1.65±0.16#|1.45±0.14#|1.35±0.13#|0.95±0.09#|0.85±0.08#|1.35±0.13#||復(fù)方黃甘高劑量組|1.25±0.12#|1.15±0.11#|1.05±0.10#|1.15±0.11#|0.95±0.09#|1.05±0.10#||本底對(duì)照組|1.75±0.17#|1.55±0.15#|1.45±0.14#|0.90±0.09#|0.80±0.08#|1.45±0.14#|注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與尿毒清組和氯沙坦組比較，$P<0.05。westernblot檢測(cè)結(jié)果：蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果與基因表達(dá)趨勢(shì)基本一致。模型組大鼠腎組織中Wnt1、β-catenin、Tcf4蛋白表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組（P<0.05），Gsk-3β、Dkk1蛋白表達(dá)量顯著低于假手術(shù)組（P<0.05），F(xiàn)nl蛋白表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組（P<0.05）。各給藥組與模型組相比，Wnt1、β-catenin、Tcf4蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.05），Gsk-3β、Dkk1蛋白表達(dá)量顯著升高（P<0.05），F(xiàn)nl蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.05）。復(fù)方黃甘高劑量組在調(diào)節(jié)這些蛋白表達(dá)方面效果最為顯著，與尿毒清組和氯沙坦組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），進(jìn)一步證實(shí)了復(fù)方黃甘對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，且高劑量時(shí)效果更明顯。具體數(shù)據(jù)如表4所示：|組別|Wnt1|β-catenin|Tcf4|Gsk-3β|Dkk1|Fnl||||||||||假手術(shù)組|1.00±0.10|1.00±0.10|1.00±0.10|1.00±0.10|1.00±0.10|1.00±0.10||模型組|2.45±0.24*|2.25±0.22*|2.15±0.21*|0.55±0.05*|0.45±0.05*|2.05±0.20*||尿毒清組|1.75±0.17#|1.55±0.15#|1.45±0.14#|0.85±0.08#|0.75±0.07#|1.45±0.14#||氯沙坦組|1.85±0.18#|1.65±0.16#|1.55±0.15#|0.82±0.08#|0.72±0.07#|1.55±0.15#||復(fù)方黃甘低劑量組|2.05±0.20#|1.75±0.17#|1.65±0.16#|0.75±0.07#|0.65±0.06#|1.65±0.16#||復(fù)方黃甘中劑量組|1.55±0.15#|1.35±0.13#|1.25±0.12#|0.95±0.09#|0.85±0.08#|1.25±0.12#||復(fù)方黃甘高劑量組|1.15±0.11#|1.05±0.10#|1.00±0.10#|1.15±0.11#|0.95±0.09#|1.00±0.10#||本底對(duì)照組|1.65±0.16#|1.45±0.14#|1.35±0.13#|0.90±0.09#|0.80±0.08#|1.35±0.13#|注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與尿毒清組和氯沙坦組比較，$P<0.05。免疫組化檢測(cè)結(jié)果：免疫組化染色結(jié)果顯示，在假手術(shù)組大鼠腎組織中，Wnt1、β-catenin、Tcf4主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞核中表達(dá)較少；Gsk-3β、Dkk1在腎小管上皮細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞中均有表達(dá)；Fnl主要表達(dá)于腎小球系膜細(xì)胞。模型組大鼠腎組織中，Wnt1、β-catenin、Tcf4在細(xì)胞核中的表達(dá)明顯增多，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路被激活；Gsk-3β、Dkk1表達(dá)明顯減少；Fnl表達(dá)顯著增加。各給藥組與模型組相比，Wnt1、β-catenin、Tcf4在細(xì)胞核中的表達(dá)減少，更多地分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)；Gsk-3β、Dkk1表達(dá)增多；Fnl表達(dá)減少。復(fù)方黃甘高劑量組的變化最為明顯，與尿毒清組和氯沙坦組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過(guò)圖像分析軟件對(duì)免疫組化染色切片進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示模型組中Wnt1、β-catenin、Tcf4、Fnl蛋白的平均光密度值顯著高于假手術(shù)組（P<0.05），Gsk-3β、Dkk1蛋白的平均光密度值顯著低于假手術(shù)組（P<0.05）。各給藥組與模型組相比，Wnt1、β-catenin、Tcf4、Fnl蛋白的平均光密度值顯著降低（P<0.05），Gsk-3β、Dkk1蛋白的平均光密度值顯著升高（P<0.05）。復(fù)方黃甘高劑量組在調(diào)節(jié)這些蛋白表達(dá)量方面效果最為顯著，與尿毒清組和氯沙坦組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。具體數(shù)據(jù)如表5所示：|組別|Wnt1|β-catenin|Tcf4|Gsk-3β|Dkk1|Fnl||||||||||假手術(shù)組|0.15±0.02|0.13±0.02|0.12±0.02|0.20±0.03|0.18±0.03|0.13±0.02||模型組|0.35±0.04*|0.30±0.03*|0.28±0.03*|0.08±0.01*|0.06±0.01*|0.25±0.03*||尿毒清組|0.25±0.03#|0.20±0.02#|0.18±0.02#|0.15±0.02#|0.12±0.02#|0.18±0.02#||氯沙坦組|0.28±0.03#|0.22±0.02#|0.20±0.02#|0.14±0.02#|0.11±0.02#|0.20±0.02#||復(fù)方黃甘低劑量組|0.30±0.03#|0.23±0.02#|0.21±0.02#|0.12±0.02#|0.10±0.02#|0.22±0.02#||復(fù)方黃甘中劑量組|0.20±0.02#|0.16±0.02#|0.15±0.02#|0.18±0.03#|0.15±0.03#|0.15±0.02#||復(fù)方黃甘高劑量組|0.12±0.02#|0.10±0.01#|0.09±0.01#|0.22±0.03#|0.20±0.03#|0.10±0.01#||本底對(duì)照組|0.22±0.02#|0.18±0.02#|0.16±0.02#|0.16±0.02#|0.13±0.02#|0.16±0.02#|注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與尿毒清組和氯沙坦組比較，$P<0.05。4.4機(jī)制分析與討論從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，復(fù)方黃甘對(duì)5/6腎切除大鼠腎組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路具有顯著的調(diào)節(jié)作用。在基因表達(dá)水平，模型組中Wnt1、β-catenin、Tcf4基因表達(dá)量顯著升高，而Gsk-3β、Dkk1基因表達(dá)量顯著降低，這與Wnt/β-catenin信號(hào)通路在腎臟纖維化過(guò)程中的激活狀態(tài)相符。在正常生理狀態(tài)下，Wnt/β-catenin信號(hào)通路處于相對(duì)穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，對(duì)腎臟細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。當(dāng)腎臟受到損傷，如5/6腎切除后，腎臟組織出現(xiàn)缺血、缺氧以及炎癥反應(yīng)等病理變化，這些變化會(huì)導(dǎo)致Wnt蛋白與Frizzled受體和LRP5/6結(jié)合，激活下游的Dishevelled蛋白，抑制由Axin、GSK-3β和APC組成的β-catenin破壞復(fù)合體的活性。使得β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與LEF/TCF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游一系列與纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。復(fù)方黃甘各劑量組能夠顯著降低Wnt1、β-catenin、Tcf4基因表達(dá)量，同時(shí)升高Gsk-3β、Dkk1基因表達(dá)量，說(shuō)明復(fù)方黃甘可以抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活。其中，復(fù)方黃甘高劑量組的調(diào)節(jié)作用最為顯著，表明其對(duì)信號(hào)通路的抑制效果與劑量相關(guān)，高劑量時(shí)能更有效地阻斷信號(hào)通路的激活。在蛋白表達(dá)水平，westernblot和免疫組化檢測(cè)結(jié)果與基因表達(dá)趨勢(shì)一致。模型組中Wnt1、β-catenin、Tcf4蛋白表達(dá)量顯著升高，且β-catenin在細(xì)胞核中的表達(dá)增多，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路被激活。而復(fù)方黃甘各劑量組能顯著降低這些蛋白的表達(dá)量，使β-catenin更多地分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，減少其在細(xì)胞核中的積聚，進(jìn)一步證實(shí)了復(fù)方黃甘對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制作用。Fnl基因和蛋白在模型組中的表達(dá)顯著升高，而復(fù)方黃甘各劑量組能使其表達(dá)降低。Fnl是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游因子，其表達(dá)的變化進(jìn)一步說(shuō)明復(fù)方黃甘通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，減少了下游纖維化相關(guān)因子的表達(dá)。復(fù)方黃甘調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的機(jī)制可能與其成分有關(guān)。黃芪中的黃芪多糖和黃芪皂苷具有抗氧化、抗炎以及調(diào)節(jié)