不同蛋白抗原對小鼠骨髓源DC分化成熟的影響

摘要前列腺特異膜抗原（Prostate-specificmembraneantigen,PSMA）是由前列腺上皮細胞分泌的一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，被認為是前列腺癌診斷和治療研究的理想靶點。本實驗以GM-CSF和IL-4聯(lián)合培養(yǎng)小鼠骨髓源DC為基礎，利用不同的蛋白抗原刺激誘導，流式細胞儀檢測CD11c、CD86表達水平，探討幾種不同來源的前列腺特異膜抗原對小鼠骨髓源DC成熟分化的影響。結(jié)果：霍亂毒素樣嵌合蛋白、五聚體蛋白和混合蛋白刺激后的DC86表達水平均要高于標準品，表明這三種蛋白抗原較標準品有更好的免疫原性，能更好地提高DC的抗原程度能力。關鍵詞：免疫治療，流式細胞儀，樹突狀細胞，前列腺特異性膜抗原注：本設計（論文）題目來源于教師的廳級（或省部級、廳局級、校級、企業(yè)）科研項目，項目編號為：81501429注：本設計（論文）題目來源于教師的廳級（或省部級、廳局級、校級、企業(yè)）科研項目，項目編號為：81501429。Prostate-specificmembraneantigen(PSMA)isatypeIItransmembraneglycoproteinsecretedbyprostateepithelialcellsandisconsideredtobeanidealtargetforthediagnosisandtreatmentofprostatecancer.Inthisexperiment,GM-CSFandIL-4werecombinedtoculturemousebonemarrow-derivedDCs.Differentproteinantigenswereusedtostimulateinduction.FlowcytometrywasusedtodetecttheexpressionlevelsofCD11candCD86,andseveraldifferentsourcesofprostatespecificmembraneantigenpairswereexplored.Theeffectofmaturationofmousebonemarrow-derivedDCs.Results:TheexpressionlevelofDC86stimulatedbycholera-toxin-likechimericprotein,pentamericproteinandmixedproteinwashigherthanthatofthestandard,indicatingthatthesethreeproteinantigenshavebetterimmunogenicitythanthestandardandcanbebetter.ImprovetheantigeniccapacityofDC.KeyWords:Immunotherapy,prostatespecificmembraneantigen,flowcytometry,dendriticcells

目錄1 緒論 71.1 前列腺癌藥物治療的研究進展 71.2 前列腺特異性膜抗原的研究進展 71.2.1 PSMA的基本結(jié)構(gòu)及性質(zhì) 81.2.2 PSMA與前列腺癌的關系 81.2.3 基于PSMA的免疫療法 91.3 樹突狀細胞的研究進展 91.3.1 DC的來源和分布 101.3.2 DC的生物學特征 101.3.3 DC的抗腫瘤機制 101.4 本研究目的和意義 112 實驗材料 132.1 菌株與質(zhì)粒 132.2 實驗動物 132.3 實驗試劑 132.4 溶液配制 172.5 實驗儀器 213 實驗方法 233.1 重組蛋白CTB-PAMA624-632和mGM-CSF-CTA2的表達純化 233.1.1 菌種的接種培養(yǎng) 233.1.2 目的蛋白的誘導表達 243.1.3 濕菌體的收集與裂解 243.1.4 包涵體的洗滌與溶解 243.1.5 透析袋的活化 253.1.6 重組蛋白透析復性 253.1.7 重組蛋白層析純化 253.1.8 重組蛋白除鹽凍干 263.1.9 BCA蛋白定量 263.2 重組蛋白CTB-PAMA624-632和mGM-CSF-CTA2的表達鑒定 273.3 嵌合蛋白的制備及鑒定 283.3.1 酸堿變復性獲得嵌合蛋白 283.3.2 BCA蛋白定量 293.3.3 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 293.4 小鼠骨髓細胞分離與培養(yǎng) 293.4.1 小鼠骨髓細胞的分離 303.4.2 小鼠骨髓細胞的培養(yǎng) 303.5 成熟DC的誘導表達與鑒定 303.5.1 刺激誘導為成熟DC 303.5.2 小鼠骨髓源樹突狀細胞的形態(tài)觀察 313.5.3 流式細胞術檢測樹突狀細胞表面標志 314 實驗結(jié)果與討論 324.1 重組蛋白CTB-PAMA624-632和mGM-CSF-CTA2的表達純化與鑒定 324.1.1 重組蛋白CTB-PAMA624-632和mGM-CSF-CTA2的表達純化 324.1.2 重組蛋白CTB-PAMA624-632和mGM-CSF-CTA2的鑒定 324.2 嵌合蛋白的制備與鑒定 334.3 BCA蛋白定量 334.3.1 CTB-PAMA624-632和mGM-CSF-CTA2 334.3.2 嵌合蛋白 344.4 小鼠骨髓源樹突狀細胞的形態(tài)學觀察 354.5 樹突狀細胞表面共刺激表達分子的鑒定 365 中空纖維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的設計 385.1 原理 385.2 基本結(jié)構(gòu) 385.2.1 儲液瓶 385.2.2 中空纖維生物反應器 385.2.3 供氧器 395.2.4 蠕動泵 395.3 培養(yǎng)方法 39總結(jié)和展望 40參考文獻 41致謝 42

緒論前列腺癌藥物治療的研究進展前列腺癌是指發(fā)生在前列腺的上皮性惡性腫瘤，是泌尿系最常見的的惡性腫瘤之一。在世界范圍內(nèi)，前列腺癌的發(fā)病率在男性所有惡性腫瘤中排名第二。在美國，前列腺癌已成為第一位危害男性健康的腫瘤。而在中國，2008年腫瘤登記地區(qū)男性前列腺癌發(fā)病率為11.00/10萬,70歲以上中國男性的前列腺癌居男性泌尿生殖系腫瘤發(fā)病率第1位。調(diào)查顯示[1]，近十余年來，中國男性前列腺癌無論是發(fā)病率還是死亡率均呈現(xiàn)快速增長趨勢，前列腺癌正成為嚴重影響我國男性健康的泌尿系惡性腫瘤。前列腺癌早期通常沒有癥狀，一般發(fā)現(xiàn)時已多為晚期。前列腺癌的發(fā)展分為先期激素依賴性腫瘤細胞為主和后期激素抵抗性腫瘤細胞為主的兩個階段。前一階段的藥物治療主要是指通過阻斷雄激素促使雄激素依賴性的癌細胞凋亡的內(nèi)分泌治療，主要包括雌激素及其類似物、黃體生成素釋放激素藥物的去勢治療、甾類及非甾類的抗雄激素藥物治療、最大雄激素阻斷治療和間歇性內(nèi)分泌治療；后一階段的藥物治療主要包括化療、免疫治療、抗雄激素新藥治療、分子靶向治療等[2]。前列腺癌的藥物治療主要是內(nèi)分泌治療，內(nèi)分泌治療可以使大多數(shù)患者的病情得到控制和改善，但經(jīng)過約18～30個月的中位緩解期后，前列腺癌細胞仍不斷增殖，會發(fā)展為激素抵抗性癌細胞。此類患者生存期僅為18～24個月，生存率較低。這一階段，可采用化療、免疫治療等手段延長患者的生存時間，但目前仍沒有辦法治愈。作為新型的腫瘤綜合模式，免疫治療具有化療所不具有的優(yōu)勢，其主要方法為增強患者的免疫能力，通過免疫細胞的特異性殺傷能力來清除腫瘤細胞。且前列腺癌細胞擁有眾多的免疫性標志物，一直被認為是最適宜于免疫治療的腫瘤之一。前列腺特異性膜抗原的研究進展由于擁有眾多的免疫性標志物，前列腺癌一直被認為是最適宜于免疫治療的腫瘤之一。目前已有多種前列腺癌特異性或相關性抗原被應用于腫瘤的診斷和治療中，如前列腺特異性抗原(prostatespecificantigen，PSA)、前列腺特異性膜抗原(prostate-specificmemberaneantigen，PSMA)、前列腺酸性磷酸化酶(prostateacidphosphatase，PAP)等。前列腺特異性膜抗原在前列腺癌中高表達，并且在低分化、進展期、激素難治性及轉(zhuǎn)移性的前列腺癌中表達進一步增高。因為這一特性，PSMA被認為是前列腺癌診斷和治療研究的理想靶點。PSMA的基本結(jié)構(gòu)及性質(zhì)前列腺特異膜抗原（Prostate-specificmembraneantigen,PSMA）是由前列腺上皮細胞分泌的一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，同時還是一種葉酸水解酶。最初由前列腺癌淋巴結(jié)細胞中提取出的單克隆抗體7E11而命名，主要表達在前列腺分泌腺泡上皮細胞和前列腺癌，部分前列腺外組織中也可高表達。PSMA由750個氨基酸殘基組成，分子量為100kD，其基因定位于11q14，11號染色體短臂上，共有19個外顯子和18個內(nèi)含子。PSMA具有葉酸水解酶和N-乙?；?酸性二肽酶2種酶的活性[3]。PSMA與血清轉(zhuǎn)鐵蛋白受體有54%的同源性，因此同血清轉(zhuǎn)鐵蛋白相似，進入細胞時需要經(jīng)歷細胞內(nèi)吞作用。PSMA需經(jīng)糖基化作用才可發(fā)揮酶的活性，作為葉酸水解酶時具有調(diào)節(jié)細胞生長、分化的作用，可通過釋放谷氨酸導致谷氨酸的神經(jīng)毒性或谷氨酸興奮性中毒參與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)??；作為肽酶時，可激活信號級聯(lián)反應。PSMA還具有其他一些性質(zhì)，例如，在新生血管中強有力地表達；參與內(nèi)皮細胞體外入侵；參與整合素信號和黏著斑激酶激活;與細絲蛋白相互作用調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞活性等。PSMA與前列腺癌的關系PSMA最初只發(fā)現(xiàn)主要在前列腺腫瘤中高度表達。而后研究發(fā)現(xiàn)，PSMA普遍在實體腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞中表達，良性組織和惡性腫瘤的內(nèi)皮細胞中均能表達。在正常組織中，PSMA高表達于前列腺分泌腺泡上皮細胞，低表達于腎、涎腺、十二指腸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)組織。PSMA的mRNA或蛋白表達在良性的非前列腺組織的血管內(nèi)皮細胞中。在惡性組織中，PSMAmRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達在腫瘤相關的新生血管內(nèi)皮細胞中。在非前列腺癌中，腫瘤血管的生成與PSMA在腫瘤毛細血管床的內(nèi)皮細胞中的表達有關。研究[4]表明，PSMA表達于正常腎組織的近曲小管和腎腫瘤組織的相關血管，高表達于腎透明細胞癌，低表達于腎乳頭狀細胞癌和血管平滑肌脂肪瘤。因此，在腎腫瘤中，PSMA既可作為一個診斷標志物，也能作為一個藥物治療靶點?；赑SMA的免疫療法基于PSMA的免疫療法主要是基于PSMA的腫瘤疫苗，其中包括DNA疫苗、蛋白疫苗、重組病毒疫苗、抗原提呈細胞疫苗等。DNA疫苗即將攜帶外源基因的真核表達載體注射入動物體內(nèi)，使外源基因在體內(nèi)表達，通過MHC-Ⅰ類途徑誘導產(chǎn)生CD8+、CTL，從而殺死腫瘤細胞。同時,攜帶外源基因的載體可充當免疫佐劑,增強免疫反應。正常情況下機體對自身腫瘤抗原具有免疫耐受性，但是異基因免疫接種編碼腫瘤抗原的DNA疫苗可以誘導機體產(chǎn)生針對該抗原的抗體和免疫反應。已有相關研究將編碼人PSMA的DNA疫苗成功接種到C57BL/6小鼠身上，并成功誘導產(chǎn)生抗人/小鼠PSMA抗體和細胞毒性T細胞反應，且尚未發(fā)現(xiàn)不良反應。蛋白疫苗指將表達PSMA的基因構(gòu)建在表達載體上，將已構(gòu)建的表達蛋白載體轉(zhuǎn)化到細菌、酵母或哺乳動物或昆蟲細胞中，在一定的誘導條件下，表達出大量的抗原蛋白，通過純化后制備的疫苗?，F(xiàn)也有從中國倉鼠卵巢細胞中分泌獲得的重組PSMA疫苗進入臨床實驗，但仍需進一步評估免疫治療后的療效。重組病毒疫苗是在病毒體內(nèi)插入一段可自我擴增的PSMA基因序列，讓被修飾的病毒作為一個攜帶者來表達該基因。一方面，該病毒進入細胞后可高水平表達PSMA，另一方面，病毒載體可感染樹突狀在細胞，從而誘導PSMA特異性免疫反應。該方法最大的優(yōu)勢是能維持時間較長的細胞免疫和體液免疫，但是操作過于繁瑣。抗原提呈細胞疫苗的典型是DC細胞疫苗，樹突狀細胞在體外被腫瘤相關抗原沖擊致敏后，回輸體內(nèi)可誘導出特異性腫瘤反應。同樣地，此種免疫治療方法仍還有許多問題還未解決，如DCs回輸前是否冷藏、回輸方式和患者整體治療方案、DCs的作用機理、DCs臨床療效評估方法等，還需要進一步的研究。樹突狀細胞的研究進展1973年，Steinman和Cohn[5]從小鼠外周淋巴器官制備的貼壁細胞群中鑒定出一種新的細胞類型，其在形態(tài)學上的差異和缺乏淋巴細胞表面分化標志物可區(qū)別于淋巴細胞或巨噬細胞，又因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而命名為樹突狀細胞。DC的來源和分布樹突狀細胞（dendriticcell，簡稱DC）是目前發(fā)現(xiàn)的哺乳動物體內(nèi)最強的專職抗原呈遞細胞，也是唯一可以激活初始T細胞的抗原呈遞細胞。其最初起源于骨髓中的造血干細胞，根據(jù)其來源，可將其分為兩類——髓樣DC和淋巴樣DC。前者是髓樣干細胞在GM-CSF的刺激下分化而成的，與單核細胞和粒細胞有共同的前體細胞；后者來源于淋巴樣干細胞，與T細胞、B細胞和NK細胞有共同的前體細胞。雖然樹突狀細胞在人和動物體內(nèi)的含量極低，數(shù)量不足外周血單核細胞的1%，但其分布廣泛，存在除了大腦以外的幾乎所有的組織和器官中。通常少量分布于與外界接觸的皮膚(黏膜)部位，主要為皮膚和鼻腔、肺、胃與腸的內(nèi)層。血液中也存在未成熟的DC細胞，當受到抗原的刺激時，他們會被活化成為成熟DC，遷移至淋巴組織中與T細胞與B細胞互相作用，促進免疫反應。DC的生物學特征DC主要分為未成熟DC和成熟DC，其發(fā)育主要分為4個階段[6]——骨髓中的DC前體細胞、在血液、淋巴組織中巡查的DC前體細胞、組織中未成熟DC和成熟DC。不同發(fā)育階段的DC具有不同的生物學特征[7,8]。DC前體細胞一般定居于骨髓中，當機體發(fā)生急性炎癥時，骨髓中的DC前體會進入到外周血中，再分布到非淋巴組織中。在這一階段的DC前體細胞能分泌促使炎癥反應局限化的細胞因子，協(xié)助消除入侵微生物。存在于組織中的未成熟DC對抗原具有很強的攝取能力，獲得抗原的未成熟DC會慢慢分化為成熟DC。但隨著DC的成熟，其表面的表達分子和形態(tài)上會發(fā)生改變，其內(nèi)吞能力也在慢慢減弱。成熟狀態(tài)的DC主要分布在次級淋巴器官中，在吞噬抗原后，其共刺激因子如CD80、CD86等的表達水平從未成熟時的中度上調(diào)到高表達，從而能夠激活特異性T細胞。另外，它還參與B細胞的發(fā)育、分化和激活，介導其它免疫細胞的趨化作用。DC的抗腫瘤機制隨著對腫瘤細胞學研究的越來越深入，人們漸漸發(fā)現(xiàn)DC在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。已有研究表明，腫瘤組織中的成熟DC遠低于正常組織，由于腫瘤組織中的DC大多處于未成熟狀態(tài)，對抗原的呈遞能力較弱，從而使得免疫反應不能被有效激活，引起免疫逃逸。另外，腫瘤的發(fā)生發(fā)展能夠反過來調(diào)節(jié)DC的增殖和分化，腫瘤細胞能夠直接誘導DC凋亡，還能通過分泌細胞因子抑制DC的增殖分化。因此，DC細胞的激活在腫瘤的治療中有重要意義。DC的抗腫瘤的機制主要分為三點。一是因為DC可以高表達MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子，MHC分子與其捕獲加工的腫瘤抗原結(jié)合形成MHC分子-抗原肽復合物，將其遞呈給T細胞，可誘發(fā)MHC-I類限制性CTL反應和MHC-Ⅱ類限制性的CD4+Thl反應。同時，DC還通過其高表達的共刺激分子提供T細胞活化所必須的第二信號，啟動了免疫應答；二是DC與T細胞結(jié)合可大量分泌IL-12、IL-18激活T細胞增殖，誘導CTL生成，主導Th1型免疫應答，利于腫瘤清除；激活穿孔素P顆粒酶B和FasL/Fas介導的途徑增強NK細胞毒作用；三是DC分泌趨化因子，專一趨化初始型T細胞促進T細胞聚集，增強了T細胞的激活。保持效應T細胞在腫瘤部位長期存在，可能通過釋放某些抗血管生成物質(zhì)(如IL-12、IFN-γ)及前血管生成因子而影響腫瘤血管的形成。上述趨化因子進一步以正反饋旁分泌的方式活化DC，上調(diào)其表面共刺激分子的表達；同時DC也直接向CD8+T細胞呈遞抗原肽，在活化的CD4+T細胞輔助下使CD8+T細胞活化，CD4+和CD8+T細胞還可以進一步通過分泌細胞因子或直接殺傷，增強機體抗腫瘤免疫應答。本研究目的和意義霍亂毒素（choleratoxin,CT）是霍亂弧菌分泌的腸毒素，由一個A亞單位（choleratoxinsubunitA,CTA）和五個B亞單位（choleratoxinsubunitB,CTB）以非共價鍵形式連接而成。實驗前期表達純化獲得兩種基于霍亂毒素AB5結(jié)構(gòu)設計的重組蛋白CTB-PSMA624-632和mGM-CSF-CTA2，并通過酸堿變復性的方式將兩者成功組裝得到嵌合蛋白mGM-CSF-CTA2-TAT/(CTB-PSMA)5。以GM-CSF和IL-4聯(lián)合培養(yǎng)小鼠骨髓源DC為基礎，與前列腺癌膜抗原標準品PSMA624-632對比，利用流式細胞儀檢測蛋白抗原刺激后DC表面共刺激分子的表達，以探討這幾種蛋白抗原對DC表型的影響。

實驗材料菌株與質(zhì)粒表達質(zhì)粒pET28a-CTB-PSMA624-632和pET22b-GM-CSF-CTA2-TAT由實驗室設計、北京普爾普樂生物技術公司合成。注：左為mGM-CSF-CTA2-TAT；右為CTB-PSMA624-632圖STYLEREF1\s2.SEQ圖\*ARABIC\s11兩種重組蛋白的表達質(zhì)粒實驗動物SPF級C57BL/6J雄性小鼠，4-6周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司檢測室。實驗試劑表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s11菌種的接種培養(yǎng)試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家胰蛋白胨美國Oxoid公司酵母提取物美國Oxoid公司氯化鈉廣州化學試劑廠氨芐青霉素廣州瑞舒生物科技有限公司卡那霉素廣州瑞舒生物科技有限公司ddH2O廣州瑞舒生物科技有限公司表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s12誘導表達及菌體裂解試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）廣州瑞舒生物科技有限公司三羥甲基氨基甲烷（Tris）廣州瑞舒生物科技有限公司乙二胺四乙酸（EDTA）廣州瑞舒生物科技有限公司聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）生工生物工程（上海）股份有限公司尿素廣州瑞舒生物科技有限公司HCl廣州瑞舒生物科技有限公司溶菌酶Amresco公司脫氧核糖核酸酶（DNAaseI）美國sigma公司產(chǎn)品（國內(nèi)分裝）ddH2O廣州瑞舒生物科技有限公司表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s13包涵體洗滌溶劑試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家三羥甲基氨基甲烷（Tris）廣州瑞舒生物科技有限公司聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）廣州瑞舒生物科技有限公司尿素廣州瑞舒生物科技有限公司β-巰基乙醇廣州瑞舒生物科技有限公司HCl廣州瑞舒生物科技有限公司表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s14透析復性試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家NaHCO3廣州瑞舒生物科技有限公司EDTA2Na廣州瑞舒生物科技有限公司三羥甲基氨基甲烷（Tris）廣州瑞舒生物科技有限公司HCl廣州瑞舒生物科技有限公司尿素廣州瑞舒生物科技有限公司甘油廣州瑞舒生物科技有限公司氧化型谷胱甘肽上海阿拉丁生化科技股份有限公司還原型谷胱甘肽美國Amresco公司ddH2O廣州瑞舒生物科技有限公司表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s15層析純化試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家鎳柱北京索萊寶生物科技有限公司DEAE-纖維素北京索萊寶生物科技有限公司三羥甲基氨基甲烷（Tris）廣州瑞舒生物科技有限公司HCl廣州瑞舒生物科技有限公司咪唑廣州瑞舒生物科技有限公司氯化鈉廣州化學試劑廠ddH2O廣州瑞舒生物科技有限公司表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s16蛋白質(zhì)電泳試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家考馬斯亮藍R-250廣州瑞舒生物科技有限公司甲醇廣州瑞舒生物科技有限公司丙烯酰胺廣州瑞舒生物科技有限公司過硫酸銨（AP）美國sigma公司產(chǎn)品（國內(nèi)分裝）三羥甲基氨基甲烷（Tris）廣州瑞舒生物科技有限公司HCl廣州瑞舒生物科技有限公司十二烷基硫酸鈉（SDS）生工生物工程（上海）股份有限公司甘氨酸廣州瑞舒生物科技有限公司TEMEDAmresco公司考馬斯亮藍G-250廣州瑞舒生物科技有限公司N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺美國sigma公司Marker美國Thermo公司SDS蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液（5X）Native上樣緩沖液（2X）Beyotime碧云天生物技術北京索萊寶生物科技有限公司二硫蘇糖醇（DTT）廣州瑞舒生物科技有限公司溴酚藍廣州瑞舒生物科技有限公司冰乙酸無水乙醇天津市大茂化學試劑廠天津市大茂化學試劑廠表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s17嵌合蛋白制備試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家檸檬酸天津市大茂化學試劑廠三羥甲基氨基甲烷Tris廣州瑞舒生物科技有限公司HCl廣州瑞舒生物科技有限公司表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s18BCA蛋白定量試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家BCA蛋白定量試劑盒Beyotime碧云天生物技術表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s19小鼠骨髓細胞分離和培養(yǎng)試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家無水乙醇RPMI-1640培養(yǎng)基PBS天津市大茂化學試劑廠美國Gibco公司美國Hyclone公司青霉素鏈霉素溶液美國Gibco公司紅細胞裂解液重組鼠源GM-CSF重組鼠源IL-4胎牛血清北京鼎國昌盛生物技術有限公司PeproTech公司PeproTech公司美國Gibco公司表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s110成熟DC的誘導表達與鑒定試劑試劑名稱生產(chǎn)廠家PSMA624-632脂多糖（LPS）鼠源IFN-γ吉爾生化（上海）有限公司美國sigma公司PeproTech公司CD86-PE抗體CD11c-APC抗體北京博奧森生物技術有限公司北京博奧森生物技術有限公司溶液配制1.LB液體培養(yǎng)基配方（100mL）：分別稱取0.5g酵母提取物、1g胰蛋白胨、1gNaCl，溶于蒸餾水并定容至10mL，121℃下高壓蒸汽滅菌30min。2.卡那霉素儲存液（50mg/mL）：取0.5g卡那霉素溶于10mLddH2O，使用0.45μm濾頭過濾除菌后，將溶液分裝于1.5mLEP管中，封口膠封好做好標記，存放于-20℃冰箱。3.氨芐青霉素儲存液（50mg/mL）：稱取0.5g氨芐青霉素溶于10mLddH2O，使用0.45μm濾頭過濾除菌后，將溶液分裝于1.5mLEP管中，封口膠封好做好標記，存放于-20℃冰箱。4.IPTG溶液（儲存液1mol/L，終濃度1mmol/L）：2.383gIPTG溶于8mLddH2O中，用膠頭滴管加入ddH2O定容至10mL，過濾除菌，分裝成1mL，-20℃保存。5.50mmol/LTris溶液（1L）：稱取6.057gTris固體于500mL燒杯中，加蒸餾水溶解定容至1L。經(jīng)高溫滅菌后，將其貯存于4℃冰箱中。6.細胞裂解緩沖液（500mL）：稱取0.146gEDTA和1.514gTris溶于250mLTris溶液（50mmol/L）中，并加入5mLTritonX-100，滴加HCl調(diào)節(jié)pH為8.0，最后加蒸餾水定容至500mL。7.包涵體洗滌液A的配方：將TritonX-100溶于25mmoL/LTris-HCl(pH=8.0)中使其終濃度為0.5%。8.包涵體洗滌液B的配方：將尿素溶于25mmoL/LTris-HCl(pH=8.0)使其終濃度為2moL/L。9.包涵體溶解液的配方：將尿素溶于25mmoL/LTris-HCl，(pH=8.8)使其終濃度為8moL/L，添加β-巰基乙醇至終濃度為1%。10.2%的NaHCO3和1mol/L的EDTA2Na混合液（300mL，pH=8.0）：稱0.504gNaHCO3和111.672gEDTA2Na，加入約270mL蒸餾水溶解，pH計調(diào)節(jié)pH=8.0，加入蒸餾水定容至300mL。11.1mmoL/L的EDTA2Na（300mL，pH=8.0）：稱0.1167gEDTA2Na，加入約270mL蒸餾水溶解，pH計調(diào)節(jié)pH=8.0，加入蒸餾水定容至300mL。12.25mmoL/LTris-HCl緩沖液（2L，pH=8.74）：稱6.057gTris，加入約1.5L蒸餾水溶解，pH計調(diào)至pH=8.74，加入蒸餾水定容至2L。13.6moL/L尿素溶液（250mL）：稱取90.09g尿素，溶于125mL50mmoL/LTris溶液中，調(diào)節(jié)pH為8.8，蒸餾水定容至250mL。14.500mmoL/LNaCl緩沖液（100mL）：稱2.922gNaCl，溶于50mL50mmoL/LTris-HCl緩沖液中，調(diào)節(jié)pH為8.8，并用蒸餾水定容至100mL。15.300mmoL/LNaCl緩沖液（50mL）：量取30mL500mmoL/LNaCl緩沖液，加蒸餾水定容至50mL。16.200mmoL/LNaCl緩沖液（50mL）：量取20mL500mmoL/LNaCl緩沖液，加蒸餾水定容至50mL。17.150mmoL/LNaCl緩沖液（50mL）：量取15mL500mmoL/LNaCl緩沖液，加蒸餾水定容至50mL。18.100mmoL/LNaCl緩沖液（50mL）：量取10mL500mmoL/LNaCl緩沖液，加蒸餾水定容至50mL。19.50mmoL/LNaCl緩沖液（50mL）：量取5mL500mmoL/LNaCl緩沖液，加蒸餾水定容至50mL。20.20mmoL/LNaCl緩沖液（50mL）：量取2mL500mmoL/LNaCl緩沖液，加蒸餾水定容至50mL。21.15mmoL/LNaCl緩沖液（50mL）：量取1.5mL500mmoL/LNaCl緩沖液，加蒸餾水定容至50mL。22.10mmoL/LNaCl緩沖液（50mL）：量取1mL500mmoL/LNaCl緩沖液，加蒸餾水定容至50mL。23.5mmoL/LNaCl緩沖液（50mL）：量取0.5mL500mmoL/LNaCl緩沖液，加蒸餾水定容至50mL。24.500mmoL/L咪唑緩沖液（150mL）：稱取5.106g咪唑，溶于75mL50mmoL/LTris-HCl緩沖液中，調(diào)節(jié)pH為8.8，并用蒸餾水定容至150mL。25.400mmoL/L咪唑緩沖液（50mL）：量取40mL500mmoL/L咪唑緩沖液，加蒸餾水定容至50mL。26.200mmoL/L咪唑緩沖液（50mL）：量取20mL500mmoL/L咪唑緩沖液，加蒸餾水定容至50mL。27.100mmoL/L咪唑緩沖液（50mL）：量取10mL500mmoL/L咪唑緩沖液，加蒸餾水定容至50mL。28.50mmoL/L咪唑緩沖液（50mL）：量取5mL500mmoL/L咪唑緩沖液，加蒸餾水定容至50mL。29.20mmoL/L咪唑緩沖液（50mL）：量取2mL500mmoL/L咪唑緩沖液，加蒸餾水定容至50mL。30.1×電泳緩沖液：稱取Tris15.1g、Glycine94g、SDS5g加入約800ml去離子水，溶解攪拌，最終加去離子水定容至1L配成5×電泳緩沖液，用時則按去離子水：5×電泳緩沖液=4：1配成1×電泳緩沖液，室溫保存。31.染色液：1g考馬斯亮藍R-250溶解于450mL甲醇和100mL冰醋酸的混合溶液中，蒸餾水定容至1L。32.脫色液：100mL乙醇、100mL冰醋酸、加蒸餾水定容至1L。33.1.5mol/LTris-HCl（pH=8.8）：45.43gTris溶于200mL蒸餾水，用1mol/LHCl調(diào)pH至8.8，最后用蒸餾水定容至250mL,室溫保存即可。34.0.5mol/LTris-HCl（pH=6.8）：15.14gTris溶于200mL蒸餾水，用1mol/LHCl調(diào)pH至6.8，最后用蒸餾水定容至250mL,室溫保存。35.10%SDS:10gSDS，加蒸餾水100ml，50℃水浴助溶，室溫保存。36.10%AP（過硫酸銨）：(現(xiàn)配現(xiàn)用，一周之內(nèi)使用，根據(jù)實際情況重新配置)0.1g過硫酸銨粉末，溶于1mL蒸餾水，置于EP管中4℃保存。37.30%丙烯酰胺混合液:29g丙烯酰胺、1g甲叉雙丙烯酰胺，加蒸餾水定容至100mL（微熱攪拌）4℃保存。38.配制SDS%分離膠（一塊膠，約5mL）：水1mL、30%丙烯酰胺混合液2mL、1.5mol/LTris-HCl(pH=8.8)1.9mL、10%SDS0.05mL、10%AP0.05mL、TEMED0.002mL，混合均勻。39.配制SDS%積層膠膠（一塊膠，約2mL）：水1.4mL、30%丙烯酰胺混合液0.33mL、0.5mol/LTris-HCl(pH=6.8)0.25mL、10%SDS0.02mL、10%AP0.02mL、TEMED0.002mL，混合均勻。40.配制Native%分離膠（一塊膠，約5mL）：水1mL、30%丙烯酰胺混合液2mL、1.5mol/LTris-HCl(pH=8.8)1.9mL、10%SDS0.05mL、10%AP0.05mL、TEMED0.002mL，混合均勻。41.配制Native%積層膠（一塊膠，約2mL）：水1.4mL、30%丙烯酰胺混合液0.33mL、1.5mol/LTris-HCl(pH=8.8)0.25mL、10%SDS0.02mL、10%AP0.02mL、TEMED0.002mL，混合均勻。42.BCA工作液（5.1mL）：量取5mLBCA試劑A和100μL試劑B混合均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。43.完全培養(yǎng)基配方：基礎培養(yǎng)基RPMI-1640：FBS：青鏈霉素混合液=90:10:1。44.20μg/mL（CTB-PAMA624-632）5：打開前需離心，用無菌水稀釋至蛋白濃度20μg/mL。45.20μg/mLCTB-PAMA624-632和mGM-CSF-CTA2的混合溶液：將兩種重組蛋白以摩爾比1:1混合，并用無菌水稀釋至蛋白濃度20μg/mL。46.20μg/mLPSMA624-632：用無菌水溶解混勻配成終濃度為20μg/mL的溶液，用0.22μm濾膜過濾除菌，保存在-20℃。47.20μg/mL嵌合蛋白：打開前需離心，用無菌水稀釋至蛋白濃度20μg/mL。48.10μg/mLmGM-CSF：用無菌水溶解混勻配成終濃度為20μg/mL的溶液，用0.22μm濾膜過濾除菌，保存在-20℃。49.20μg/mLmIL-4：用無菌水溶解混勻配成終濃度為20μg/mL的溶液，用0.22μm濾膜過濾除菌，保存在-20℃。50.20μg/mLLPS：用無菌水溶解混勻配成終濃度為20μg/mL的溶液，用0.22μm濾膜過濾除菌，保存在-20℃。51.20μg/mLIFN-γ：用無菌水溶解混勻配成終濃度為20μg/mL的溶液，用0.22μm濾膜過濾除菌，保存在-20℃。實驗儀器表STYLEREF1\s2.SEQ表\*ARABIC\s111本實驗所用儀器儀器名稱廠商型號電子天平梅特勒-托利多集團ME204E加熱磁力攪拌器德國IKA集團IKAC-MAGHS4超凈工作臺AIRTECH蘇凈集團安泰公司制造AIRTECH上海申安立式滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠LDZX-50KBS海信雙層冰箱海信（北京）電器有限公司BCD-251H-80℃超低溫保存箱深圳市科力易翔儀器設備有限公司DW-86L828恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智城分析儀器制造有限公司ZWY-211C手動可調(diào)式移液槍大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司MicroPette托盤天平東莞市東旺化玻儀器有限公司馬頭牌500g大容量高速冷凍離心機湘儀離心機儀器有限公司GL-10MDPH試紙梅特勒-托利多集團—基礎電源小型垂直電泳槽倒置熒光顯微鏡MolecjiLarDevices酶標儀二氧化碳培養(yǎng)箱美國BIO-RAD伯樂公司美國BIO-RAD伯樂公司OLYMPUS美谷分子儀器（上海）有限公司賽默飛世爾科技有限公司164-5052—IX71MultiskanFCMidi40立式單門層析冷柜邢臺潤聯(lián)科技開發(fā)有限公司—核酸蛋白檢測儀上海嘉誠生物科技有限公司—雙門生物冷柜上海金達生化儀器有限公司LG-2蠕動泵上海金達生化儀器有限公司—親和層析柱北京索萊寶科技有限公司—

實驗方法重組蛋白CTB-PAMA624-632和mGM-CSF-CTA2的表達純化CTB-PSMA624-632的氨基酸序列如下：MTPQNITDLCAEYHNTQIYTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGAIFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMANASGGTYSVSFDSLLEHHHHHHmGM-CSF-CTA2的氨基酸序列如下：MAPTRSPITVTRPWKHVEAIKEALNLLDDMPVTLNEEVEVVSNEFSFKKLTCVQTRLKIFEQGLRGNFTKLKGALNMTASYYQTYCPPTPETDCETQVTTYADFIDSLKTFLTDIPFECKKPSQKDPTGGASEFELGGGGSMSNTCDEKTQSLGVKFLDEYQSKVKRQIFSGYQSDIDTHNRIKDELVDGRKKRRQRRRPPQLEHHHHHH在CTB-PSMA624-632的氨基酸序列中，粗體字母代表CTB序列，ASGG為連接序列，下劃線部分為PSMA624-632序列。在mGM-CSF-CTA2的氨基酸序列中，粗體字母代表mGM-CSF序列，GGGGS為連接序列，下劃線部分為CTA2序列。經(jīng)由EXPASY（）網(wǎng)站中的ProtParam軟件，可以推算出mGM-CSF-CTA2的理論等電點為7.68，理論分子量為24052.17；CTB-PSMA624-632的理論等電點為6.74，理論分子量為14114.01。菌種的接種培養(yǎng)在超凈工作臺上分別往6支試管（7mL）加入7μL抗生素溶液（儲存液50mg/mL，終濃度50μg/mL）和10大腸桿菌菌液，將試管置于37℃的恒溫培養(yǎng)振蕩箱以200rpm轉(zhuǎn)速振蕩搖菌培養(yǎng)過夜12h。12h后試管有明顯渾濁，表明細菌正常增長。取出經(jīng)過夜培養(yǎng)的6支試管，在超凈工作臺上按2%的接種量轉(zhuǎn)接到含350μL抗生素溶液（儲存液50mg/mL，終濃度50μg/mL）的350mLLB液體培養(yǎng)基（錐形瓶）中，將6個錐形瓶置于37℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱以200rpm轉(zhuǎn)速振蕩搖菌培養(yǎng)4h。表達兩種重組蛋白的菌種在接種時的不同之處在于，CTB-PSMA624-632接種菌種為pET28a-CTB-PSMA624-632，加入的抗生素為卡那霉素；mGM-CSF-CTA2接種菌種為pET22b-GM-CSF-CTA2-TAT，加入的抗生素為氨芐青霉素。目的蛋白的誘導表達在錐形瓶中培養(yǎng)4h后，在超凈工作臺上分別往6個錐形瓶各加入350μLIPTG儲存液（儲存液1moL/L，終濃度約為1mmoL/L）誘導蛋白質(zhì)表達，置于37℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱以200rpm轉(zhuǎn)速振蕩搖菌培養(yǎng)5h。誘導前和誘導后需分別量取少量菌液作為后續(xù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品。濕菌體的收集與裂解IPTG誘導表達5h后，使用大容量高速冷凍離心機以溫度4℃，轉(zhuǎn)速10000rpm，和離心時間10min的參數(shù)離心收菌。收菌時每次均棄上清留沉淀。離心收菌完畢后，用刮刀將菌體刮下收集，并記錄重量，最后將上清培養(yǎng)基收集并于立式滅菌器滅菌。將濕菌體懸浮于裂解緩沖液中,根據(jù)以濕菌體1g：裂解緩沖液10mL的比例加入裂解緩沖液，加入溶菌酶適量（80μg/mL），加入攪拌子于加熱磁力攪拌器上攪拌至菌體完全懸浮。濕菌體懸浮均勻后放入-80℃超低溫保存箱凍至完全凝固，取出于37℃振蕩培養(yǎng)箱解凍至完全變成液體時再次放入-80℃超低溫保存箱凍完全凝固，取出于于37℃下完全解凍。如此反復多次至菌液不再粘稠即可判斷為凍融充分且完全。包涵體的洗滌與溶解將裂解后的菌體以4℃，10000rpm，15min的參數(shù)離心。收集包涵體沉淀，并以每克包涵體濕重加入10mL包涵體洗滌液，在加熱磁力攪拌器上使沉淀重新懸浮均勻30min后，以參數(shù)：4℃、10000r/min、15min離心，棄上清；稱量剩下的沉淀重量，重復以上步驟多次至沉淀質(zhì)量變化差異不大。本實驗使用包涵體洗滌液A洗滌3次、包涵體洗滌液B洗滌3次、蒸餾水洗滌2次，依次洗滌。最后，與前面步驟相同的參數(shù)離心收集沉淀待溶解。洗滌后的包涵體沉淀，按1g包涵體濕重：50mL8moL/L的尿素溶液（要溶解在Tris-HCl緩沖液中）的量添加，加入β巰基乙醇至終濃度為1%，使用加熱磁力攪拌器攪拌至少6小時。當沉淀重新溶解和懸浮于尿素溶液時，以4℃，10000rpm，20min的參數(shù)離心。收集所有上清并做好保存，棄沉淀。對裂解后的上清液、包涵體沉淀、洗滌之后離心的上清液和包涵體溶解后溶液留樣，以作后續(xù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。透析袋的活化將透析袋剪成15-20cm的小段。在約300mL的含2%（W/V）NaHCO3和1mol/LEDTA2Na的溶液（pH8.00）中將透析袋煮沸10min。然后用蒸餾水徹底清洗透析袋，即反復浸泡、沖洗后，再在300mL的1mmol/L的EDTA2Na（pH8.00）中將之煮沸10min。待其冷卻后，置于30%或50%的酒精中，放于4℃冰箱中保存，必須確保透析袋始終浸泡在溶液中。注意：使用前后要用蒸餾水將透析袋里里外外清洗干凈；透析袋的取用要戴手套，以免皮屑等大分子堵塞透析袋。另外，透析袋一定不能干。重組蛋白透析復性活化透析袋后，使用前用去離子水將透析袋里里外外清洗干凈。將溶解后的蛋白置于透析袋中透析復性，透析外液依次為6、4、2、1、0.5和0mol/L的尿素溶液，0mol/L時可以透析至少3次，每隔8h換一次液。透析于4℃的層析柜中進行，外液中需加攪拌子不斷攪拌。若蛋白不能夠正確的折疊有沉淀生成，可加入還原/氧化型谷光氨肽至終濃度為1mmoL/L和0.1mmoL/L輔助蛋白復性。最后將復性后的蛋白收集保存于4℃冰箱中，待下一步操作。重組蛋白層析純化裝柱：將填料裝入合適的層析柱，同時打開核酸蛋白檢測儀預熱30min，調(diào)好蠕動泵（最終rpm3.2，靈敏度1.0A，調(diào)整基線為0.01）。平衡：檢查層析柱密閉性良好，若良好對填料進行平衡，一般用10倍填料體積的平衡緩沖液洗（或平衡緩沖液洗一晚），以除去填料中的氣泡和乙醇。（注意平衡要使基線數(shù)值達到穩(wěn)定并保持一段時間30min，才說明已經(jīng)平衡好了）；上樣：調(diào)節(jié)流速，30-60mL/h左右，將10mL樣品加入層析柱開始過柱子；平衡：上樣完畢，用平衡緩沖液洗滌（為了接出管路中殘留的目的樣品），待峰值穩(wěn)定，再繼續(xù)用平衡緩沖液使其重新平衡最終差不多達到原來基線（注意這里的平衡溶液與前面平衡所用的溶液應一致）；洗脫、收集出峰蛋白：一般用5倍于組氨酸標簽凝膠的洗脫緩沖液梯度洗脫，通過核酸蛋白檢測儀觀察基線的變化，每當出現(xiàn)較為突出的峰值時接樣并做好標注（實際由于第一次接觸可能不清楚何時會出峰，所有流出液都可以接，然后經(jīng)過后期電泳結(jié)果進行判斷）；平衡：待梯度洗脫完成后，平衡緩沖液洗滌待數(shù)值穩(wěn)定；數(shù)值穩(wěn)定后換用蒸餾水沖洗（可調(diào)快流速）充分清洗填料，將填料置于20%乙醇中4℃保存；關閉儀器，清洗柱子，整理實驗用品。兩種重組蛋白層析純化步驟基本相同。但CTB-PAMA624-632所用填料為DEAE-纖維素，洗脫緩沖液為含不同濃度NaCl的Tris-HCl緩沖液（25mmol/L，pH8.8），洗脫濃度為5、10、15、20、50、100、150、200、300mmol/L；mGM-CSF-CTA2所用填料為組氨酸標簽凝膠，洗脫緩沖液為含不同濃度咪唑的Tris-HCl緩沖液（25mmol/L，pH8.8），洗脫濃度為20、50、100、200、400、500mmol/L。重組蛋白除鹽凍干將經(jīng)層析純化的蛋白置于活化后的透析袋中除鹽，透析袋外液為去離子水，主要是通過滲透作用，讓蛋白溶液濃度中鹽等小分子從透析袋微孔中出來，從而達到除鹽的作用。一般每間隔8h更換一次外液，共更換兩次外液。若蛋白的等電點與去離子水相近，蛋白容易沉淀析出，可多次更換外液，適當縮短單次透析時長，也可達到同樣的效果。除鹽后的蛋白溶液分裝于玻璃培養(yǎng)皿中，在-80℃預凍12h后冷凍干燥。收集冷凍干燥好的蛋白，-20℃保存。BCA蛋白定量蛋白質(zhì)標準品的處理：用ddH2O將蛋白質(zhì)標準品稀釋至0.5mg/mL，將0.5mg/mL的標準品按0μL、1μL、2μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL加入96孔板中，再加ddH2O補足至20μL，即每孔中的蛋白濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ng/mL，每孔中加入200μLBCA工作液。待測樣品的配制處理：把10μL待測樣品加入96孔板中，加ddH2O補足至20μL，每孔中加入200μLBCA工作液。把96孔板放置于37℃恒溫箱中20~30分鐘。濃度測定：使用酶標儀在A562下測定吸光值，繪制蛋白質(zhì)濃度與吸光值的標準曲線，根據(jù)待測樣品的吸光值計算蛋白的濃度。重組蛋白CTB-PAMA624-632和mGM-CSF-CTA2的表達鑒定十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，簡稱SAS)，是聚丙烯酰胺凝膠電泳中最常見的一種蛋白表達分析技術，其原理是根據(jù)上樣蛋白分子量大小的不同，使其在電泳膠中分離。清洗設備：對電泳需要的玻璃板和電泳槽等實驗儀器進行清洗，并用蒸餾水潤洗干凈，晾干備用。灌膠（12%分離膠、5%濃縮膠）：檢漏：將帶凹槽的長玻璃板和短玻璃板底端對齊后放入灌膠支架內(nèi)固定（短玻璃板朝外），向兩塊玻璃板之間的間隙加入去離子水，靜置1min，觀察是否漏液（即觀察頁面是否下降）。若漏液，需重新將兩塊玻璃板取出，重復以上操作直至液面不再下降；如排除漏液，則可倒去去離子水，凹槽內(nèi)殘余水分可用濾紙吸干或吹風機冷風吹干。灌12%分離膠：按照配方配制12%分離膠，混合均勻后用1mL移液槍快速往兩塊玻璃間的間隙灌膠至一定高度，之后灌入適量蒸餾水進行液封，可使分離膠凝聚得更迅速。灌5%積層膠：待上步驟中的分離膠凝固（水層下面有一清晰的界面）后倒掉液封用的蒸餾水，配制好5%積層膠后迅速灌進兩塊玻璃板的間隙至短玻璃板的高度，插入樣梳。積層膠凝固過程中體積會縮小，可對其進行補膠操作。待積層膠凝固后拔掉梳子。樣品處理：前面實驗步驟中所留樣品均做處理。沉淀樣品：取適量沉淀加入40μLddH2O和10μL5×SDS蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液混懸均勻，置于沸水浴中加熱5min使蛋白變性。最后用小型冷凍離心機12000rpm離心2min。溶液樣品：取40μL液體樣品和10μL5×SDS蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液混懸均勻，置于沸水浴中加熱5min使蛋白變性。最后用小型冷凍離心機12000rpm離心2min。上樣：將制備好的電泳凝膠放置到電泳槽中，向電泳槽中加入適量的1×電泳緩沖液（電泳緩沖液需沒過凝膠）。用微量移液槍吸取處理好的樣品上清各5μL加入到加樣孔中上樣，另外，吸取3μLMarker作為標準樣品上樣。每次上樣均需更換槍頭。電泳：蓋上電泳槽蓋，注意正負極不要接反。電泳時間一般為2~3h，開始以45V電壓電泳30min，之后以80V電壓電泳至上樣緩沖液中的溴酚藍染液跑到玻璃板底部。切膠：將玻璃板從電泳槽中取出，用切膠塑料片多次輕撬短玻璃板，將其和帶凹槽的長玻璃板分開。輕輕將短玻璃板和膠分離（分離時一定要溫和，避免把膠弄爛），用清水緩緩地將貼在板上的分離膠沖入儲存盒中，清水洗兩次，蒸餾水洗兩次，最后將水倒干。染色：向干凈的儲存盒中加入染色液至沒過凝膠，將儲存盒放置在搖床上搖染1~2h。染色液可回收利用。脫色：往儲存盒中加入脫色液至沒過凝膠，搖床搖染2h，每隔1h更換一次脫色液。嵌合蛋白的制備及鑒定酸堿變復性獲得嵌合蛋白將除鹽凍干后的CTB-PAMA624-632和mGM-CSF-CTA2進行BCA蛋白定量后，以摩爾比1:1混合，再緩慢加入1/10體積的0.5M的檸檬酸調(diào)節(jié)pH為2.3，23℃變性20min。最后，加入2mol/L的Tris溶液調(diào)節(jié)pH為8.5，4℃復性48h，得到嵌合蛋白mGM-CSF-CTA2-TAT/（CTB-PSMA）5。BCA蛋白定量實驗方法同3.1.9所述。首先對蛋白質(zhì)標準品進行處理，用ddH2O將蛋白質(zhì)標準品稀釋至0.5mg/mL，將0.5mg/mL的標準品按0μL、1μL、2μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL加入96孔板中，加入ddH2O補足至20μL，再在每孔中加入200μLBCA工作液。然后，把10μL嵌合蛋白溶液加入96孔板中，加ddH2O補足至20μL后，每孔中加入200μLBCA工作液。將96孔板放置于37℃恒溫箱中20~30分鐘后，使用酶標儀測定A562，繪制蛋白質(zhì)濃度與吸光值的標準曲線，根據(jù)待測樣品的吸光值計算蛋白的濃度。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native）或稱為活性電泳是在不加入SDS和疏基乙醇等變性劑的條件下，對保持活性的蛋白質(zhì)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于酶的鑒定、同工酶分析和提純。Native與前述SDS（3.2）在積層膠和分離膠的配方以及樣品的處理有所不同。Native是將變性劑SDS換成水，積層膠和分離膠均采用pH=8.8的Tris-HCl，上樣時，用2×nativeloadingbuffer與樣品直接混勻，無需煮沸，直接上樣即可。其余實驗步驟基本一致：首先以45V電壓跑30min，再以80V電壓跑1.5-2.0h。至溴酚蘭跑至底部剛越過綠色橡膠墊時即可終止電泳。將膠從電泳槽中取出，用切膠塑料片多次輕輕撬短玻璃板，將其和帶凹槽的長玻璃板分開，輕輕將短玻璃板和膠分離，用切膠塑料片切除濃縮膠，用清水緩緩地將貼在板上的分離膠沖入儲存盒中，清水洗兩次，蒸餾水洗兩次，最后將水倒干。向儲存盒中加入稍多的染色液沒過膠，放置在搖床上搖染1-2h。脫色需要2h，搖1h換一次脫色液。總共需兩次脫色液脫色。小鼠骨髓細胞分離與培養(yǎng)DC細胞在人和動物體內(nèi)的含量極少，要對其進行研究需要足夠數(shù)量的細胞，單單依靠從不同組織和器官中分離獲得是不足夠的。1994年，Romani等[9]建立了體外誘導培養(yǎng)技術，應用GM-CSF、IL-4和TNF-α等聯(lián)合體外誘導培養(yǎng)小鼠DC。研究表明，應用GM-CSF和IL-4聯(lián)合誘導培養(yǎng)對小鼠DC的擴增效果最好。小鼠骨髓細胞的分離將C57BL/6雄性小鼠頸椎脫臼法處死之后，浸沒于75%乙醇5min，然后取出小鼠在無菌的環(huán)境下剪開腹部皮膚至背部皮膚，用手剝離兩下肢的皮膚。尋找股骨頭，往上用手術剪剪開髂關節(jié)，往下在腳踝處剪斷，剝離完整的下肢。用鑷子剔盡骨頭上的肌肉和軟組織，剪開膝關節(jié)使股骨與脛骨分離（注意不要破壞骨髓腔的完整性），將剔干凈的股骨和脛骨浸沒在裝有75%乙醇的無菌培養(yǎng)皿中。將股骨和脛骨轉(zhuǎn)移到含有適量RPMI-1640基礎培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)皿中，無菌手術剪剪開骨兩端，用1mL注射器吸取RPMI-1640基礎培養(yǎng)基從骨端插入骨髓腔，沖出骨髓細胞，每根長骨反復沖洗直至骨髓腔呈白色透明狀。將細胞液通過200目濾網(wǎng)過濾，收集到離心管中，1200rpm/min離心5min。離心后丟棄上清，加入3~5倍的紅細胞裂解液室溫作用2min左右，然后1200rpm/min離心5min，棄上清，再加入5倍細胞體積的無菌PBS重懸沉淀，1000rpm離心2~3分鐘，棄上清，洗滌1~2次。小鼠骨髓細胞的培養(yǎng)洗滌完細胞之后，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞，使其成為細胞懸液。將細胞懸液鋪于6孔板中，每孔加入2mL細胞懸液、2μLmGM-CSF（10ng/μL）和2μLmIL-4（10ng/μL），輕輕搖勻。然后把細胞板置于37℃，含有5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72h之后，輕輕晃動細胞板，將孔中的培養(yǎng)液和懸浮細胞全部吸去，僅保留貼壁細胞。加入等量新鮮的RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%FBS、1%雙抗、mGM-CSF（10ng/mL）、mIL-4（10ng/mL）），在相同的環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，往后隔天半量換液。收集培養(yǎng)到第7天的DCs，離心，棄上清，重懸細胞并進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為7.5-10×106個/mL。重新接種于6孔板中，待下一步試驗。成熟DC的誘導表達與鑒定刺激誘導為成熟DC向重新接種的6孔板中加入不同蛋白抗原，以刺激骨髓源DC成為成熟DC，共分為5個實驗組。實驗組1：向6孔板中分別加入終濃度為200ng/mL的嵌合蛋白mGM-CSF-CTA2-TAT/（CTB-PSMA）5、LPS和IFN-γ。實驗組2：向6孔板中分別加入終濃度為200ng/mL的（CTB-PSMA624-632）5、LPS和IFN-γ。實驗組3：向6孔板中分別加入終濃度為200ng/mL的（CTB-PSMA624-632）5和mGM-CSF-CTA2的混合溶液、LPS和IFN-γ。實驗組4：向6孔板中分別加入終濃度為200ng/mL的PSMA624-632、LPS和IFN-γ。實驗組5（空白組）：不加抗原，不加誘導劑LPS和IFN-γ。然后將細胞板置于37℃，含有5%CO2培養(yǎng)箱中，誘導培養(yǎng)36h。小鼠骨髓源樹突狀細胞的形態(tài)觀察在細胞培養(yǎng)期間，應用熒光倒置顯微鏡對小鼠骨髓源性DC形態(tài)變化進行觀察并拍照。流式細胞術檢測樹突狀細胞表面標志輕輕吹打收集各組懸浮細胞和疏松貼壁的細胞，以1000rpm離心10min，用4℃的PBS洗滌2次后重懸細胞，細胞計數(shù)調(diào)整細胞濃度為106個/mL。加入終濃度為2.5μg/mL的APC標記的CD11c抗體和按1:100的比例加入的PE標記的CD86抗體，輕輕吹打混勻，4℃避光孵育30min，PBS洗滌細胞2次，1000rpm，5min離心，棄上清。最后加入100-300μLPBS重懸細胞，利用流式細胞儀檢測純度與表型，應用軟件IDEAS6.2分析數(shù)據(jù)。

實驗結(jié)果與討論重組蛋白CTB-PAMA624-632和mGM-CSF-CTA2的表達純化與鑒定重組蛋白CTB-PAMA624-632和mGM-CSF-CTA2的表達純化菌種接種培養(yǎng)12h進行擴大培養(yǎng)，試管中的培養(yǎng)基由澄清變渾濁，表明細菌正常增長。加入誘導劑誘導目的蛋白表達后，收集到濕菌體約8g。利用洗滌A液、B液和蒸餾水對包涵體蛋白進行洗滌后，獲得包涵體重量約2.3g。對重組蛋白進行透析復性以及除鹽時，有蛋白小顆粒出現(xiàn)，但是沒有大面積出現(xiàn)蛋白絮狀沉淀，說明重組蛋白天然構(gòu)象和生物活性恢復良好。重組蛋白CTB-PAMA624-632和mGM-CSF-CTA2的鑒定經(jīng)軟件分析，重組蛋白CTB-PAMA624-632的分子量理論值應為14kDa，重組蛋白mGM-CSF-CTA2的分子量理論值應為24kDa。對誘導后全菌、裂解后沉淀、裂解后上清、洗滌后上清、透析復性后蛋白溶液和層析純化后蛋白溶液進行SDS，以檢驗目的蛋白的表達。結(jié)果如圖，泳道1在14kDa和24kDa處分別有明顯的目的條帶，證明目的蛋白成功表達。泳道2和泳道3為裂解的沉淀和上清，由圖可知，目的蛋白主要以包涵體沉淀形式存在，上清溶液中幾乎沒有目的蛋白存在。泳道4為洗滌后上清溶液，表明洗滌液能很好的洗掉雜蛋白，而不損失目的蛋白。將泳道2、5和6進行對比，可知，對包涵體進行洗滌能夠洗掉絕大部分的雜蛋白，進行層析純化后，重組蛋白CTB-PAMA624-632的蛋白溶液基本上沒有雜蛋白的存在了，但重組蛋白mGM-CSF-CTA2的蛋白溶液中還有少量的雜蛋白。注：泳道1：誘導后蛋白沉淀；泳道2：裂解沉淀；泳道3：裂解上清；泳道4：洗滌上清；泳道5：透析復性后蛋白溶液；泳道6：過柱純化后的蛋白溶液；（左為CTB-PSMA624-632；右為mGM-CSF-CTA2-TAT）圖STYLEREF1\s4.SEQ圖\*ARABIC\s11兩種重組蛋白SDS結(jié)果嵌合蛋白的制備與鑒定將BCA蛋白定量后的重組蛋白CTB-PSMA624-632和mGM-CSF-CTA2以摩爾比1:1進行酸堿變復性處理，得到嵌合蛋白mGM-CSF-CTA2-TAT/（CTB-PSMA）5，并對其進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，以marker和重組蛋白CTB-PSMA624-632作為參照。重組蛋白CTB-PSMA624-632復性后以五聚體的結(jié)構(gòu)存在，理論分子量為70kDa；而嵌合蛋白是兩種重組蛋白以非共價鍵連接而成，其理論分子量為94kDa。由圖4.2可知，重組蛋白CTB-PSMA624-632和嵌合蛋白均恢復其天然構(gòu)象和生物活性。泳道1：(CTB-PSMA624-632)5；泳道2：嵌合蛋白圖STYLEREF1\s4.SEQ圖\*ARABIC\s12嵌合蛋白的Native結(jié)果BCA蛋白定量CTB-PAMA624-632和mGM-CSF-CTA2對重組蛋白CTB-PAMA624-632和mGM-CSF-CTA2進行BCA蛋白定量，測得BCA蛋白標準品的濃度和吸光度關系如表4.1表STYLEREF1\s4.SEQ表\*ARABIC\s11蛋白標準品的濃度和吸光度關系表標準品濃度（mg/mL）00.0250.00.40.5OD5620.0770.1270.1700.2400.3890.5090.6310.761利用數(shù)據(jù)點繪圖并進行線性擬合（如圖4.3），計算得標準曲線為：A=1.3469c+0.0978其中A為吸光度；c為蛋白溶液濃度，單位為mg/mL。算出其R2為0.9973。圖STYLEREF1\s4.SEQ圖\*ARABIC\s13BCA法測定蛋白濃度標準曲線圖1標準曲線R2=0.9973接近于1，曲線擬合效果較好，誤差較小。實驗所測蛋白樣品濃度為稀釋一倍后的濃度，因此根據(jù)標準曲線方程計算出蛋白濃度為實際蛋白濃度的一半。測得重組蛋白CTB-PAMA624-632的吸光度A為1.2830，計算得其實際濃度為1.76mg/mL；測得重組蛋白mGM-CSF-CTA2的吸光度A為0.4884，計算得其實際濃度為0.58mg/mL。嵌合蛋白對嵌合蛋白mGM-CSF-CTA2-TAT/（CTB-PSMA）5進行BCA蛋白定量，測得蛋白標準品的濃度和吸光度關系如表4.2。表STYLEREF1\s4.SEQ表\*ARABIC\s12蛋白標準品的濃度和吸光度關系表標準品濃度（mg/mL）00.0250.00.40.5OD5620.0900.1250.1580.2140.3080.4160.5280.610利用數(shù)據(jù)點繪圖并進行線性擬合（如圖4.4），計算得標準曲線為：A=1.0405c+0.1013其中A為吸光度；c為蛋白溶液濃度，單位為mg/mL。算出其R2為0.9982。圖STYLEREF1\s4.SEQ圖\*ARABIC\s14BCA法測定蛋白濃度標準曲線圖2標準曲線R2=0.9982接近于1，曲線擬合效果較好，誤差較小。計算實際蛋白濃度原理如前所述（4.3.1）測得嵌合蛋白mGM-CSF-CTA2-TAT/（CTB-PSMA）5的吸光度A為0.4089，計算得其濃度為0.59mg/mL。小鼠骨髓源樹突狀細胞的形態(tài)學觀察用熒光倒置顯微鏡分別觀察第0天、第5天和第9天的DC形態(tài)，結(jié)果如4.5所示。將從小鼠骨髓中提取的髓樣DC接種到細胞板時，細胞呈懸浮狀態(tài)，可見細胞呈圓形，形態(tài)規(guī)則；培養(yǎng)到第5天時，可觀察到已有部分細胞表面呈毛刺狀樹突。此時的細胞密度與之前（第0天）相比，細胞密度明顯增加，細胞應當為半貼壁生長；培養(yǎng)至第9天（加入蛋白、LPS和IFN-γ誘導36h），細胞形成集落并且周圍有長毛刺狀樹突，為DC成熟的表現(xiàn)。圖STYLEREF1\s4.SEQ圖\*ARABIC\s15小鼠骨髓源樹突狀細胞形態(tài)學觀察結(jié)果樹突狀細胞表面共刺激表達分子的鑒定小鼠骨髓源DC表面特異性的標志為CD11c，通過測定CD11c可將其與其他細胞區(qū)分開。DC在成熟和未成熟時表面共刺激分子（如CD86）的表達水平是不同的，通過測定CD86的表達水平可得知DC的成熟度。本實驗通過APC標記的CD11c抗體和PE標記的CD86抗體結(jié)合DC表面標志，通過流式細胞術檢測，應用IDEAS6.2分析并計算DC的成熟度（高表達CD86的DC與低表達CD86的DC比例，見圖4.6）。5個實驗組的DC成熟度依次為89.9%、81.3%、78.6%、64.8%、51.5%。結(jié)果表明，實驗組1的DC成熟度要高于其他所有實驗組，說明基于霍亂毒素AB5結(jié)構(gòu)設計的前列腺特異性膜抗原有更好的免疫原性，能更好的被呈遞給未成熟的DC，并誘導使其成熟；實驗組3的DC成熟度要低于實驗組1和實驗組2，可能是因為加入的終濃度為200ng/mL的兩個重組蛋白的混合溶液，實際上每種蛋白溶液都被稀釋了一倍，蛋白濃度減半，導致誘導效果不如實驗組1和2。但是實驗組1、2、3的誘導效果均優(yōu)于實驗組4。圖STYLEREF1\s4.SEQ圖\*ARABIC\s16樹突狀細胞表面共刺激表達分子的鑒定結(jié)果

中空纖維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的設計前面已在6孔細胞板上對小鼠骨髓源DC進行培養(yǎng)誘導，于體外證實嵌合蛋白擁有更好的免疫原型，但需要進一步證實實驗的可重復性，設計中空纖維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)更好地模擬動物體內(nèi)環(huán)境以獲得更多的細胞，減少培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)所消耗的時間。原理在動植物體內(nèi)，細胞能夠沿三維空間的各個方向增殖、生長、形成組織。而組織中的細胞密度可達到109細胞/mL，且能長期穩(wěn)定的進行生命活動。目前實驗室常用的細胞培養(yǎng)方法多為單層靜止培養(yǎng)，該法培養(yǎng)細胞只能形成單層致密細胞，既無法沿著三維空間生長，也無法形成高密度的培養(yǎng)物，細胞密度最高為106/mL。為了獲得更高密度的細胞，也盡可能地在體外模擬體內(nèi)的情況以培養(yǎng)細胞，1972年Knazek等設計并制造了小型中空纖維細胞培養(yǎng)裝置，證實細胞能在中空纖維膜上形成類似組織的多層細胞。中空纖維是一種外形像纖維狀，具有自支撐作用的膜，直徑只有人的頭發(fā)絲般粗細（200μm)。其結(jié)構(gòu)和功能與體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中毛纖維相似，能形成易于細胞附著的多孔滲濾支撐，是最類似于活體內(nèi)的細胞生長方式。纖維膜的組成一般包括多種生物相容性材料，以提供細胞粘附其上的基質(zhì)和選擇透過性等。基本結(jié)構(gòu)中空纖維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)一般是由中空纖維生物反應器、培養(yǎng)基容器、供氧器和蠕動泵組成。各部分由硅橡膠管連接，形成回路。儲液瓶本設計中所用到的溶液主要為含有終濃度為10μg/mL的mGM-CSF和mIL-4的完全培養(yǎng)基（含90%RPMI-1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素溶液），同時需要接收反應器中排出的廢液，因此，至少需要2個儲液瓶。中空纖維生物反應器中