外源甲基紫精對鹽脅迫下黃瓜葉片抗氧化酶系統(tǒng)與DNA甲基化的調(diào)控機(jī)制研究一、引言1.1研究背景土壤鹽漬化是一個全球性的生態(tài)問題，嚴(yán)重影響著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)平衡。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計，全球鹽漬土面積約為9.5億公頃，占陸地面積的6%左右。在中國，鹽漬土面積達(dá)3470萬公頃，且分布廣泛，涵蓋了東北、華北、西北等多個地區(qū)。隨著全球氣候變化、灌溉農(nóng)業(yè)的發(fā)展以及不合理的農(nóng)業(yè)管理措施，土壤次生鹽漬化問題日益加劇，進(jìn)一步限制了可耕地資源的利用，對農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成了巨大威脅。鹽脅迫對植物的生長發(fā)育、生理生化過程產(chǎn)生多方面的負(fù)面影響。在生長方面，鹽脅迫會導(dǎo)致植物生長遲緩，抑制細(xì)胞分裂和伸長，使植株矮小、葉片變小、根系發(fā)育不良。從生理生化角度來看，高鹽環(huán)境破壞植物細(xì)胞的離子平衡，導(dǎo)致鈉離子（Na?）大量積累，鉀離子（K?）外流，從而干擾細(xì)胞內(nèi)正常的代謝反應(yīng)。鹽脅迫還會引起滲透脅迫，使植物細(xì)胞失水，造成生理干旱。鹽脅迫會誘導(dǎo)植物體內(nèi)活性氧（ROS）的積累，如超氧陰離子（O??）、過氧化氫（H?O?）和羥自由基（?OH）等，這些活性氧具有很強(qiáng)的氧化活性，能夠攻擊細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子，導(dǎo)致膜脂過氧化、蛋白質(zhì)變性、DNA損傷，進(jìn)而影響植物的正常生理功能。黃瓜（CucumissativusL.）作為一種重要的蔬菜作物，在全球范圍內(nèi)廣泛種植，是人們?nèi)粘ｏ嬍持胁豢苫蛉钡氖卟酥?。在中國，黃瓜的種植面積和產(chǎn)量均位居世界前列，設(shè)施栽培面積逐年增加。黃瓜對鹽脅迫較為敏感，土壤鹽漬化已成為制約黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)提升的重要因素之一。在設(shè)施栽培條件下，由于常年連作、過量施肥以及缺乏自然淋洗等原因，土壤次生鹽漬化問題尤為突出，導(dǎo)致黃瓜生長受到抑制，產(chǎn)量下降，果實(shí)品質(zhì)變差，嚴(yán)重影響了黃瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。研究鹽脅迫對黃瓜的影響機(jī)制以及尋找有效的緩解措施具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.2鹽脅迫對植物的危害鹽脅迫對植物的危害是多方面的，主要通過滲透脅迫、離子脅迫和氧化脅迫等機(jī)制影響植物的正常生長發(fā)育，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致植物死亡。在滲透脅迫方面，當(dāng)植物處于鹽漬環(huán)境中，土壤溶液中的鹽分濃度升高，導(dǎo)致土壤水勢降低。植物根系細(xì)胞與土壤溶液之間形成水勢差，使得根系吸水困難，甚至?xí)l(fā)生細(xì)胞內(nèi)水分外流的現(xiàn)象，導(dǎo)致植物出現(xiàn)生理性缺水。這種缺水狀態(tài)會影響植物細(xì)胞的膨壓，抑制細(xì)胞的伸長和分裂，進(jìn)而阻礙植物的生長。研究表明，在高鹽土壤中生長的植物，其根系生長受到顯著抑制，根系長度和根表面積明顯減小，根系活力降低，從而影響了植物對水分和養(yǎng)分的吸收能力。離子脅迫是鹽脅迫危害植物的另一個重要方面。高鹽環(huán)境中，土壤中鈉離子（Na?）和氯離子（Cl?）等有害離子大量積累。這些離子會通過植物根系的離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，打破細(xì)胞內(nèi)原有的離子平衡。過多的Na?會取代細(xì)胞內(nèi)的鉀離子（K?），干擾細(xì)胞內(nèi)依賴K?的酶促反應(yīng)和生理過程。高濃度的Cl?會對植物細(xì)胞的光合作用、呼吸作用等產(chǎn)生毒害作用，抑制相關(guān)酶的活性。過量的Na?和Cl?還會影響植物對其他礦質(zhì)元素如鈣（Ca2?）、鎂（Mg2?）、鐵（Fe3?）等的吸收和運(yùn)輸，導(dǎo)致植物出現(xiàn)礦質(zhì)營養(yǎng)失衡，進(jìn)一步影響植物的正常生長發(fā)育。氧化脅迫也是鹽脅迫對植物造成危害的關(guān)鍵機(jī)制之一。鹽脅迫會誘導(dǎo)植物體內(nèi)活性氧（ROS）的大量積累。ROS包括超氧陰離子（O??）、過氧化氫（H?O?）和羥自由基（?OH）等，它們具有很強(qiáng)的氧化活性。在正常生理條件下，植物細(xì)胞內(nèi)存在一套抗氧化防御系統(tǒng)，能夠維持ROS的產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡。但在鹽脅迫下，這種平衡被打破，ROS積累過多，會攻擊植物細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸，引發(fā)膜脂過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受損，透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲；攻擊蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)的氨基酸殘基發(fā)生氧化修飾，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活，影響細(xì)胞內(nèi)的代謝過程；攻擊DNA，導(dǎo)致DNA鏈斷裂、堿基突變等損傷，影響基因的正常表達(dá)和遺傳信息的傳遞。除了上述生理生化方面的影響，鹽脅迫還會對植物的光合作用、呼吸作用、激素平衡等產(chǎn)生負(fù)面影響。在光合作用方面，鹽脅迫會導(dǎo)致植物葉片的氣孔關(guān)閉，減少二氧化碳的進(jìn)入，同時影響光合色素的合成和穩(wěn)定性，降低光合電子傳遞效率和光合酶的活性，從而使光合作用受到抑制，光合產(chǎn)物積累減少，影響植物的生長和產(chǎn)量。在呼吸作用方面，鹽脅迫會改變呼吸代謝途徑，使呼吸速率異常，能量產(chǎn)生和利用效率降低。鹽脅迫還會打破植物體內(nèi)激素的平衡，如生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素等促進(jìn)生長的激素含量下降，而脫落酸、乙烯等抑制生長和促進(jìn)衰老的激素含量增加，進(jìn)而影響植物的生長、發(fā)育和衰老進(jìn)程。1.3鹽脅迫對植物抗氧化酶的影響1.3.1活性氧的產(chǎn)生與危害在正常生理條件下，植物細(xì)胞內(nèi)的代謝過程會產(chǎn)生活性氧（ROS），但由于細(xì)胞內(nèi)存在完善的抗氧化防御系統(tǒng)，能夠及時清除這些ROS，維持細(xì)胞內(nèi)ROS水平的相對穩(wěn)定，使其不會對細(xì)胞造成損害。當(dāng)植物遭受鹽脅迫時，這種平衡被打破，ROS大量積累。鹽脅迫下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生主要通過多個途徑。在葉綠體中，鹽脅迫會影響光合電子傳遞鏈的正常運(yùn)行。光合系統(tǒng)Ⅰ（PSI）的受體端存在大量可自動氧化的物質(zhì)，在鹽脅迫下，電子傳遞至分子氧的概率增加，通過米勒反應(yīng)將氧光還原成超氧化物陰離子（O??）。這些超氧化物陰離子一部分參與PSI電子循環(huán)，另一部分則從類囊體腔擴(kuò)散至基質(zhì)膜表面。在基質(zhì)膜表面，超氧化物陰離子可通過酶促反應(yīng)歧化成過氧化氫（H?O?）和氧氣；在鐵（Fe）或銅（Cu）離子存在的情況下，還能通過芬頓（Fenton）或哈伯-韋斯（Haber-weiss）反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基（?OH）和氧氣。研究表明，在鹽脅迫下，菠菜葉綠體中PSI產(chǎn)生的超氧化物陰離子明顯增多，導(dǎo)致葉綠體膜脂過氧化程度加劇，影響光合作用的正常進(jìn)行。線粒體也是活性氧產(chǎn)生的重要場所。鹽脅迫干擾線粒體的呼吸電子傳遞鏈，使電子傳遞受阻，電子漏出并傳遞給分子氧，從而產(chǎn)生超氧化物陰離子。超氧化物陰離子進(jìn)一步通過一系列反應(yīng)轉(zhuǎn)化為其他活性氧。在鹽脅迫下，小麥線粒體中呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和復(fù)合物Ⅲ的活性受到抑制，電子傳遞異常，導(dǎo)致超氧化物陰離子大量產(chǎn)生，進(jìn)而引發(fā)線粒體膜電位下降，影響線粒體的能量代謝功能。植物細(xì)胞質(zhì)膜上的NADPH氧化酶也參與活性氧的產(chǎn)生。在鹽脅迫刺激下，NADPH氧化酶被激活，以NADPH為電子供體，將分子氧還原為超氧化物陰離子。超氧化物陰離子釋放到細(xì)胞外或在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其他活性氧。在鹽脅迫下，擬南芥細(xì)胞質(zhì)膜上的NADPH氧化酶活性顯著升高，導(dǎo)致超氧化物陰離子大量積累，引發(fā)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)?；钚匝蹙哂泻軓?qiáng)的氧化活性，對植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能會造成嚴(yán)重破壞?；钚匝鯐艏?xì)胞膜中的不飽和脂肪酸，引發(fā)膜脂過氧化反應(yīng)。膜脂過氧化過程中產(chǎn)生的丙二醛（MDA）等物質(zhì)會與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)、酶等結(jié)合，改變其結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞膜的透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外滲，破壞細(xì)胞的正常生理功能。鹽脅迫下，黃瓜葉片細(xì)胞膜的MDA含量顯著增加，細(xì)胞膜透性增大，電解質(zhì)滲漏率升高，表明細(xì)胞膜受到了嚴(yán)重的氧化損傷?；钚匝鯐趸揎椀鞍踪|(zhì)，使蛋白質(zhì)的氨基酸殘基發(fā)生改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活?；钚匝蹩梢匝趸鞍踪|(zhì)中的半胱氨酸（Cys）、甲硫氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）等氨基酸殘基，形成羰基衍生物，破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和功能。在鹽脅迫下，大豆葉片中許多參與光合作用、呼吸作用等重要生理過程的蛋白質(zhì)因受到活性氧的氧化修飾而活性降低，影響了植物的正常代謝?；钚匝踹€會對DNA造成損傷，導(dǎo)致DNA鏈斷裂、堿基突變等?；钚匝蹩梢怨鬌NA分子中的堿基和脫氧核糖，引發(fā)DNA鏈的斷裂和堿基的氧化修飾。羥自由基能夠與DNA中的鳥嘌呤反應(yīng)，形成8-羥基鳥嘌呤等氧化產(chǎn)物，影響DNA的正常復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響基因的表達(dá)和遺傳信息的傳遞。研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，玉米根尖細(xì)胞中的DNA損傷明顯增加，8-羥基鳥嘌呤含量升高，表明DNA受到了活性氧的損傷。1.3.2植物體內(nèi)的抗氧化酶為了抵御活性氧的傷害，植物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套復(fù)雜而高效的抗氧化酶系統(tǒng)，主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等，這些抗氧化酶協(xié)同作用，共同維持細(xì)胞內(nèi)活性氧的動態(tài)平衡，保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化損傷。超氧化物歧化酶（SOD）是抗氧化酶系統(tǒng)的第一道防線，能夠催化超氧陰離子（O??）發(fā)生歧化反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為過氧化氫（H?O?）和氧氣。在高等植物中，根據(jù)其輔基部位結(jié)合的不同金屬離子，SOD可分為3類：錳超氧化物歧化酶（Mn-SOD）、鐵超氧化物歧化酶（Fe-SOD）和銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）。Mn-SOD主要存在于線粒體中，F(xiàn)e-SOD和Cu/Zn-SOD在葉綠體、細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體等部位均有分布，其中Cu/Zn-SOD是植物中含量最豐富的一類SOD。不同類型的SOD在植物應(yīng)對鹽脅迫等逆境時發(fā)揮著不同的作用。在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)Mn-SOD基因煙草的線粒體能夠更好地維持其結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，減少活性氧的積累，從而提高煙草對鹽脅迫的耐受性。過氧化氫酶（CAT）主要存在于過氧化物酶體中，可高效催化過氧化氫分解為水和氧氣，是清除細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的關(guān)鍵酶。CAT具有較高的催化效率，能夠迅速將細(xì)胞內(nèi)積累的過氧化氫清除，避免其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為毒性更強(qiáng)的羥自由基，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。在鹽脅迫下，水稻葉片中CAT活性的升高有助于減少過氧化氫的積累，緩解氧化脅迫對葉片的傷害，維持葉片的正常生理功能。過氧化物酶（POD）是一類以過氧化氫為電子受體，催化底物氧化的酶，其同工酶種類繁多，廣泛存在于植物的各個組織和器官中。POD可以利用過氧化氫氧化多種底物，如酚類、胺類等，在清除過氧化氫的同時，還參與植物的生長發(fā)育、細(xì)胞壁的合成與修飾、木質(zhì)素的合成以及植物的防御反應(yīng)等多種生理過程。在鹽脅迫下，番茄根系中POD活性升高，通過氧化木質(zhì)素前體物質(zhì)，促進(jìn)木質(zhì)素的合成，增強(qiáng)根系細(xì)胞壁的強(qiáng)度，提高根系對鹽脅迫的抵抗能力?？箟难徇^氧化物酶（APX）也是植物抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，主要存在于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中。APX以抗壞血酸（AsA）為電子供體，將過氧化氫還原為水，同時抗壞血酸被氧化為單脫氫抗壞血酸。在葉綠體中，APX在光合電子傳遞過程中產(chǎn)生的過氧化氫的清除中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，保護(hù)光合機(jī)構(gòu)免受氧化損傷。在鹽脅迫下，菠菜葉綠體中APX活性增強(qiáng)，有效地清除了因鹽脅迫導(dǎo)致的光合電子傳遞異常而積累的過氧化氫，維持了葉綠體的正常功能。谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）能夠利用還原型谷胱甘肽（GSH）將過氧化氫還原為水，同時將GSH氧化為氧化型谷胱甘肽（GSSG）。GPX在植物抵御氧化脅迫中也具有重要作用，它可以與其他抗氧化酶協(xié)同作用，共同維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。在鹽脅迫下，擬南芥中GPX活性的變化與植物的耐鹽性密切相關(guān)，耐鹽品種中GPX活性的升高有助于增強(qiáng)植物對鹽脅迫的耐受性。1.3.3鹽脅迫對植物體內(nèi)抗氧化酶的影響鹽脅迫下，植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)會發(fā)生一系列變化，這些變化與植物的耐鹽性密切相關(guān)。在鹽脅迫初期，植物會感知到外界的鹽脅迫信號，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活抗氧化酶基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)抗氧化酶活性升高。在低鹽濃度（50mMNaCl）處理下，黃瓜幼苗葉片中的SOD、CAT和POD活性在處理初期（1-3天）均顯著升高，表明植物啟動了抗氧化防御機(jī)制，以應(yīng)對鹽脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧。隨著鹽脅迫程度的加重和脅迫時間的延長，抗氧化酶活性的變化會因植物品種、組織器官以及脅迫條件的不同而有所差異。對于一些耐鹽性較強(qiáng)的植物品種，在一定范圍內(nèi)，抗氧化酶活性會持續(xù)升高或維持在較高水平，以有效地清除活性氧，保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化損傷。在100mMNaCl脅迫下，耐鹽性較強(qiáng)的小麥品種‘德抗961’的葉片中SOD、CAT和POD活性在處理7天后仍能保持較高水平，從而維持了細(xì)胞內(nèi)活性氧的動態(tài)平衡，減輕了鹽脅迫對植物的傷害。對于一些鹽敏感品種或當(dāng)鹽脅迫超過植物的耐受限度時，抗氧化酶活性可能會下降。高鹽濃度（200mMNaCl）長時間（10天）處理下，鹽敏感的小麥品種‘濟(jì)南17’葉片中的SOD、CAT和POD活性在處理后期顯著降低，導(dǎo)致活性氧積累過多，引發(fā)膜脂過氧化等氧化損傷，使植物生長受到嚴(yán)重抑制。不同抗氧化酶在鹽脅迫下的響應(yīng)模式也存在差異。SOD作為抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線，通常在鹽脅迫初期迅速響應(yīng)，活性顯著升高，以催化超氧陰離子歧化為過氧化氫。隨著鹽脅迫的持續(xù)，CAT和POD等負(fù)責(zé)清除過氧化氫的酶活性也會相應(yīng)變化。在鹽脅迫下，玉米葉片中SOD活性在處理1天后就明顯升高，而CAT和POD活性在SOD活性升高后逐漸升高，且POD活性的升高幅度相對較大，表明不同抗氧化酶在鹽脅迫下協(xié)同作用，共同參與活性氧的清除過程。鹽脅迫還會影響抗氧化酶同工酶的表達(dá)和活性。不同的抗氧化酶同工酶可能在不同的組織器官、發(fā)育階段以及脅迫條件下發(fā)揮特定的作用。在鹽脅迫下，黃瓜幼苗葉片、韌皮部滲出液和根系中SOD、POD和CAT同工酶的表達(dá)存在差異，且不同品種之間也表現(xiàn)出不同的變化模式?！绿┟艽獭S瓜在鹽脅迫下，韌皮部滲出液中3種抗氧化酶同工酶表達(dá)增強(qiáng)，而‘津優(yōu)1號’則表現(xiàn)為抑制，這表明抗氧化酶同工酶的表達(dá)變化與植物的耐鹽性密切相關(guān)，且具有品種及組織特異性。1.4鹽脅迫對植物基因組DNA甲基化的影響1.4.1DNA甲基化的維持機(jī)制DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNAmethyltransferases，DMTs）的催化作用下，將甲基基團(tuán)添加到特定的DNA區(qū)域，主要是CpG二核苷酸中的胞嘧啶殘基上，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。在植物中，DNA甲基化的維持涉及多種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，這些酶在DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，確保甲基化模式能夠穩(wěn)定地傳遞給子代細(xì)胞。植物中的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶主要包括四類：MET1（METHYLTRANSFERASE1）、CMT3（CHROMOMETHYLASE3）、DRM1/2（DOMAINSREARRANGEDMETHYLTRANSFERASE1/2）和DNMT2（DNAMETHYLTRANSFERASE2）。MET1是植物中維持CG位點(diǎn)甲基化的關(guān)鍵酶，它與哺乳動物中的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）具有較高的同源性。在DNA復(fù)制過程中，新合成的DNA鏈在MET1的作用下，以親代DNA鏈上的甲基化模式為模板，在對應(yīng)的CG位點(diǎn)添加甲基基團(tuán)，從而實(shí)現(xiàn)CG位點(diǎn)甲基化的穩(wěn)定遺傳。研究表明，擬南芥中MET1基因的突變會導(dǎo)致CG位點(diǎn)甲基化水平顯著下降，進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育，出現(xiàn)植株矮小、葉片形態(tài)異常等表型。CMT3主要負(fù)責(zé)維持CHG（H代表A、T或C）位點(diǎn)的甲基化，它與植物特有的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白SUVH（SU(VAR)3-9HOMOLOG）家族成員相互作用，識別并結(jié)合到特定的染色質(zhì)區(qū)域，催化CHG位點(diǎn)的甲基化。CMT3對CHG位點(diǎn)甲基化的維持依賴于組蛋白H3第9位賴氨酸的甲基化修飾（H3K9me），這種修飾為CMT3提供了結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)其對CHG位點(diǎn)的甲基化作用。在擬南芥中，cmt3突變體的CHG位點(diǎn)甲基化水平明顯降低，導(dǎo)致一些基因的表達(dá)發(fā)生改變，影響植物對逆境脅迫的響應(yīng)。DRM1/2屬于從頭甲基化轉(zhuǎn)移酶，能夠在DNA雙鏈上從頭催化建立新的甲基化位點(diǎn)，包括CG、CHG和CHH位點(diǎn)。它們參與RNA介導(dǎo)的DNA甲基化（RNA-directedDNAmethylation，RdDM）途徑，在該途徑中，雙鏈RNA（dsRNA）被核酸酶切割成小干擾RNA（siRNA），siRNA與AGO4（ARGONAUTE4）等蛋白結(jié)合形成RNA-誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），RISC識別并結(jié)合到靶DNA序列上，招募DRM1/2對靶位點(diǎn)進(jìn)行甲基化修飾。在鹽脅迫等逆境條件下，植物體內(nèi)會產(chǎn)生一些與脅迫相關(guān)的siRNA，通過RdDM途徑，DRM1/2可以在相關(guān)基因的啟動子區(qū)域或編碼區(qū)建立新的甲基化位點(diǎn)，從而調(diào)控基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物對逆境的適應(yīng)能力。DNMT2在植物中的功能相對較為復(fù)雜，它既具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性，又參與tRNA的甲基化修飾。雖然DNMT2對DNA甲基化的直接作用相對較小，但它可能通過影響tRNA的甲基化狀態(tài)，間接影響蛋白質(zhì)的合成過程，進(jìn)而對植物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)產(chǎn)生影響。1.4.2植物DNA甲基化的生物學(xué)功能DNA甲基化在植物的生長發(fā)育、基因表達(dá)調(diào)控以及對環(huán)境脅迫的響應(yīng)等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的生物學(xué)功能。在基因表達(dá)調(diào)控方面，DNA甲基化可以通過改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象，影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合能力，從而調(diào)控基因的表達(dá)水平。通常情況下，DNA甲基化發(fā)生在基因的啟動子區(qū)域或編碼區(qū)，會抑制基因的轉(zhuǎn)錄起始或延伸，導(dǎo)致基因表達(dá)沉默。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，一些參與花器官發(fā)育的基因，如AGAMOUS（AG）基因，其啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)與基因的表達(dá)密切相關(guān)。在花發(fā)育的特定階段，AG基因啟動子區(qū)域的甲基化水平降低，使得轉(zhuǎn)錄因子能夠順利結(jié)合到啟動子上，激活A(yù)G基因的表達(dá)，促進(jìn)花器官的正常發(fā)育。而當(dāng)AG基因啟動子區(qū)域發(fā)生高甲基化時，基因表達(dá)受到抑制，會導(dǎo)致花器官發(fā)育異常。DNA甲基化在植物的生長發(fā)育過程中也起著關(guān)鍵作用。在植物的胚胎發(fā)育過程中，DNA甲基化參與調(diào)控胚胎細(xì)胞的分化和組織器官的形成。在種子萌發(fā)過程中，DNA甲基化狀態(tài)的改變會影響種子的休眠與萌發(fā)特性。對水稻種子的研究表明，在種子休眠期，一些與種子萌發(fā)相關(guān)的基因啟動子區(qū)域處于高甲基化狀態(tài)，基因表達(dá)受到抑制，種子保持休眠狀態(tài)。而在種子萌發(fā)時，這些基因啟動子區(qū)域的甲基化水平降低，基因表達(dá)被激活，促進(jìn)種子的萌發(fā)和幼苗的生長。DNA甲基化還在植物對生物和非生物脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。在面對鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫等非生物脅迫時，植物會通過調(diào)整基因組DNA甲基化水平和模式，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)對脅迫的耐受性。在鹽脅迫下，一些植物會在與離子平衡調(diào)節(jié)、滲透調(diào)節(jié)、抗氧化防御等相關(guān)基因的啟動子區(qū)域發(fā)生DNA甲基化水平的變化，進(jìn)而調(diào)控這些基因的表達(dá)，使植物能夠更好地適應(yīng)鹽漬環(huán)境。在擬南芥中，鹽脅迫會誘導(dǎo)一些與鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的啟動子區(qū)域發(fā)生低甲基化，從而增強(qiáng)這些基因的表達(dá)，促進(jìn)鈉離子的外排或區(qū)隔化，降低細(xì)胞內(nèi)鈉離子的濃度，減輕鹽脅迫對植物的傷害。在植物抵御病原菌侵染等生物脅迫時，DNA甲基化也參與了植物的免疫反應(yīng)。病原菌侵染會導(dǎo)致植物基因組DNA甲基化模式的改變，一些與植物免疫相關(guān)基因的表達(dá)受到調(diào)控，從而激活植物的防御機(jī)制，增強(qiáng)植物對病原菌的抵抗力。1.4.3DNA甲基化的研究方法隨著對DNA甲基化研究的深入，一系列檢測DNA甲基化水平和模式的技術(shù)不斷發(fā)展和完善，這些技術(shù)為深入探究DNA甲基化在植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)中的作用機(jī)制提供了有力的工具。甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性分析（Methylation-sensitiveamplificationpolymorphism，MSAP）是一種常用的DNA甲基化檢測技術(shù)。該技術(shù)基于限制性內(nèi)切酶對DNA甲基化的敏感性差異，利用一對同裂酶（如HpaⅡ和MspⅠ）和選擇性擴(kuò)增引物對基因組DNA進(jìn)行酶切和擴(kuò)增。HpaⅡ和MspⅠ都能識別CCGG序列，但HpaⅡ?qū)CGG位點(diǎn)內(nèi)部胞嘧啶的甲基化敏感，當(dāng)該位點(diǎn)發(fā)生甲基化時，HpaⅡ無法切割；而MspⅠ對外部胞嘧啶的甲基化敏感。通過比較HpaⅡ和MspⅠ酶切后的擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性，可以檢測出基因組DNA中CCGG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。MSAP技術(shù)具有操作相對簡單、成本較低、可同時檢測多個位點(diǎn)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于植物DNA甲基化的研究中。在研究鹽脅迫對黃瓜基因組DNA甲基化的影響時，可利用MSAP技術(shù)分析不同鹽濃度處理下黃瓜基因組中CCGG位點(diǎn)的甲基化變化，從而了解鹽脅迫對黃瓜DNA甲基化模式的影響。重亞硫酸鹽測序（Bisulfitesequencing，BS-seq）是一種能夠精確檢測DNA甲基化位點(diǎn)和甲基化水平的技術(shù)。該技術(shù)首先用重亞硫酸鹽處理基因組DNA，使未甲基化的胞嘧啶（C）脫氨基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶則保持不變。然后對處理后的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，通過與參考基因組比對，即可確定每個胞嘧啶位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。BS-seq技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)單堿基分辨率的DNA甲基化檢測，能夠全面、準(zhǔn)確地揭示基因組DNA的甲基化圖譜。在植物DNA甲基化研究中，BS-seq技術(shù)常用于繪制不同組織、不同發(fā)育階段以及不同脅迫條件下植物基因組的甲基化圖譜，為深入研究DNA甲基化的調(diào)控機(jī)制提供了高精度的數(shù)據(jù)支持。甲基化DNA免疫沉淀測序（MethylatedDNAimmunoprecipitationsequencing，MeDIP-seq）是基于抗體特異性識別5-甲基胞嘧啶的原理進(jìn)行DNA甲基化檢測的技術(shù)。利用抗5-甲基胞嘧啶抗體富集基因組中發(fā)生甲基化的DNA片段，然后對富集的片段進(jìn)行高通量測序。MeDIP-seq技術(shù)可以在全基因組水平上檢測DNA甲基化區(qū)域，具有較高的靈敏度和覆蓋度。通過MeDIP-seq技術(shù)，可以獲得植物基因組中甲基化區(qū)域的分布信息，分析甲基化區(qū)域與基因功能、染色體結(jié)構(gòu)等之間的關(guān)系。在研究植物對鹽脅迫的響應(yīng)時，利用MeDIP-seq技術(shù)可以篩選出在鹽脅迫下甲基化水平發(fā)生顯著變化的基因區(qū)域，進(jìn)一步研究這些區(qū)域的功能及其在植物耐鹽機(jī)制中的作用。結(jié)合亞硫酸氫鹽的限制性內(nèi)切酶分析（Combinedbisulfiterestrictionanalysis，COBRA）也是一種常用的DNA甲基化檢測方法。該方法先對DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽處理，然后用特定的限制性內(nèi)切酶切割處理后的DNA，通過凝膠電泳或定量PCR等方法分析酶切產(chǎn)物的多態(tài)性，從而判斷特定區(qū)域的DNA甲基化水平。COBRA技術(shù)操作相對簡便，適用于對已知基因或DNA區(qū)域甲基化水平的檢測。在研究植物中某個與鹽脅迫相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)時，可采用COBRA技術(shù)進(jìn)行檢測，快速準(zhǔn)確地獲得該基因的甲基化信息。1.4.4鹽脅迫對基因組DNA甲基化的影響鹽脅迫作為一種重要的非生物脅迫，能夠顯著改變植物基因組DNA的甲基化水平和模式，這種變化在植物對鹽脅迫的響應(yīng)和適應(yīng)過程中起著關(guān)鍵作用。大量研究表明，鹽脅迫會導(dǎo)致植物基因組DNA甲基化水平發(fā)生改變。在一些植物中，鹽脅迫會使基因組整體DNA甲基化水平升高。對鹽脅迫下的小麥進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的增加和脅迫時間的延長，小麥基因組DNA甲基化水平逐漸上升。這可能是植物為了應(yīng)對鹽脅迫，通過增加DNA甲基化水平來調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，以維持細(xì)胞內(nèi)的離子平衡、滲透平衡等生理過程。在鹽脅迫下，小麥中一些與離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的啟動子區(qū)域甲基化水平升高，導(dǎo)致這些基因的表達(dá)受到抑制，從而減少鈉離子的吸收，維持細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)。在另一些植物中，鹽脅迫會引起基因組DNA甲基化水平下降。在對鹽脅迫下的擬南芥進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，鹽處理后擬南芥基因組DNA甲基化水平降低。這種甲基化水平的降低可能使一些原本被甲基化沉默的基因得以表達(dá)，從而激活植物的耐鹽相關(guān)基因，增強(qiáng)植物對鹽脅迫的適應(yīng)性。在鹽脅迫下，擬南芥中一些參與抗氧化防御的基因啟動子區(qū)域甲基化水平降低，基因表達(dá)上調(diào)，使植物能夠產(chǎn)生更多的抗氧化酶，清除體內(nèi)過多的活性氧，減輕鹽脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷。鹽脅迫還會導(dǎo)致植物基因組DNA甲基化模式發(fā)生改變，即不同基因或DNA區(qū)域的甲基化位點(diǎn)和甲基化程度發(fā)生變化。這些甲基化模式的改變與植物對鹽脅迫的響應(yīng)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，黃瓜基因組中一些與光合作用、滲透調(diào)節(jié)、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)基因的啟動子區(qū)域或編碼區(qū)的甲基化模式發(fā)生顯著變化。在黃瓜中，鹽脅迫會使一些與光合作用相關(guān)基因的啟動子區(qū)域部分甲基化位點(diǎn)發(fā)生改變，導(dǎo)致基因表達(dá)受到調(diào)控，影響光合作用的效率，進(jìn)而影響植物的生長和對鹽脅迫的適應(yīng)能力。DNA甲基化模式的改變還可能通過影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，間接影響植物對鹽脅迫的響應(yīng)。DNA甲基化與組蛋白修飾等表觀遺傳標(biāo)記相互作用，共同調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和基因的可及性。在鹽脅迫下，DNA甲基化模式的改變可能會引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑，使一些與鹽脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因更容易或更難被轉(zhuǎn)錄因子識別和結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達(dá)。1.5外源甲基紫精提高植物抗逆性的研究進(jìn)展甲基紫精（Methylviologen，MV），又稱百草枯，是一種廣泛應(yīng)用的觸殺型除草劑。因其具有獨(dú)特的氧化還原特性，在農(nóng)業(yè)和生物學(xué)研究領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。近年來，研究發(fā)現(xiàn)低濃度的外源甲基紫精處理能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生一系列生理生化變化，從而提高植物對多種逆境脅迫的抵抗能力。在干旱脅迫方面，外源甲基紫精處理能夠增強(qiáng)植物的抗旱性。研究表明，用低濃度甲基紫精溶液預(yù)處理小麥種子，在干旱脅迫下，小麥幼苗的根系活力顯著增強(qiáng)，根系生長受到促進(jìn)，根系長度和根表面積增加，從而提高了小麥對水分的吸收能力。甲基紫精處理還能誘導(dǎo)小麥葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)如脯氨酸、可溶性糖等的積累，降低葉片的滲透勢，增強(qiáng)細(xì)胞的保水能力。干旱脅迫下，經(jīng)甲基紫精處理的小麥葉片中脯氨酸含量比對照提高了30%-50%，可溶性糖含量也明顯增加，有效地緩解了干旱脅迫對小麥的傷害。在高溫脅迫方面，外源甲基紫精可以提高植物的耐熱性。對番茄進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫前用甲基紫精噴施番茄葉片，能夠顯著提高番茄葉片中抗氧化酶SOD、CAT和POD的活性，降低活性氧的積累，減輕高溫脅迫對細(xì)胞膜的損傷，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。高溫脅迫下，甲基紫精處理組番茄葉片的MDA含量明顯低于對照組，細(xì)胞膜透性降低，表明甲基紫精處理有效地減輕了高溫脅迫對番茄的氧化損傷。甲基紫精還能調(diào)節(jié)番茄體內(nèi)的激素平衡，增加脫落酸（ABA）等激素的含量，從而提高番茄對高溫脅迫的適應(yīng)能力。在重金屬脅迫方面，外源甲基紫精也表現(xiàn)出良好的緩解作用。研究表明，在鎘（Cd）脅迫下，用甲基紫精處理水稻幼苗，能夠降低水稻幼苗對鎘的吸收和積累，減少鎘在根部和地上部的含量。甲基紫精處理還能促進(jìn)水稻根系中鎘的區(qū)隔化，將鎘離子限制在液泡等細(xì)胞器中，降低其對細(xì)胞代謝的干擾。甲基紫精可以誘導(dǎo)水稻體內(nèi)金屬硫蛋白（MTs）等金屬結(jié)合蛋白的合成，增強(qiáng)水稻對鎘的螯合能力，從而減輕鎘脅迫對水稻的毒害作用。在生物脅迫方面，外源甲基紫精能夠增強(qiáng)植物對病原菌的抗性。用甲基紫精處理煙草后，煙草對煙草花葉病毒（TMV）的抗性顯著增強(qiáng)。甲基紫精處理誘導(dǎo)煙草葉片中病程相關(guān)蛋白（PR蛋白）基因的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)PR蛋白的合成，這些蛋白具有抗菌、抗病毒等功能，能夠增強(qiáng)植物的防御能力。甲基紫精還能激活煙草的水楊酸（SA）信號通路，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性（SAR），使植物對病原菌的侵染產(chǎn)生持久的抗性。1.6本研究的目的意義綜上所述，鹽脅迫對黃瓜等植物的生長發(fā)育造成了嚴(yán)重危害，通過氧化脅迫、滲透脅迫和離子脅迫等多種機(jī)制影響植物的生理生化過程。植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)和DNA甲基化在應(yīng)對鹽脅迫中發(fā)揮著重要作用，然而，關(guān)于鹽脅迫下兩者之間的相互關(guān)系以及外源甲基紫精對其調(diào)控機(jī)制的研究仍相對較少。本研究旨在探討外源甲基紫精對鹽脅迫下黃瓜葉片抗氧化酶活性和DNA甲基化的影響，揭示其在緩解鹽脅迫傷害中的作用機(jī)制。通過研究不同濃度外源甲基紫精處理下，鹽脅迫黃瓜葉片中抗氧化酶活性的變化規(guī)律，明確外源甲基紫精對黃瓜抗氧化防御系統(tǒng)的調(diào)控作用；分析DNA甲基化水平和模式的改變，探究DNA甲基化在黃瓜響應(yīng)鹽脅迫及外源甲基紫精調(diào)控過程中的分子機(jī)制。本研究不僅有助于深入理解植物響應(yīng)鹽脅迫的生理和分子機(jī)制，豐富植物逆境生物學(xué)的理論知識，還為提高黃瓜等蔬菜作物的耐鹽性提供新的思路和理論依據(jù)，對指導(dǎo)設(shè)施蔬菜生產(chǎn)、緩解土壤鹽漬化對農(nóng)業(yè)的威脅具有重要的實(shí)踐意義，有望為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)對鹽脅迫問題提供切實(shí)可行的解決方案，促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料本實(shí)驗(yàn)選用黃瓜品種為“津優(yōu)1號”，該品種在設(shè)施栽培中廣泛應(yīng)用，對鹽脅迫較為敏感，由[具體種子供應(yīng)商名稱]提供。甲基紫精（MV，分析純，純度≥98%）購自[試劑公司名稱]，用于外源處理以探究其對鹽脅迫下黃瓜的影響。其他主要試劑包括：氯化鈉（NaCl，分析純，純度≥99.5%），購自[試劑公司名稱]，用于模擬鹽脅迫環(huán)境；CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）、β-巰基乙醇、Tris-HCl、EDTA、氯仿、異戊醇、異丙醇、無水乙醇等分子生物學(xué)試劑，均為分析純，用于DNA提取和相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作，購自[試劑公司名稱]；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HpaⅡ、MspⅠ以及T4DNA連接酶、DNAMarker等，購自[生物工程公司名稱]，用于DNA甲基化分析實(shí)驗(yàn)；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等抗氧化酶活性測定試劑盒，購自[生物技術(shù)公司名稱]，用于抗氧化酶活性的檢測。2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計將黃瓜種子用0.1%的升汞溶液消毒10-15分鐘，然后用蒸餾水沖洗3-5次，去除殘留的消毒劑。將消毒后的種子浸泡在溫水中（25-30℃）6-8小時，使其充分吸水膨脹。浸泡后的種子均勻播于裝有濕潤蛭石的育苗盤中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件設(shè)置為：光照強(qiáng)度2500-3000lx，光照時間16小時/天，晝夜溫度為28℃/20℃，相對濕度60%-70%。待黃瓜幼苗長至兩葉一心時，選取生長健壯、整齊一致的幼苗，移栽至裝有1/2Hoagland營養(yǎng)液的塑料栽培槽中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，預(yù)培養(yǎng)時間為3天。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將黃瓜幼苗隨機(jī)分為4組，每組設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)10株幼苗，分別進(jìn)行以下處理：CK組：正常1/2Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，不進(jìn)行鹽脅迫和外源甲基紫精處理，作為空白對照。S組：在1/2Hoagland營養(yǎng)液中加入150mMNaCl，模擬鹽脅迫環(huán)境，處理時間為7天。150mMNaCl濃度是根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)及相關(guān)文獻(xiàn)研究確定，此濃度能夠顯著抑制黃瓜生長，且能較好地模擬設(shè)施栽培中常見的鹽脅迫程度。S+MV1組：在含150mMNaCl的1/2Hoagland營養(yǎng)液中，加入10μM甲基紫精，處理時間為7天。外源甲基紫精濃度的選擇參考了相關(guān)研究，10μM的甲基紫精在前期研究中表現(xiàn)出對植物抗逆性有顯著促進(jìn)作用，且對植物生長無明顯負(fù)面影響。S+MV2組：在含150mMNaCl的1/2Hoagland營養(yǎng)液中，加入50μM甲基紫精，處理時間為7天。設(shè)置50μM甲基紫精濃度旨在探究較高濃度的外源甲基紫精對鹽脅迫下黃瓜的影響，以確定其最適調(diào)控濃度范圍。在處理期間，每天定時更換營養(yǎng)液，以保持營養(yǎng)液中鹽濃度和甲基紫精濃度的穩(wěn)定，并確保營養(yǎng)液的pH值維持在6.0-6.5之間。每隔2天用去離子水沖洗栽培槽，防止鹽分積累對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。每天觀察記錄黃瓜幼苗的生長狀況，包括葉片顏色、形態(tài)、生長速率等。2.3葉片抗氧化酶活性及相關(guān)指標(biāo)的測定在處理7天后，選取黃瓜幼苗從上往下數(shù)第3片完全展開的功能葉，用于抗氧化酶活性及相關(guān)指標(biāo)的測定。超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法測定。稱取0.2g葉片，加入5mL預(yù)冷的50mM磷酸緩沖液（pH7.8，含1%聚乙烯吡咯烷酮PVP），在冰浴中研磨成勻漿，然后于4℃、12000×g離心20分鐘，取上清液作為酶液。取3mL反應(yīng)混合液（含50mM磷酸緩沖液pH7.8、13mM甲硫氨酸、75μMNBT、10μM核黃素、0.1mMEDTA），加入50μL酶液，以不加酶液的反應(yīng)混合液作為對照，在光照強(qiáng)度為4000lx的條件下光照反應(yīng)20分鐘，然后用遮光布迅速遮光終止反應(yīng)，在560nm波長下測定吸光度。以抑制NBT光化還原50%所需的酶量為一個SOD活性單位（U），計算SOD活性，單位為U/gFW（鮮重）。過氧化氫酶（CAT）活性通過測定過氧化氫的分解速率來確定。稱取0.2g葉片，按上述SOD酶液提取方法制備酶液。取3mL反應(yīng)混合液（含50mM磷酸緩沖液pH7.0、20mMH?O?），加入50μL酶液，立即在240nm波長下測定吸光度，每隔30秒記錄一次，共記錄3分鐘。以每分鐘吸光度減少0.01為一個CAT活性單位（U），計算CAT活性，單位為U/gFW。過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測定。同樣稱取0.2g葉片制備酶液。取3mL反應(yīng)混合液（含50mM磷酸緩沖液pH6.0、20mM愈創(chuàng)木酚、10mMH?O?），加入50μL酶液，在470nm波長下測定吸光度，每隔30秒記錄一次，共記錄3分鐘。以每分鐘吸光度增加0.01為一個POD活性單位（U），計算POD活性，單位為U/gFW。丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定。稱取0.2g葉片，加入5mL10%三氯乙酸（TCA）和少量石英砂，研磨成勻漿，然后于4℃、10000×g離心10分鐘，取上清液。取2mL上清液，加入2mL0.6%TBA（用10%TCA配制），混勻后在沸水浴中加熱15分鐘，迅速冷卻后于4℃、10000×g離心10分鐘，取上清液在532nm、600nm和450nm波長下測定吸光度。根據(jù)公式計算MDA含量，單位為μmol/gFW。計算公式為：MDA（μmol/gFW）=6.45×（A532-A600）-0.56×A450，其中A532、A600和A450分別為532nm、600nm和450nm波長下的吸光度。可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定。稱取0.2g葉片，加入5mL50mM磷酸緩沖液（pH7.8），在冰浴中研磨成勻漿，然后于4℃、12000×g離心20分鐘，取上清液。取0.1mL上清液，加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，混勻后室溫放置5分鐘，在595nm波長下測定吸光度。以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算可溶性蛋白含量，單位為mg/gFW。2.4葉片抗氧化酶活性及相關(guān)指標(biāo)的統(tǒng)計分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理。首先，對各處理組的抗氧化酶活性（SOD、CAT、POD）、MDA含量和可溶性蛋白含量等數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA），以檢驗(yàn)不同處理之間是否存在顯著差異。方差分析的模型設(shè)定為：Yij=μ+τi+εij，其中Yij表示第i個處理組的第j個觀測值，μ為總體均值，τi為第i個處理的效應(yīng)，εij為隨機(jī)誤差。若方差分析結(jié)果顯示處理間存在顯著差異（P<0.05），則進(jìn)一步采用鄧肯氏新復(fù)極差法（Duncan'snewmultiplerangetest）進(jìn)行多重比較，以明確各處理組之間的具體差異情況。例如，通過多重比較可以確定S組與CK組、S+MV1組、S+MV2組之間，以及S+MV1組與S+MV2組之間在抗氧化酶活性等指標(biāo)上是否存在顯著差異。為了探究各指標(biāo)之間的內(nèi)在聯(lián)系，對SOD活性、CAT活性、POD活性、MDA含量和可溶性蛋白含量進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。計算各指標(biāo)之間的相關(guān)系數(shù)r，并根據(jù)相關(guān)系數(shù)的大小和正負(fù)判斷指標(biāo)之間的相關(guān)性方向和強(qiáng)度。當(dāng)r>0時，表示兩個指標(biāo)呈正相關(guān)；當(dāng)r<0時，表示兩個指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)；|r|越接近1，說明相關(guān)性越強(qiáng)。通過相關(guān)性分析，可以了解抗氧化酶活性與MDA含量、可溶性蛋白含量之間的相互關(guān)系，以及不同抗氧化酶之間的協(xié)同或拮抗作用，為深入分析外源甲基紫精對鹽脅迫下黃瓜葉片生理特性的影響提供依據(jù)。2.5基因組DNA的提取與純化在處理7天后，取黃瓜葉片約0.2g，采用改良的CTAB法提取基因組DNA。將葉片置于預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮，迅速研磨成粉末狀，確保葉片組織充分破碎，以利于后續(xù)DNA的釋放。將研磨好的粉末轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入700μL預(yù)熱至65℃的CTAB提取緩沖液（含2%CTAB、1.4MNaCl、100mMTris-HClpH8.0、20mMEDTApH8.0、2%β-巰基乙醇）。β-巰基乙醇在提取過程中起著重要作用，它作為強(qiáng)還原劑，能有效防止植物組織中的多酚類物質(zhì)氧化，避免其與DNA結(jié)合，從而保證DNA的純度。加入β-巰基乙醇后，迅速渦旋振蕩，使粉末與提取緩沖液充分混勻。將離心管置于65℃水浴鍋中保溫30分鐘，期間每隔10分鐘輕輕顛倒混勻一次，以促進(jìn)細(xì)胞裂解和DNA的溶解。保溫結(jié)束后，冷卻至室溫，加入等體積（700μL）的氯仿：異戊醇（24:1）混合液。氯仿能使蛋白質(zhì)變性沉淀，而異戊醇則可減少抽提過程中泡沫的產(chǎn)生，兩者協(xié)同作用，有助于將蛋白質(zhì)與DNA分離。上下顛倒離心管10-15分鐘，使水相和有機(jī)相充分混合，然后于4℃、12000×g離心15分鐘。離心后，溶液分為三層，上層為含DNA的水相，中間為變性蛋白質(zhì)層，下層為氯仿有機(jī)相。小心吸取上清液（約600μL）轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，避免吸到中間的蛋白質(zhì)層和下層的氯仿相，以防DNA被污染。加入0.6倍體積（約360μL）預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，此時可見白色絮狀的DNA沉淀析出。將離心管置于-20℃冰箱中靜置30分鐘，以促進(jìn)DNA充分沉淀。隨后，于4℃、12000×g離心10分鐘，棄上清液，此時DNA沉淀在離心管底部。向離心管中加入1mL70%乙醇，輕輕洗滌DNA沉淀，以去除殘留的鹽離子和雜質(zhì)。70%乙醇既能溶解鹽類等雜質(zhì)，又能使DNA保持沉淀狀態(tài)。于4℃、12000×g離心5分鐘，棄上清液，重復(fù)洗滌一次。將離心管倒置在干凈的濾紙上，晾干DNA沉淀，注意避免過度干燥，以免DNA難以溶解。待DNA沉淀干燥后，加入50μLTE緩沖液（10mMTris-HClpH8.0、1mMEDTApH8.0），輕輕吹打使DNA充分溶解。將溶解后的DNA溶液置于4℃冰箱中保存，備用。采用核酸蛋白分析儀測定提取的基因組DNA的濃度和純度。通過檢測260nm和280nm波長下的吸光度（A）值，計算A260/A280比值，以評估DNA的純度。一般來說，純凈的DNA樣品A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間。若比值低于1.8，說明DNA樣品可能存在蛋白質(zhì)污染；若比值高于2.0，則可能存在RNA污染。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。將DNA樣品與上樣緩沖液混合后，加入到含EB（溴化乙錠）的1%瓊脂糖凝膠加樣孔中，在1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳，電壓為120V，時間約30分鐘。電泳結(jié)束后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，若DNA條帶清晰、無拖尾現(xiàn)象，表明提取的DNA完整性良好。2.6甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性分析甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（Methylation-sensitiveamplificationpolymorphism，MSAP）分析是一種基于PCR技術(shù)，用于檢測基因組DNA甲基化水平和模式的常用方法。該技術(shù)利用限制性內(nèi)切酶對DNA甲基化的敏感性差異，來識別和分析基因組中特定區(qū)域的甲基化狀態(tài)。具體操作流程如下：首先，將提取的高質(zhì)量基因組DNA進(jìn)行雙酶切。選用的限制性內(nèi)切酶組合為EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ，其中EcoRⅠ識別并切割GAATTC序列，對甲基化不敏感；HpaⅡ和MspⅠ是同裂酶，都能識別CCGG序列，但對甲基化的敏感性不同。HpaⅡ?qū)CGG位點(diǎn)內(nèi)部胞嘧啶的甲基化敏感，當(dāng)該位點(diǎn)內(nèi)部胞嘧啶發(fā)生甲基化時，HpaⅡ無法切割；而MspⅠ對CCGG位點(diǎn)外部胞嘧啶的甲基化敏感。通過這種酶切組合，可以將基因組DNA切割成不同長度的片段。酶切完成后，將酶切產(chǎn)物與特定的接頭進(jìn)行連接。接頭是一段人工合成的雙鏈DNA片段，其序列與酶切位點(diǎn)互補(bǔ)，能夠與酶切后的DNA片段末端連接，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供引物結(jié)合位點(diǎn)。連接反應(yīng)使用T4DNA連接酶，在適宜的溫度和緩沖條件下進(jìn)行，確保接頭與酶切產(chǎn)物高效連接。連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。預(yù)擴(kuò)增引物的設(shè)計與接頭序列互補(bǔ)，通過PCR擴(kuò)增，使連接上接頭的DNA片段得到初步擴(kuò)增，增加模板的數(shù)量。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系包含適量的連接產(chǎn)物、預(yù)擴(kuò)增引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液等。反應(yīng)條件一般為94℃預(yù)變性5分鐘；然后進(jìn)行25個循環(huán)，每個循環(huán)包括94℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分鐘；最后72℃延伸10分鐘。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)稀釋后，用于選擇性擴(kuò)增。選擇性擴(kuò)增是MSAP分析的關(guān)鍵步驟。根據(jù)預(yù)擴(kuò)增引物的序列，設(shè)計帶有選擇性堿基的引物對預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增。選擇性引物在引物3'端添加了1-3個選擇性堿基，這些堿基的添加增加了擴(kuò)增的特異性，使得只有與引物完全匹配的DNA片段才能被擴(kuò)增。選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件與預(yù)擴(kuò)增類似，但退火溫度根據(jù)引物的Tm值進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以保證擴(kuò)增的特異性和效率。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進(jìn)行分離檢測。聚丙烯酰胺凝膠具有較高的分辨率，能夠清晰地分辨出不同長度的DNA片段。將擴(kuò)增產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后，加入到聚丙烯酰胺凝膠的加樣孔中，在合適的電壓和電泳緩沖液條件下進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，采用銀染法對凝膠進(jìn)行染色，使DNA條帶顯現(xiàn)出來。銀染法具有靈敏度高、分辨率好的優(yōu)點(diǎn)，能夠清晰地顯示出擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。通過觀察凝膠上DNA條帶的有無和位置，可以判斷CCGG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。數(shù)據(jù)分析時，根據(jù)凝膠上的條帶情況，將條帶分為不同的類型。若EcoRⅠ和HpaⅡ酶切組合與EcoRⅠ和MspⅠ酶切組合都有條帶，且條帶位置相同，說明該CCGG位點(diǎn)未發(fā)生甲基化；若EcoRⅠ和HpaⅡ酶切組合無條帶，而EcoRⅠ和MspⅠ酶切組合有條帶，說明該CCGG位點(diǎn)內(nèi)部胞嘧啶發(fā)生了甲基化；若EcoRⅠ和HpaⅡ酶切組合有條帶，而EcoRⅠ和MspⅠ酶切組合無條帶，說明該CCGG位點(diǎn)外部胞嘧啶發(fā)生了甲基化。統(tǒng)計不同類型條帶的數(shù)量和分布情況，計算甲基化水平和多態(tài)性指數(shù)。甲基化水平可以通過甲基化條帶數(shù)與總條帶數(shù)的比值來計算，多態(tài)性指數(shù)則反映了不同樣本間甲基化模式的差異程度。利用聚類分析、主成分分析等方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析，揭示不同處理組之間DNA甲基化模式的差異和相似性，探討鹽脅迫及外源甲基紫精處理對黃瓜基因組DNA甲基化的影響。三、結(jié)果與分析3.1甲基紫精預(yù)處理對鹽脅迫下黃瓜葉片抗氧化酶的影響3.1.1對SOD活性的影響超氧化物歧化酶（SOD）作為植物抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，在清除超氧陰離子、維持細(xì)胞內(nèi)活性氧平衡方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究中，不同處理對黃瓜葉片SOD活性的影響呈現(xiàn)出顯著差異（圖1）。對照組（CK組）黃瓜葉片的SOD活性維持在一個相對穩(wěn)定的基礎(chǔ)水平，為[X1]U/gFW。在鹽脅迫處理（S組）下，黃瓜葉片的SOD活性顯著上升，達(dá)到[X2]U/gFW，相較于CK組增加了[X3]%。這表明鹽脅迫能夠誘導(dǎo)黃瓜啟動自身的抗氧化防御機(jī)制，促使SOD活性升高，以應(yīng)對鹽脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量超氧陰離子，減輕氧化損傷。經(jīng)過10μM甲基紫精預(yù)處理的鹽脅迫組（S+MV1組），黃瓜葉片SOD活性進(jìn)一步提高，達(dá)到[X4]U/gFW，與S組相比顯著增加了[X5]%。這說明低濃度的外源甲基紫精能夠有效增強(qiáng)鹽脅迫下黃瓜葉片SOD的活性，進(jìn)一步提升其對超氧陰離子的清除能力，從而增強(qiáng)黃瓜對鹽脅迫的耐受性。當(dāng)甲基紫精濃度提高到50μM（S+MV2組）時，黃瓜葉片SOD活性雖仍高于S組，但相較于S+MV1組出現(xiàn)了一定程度的下降，為[X6]U/gFW，較S+MV1組降低了[X7]%。這可能是由于過高濃度的甲基紫精對黃瓜產(chǎn)生了一定的脅迫效應(yīng)，抑制了SOD活性的進(jìn)一步升高，甚至對其活性產(chǎn)生了負(fù)面影響。通過對不同處理組SOD活性的分析可知，適量濃度的外源甲基紫精預(yù)處理能夠顯著增強(qiáng)鹽脅迫下黃瓜葉片SOD活性，從而提高黃瓜對鹽脅迫的抵抗能力，但過高濃度的甲基紫精可能會產(chǎn)生負(fù)面作用。3.1.2對CAT、GPX、GSH-Px和APX活性的影響過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-Px）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）在植物清除過氧化氫（H?O?）的過程中協(xié)同發(fā)揮作用，它們的活性變化直接反映了植物對H?O?的清除能力以及抗氧化防御系統(tǒng)的功能狀態(tài)。在CK組中，黃瓜葉片的CAT、GPX、GSH-Px和APX活性分別維持在[Y1]U/gFW、[Y2]U/gFW、[Y3]U/gFW和[Y4]U/gFW的水平。鹽脅迫處理（S組）后，這些抗氧化酶的活性均有不同程度的變化。其中，CAT活性顯著升高，達(dá)到[Y5]U/gFW，較CK組增加了[Y6]%；GPX活性也有所上升，為[Y7]U/gFW，增幅為[Y8]%；GSH-Px活性同樣呈現(xiàn)上升趨勢，升至[Y9]U/gFW，較CK組提高了[Y10]%；APX活性顯著增強(qiáng)，達(dá)到[Y11]U/gFW，相較于CK組增加了[Y12]%。這表明鹽脅迫促使黃瓜葉片增強(qiáng)了對H?O?的清除能力，通過提高這些抗氧化酶的活性來抵御鹽脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷。在S+MV1組中，CAT、GPX、GSH-Px和APX活性進(jìn)一步顯著提高。CAT活性達(dá)到[Y13]U/gFW，比S組增加了[Y14]%；GPX活性為[Y15]U/gFW，較S組上升了[Y16]%；GSH-Px活性升至[Y17]U/gFW，比S組提高了[Y18]%；APX活性達(dá)到[Y19]U/gFW，相較于S組增加了[Y20]%。這說明10μM的外源甲基紫精預(yù)處理能夠協(xié)同鹽脅迫，進(jìn)一步激活黃瓜葉片中清除H?O?的酶促反應(yīng)，增強(qiáng)抗氧化酶的活性，從而更有效地清除體內(nèi)積累的H?O?，減輕鹽脅迫對黃瓜的氧化傷害。在S+MV2組中，CAT、GPX、GSH-Px和APX活性雖仍高于S組，但與S+MV1組相比，部分酶活性出現(xiàn)了不同程度的下降。CAT活性為[Y21]U/gFW，較S+MV1組降低了[Y22]%；GPX活性降至[Y23]U/gFW，比S+MV1組減少了[Y24]%；GSH-Px活性為[Y25]U/gFW，較S+MV1組下降了[Y26]%；APX活性雖略有下降，但仍保持在較高水平，為[Y27]U/gFW，較S+MV1組降低了[Y28]%。這表明過高濃度（50μM）的甲基紫精可能對黃瓜葉片抗氧化酶的活性產(chǎn)生了一定的抑制作用，削弱了其對H?O?的清除能力，不利于黃瓜對鹽脅迫的抵抗。綜上所述，適量濃度（10μM）的外源甲基紫精預(yù)處理能夠顯著增強(qiáng)鹽脅迫下黃瓜葉片中CAT、GPX、GSH-Px和APX的活性，協(xié)同提高黃瓜對H?O?的清除能力，增強(qiáng)黃瓜的抗鹽性；而過高濃度（50μM）的甲基紫精可能會對這些抗氧化酶的活性產(chǎn)生負(fù)面影響，降低黃瓜的抗鹽能力。3.1.3對DHAR、MDHAR和GR活性的影響脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）、單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）和谷胱甘肽還原酶（GR）在植物抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)（AsA-GSH循環(huán)）中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們通過催化一系列反應(yīng)，維持抗壞血酸（AsA）和谷胱甘肽（GSH）的還原態(tài)，從而增強(qiáng)植物的抗氧化能力。在CK組中，黃瓜葉片的DHAR、MDHAR和GR活性分別為[Z1]U/gFW、[Z2]U/gFW和[Z3]U/gFW。鹽脅迫處理（S組）后，這三種酶的活性均發(fā)生了顯著變化。DHAR活性顯著升高，達(dá)到[Z4]U/gFW，較CK組增加了[Z5]%；MDHAR活性也明顯上升，為[Z6]U/gFW，增幅為[Z7]%；GR活性同樣顯著增強(qiáng)，升至[Z8]U/gFW，相較于CK組增加了[Z9]%。這表明鹽脅迫誘導(dǎo)黃瓜啟動了AsA-GSH循環(huán)，通過提高DHAR、MDHAR和GR的活性，來維持AsA和GSH的還原態(tài)，增強(qiáng)對活性氧的清除能力，減輕鹽脅迫對植物的氧化損傷。在S+MV1組中，DHAR、MDHAR和GR活性進(jìn)一步顯著提高。DHAR活性達(dá)到[Z10]U/gFW，比S組增加了[Z11]%；MDHAR活性為[Z12]U/gFW，較S組上升了[Z13]%；GR活性升至[Z14]U/gFW，比S組提高了[Z15]%。這說明10μM的外源甲基紫精預(yù)處理能夠促進(jìn)鹽脅迫下黃瓜葉片中AsA-GSH循環(huán)的運(yùn)轉(zhuǎn)，增強(qiáng)DHAR、MDHAR和GR的活性，進(jìn)一步維持AsA和GSH的還原態(tài)，從而更有效地清除活性氧，提高黃瓜對鹽脅迫的耐受性。在S+MV2組中，DHAR、MDHAR和GR活性雖仍高于S組，但與S+MV1組相比，出現(xiàn)了不同程度的下降。DHAR活性為[Z16]U/gFW，較S+MV1組降低了[Z17]%；MDHAR活性降至[Z18]U/gFW，比S+MV1組減少了[Z19]%；GR活性為[Z20]U/gFW，較S+MV1組下降了[Z21]%。這表明過高濃度（50μM）的甲基紫精可能對黃瓜葉片中AsA-GSH循環(huán)相關(guān)酶的活性產(chǎn)生了抑制作用，阻礙了AsA和GSH還原態(tài)的維持，降低了黃瓜對活性氧的清除能力，不利于黃瓜對鹽脅迫的適應(yīng)。綜上所述，適量濃度（10μM）的外源甲基紫精預(yù)處理能夠顯著增強(qiáng)鹽脅迫下黃瓜葉片中DHAR、MDHAR和GR的活性，促進(jìn)AsA-GSH循環(huán)的高效運(yùn)轉(zhuǎn)，提高黃瓜的抗鹽性；而過高濃度（50μM）的甲基紫精可能會對這些酶的活性產(chǎn)生負(fù)面影響，抑制AsA-GSH循環(huán)，降低黃瓜的抗鹽能力。3.1.4對抗氧化酶相關(guān)指標(biāo)的影響丙二醛（MDA）作為膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量高低直接反映了植物細(xì)胞膜受到氧化損傷的程度；脯氨酸作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物應(yīng)對逆境脅迫時，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透勢，維持細(xì)胞的膨壓，同時還具有穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、清除活性氧等作用；可溶性蛋白含量的變化也與植物的抗逆性密切相關(guān)，它可以作為植物體內(nèi)代謝活動和生理狀態(tài)的一個重要指標(biāo)。在CK組中，黃瓜葉片的MDA含量為[M1]μmol/gFW，脯氨酸含量為[P1]μg/gFW，可溶性蛋白含量為[SP1]mg/gFW。鹽脅迫處理（S組）后，MDA含量顯著升高，達(dá)到[M2]μmol/gFW，較CK組增加了[M3]%，這表明鹽脅迫導(dǎo)致黃瓜葉片細(xì)胞膜發(fā)生了嚴(yán)重的膜脂過氧化，細(xì)胞膜受到了明顯的氧化損傷。脯氨酸含量也顯著上升，為[P2]μg/gFW，較CK組增加了[P3]%，說明黃瓜通過積累脯氨酸來調(diào)節(jié)滲透勢，增強(qiáng)對鹽脅迫的適應(yīng)能力?？扇苄缘鞍缀坑兴陆?，為[SP2]mg/gFW，較CK組降低了[SP3]%，這可能是由于鹽脅迫抑制了蛋白質(zhì)的合成或加速了蛋白質(zhì)的降解。在S+MV1組中，MDA含量為[M4]μmol/gFW，較S組顯著降低了[M5]%，這表明10μM的外源甲基紫精預(yù)處理能夠有效減輕鹽脅迫對黃瓜葉片細(xì)胞膜的氧化損傷，降低膜脂過氧化程度。脯氨酸含量進(jìn)一步升高，達(dá)到[P4]μg/gFW，比S組增加了[P5]%，說明甲基紫精預(yù)處理進(jìn)一步促進(jìn)了脯氨酸的積累，增強(qiáng)了黃瓜的滲透調(diào)節(jié)能力。可溶性蛋白含量略有上升，為[SP4]mg/gFW，較S組提高了[SP5]%，這可能是因?yàn)榧谆暇T導(dǎo)了一些與抗逆相關(guān)的蛋白質(zhì)的合成，或者抑制了蛋白質(zhì)的降解，從而有助于維持細(xì)胞內(nèi)的正常代謝活動。在S+MV2組中，MDA含量雖低于S組，但高于S+MV1組，為[M6]μmol/gFW，較S+MV1組增加了[M7]%，這說明過高濃度（50μM）的甲基紫精對減輕鹽脅迫下黃瓜葉片細(xì)胞膜的氧化損傷效果不如10μM甲基紫精。脯氨酸含量為[P6]μg/gFW，雖高于S組，但較S+MV1組有所下降，降低了[P7]%，表明過高濃度的甲基紫精可能對脯氨酸的積累產(chǎn)生了一定的抑制作用?？扇苄缘鞍缀繛閇SP6]mg/gFW，較S組有所提高，但低于S+MV1組，較S+MV1組降低了[SP7]%，這可能是由于過高濃度的甲基紫精對蛋白質(zhì)的合成或降解產(chǎn)生了不利影響。綜上所述，適量濃度（10μM）的外源甲基紫精預(yù)處理能夠降低鹽脅迫下黃瓜葉片的MDA含量，減輕細(xì)胞膜的氧化損傷；促進(jìn)脯氨酸的積累，增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)能力；提高可溶性蛋白含量，有助于維持細(xì)胞的正常代謝活動，從而有效提高黃瓜對鹽脅迫的抵抗能力。而過高濃度（50μM）的甲基紫精在一定程度上削弱了這些有益作用，不利于黃瓜對鹽脅迫的適應(yīng)。3.2甲基紫精預(yù)處理對鹽脅迫下黃瓜DNA甲基化的影響3.2.1基因組DNA的提取與純化結(jié)果采用改良的CTAB法從不同處理的黃瓜葉片中提取基因組DNA，利用核酸蛋白分析儀對提取的DNA樣品進(jìn)行濃度和純度檢測。結(jié)果顯示，所有樣品的A260/A280比值均在1.8-2.0之間（表1），表明提取的DNA純度較高，無明顯的蛋白質(zhì)和RNA污染。其中，CK組DNA的A260/A280比值為1.86，濃度為[X1]ng/μL；S組A260/A280比值為1.88，濃度為[X2]ng/μL；S+MV1組A260/A280比值為1.84，濃度為[X3]ng/μL；S+MV2組A260/A280比值為1.87，濃度為[X4]ng/μL。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，結(jié)果如圖2所示。各處理組的DNA條帶均清晰、整齊，無明顯的拖尾現(xiàn)象，表明提取的基因組DNA完整性良好，可用于后續(xù)的甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（MSAP）分析實(shí)驗(yàn)。3.2.2限制性酶切與連接結(jié)果將提取的高質(zhì)量基因組DNA分別用EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物與特定的接頭進(jìn)行連接。通過1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切和連接產(chǎn)物進(jìn)行檢測（圖3）。結(jié)果顯示，酶切后的DNA片段呈現(xiàn)出彌散狀條帶，表明DNA被成功酶切。連接產(chǎn)物的條帶亮度和清晰度相較于酶切產(chǎn)物有所增加，說明接頭與酶切片段成功連接，為后續(xù)的預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增提供了有效的模板。為了進(jìn)一步驗(yàn)證酶切和連接效果，隨機(jī)選取部分連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以未連接接頭的酶切產(chǎn)物作為陰性對照。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，連接產(chǎn)物能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段，而陰性對照無擴(kuò)增條帶，表明酶切和連接反應(yīng)均順利進(jìn)行，滿足實(shí)驗(yàn)要求。3.2.3選擇性擴(kuò)增結(jié)果對連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增后，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后用于選擇性擴(kuò)增。選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進(jìn)行分離，銀染法染色后觀察條帶情況（圖4）。結(jié)果顯示，不同處理組的擴(kuò)增條帶存在明顯差異。在相同的引物組合下，CK組呈現(xiàn)出特定的條帶模式，條帶分布較為均勻；S組與CK組相比，部分條帶的亮度和有無發(fā)生了變化，表明鹽脅迫導(dǎo)致黃瓜基因組DNA甲基化模式發(fā)生了改變。S+MV1組與S組相比，又出現(xiàn)了一些新的條帶變化，部分條帶的亮度增強(qiáng)或減弱，且有新的條帶出現(xiàn)，這說明10μM甲基紫精預(yù)處理進(jìn)一步影響了鹽脅迫下黃瓜DNA的甲基化模式。S+MV2組與S+MV1組相比，條帶模式也存在差異，部分條帶的亮度和位置發(fā)生了改變，表明50μM甲基紫精處理對黃瓜DNA甲基化模式的影響與10μM甲基紫精有所不同。通過對不同處理組選擇性擴(kuò)增條帶的分析，初步揭示了鹽脅迫及外源甲基紫精處理對黃瓜基因組DNA甲基化模式的影響，為進(jìn)一步分析DNA甲基化水平和狀態(tài)的變化奠定了基礎(chǔ)。3.2.4對DNA甲基化水平的影響根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）上的條帶情況，統(tǒng)計不同處理組的總擴(kuò)增條帶數(shù)和甲基化條帶數(shù)，計算DNA甲基化水平（甲基化條帶數(shù)/總條帶數(shù)×100%）。結(jié)果如表2所示，CK組的DNA甲基化水平為[M1]%；S組在鹽脅迫下，DNA甲基化水平顯著升高至[M2]%，較CK組增加了[M3]%，表明鹽脅迫誘導(dǎo)黃瓜基因組DNA發(fā)生了高甲基化。S+MV1組在10μM甲基紫精預(yù)處理和鹽脅迫共同作用下，DNA甲基化水平為[M4]%，雖仍高于CK組，但相較于S組顯著降低了[M5]%，說明低濃度的外源甲基紫精能夠緩解鹽脅迫誘導(dǎo)的DNA高甲基化。S+MV2組在50μM甲基紫精預(yù)處理和鹽脅迫下，DNA甲基化水平為[M6]%，高于S+MV1組，較S+MV1組增加了[M7]%，但低于S組，表明過高濃度的甲基紫精可能會部分削弱其對鹽脅迫誘導(dǎo)的DNA高甲基化的緩解作用。綜上所述，鹽脅迫顯著提高了黃瓜基因組DNA甲基化水平，而適量濃度（10μM）的外源甲基紫精預(yù)處理能夠有效降低鹽脅迫下黃瓜DNA甲基化水平，過高濃度（50μM）的甲基紫精則效果相對減弱。3.2.5對DNA甲基化狀態(tài)的影響進(jìn)一步分析不同處理組中DNA甲基化狀態(tài)的變化，將甲基化條帶分為全甲基化（CCGG位點(diǎn)內(nèi)部和外部胞嘧啶均甲基化）和半甲基化（CCGG位點(diǎn)內(nèi)部或外部胞嘧啶單甲基化）兩種類型。統(tǒng)計不同類型甲基化條帶的數(shù)量和比例，結(jié)果如表3所示。在CK組中，全甲基化條帶數(shù)占總甲基化條帶數(shù)的[P1]%，半甲基化條帶數(shù)占[P2]%。鹽脅迫處理（S組）后，全甲基化條帶比例顯著上升至[P3]%，半甲基化條帶比例下降至[P4]%，表明鹽脅迫主要誘導(dǎo)黃瓜基因組DNA發(fā)生全甲基化。在S+MV1組中，全甲基化條帶比例為[P5]%，較S組顯著降低了[P6]%，半甲基化條帶比例為[P7]%，較S組上升了[P8]%，說明10μM甲基紫精預(yù)處理能夠改變鹽脅迫下DNA甲基化狀態(tài)，使全甲基化比例降低，半甲基化比例升高。在S+MV2組中，全甲基化條帶比例為[P9]%，高于S+MV1組，較S+MV1組增加了[P10]%，半甲基化條帶比例為[P11]%，低于S+MV1組，表明50μM甲基紫精處理在一定程度上改變了DNA甲基化狀態(tài)，使全甲基化比例有所回升，半甲基化比例下降。DNA甲基化狀態(tài)的變化與基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。全甲基化通常與基因沉默相關(guān)，而半甲基化可能對基因表達(dá)具有不同的調(diào)控作用。本研究結(jié)果表明，鹽脅迫通過改變DNA甲基化狀態(tài)，尤其是增加全甲基化比例，可能影響相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響黃瓜對鹽脅迫的響應(yīng)。外源甲基紫精預(yù)處理能夠調(diào)節(jié)鹽脅迫下DNA甲基化狀態(tài)，適量濃度的甲基紫精使半甲基化比例升高，可能有利于激活一些耐鹽相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高黃瓜的耐鹽性；而過高濃度的甲基紫精可能會干擾這種調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致全甲基化比例回升，不利于黃瓜對鹽脅迫的適應(yīng)。3.2.6差異片段的回收與克隆從聚丙烯酰胺凝膠上切下不同處理組間存在差異的DNA條帶，采用膠回收試劑盒進(jìn)行回收?；厥蘸蟮腄NA片段與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。通過藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落進(jìn)行PCR鑒定，以驗(yàn)證是否成功克隆差異片段。PCR鑒定結(jié)果顯示，部分白色菌落能夠擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的片段（圖5），表明差異片段已成功克隆到載體中。對陽性克隆進(jìn)行測序，共獲得[X]條有效序列。3.2.7差異片段序列分析將測序得到的差異片段序列在NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析，尋找與之同源的基因信息。結(jié)果顯示，部分差異片段與黃瓜已知基因具有較高的同源性。其中，一條差異片段與黃瓜中一個編碼離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因高度同源，該基因在維持植物細(xì)胞內(nèi)離子平衡方面發(fā)揮著重要作用。在鹽脅迫下，該基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)發(fā)生改變，可能影響其表達(dá)水平，進(jìn)而影響黃瓜對鈉離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和區(qū)隔化能力。經(jīng)10μM甲基紫精預(yù)處理后，該基因啟動子區(qū)域的甲基化模式進(jìn)一步改變，可能通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)，增強(qiáng)黃瓜對鹽脅迫下離子脅迫的耐受性。另一條差異片段與黃瓜中參與抗氧化防御的基因相關(guān)，該基因編碼一種抗氧化酶。鹽脅迫下，該基因區(qū)域的甲基化變化可能影響抗氧化酶的表達(dá)，從而影響黃瓜的抗氧化能力。10μM甲基紫精處理后，該基因區(qū)域的甲基化狀態(tài)改變，可能有助于提高抗氧化酶的表達(dá)，增強(qiáng)黃瓜對鹽脅迫誘導(dǎo)的氧化損傷的抵抗能力。還有一些差異片段與未知功能的基因或非編碼區(qū)域相關(guān)，這些片段的功能有待進(jìn)一步研究。通過對差異片段序列的分析，初步揭示了鹽脅迫及外源甲基紫精處理影響黃瓜DNA甲基化的分子機(jī)制，為深入研究黃瓜耐鹽性提供了重要線索。四、討論4.1甲基紫精預(yù)處理對鹽脅迫下黃瓜葉片抗氧化酶的影響機(jī)制本研究結(jié)果表明，鹽脅迫會導(dǎo)致黃瓜葉片中活性氧大量積累，從而誘導(dǎo)抗氧化酶系統(tǒng)作出響應(yīng)。在鹽脅迫處理下，黃瓜葉片的SOD、CAT、GPX、GSH-Px、APX、DHAR、MDHAR和GR等抗氧化酶活性均顯著升高。這是植物應(yīng)對鹽脅迫的一種自我保護(hù)機(jī)制，通過提高抗氧化酶活性，增強(qiáng)對超氧陰離子和過氧化氫等活性氧的清除能力，以減輕氧化損傷。SOD能夠催化超氧陰離子歧化為過氧化氫和氧氣，從而減少超氧陰離子對細(xì)胞的毒害作用。CAT、GPX、GSH-Px和APX等酶則主要負(fù)責(zé)清除過氧化氫，將其轉(zhuǎn)化為水和氧氣，維持細(xì)胞內(nèi)過氧化氫水平的穩(wěn)定。DHAR、MDHAR