限時(shí)練26基因表達(dá)載體的構(gòu)建及基因工程的技術(shù)應(yīng)用(選擇題每小題3分)一、選擇題1.(2025·福建漳州模擬)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖1所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒,構(gòu)建基因表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化到受體菌中。利用影印法(用無(wú)菌絨布輕蓋在已長(zhǎng)好菌落的原培養(yǎng)基上,然后不轉(zhuǎn)動(dòng)任何角度,“復(fù)印”至新的培養(yǎng)基上)篩選菌株,過(guò)程如圖2所示。下列敘述正確的是()圖1圖2A.為防止目的基因與質(zhì)粒的反向連接,可用HindⅢ和ScaⅠ酶切B.將質(zhì)粒用ScaⅠ酶切后,所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可出現(xiàn)3個(gè)條帶C.目的基因插入TetR中,篩選時(shí)A培養(yǎng)基含四環(huán)素,B培養(yǎng)基含氨芐青霉素D.利用影印法篩選時(shí),能在B培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的是轉(zhuǎn)化成功的菌落2.(2025·江西模擬)受到外源DNA入侵時(shí),細(xì)菌能將外源DNA中特異性序列整合到CRISPR基因上。當(dāng)再受到同樣外源DNA入侵時(shí),細(xì)菌可從CRISPR基因上提取特異性片段,轉(zhuǎn)錄出sgRNA;Cas基因則表達(dá)產(chǎn)生Cas酶,對(duì)外源DNA進(jìn)行分解,兩者共同作用完成對(duì)細(xì)菌自身的保護(hù),過(guò)程如圖所示。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是()A.細(xì)菌將外源DNA整合到CRISPR基因上屬于基因重組B.sgRNA能對(duì)外源DNA進(jìn)行定位且序列越短定位越準(zhǔn)確C.Cas酶能切割磷酸二酯鍵催化外源DNA分解D.通過(guò)設(shè)計(jì)sgRNA可對(duì)動(dòng)物細(xì)胞實(shí)現(xiàn)特定基因的定位二、非選擇題3.(11分)(2025·四川卷)桿菌M2合成的短肽拉索西丁能有效殺死多種臨床耐藥細(xì)菌。拉索西丁能與細(xì)菌的核糖體結(jié)合,阻止攜帶氨基酸的tRNA進(jìn)入核糖體位點(diǎn)2。有人將合成拉索西丁的相關(guān)基因(lrcAlrcF)導(dǎo)入鏈霉菌,基因克隆流程及拉索西丁的作用機(jī)制如下圖?；卮鹣铝袉?wèn)題。注:①F1、F2、F3和F4為與相應(yīng)位置的DNA配對(duì)的單鏈引物,“→”指引物5'3'方向。②密碼子對(duì)應(yīng)的氨基酸為AAA—賴氨酸;AUG—甲硫氨酸(起始);UUC—苯丙氨酸;ACA—蘇氨酸;UCG—絲氨酸。(1)用PCR技術(shù)從桿菌M2基因組中擴(kuò)增lrcAlrcF目的基因時(shí),應(yīng)選用引物。本研究載體使用了鏈霉菌的復(fù)制原點(diǎn),其目的是

。

(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切構(gòu)建的重組質(zhì)粒,產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)應(yīng)產(chǎn)生條電泳條帶,電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物的目的是。

(3)由圖可知,拉索西丁與核糖體結(jié)合后,會(huì)阻止攜帶(填氨基酸名稱)的tRNA進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn),導(dǎo)致,最終引起細(xì)菌死亡。

(4)重組鏈霉菌的目的基因產(chǎn)物經(jīng)驗(yàn)證有殺菌活性,但重組菌在實(shí)驗(yàn)室多次培養(yǎng)后,提取的目的基因產(chǎn)物殺菌活性喪失,可能的原因是。若運(yùn)用發(fā)酵工程來(lái)生產(chǎn)拉索西丁工程藥物,除產(chǎn)物活性外還需進(jìn)一步研究的問(wèn)題有(答出1點(diǎn)即可)。

4.(11分)(2025·黑吉遼蒙卷)香樹(shù)脂醇具有抗炎等功效,從植物中提取難度大、產(chǎn)率低。通過(guò)在酵母菌中表達(dá)外源香樹(shù)脂醇合酶基因N,可高效生產(chǎn)香樹(shù)脂醇?；卮鹣铝袉?wèn)題。(1)可從中查詢基因N的編碼序列,設(shè)計(jì)特定引物。如圖1所示,a鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈,為保證基因N與質(zhì)粒pYL正確連接,需在引物1和引物2的5'端分別引入和限制酶識(shí)別序列。PCR擴(kuò)增基因N,特異性酶切后,利用連接DNA片段,構(gòu)建重組質(zhì)粒,大小約9.5kb(kb為千堿基對(duì)),假設(shè)構(gòu)建重組質(zhì)粒前后,質(zhì)粒pYL對(duì)應(yīng)部分大小基本不變。

圖1注:M為指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物,1~4為菌株號(hào)。圖2(2)進(jìn)一步篩選構(gòu)建的質(zhì)粒,以1~4號(hào)菌株中提取的質(zhì)粒為模板,使用引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳PCR產(chǎn)物,結(jié)果如圖2。在第5組的PCR反應(yīng)中,使用無(wú)菌水代替實(shí)驗(yàn)組的模板DNA,目的是檢驗(yàn)PCR反應(yīng)中是否有的污染。初步判斷實(shí)驗(yàn)組(從“1~4”中選填)的質(zhì)粒中成功插入了基因N,理由是

。

(3)為提高香樹(shù)脂醇合酶催化效率,將編碼第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的堿基序列替換為編碼丙氨酸的堿基序列,丙氨酸的密碼子有GCA等。a是誘變第240位脯氨酸編碼序列的引物(GCA為誘變序列),b、c、d其中一條是誘變第243位苯丙氨酸的引物,其配對(duì)模板與a的配對(duì)模板相同。據(jù)此分析,丙氨酸的密碼子除GCA外,還有。

a:5'…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…3'b:5'…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…3'c:5'…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…3'd:5'…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…3'(4)進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)基因酵母菌發(fā)酵得到的含量并進(jìn)行比較,可以選出最優(yōu)的香樹(shù)脂醇合酶基因的改造方案。

5.(11分)(2025·廣東卷)大腸桿菌是重要工業(yè)菌株之一,其培養(yǎng)過(guò)程可分為快速生長(zhǎng)期和生長(zhǎng)穩(wěn)定期兩個(gè)階段。為了通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成與降解速率來(lái)動(dòng)態(tài)調(diào)控代謝途徑關(guān)鍵酶的蛋白量,使細(xì)胞適配不同階段的生產(chǎn)需求,研究者設(shè)計(jì)了兩種質(zhì)粒,并以穩(wěn)定性好的紅色熒光蛋白mKate2為模式蛋白,測(cè)試質(zhì)粒功能?；卮鹣铝袉?wèn)題。(1)研究者首先構(gòu)建質(zhì)粒①(圖a)用于在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)C末端帶SsrA短肽的mKate2,將質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞后,在添加抗生素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)基上菌落的生長(zhǎng)狀況,結(jié)合PCR及檢測(cè),篩選獲得重組菌株W1。

圖a(2)將W1在適宜條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng),定時(shí)取樣檢測(cè)培養(yǎng)液中細(xì)胞密度,方法有(答一種)。接種前需檢測(cè)液體培養(yǎng)基的熒光強(qiáng)度,其作用是。培養(yǎng)結(jié)果(圖b)表明,進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后熒光強(qiáng)度快速下降,原因是

。

圖b(3)研究者選用啟動(dòng)子PX、X基因(編碼阻遏蛋白X,阻遏PX開(kāi)啟轉(zhuǎn)錄),重新構(gòu)建質(zhì)粒②(圖a),導(dǎo)入野生型大腸桿菌中獲得重組菌株W2。在適宜條件下?lián)u瓶培養(yǎng),W2的生長(zhǎng)趨勢(shì)不變,培養(yǎng)期間熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)為。

(4)莽草酸是一種重要工業(yè)化學(xué)品,其胞內(nèi)合成代謝途徑見(jiàn)圖c。由于野生型大腸桿菌胞內(nèi)酶A活性弱,且莽草酸會(huì)被快速轉(zhuǎn)化為細(xì)胞生長(zhǎng)必需物,因此細(xì)胞中無(wú)法大量積累莽草酸。為了保證細(xì)胞正常生長(zhǎng),并在生長(zhǎng)穩(wěn)定期實(shí)現(xiàn)莽草酸的大量積累,利用上述兩種質(zhì)粒的調(diào)控功能,結(jié)合野生型菌株遺傳物質(zhì)的改造,提出重組生產(chǎn)菌株構(gòu)建思路:

。

碳源→前體……莽草酸……細(xì)胞生長(zhǎng)必需物圖c6.(11分)(2025·河南卷)卡拉膠是一類源于海洋紅藻的大分子多糖,可被某些細(xì)菌降解為具有多種應(yīng)用前景的卡拉膠寡糖。某研究小組擬篩選具有高活性卡拉膠酶(CG)的菌種用于生產(chǎn)卡拉膠寡糖?；卮鹣铝袉?wèn)題。(1)選擇海藻和海泥作為樣本篩選卡拉膠降解菌的原因是。將培養(yǎng)后的菌液混勻并充分,再接種至微孔板中,經(jīng)培養(yǎng)和篩選獲得了CG活性最高的菌種。

(2)為構(gòu)建攜帶cg(CG的編碼基因)的大腸桿菌表達(dá)載體(圖1),對(duì)cg的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,隨后用E.coliDNA連接酶連接。為保證連接準(zhǔn)確性和效率,cg轉(zhuǎn)錄模板鏈的5'端最好含有酶切位點(diǎn)。另有兩組同學(xué)選用了各不相同的雙酶切組合和T4DNA連接酶重復(fù)上述實(shí)驗(yàn),獲得的部分重組質(zhì)粒分子大小符合預(yù)期,但均無(wú)法使用各自構(gòu)建表達(dá)載體的雙酶切組合進(jìn)行切割,其原因是

。

限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)如下:圖1(3)為將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌,需要先用Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞,目的是,隨后在含和的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后,根據(jù)菌落周?chē)袩o(wú)水解透明圈篩選目的菌株。

(4)已知空間上鄰近的兩個(gè)半胱氨酸易形成二硫鍵,從而提升蛋白質(zhì)的耐熱性。為提高CG的耐熱性,研究人員分析了五個(gè)氨基酸位點(diǎn)的空間距離和保守度(保守度值越大表明該位點(diǎn)對(duì)酶的功能越關(guān)鍵),如圖2所示。根據(jù)分析結(jié)果,選擇第位的氨基酸替換成半胱氨酸最合適,原因是

。

圖27.(12分)(2025·山東卷)種子休眠是抵御穗發(fā)芽的一種機(jī)制。通過(guò)對(duì)Ti質(zhì)粒的改造,利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將Ti質(zhì)粒上的TDNA隨機(jī)整合到小麥基因組中,篩選到2個(gè)種子休眠相關(guān)基因的插入失活純合突變體。與野生型相比,突變體種子的萌發(fā)率降低。小麥基因組序列信息已知。注:LB/RB為T(mén)DNA的邊界序列;Kanr為卡那霉素抗性基因;bp為堿基對(duì)。甲Ti質(zhì)粒與抗除草劑基因信息(1)Ti質(zhì)粒上與其在農(nóng)桿菌中的復(fù)制能力相關(guān)的結(jié)構(gòu)為。選用圖甲中的SmaⅠ對(duì)抗除草劑基因X進(jìn)行完全酶切,再選擇SmaⅠ和對(duì)Ti質(zhì)粒進(jìn)行完全酶切,將產(chǎn)生的黏性末端補(bǔ)平,補(bǔ)平時(shí)使用的酶是。利用DNA連接酶將酶切后的包含抗除草劑基因X的片段與酶切并補(bǔ)平的Ti質(zhì)粒進(jìn)行連接,構(gòu)建重組載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌;經(jīng)卡那霉素篩選并提取質(zhì)粒后再選用限制酶進(jìn)行完全酶切并電泳檢測(cè),若電泳結(jié)果呈現(xiàn)一長(zhǎng)一短2條帶,較短的條帶長(zhǎng)度近似為bp,則一定為正向重組質(zhì)粒。

(2)為證明這兩個(gè)突變體是由于TDNA插入小麥基因組中同一基因?qū)е碌?提取基因組DNA,經(jīng)酶切后產(chǎn)生含有TDNA的基因組片段(圖乙)。在此酶切過(guò)程中,限于后續(xù)PCR難以擴(kuò)增大片段DNA,最好使用識(shí)別序列為(填“4”“6”或“8”)個(gè)堿基對(duì)的限制酶,且TDNA中應(yīng)不含該酶的酶切位點(diǎn)。需首先將圖乙的片段,才能利用引物P1和P2成功擴(kuò)增未知序列。PCR擴(kuò)增出未知序列后,進(jìn)行了一系列操作,其中可以判斷出2條片段的未知序列是否屬于同一個(gè)基因的操作為(填“瓊脂糖凝膠電泳”或“測(cè)序和序列比對(duì)”)。

注:P1、P2表示引物。乙基因組DNA酶切后含TDNA的片段(3)通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的含有野生型基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入突變植株,如果檢測(cè)到野生型基因,(填“能”或“不能”)確定該植株的表型為野生型。

參考答案1.B解析若用HindⅢ和ScaⅠ酶切質(zhì)粒,由于質(zhì)粒中有兩個(gè)ScaⅠ的酶切位點(diǎn),因而不一定能防止目的基因與質(zhì)粒的反向連接,A項(xiàng)錯(cuò)誤。由于圖示質(zhì)粒中有兩個(gè)ScaⅠ的酶切位點(diǎn),所以用ScaⅠ酶切質(zhì)粒,能得到三種DNA片段,即完整的片段和兩個(gè)短片段,所得產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳可形成3個(gè)條帶,B項(xiàng)正確。目的基因插入TetR中,則含有重組質(zhì)粒的細(xì)菌對(duì)四環(huán)素不具有抗性,對(duì)氨芐青霉素有抗性,所以A培養(yǎng)基含有氨芐青霉素,B培養(yǎng)基含有四環(huán)素,C項(xiàng)錯(cuò)誤。轉(zhuǎn)化成功的菌落對(duì)氨芐青霉素有抗性,對(duì)四環(huán)素沒(méi)有抗性,所以能夠在A培養(yǎng)基中生長(zhǎng),不能在B培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌落是轉(zhuǎn)化成功的菌落,D項(xiàng)錯(cuò)誤。2.B解析細(xì)菌將外源DNA整合到CRISPR基因上屬于基因重組,A項(xiàng)正確。sgRNA通過(guò)與外源DNA分子一條單鏈互補(bǔ)配對(duì)引導(dǎo)Cas酶到特定基因位點(diǎn)進(jìn)行切割,序列越短,定位越容易發(fā)生脫靶現(xiàn)象,越不準(zhǔn)確,B項(xiàng)錯(cuò)誤。Cas酶切割特定基因位點(diǎn),相當(dāng)于限制酶作用于脫氧核糖和磷酸之間的磷酸二酯鍵,催化外源DNA分解,C項(xiàng)正確。sgRNA可以與外源DNA分子一條單鏈進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì),通過(guò)設(shè)計(jì)sgRNA可對(duì)動(dòng)物細(xì)胞實(shí)現(xiàn)特定基因的定位,D項(xiàng)正確。3.答案(1)F2、F4保證目的基因能在鏈霉菌細(xì)胞中復(fù)制(2)2檢測(cè)重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功(3)苯丙氨酸翻譯過(guò)程無(wú)法正常進(jìn)行,細(xì)菌無(wú)法合成蛋白質(zhì)(4)目的基因發(fā)生突變(或目的基因表達(dá)受到抑制等合理答案)發(fā)酵的最佳條件(或提高發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量的方法、產(chǎn)物的分離和純化方法等合理答案)解析(1)引物需要結(jié)合到模板的3'端,且與目的基因的部分堿基序列互補(bǔ)配對(duì),子鏈延伸方向?yàn)?'端→3'端,因此用PCR技術(shù)從桿菌M2基因組中擴(kuò)增lrcAlrcF目的基因時(shí),應(yīng)選用F2、F4引物。載體使用鏈霉菌的復(fù)制原點(diǎn),是為了保證目的基因能在鏈霉菌細(xì)胞中復(fù)制,使目的基因能夠在鏈霉菌中穩(wěn)定存在并遺傳給后代。(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切構(gòu)建的重組質(zhì)粒,會(huì)得到載體片段和目的基因片段,產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)應(yīng)產(chǎn)生2條電泳條帶。電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物的目的是檢測(cè)重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功,若能得到預(yù)期的載體片段和目的基因片段大小的條帶,說(shuō)明酶切成功,重組質(zhì)粒構(gòu)建可能成功。但是還需要進(jìn)一步的鑒定。(3)觀察拉索西丁的作用機(jī)制圖,結(jié)合所給密碼子信息,可知拉索西丁與核糖體結(jié)合后,會(huì)阻止攜帶苯丙氨酸的tRNA進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)。因?yàn)槲稽c(diǎn)2對(duì)應(yīng)的密碼子是UUC,編碼苯丙氨酸。拉索西丁阻止攜帶苯丙氨酸的tRNA進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn),會(huì)導(dǎo)致翻譯過(guò)程無(wú)法正常進(jìn)行,進(jìn)而使細(xì)菌無(wú)法合成蛋白質(zhì),最終引起細(xì)菌死亡。(4)重組鏈霉菌在實(shí)驗(yàn)室多次培養(yǎng)后,提取的目的基因產(chǎn)物殺菌活性喪失,可能的原因是目的基因發(fā)生突變,導(dǎo)致其表達(dá)的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)改變,從而失去殺菌活性;也可能是目的基因的表達(dá)受到抑制等。若運(yùn)用發(fā)酵工程來(lái)生產(chǎn)拉索西丁工程藥物,除產(chǎn)物活性外還需進(jìn)一步研究的問(wèn)題有:發(fā)酵的最佳條件,如溫度、pH、溶氧量等;如何提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量;產(chǎn)物的分離和純化方法等。4.答案(1)序列數(shù)據(jù)庫(kù)XhoⅠXbaⅠDNA連接酶(2)其他模板1實(shí)驗(yàn)組1的電泳條帶大小與基因N的大小接近(3)GCC(4)香樹(shù)脂醇解析(1)可從序列數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢基因N的編碼序列,設(shè)計(jì)特定引物。如圖1所示,a鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈,所以右端為啟動(dòng)子端,為保證基因N與質(zhì)粒pYL正確連接,右端要與質(zhì)粒pYL中用限制酶SpeⅠ切出的末端(5'A3'TGATC)相連,而限制酶SpeⅠ會(huì)將基因N切斷,所以引物2的5'端應(yīng)引入限制酶XbaⅠ的識(shí)別序列,以便切出與SpeⅠ相同的末端進(jìn)行連接;引物1的5'端則引入限制酶XhoⅠ的識(shí)別序列。PCR擴(kuò)增基因N,特異性酶切后,利用DNA連接酶連接DNA片段。(2)在第5組的PCR反應(yīng)中,使用無(wú)菌水代替實(shí)驗(yàn)組的模板DNA,目的是檢驗(yàn)PCR反應(yīng)中是否有其他模板的污染。初步判斷實(shí)驗(yàn)組1的質(zhì)粒中成功插入了基因N,理由是重組質(zhì)粒的大小約9.5kb,質(zhì)粒pYL的大小約7.2kb,所以基因N的大小約為2.3kb,使用引物1和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增的是基因N,實(shí)驗(yàn)組1的電泳條帶大小約為2.3kb,與基因N的大小接近。(3)a是誘變第240位脯氨酸編碼序列的引物(GCA為誘變序列),據(jù)圖可知,a的5'端顯示的前三個(gè)堿基GCA即為第240位脯氨酸替換為丙氨酸后對(duì)應(yīng)的密碼子序列;又因?yàn)閎、c、d其中一條是誘變第243位苯丙氨酸的引物,其配對(duì)模板與a的配對(duì)模板相同,據(jù)圖可知,只有c的序列與a的序列(244位~250位)相同,故c鏈為誘變第243位苯丙氨酸的引物,5'端顯示的前三個(gè)堿基為第243位苯丙氨酸替換為丙氨酸后對(duì)應(yīng)的密碼子序列GCC。據(jù)此分析,丙氨酸的密碼子除GCA外,還有GCC。(4)進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)基因酵母菌發(fā)酵得到的香樹(shù)脂醇含量并進(jìn)行比較,可以選出最優(yōu)的香樹(shù)脂醇合酶基因的改造方案。5.答案(1)熒光(或mKate2蛋白)(2)顯微鏡直接計(jì)數(shù)法排除培養(yǎng)液本身的熒光強(qiáng)度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾,保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性PGro在生長(zhǎng)穩(wěn)定期停止基因轉(zhuǎn)錄,且C末端帶有SsrA短肽的mKate2被大腸桿菌內(nèi)源蛋白酶系統(tǒng)特異性識(shí)別并降解(3)快速生長(zhǎng)期熒光強(qiáng)度弱,生長(zhǎng)穩(wěn)定期熒光強(qiáng)度迅速上升(4)用酶A基因替換質(zhì)粒②中mKate2基因,用酶B基因替換質(zhì)粒①中mKate2基因,構(gòu)建酶B基因缺失的大腸桿菌突變菌株,并導(dǎo)入上述質(zhì)粒解析(1)在基因工程中,結(jié)合PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因片段,可檢測(cè)目的基因是否成功導(dǎo)入,依據(jù)熒光(mKate2蛋白)檢測(cè)篩選出含有目的基因的重組菌株W1。(2)檢測(cè)培養(yǎng)液中細(xì)胞密度時(shí),由于大腸桿菌細(xì)胞是肉眼無(wú)法直接觀察到的,因此常用的方法有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法,顯微鏡直接計(jì)數(shù)法可通過(guò)細(xì)菌計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接數(shù)出細(xì)胞數(shù)量。接種前需要檢測(cè)液體培養(yǎng)基的熒光強(qiáng)度,其目的是排除培養(yǎng)液本身的熒光強(qiáng)度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。根據(jù)圖a中的注釋可知,PGro在生長(zhǎng)穩(wěn)定期停止基因轉(zhuǎn)錄,且C末端帶有SsrA短肽的mKate2可被大腸桿菌內(nèi)源蛋白酶系統(tǒng)特異性識(shí)別并降解,由于紅色熒光蛋白mKate2減少,因此進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期后熒光強(qiáng)度快速下降。(3)圖a中的質(zhì)粒②,由于啟動(dòng)子PGro在細(xì)胞快速生長(zhǎng)期開(kāi)啟轉(zhuǎn)錄,會(huì)使X基因編碼的阻遏蛋白X阻遏PX開(kāi)啟轉(zhuǎn)錄,致使mKate2熒光蛋白表達(dá)受阻,同時(shí)X上帶有SsrA短肽,又會(huì)被大腸桿菌不斷降解,因此快速生長(zhǎng)期熒光強(qiáng)度弱;而到了生長(zhǎng)穩(wěn)定期PGro停止基因轉(zhuǎn)錄,阻遏蛋白X又被不斷降解而含量下降,PX開(kāi)始大量轉(zhuǎn)錄,熒光蛋白不斷積累,熒光強(qiáng)度不斷上升。(4)根據(jù)(2)(3)知,用酶A基因替換質(zhì)粒②中mKate2基因,使其在生長(zhǎng)穩(wěn)定期能持續(xù)合成酶A,從而促進(jìn)莽草酸的合成,用酶B基因替換質(zhì)粒①中mKate2基因,構(gòu)建酶B基因缺失的大腸桿菌突變菌株,并導(dǎo)入上述質(zhì)粒,使其在生長(zhǎng)穩(wěn)定期時(shí)酶B合成大量減少,從而實(shí)現(xiàn)莽草酸的大量積累。因此,為保證細(xì)胞正常生長(zhǎng),并在生長(zhǎng)穩(wěn)定期實(shí)現(xiàn)莽草酸的大量積累,重組生產(chǎn)菌株構(gòu)建思路見(jiàn)答案。6.答案(1)在富含卡拉膠的環(huán)境中,存在能夠分解卡拉膠的微生物的可能性較大稀釋(2)BamHⅠ重組質(zhì)粒連接處的序列不再是原來(lái)的限制酶識(shí)別序列(3)使細(xì)胞處于一種能吸收周?chē)h(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)卡拉膠四環(huán)素(4)44該位點(diǎn)的氨基酸空間上離半胱氨酸更近,容易形成二硫鍵,而且保守度低,替換后對(duì)酶功能的影響較小解析(1)卡拉膠是一類源于海洋紅藻的大分子多糖,可被某些細(xì)菌降解為具有多種應(yīng)用前景的卡拉膠寡糖。由于在富含卡拉膠的環(huán)境中,存在能夠分解卡拉膠的微生物的可能性較大,因此可選擇海藻和海泥作為樣本篩選卡拉膠降解菌。將培養(yǎng)后的菌液混勻并充分稀釋,再接種至微孔板中,經(jīng)培養(yǎng)和篩選獲得了CG活性最高的菌種。(2)E.coliDNA連接酶連接具有平末端的DNA片段的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于T4DNA連接酶,因此為保證連接準(zhǔn)確性和效率,切割質(zhì)粒和目的基因時(shí)不能選擇切成平末端的限制酶,即不能選擇EcoRⅤ和SmaⅠ。而SpeⅠ與XbaⅠ切割后形成的黏性末端相同,若選擇SpeⅠ與XbaⅠ切割,會(huì)出現(xiàn)質(zhì)粒和目的基因的自連甚至目的基因倒接,因此切割質(zhì)粒時(shí)SpeⅠ與XbaⅠ中只能選擇一個(gè),而另一個(gè)限制酶需要選擇BamHⅠ。又由于轉(zhuǎn)錄的方向是由啟動(dòng)子→終止子,且mRNA形成的方向是5'→3',且mRNA與DNA的模板鏈方向相反,因此基因模板鏈的3'端應(yīng)靠近啟動(dòng)子,故為保證連接準(zhǔn)確性和效率,cg轉(zhuǎn)錄模板鏈的5'端最好含有BamHⅠ酶切位點(diǎn)。由于限制酶的識(shí)別序列具有專一性,若連接后的序列不存在最初限制酶的識(shí)別序列,則可能導(dǎo)致重組質(zhì)粒無(wú)法使