多組學(xué)視角下益生乳酸菌降糖降脂功效與作用機(jī)制深度剖析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1血糖血脂異?，F(xiàn)狀在全球范圍內(nèi)，血糖血脂異常已成為日益嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人們生活方式的顯著改變，如高熱量飲食攝入增加、體力活動(dòng)減少以及精神壓力增大等，血糖血脂異常的患病率呈現(xiàn)出急劇上升的趨勢。國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）的數(shù)據(jù)顯示，2021年全球糖尿病患者人數(shù)已達(dá)5.37億，預(yù)計(jì)到2045年將增至7.83億。而血脂異常同樣不容小覷，據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計(jì)，全球約有三分之一的成年人存在血脂異常問題。在中國，情況也頗為嚴(yán)峻?！吨袊难芙】蹬c疾病報(bào)告2021》指出，我國血脂異常人數(shù)已超4億，成人糖尿病患病率達(dá)12.8%。血糖血脂異常不僅發(fā)病率高，還呈現(xiàn)出年輕化的態(tài)勢，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。長期處于高血糖和高血脂狀態(tài)，會(huì)對人體健康造成嚴(yán)重危害，極易引發(fā)一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥。高血糖是糖尿病的主要特征，長期高血糖可導(dǎo)致糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病神經(jīng)病變等微血管并發(fā)癥，增加腎衰竭、失明、截肢等風(fēng)險(xiǎn)；還會(huì)引發(fā)大血管并發(fā)癥，如冠心病、腦卒中等心腦血管疾病，這些并發(fā)癥是糖尿病患者致殘、致死的主要原因。高血脂則是動(dòng)脈粥樣硬化的重要危險(xiǎn)因素，會(huì)導(dǎo)致血管壁增厚、變硬，管腔狹窄，進(jìn)而引發(fā)冠心病、心肌梗死、腦卒中等心腦血管疾病。此外，血脂異常還與脂肪肝、胰腺炎等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。面對如此嚴(yán)峻的血糖血脂異?，F(xiàn)狀，傳統(tǒng)的治療方法主要包括藥物治療、飲食控制和運(yùn)動(dòng)干預(yù)等。藥物治療雖然在一定程度上能夠有效控制血糖血脂水平，但存在諸多局限性。長期使用藥物可能會(huì)產(chǎn)生各種副作用，如低血糖、肝腎功能損害、胃腸道不適等，影響患者的生活質(zhì)量和依從性。而且藥物治療費(fèi)用較高，給患者和社會(huì)帶來了較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。飲食控制和運(yùn)動(dòng)干預(yù)雖然是健康的生活方式，但對于大多數(shù)患者來說，難以長期堅(jiān)持，效果也因人而異。因此，迫切需要尋找一種安全、有效、便捷的新型降糖降脂方法，以滿足廣大患者的需求，降低血糖血脂異常相關(guān)疾病的發(fā)生率和死亡率，減輕社會(huì)和家庭的負(fù)擔(dān)。1.1.2益生乳酸菌研究價(jià)值在探索新型降糖降脂方法的過程中，益生乳酸菌逐漸成為研究的熱點(diǎn)。益生乳酸菌是一類對宿主有益的乳酸菌，廣泛存在于人體腸道、發(fā)酵食品等環(huán)境中。與傳統(tǒng)的降糖降脂方法相比，益生乳酸菌具有諸多獨(dú)特的優(yōu)勢。從安全性角度來看，益生乳酸菌是天然存在的微生物，一般被認(rèn)為是安全的（GRAS），不會(huì)像藥物那樣產(chǎn)生明顯的副作用，對人體健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)較低。在便捷性方面，益生乳酸菌可以通過日常飲食攝入，如飲用含有益生乳酸菌的酸奶、發(fā)酵乳飲料等，無需復(fù)雜的服藥過程，患者更容易接受和堅(jiān)持。大量的研究已經(jīng)表明，益生乳酸菌在降糖降脂方面展現(xiàn)出良好的功效。在降血糖方面，一些益生乳酸菌能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，改善腸道屏障功能，減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生，從而減輕炎癥反應(yīng)，提高胰島素敏感性，降低血糖水平。某些益生乳酸菌還可以通過調(diào)節(jié)肝臟糖代謝相關(guān)酶的活性，抑制糖異生，促進(jìn)糖原合成，進(jìn)一步降低血糖。在降血脂方面，益生乳酸菌可以通過多種途徑發(fā)揮作用。它能夠抑制膽固醇的合成，促進(jìn)膽固醇的排泄，降低血液中膽固醇的含量；還可以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，減少甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的合成，增加高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的含量，從而改善血脂譜。然而，目前對于益生乳酸菌降糖降脂的具體作用機(jī)制尚未完全明確。雖然已有一些研究提出了可能的作用途徑，但這些機(jī)制往往是基于單一的研究方法或有限的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出的，缺乏全面性和系統(tǒng)性的深入探究。深入解析益生乳酸菌降糖降脂的作用機(jī)制，不僅有助于我們從分子層面揭示其內(nèi)在的生物學(xué)過程，進(jìn)一步豐富和完善微生物與人體健康相互作用的理論體系，還能為開發(fā)基于益生乳酸菌的新型降糖降脂療法提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。通過明確作用機(jī)制，可以篩選出具有更高效降糖降脂功能的益生乳酸菌菌株，優(yōu)化益生乳酸菌產(chǎn)品的配方和生產(chǎn)工藝，提高其降糖降脂效果，為血糖血脂異?；颊咛峁└行У闹委熓侄危哂兄匾睦碚撘饬x和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)1.2.1研究目的本研究旨在運(yùn)用多組學(xué)聯(lián)合分析技術(shù)，深入探究益生乳酸菌的降糖降脂功效，并全面解析其內(nèi)在作用機(jī)制。具體而言，主要包含以下三個(gè)方面的目標(biāo)：精準(zhǔn)評估益生乳酸菌的降糖降脂功效：通過精心設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膭?dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究，運(yùn)用先進(jìn)、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)和指標(biāo)，精確測定攝入益生乳酸菌后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人體的血糖、血脂水平的動(dòng)態(tài)變化情況。細(xì)致觀察血糖相關(guān)指標(biāo)，如空腹血糖、餐后血糖、糖化血紅蛋白等的波動(dòng)，以及血脂相關(guān)指標(biāo)，如總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇等的改變，從而全面、科學(xué)、準(zhǔn)確地評估益生乳酸菌在降低血糖和血脂方面的實(shí)際功效。深度解析益生乳酸菌降糖降脂的分子機(jī)制：綜合運(yùn)用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)，從基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白和代謝物等多個(gè)層面，系統(tǒng)分析益生乳酸菌干預(yù)后，機(jī)體內(nèi)部的分子變化過程。深入探究益生乳酸菌對糖脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，以及對相關(guān)信號(hào)通路的激活或抑制作用，揭示其在分子水平上調(diào)節(jié)糖脂代謝的內(nèi)在機(jī)制。挖掘益生乳酸菌降糖降脂的關(guān)鍵靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物：基于多組學(xué)數(shù)據(jù)分析結(jié)果，結(jié)合生物信息學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，精準(zhǔn)篩選出與益生乳酸菌降糖降脂功效密切相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。這些關(guān)鍵靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物不僅有助于深入理解益生乳酸菌的作用機(jī)制，還為開發(fā)基于益生乳酸菌的新型降糖降脂產(chǎn)品提供了重要的理論依據(jù)和潛在的應(yīng)用靶點(diǎn)，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2.2創(chuàng)新點(diǎn)本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在研究方法和研究視角兩個(gè)關(guān)鍵方面：研究方法創(chuàng)新：開創(chuàng)性地將基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)進(jìn)行有機(jī)整合，應(yīng)用于益生乳酸菌降糖降脂功效及作用機(jī)制的研究。這種多組學(xué)聯(lián)合分析的方法，突破了傳統(tǒng)單一組學(xué)研究的局限性，能夠從多個(gè)維度、不同層次全面地獲取益生乳酸菌干預(yù)后機(jī)體的分子變化信息，為深入解析其作用機(jī)制提供了更豐富、更全面的數(shù)據(jù)支持，使研究結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠、深入。研究視角創(chuàng)新：從多維度視角出發(fā)，綜合考慮益生乳酸菌對機(jī)體腸道菌群、代謝產(chǎn)物、基因表達(dá)以及信號(hào)通路等多個(gè)層面的影響，全面揭示其降糖降脂的作用機(jī)制。以往的研究往往側(cè)重于某一個(gè)方面，難以全面闡述益生乳酸菌的作用機(jī)制。本研究通過多維度的綜合分析，能夠更系統(tǒng)、更深入地理解益生乳酸菌與機(jī)體之間的相互作用關(guān)系，發(fā)現(xiàn)新的作用途徑和機(jī)制，為益生乳酸菌在降糖降脂領(lǐng)域的應(yīng)用提供全新的理論依據(jù)和研究思路。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1國外研究現(xiàn)狀國外對于益生乳酸菌降糖降脂的研究起步較早，在菌株篩選、功效驗(yàn)證和機(jī)制探索等方面取得了一系列成果。在菌株篩選上，眾多研究致力于從各種天然來源中尋找具有高效降糖降脂功能的益生乳酸菌菌株。比如，有研究人員從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離出嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌等菌株，并對其進(jìn)行了深入研究。通過體外實(shí)驗(yàn)，如膽固醇同化實(shí)驗(yàn)、膽鹽水解酶活性測定等，初步篩選出具有潛在降血脂能力的菌株；利用葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)、胰島素抵抗細(xì)胞模型等，評估菌株的降血糖能力。在功效驗(yàn)證方面，大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究為益生乳酸菌的降糖降脂功效提供了有力證據(jù)。一項(xiàng)針對高脂血癥小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，給予嗜酸乳桿菌干預(yù)后，小鼠的血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇水平顯著降低，高密度脂蛋白膽固醇水平有所升高，表明嗜酸乳桿菌具有良好的降血脂效果。在臨床研究中，對部分2型糖尿病患者進(jìn)行為期12周的雙歧桿菌補(bǔ)充干預(yù)，結(jié)果顯示患者的空腹血糖、糖化血紅蛋白水平明顯下降，胰島素敏感性得到提高，證實(shí)了雙歧桿菌在降血糖方面的功效。在作用機(jī)制研究上，國外學(xué)者從多個(gè)角度進(jìn)行了探索。從腸道菌群調(diào)節(jié)角度來看，研究發(fā)現(xiàn)益生乳酸菌可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加有益菌如阿克曼菌、雙歧桿菌的豐度，減少有害菌如大腸桿菌、腸球菌的數(shù)量，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，從而間接影響糖脂代謝。腸道菌群的改變能夠影響短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，短鏈脂肪酸可以作用于腸道內(nèi)分泌細(xì)胞，調(diào)節(jié)腸道激素如胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）、肽YY（PYY）的分泌，進(jìn)而影響血糖血脂代謝。從代謝途徑角度分析，一些研究揭示了益生乳酸菌可以調(diào)節(jié)肝臟中脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）等脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶的活性，抑制脂肪酸和甘油三酯的合成；還可以調(diào)節(jié)肝臟中糖異生關(guān)鍵酶如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）的活性，減少糖異生，降低血糖水平。此外，國外研究還關(guān)注到益生乳酸菌對宿主免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用與糖脂代謝之間的關(guān)聯(lián)，認(rèn)為益生乳酸菌可以通過抑制炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的產(chǎn)生，減輕慢性炎癥反應(yīng)，改善胰島素抵抗，從而降低血糖血脂。1.3.2國內(nèi)研究現(xiàn)狀國內(nèi)在益生乳酸菌降糖降脂領(lǐng)域的研究近年來也取得了顯著進(jìn)展。在菌株資源挖掘方面，國內(nèi)研究人員充分利用豐富的本土微生物資源，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品、人體腸道等樣本中分離鑒定出多種具有降糖降脂潛力的益生乳酸菌。例如，從新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到的植物乳桿菌，經(jīng)過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，表現(xiàn)出良好的降低血糖血脂的能力。通過對其全基因組測序和功能基因分析，發(fā)現(xiàn)該菌株含有與糖脂代謝相關(guān)的基因簇，為深入研究其作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)。在功效研究方面，國內(nèi)開展了大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和小規(guī)模的臨床研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用高脂高糖飼料誘導(dǎo)的糖尿病小鼠、高血脂大鼠等模型，研究不同益生乳酸菌菌株或其制劑的降糖降脂效果。結(jié)果表明，多種益生乳酸菌能夠顯著降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血糖血脂水平，改善其糖脂代謝紊亂狀況。在臨床研究方面，一些針對輕度血脂異常人群或糖耐量受損人群的干預(yù)試驗(yàn)顯示，攝入含有益生乳酸菌的發(fā)酵制品后，受試者的血脂、血糖指標(biāo)得到一定程度的改善。在作用機(jī)制研究上，國內(nèi)學(xué)者在借鑒國外研究的基礎(chǔ)上，也有了自己的創(chuàng)新和發(fā)現(xiàn)。一方面，深入研究益生乳酸菌對腸道屏障功能的影響，發(fā)現(xiàn)益生乳酸菌可以通過增強(qiáng)腸道緊密連接蛋白如閉合蛋白（Occludin）、閉鎖小帶蛋白-1（ZO-1）的表達(dá)，改善腸道屏障功能，減少內(nèi)毒素的滲漏，從而減輕炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)糖脂代謝。另一方面，從腸道菌群代謝產(chǎn)物角度進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)益生乳酸菌代謝產(chǎn)生的某些特殊代謝產(chǎn)物，如γ-氨基丁酸（GABA）、共軛亞油酸（CLA）等，具有直接或間接調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用。GABA可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，影響胰島素的分泌和作用，從而降低血糖；CLA則可以調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化和脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，減少脂肪堆積，降低血脂。此外，國內(nèi)研究還關(guān)注到益生乳酸菌與宿主基因表達(dá)之間的相互作用，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，益生乳酸菌干預(yù)后，宿主肝臟、脂肪組織等器官中多個(gè)與糖脂代謝相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，進(jìn)一步揭示了益生乳酸菌在基因水平上對糖脂代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制。1.3.3研究現(xiàn)狀分析國內(nèi)外對于益生乳酸菌降糖降脂的研究雖然取得了一定的成果，但仍存在一些不足之處，主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：研究方法局限性：目前多數(shù)研究僅采用單一的研究方法，如體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或小規(guī)模的臨床研究，難以全面、準(zhǔn)確地評估益生乳酸菌的降糖降脂功效和作用機(jī)制。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)雖然可以在一定程度上模擬體內(nèi)環(huán)境，但無法完全反映益生乳酸菌在復(fù)雜的人體生理環(huán)境中的作用；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與人體生理狀態(tài)存在差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推至人體時(shí)存在一定的不確定性；小規(guī)模的臨床研究樣本量有限，研究時(shí)間較短，結(jié)果的可靠性和普遍性有待進(jìn)一步提高。作用機(jī)制解析不全面：雖然目前已經(jīng)提出了多種益生乳酸菌降糖降脂的作用機(jī)制，但這些機(jī)制往往是基于單一的研究角度或有限的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出的，缺乏系統(tǒng)性和綜合性的深入探究。對于益生乳酸菌如何通過多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用來調(diào)節(jié)糖脂代謝，以及不同作用機(jī)制之間的相互關(guān)系，仍缺乏全面、深入的了解。例如，在腸道菌群調(diào)節(jié)方面，雖然已知益生乳酸菌可以改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，但對于腸道菌群的變化如何通過復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)通路影響宿主的糖脂代謝，以及宿主自身的遺傳背景和生活方式等因素對這一過程的影響，還需要進(jìn)一步研究。缺乏多組學(xué)聯(lián)合研究：多組學(xué)技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，但在益生乳酸菌降糖降脂研究中，多組學(xué)聯(lián)合分析的應(yīng)用還相對較少。目前的研究大多局限于單一組學(xué)層面，如僅從基因組學(xué)角度研究益生乳酸菌的基因組成和功能，或僅從代謝組學(xué)角度分析益生乳酸菌干預(yù)后宿主代謝產(chǎn)物的變化，難以從整體上全面揭示益生乳酸菌降糖降脂的分子機(jī)制。缺乏多組學(xué)聯(lián)合研究，使得我們無法深入了解益生乳酸菌與宿主之間在基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白和代謝物等多個(gè)層面的相互作用關(guān)系，限制了對其作用機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)。本研究針對上述不足，創(chuàng)新性地運(yùn)用多組學(xué)聯(lián)合分析技術(shù)，全面、系統(tǒng)地研究益生乳酸菌的降糖降脂功效及作用機(jī)制。通過整合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等多組學(xué)數(shù)據(jù)，從多個(gè)維度、不同層次深入解析益生乳酸菌與宿主之間的相互作用關(guān)系，有望揭示其潛在的作用機(jī)制，為開發(fā)基于益生乳酸菌的新型降糖降脂產(chǎn)品提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和技術(shù)支持，具有重要的研究價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)與技術(shù)2.1益生乳酸菌概述益生乳酸菌是乳酸菌的一個(gè)特殊類別，是一類對宿主健康具有積極促進(jìn)作用的活性微生物。從分類學(xué)角度來看，乳酸菌并非嚴(yán)格意義上的分類學(xué)單元，而是一類可以發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱，在細(xì)菌界中分布廣泛，涉及熱孢菌門、厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門和梭桿菌門等五個(gè)門，包含乳桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、片球菌屬等43個(gè)屬。而益生乳酸菌則是其中具有益生功能的部分菌株，常見于乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、鏈球菌屬中的嗜熱鏈球菌以及片球菌屬等。這些菌種在形態(tài)、代謝特性和生理功能上各有特點(diǎn)。在形態(tài)方面，益生乳酸菌菌體大多呈桿狀或球狀。例如，嗜酸乳桿菌屬于乳桿菌屬，其菌體形態(tài)為桿狀；而嗜熱鏈球菌屬于鏈球菌屬，菌體呈圓形或卵（橢）圓形，且成對地鏈狀排列。在代謝特性上，益生乳酸菌以發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸為主要代謝特征，根據(jù)發(fā)酵類型可分為同型發(fā)酵和異型發(fā)酵。同型發(fā)酵乳酸菌如乳球菌屬中的乳酸乳球菌，發(fā)酵葡萄糖時(shí)幾乎只產(chǎn)生乳酸；而異型發(fā)酵乳酸菌在發(fā)酵過程中除了產(chǎn)生乳酸外，還會(huì)產(chǎn)生乙醇、乙酸和二氧化碳等其他產(chǎn)物，如雙歧桿菌屬的部分菌種。在生理功能方面，不同的益生乳酸菌菌種具有各自獨(dú)特的功能。雙歧桿菌屬的動(dòng)物雙歧桿菌Bb-12，能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，促進(jìn)腸道內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，對維持腸道健康發(fā)揮著重要作用；乳桿菌屬的嗜酸乳桿菌可以產(chǎn)生多種有機(jī)酸和抗菌物質(zhì)，抑制腸道內(nèi)有害菌的生長繁殖，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，同時(shí)還能參與維生素的合成和代謝，對人體健康有益。益生乳酸菌在食品、醫(yī)療保健等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。在食品領(lǐng)域，益生乳酸菌是發(fā)酵食品的重要發(fā)酵劑。在酸奶的制作過程中，常常會(huì)添加保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為發(fā)酵菌種，它們利用牛奶中的乳糖進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)生乳酸，使牛奶的pH值降低，蛋白質(zhì)凝固，從而形成酸奶獨(dú)特的質(zhì)地和風(fēng)味。同時(shí)，這兩種益生乳酸菌還能產(chǎn)生一些有益的代謝產(chǎn)物，如維生素、酶類等，不僅豐富了酸奶的營養(yǎng)價(jià)值，還具有改善消化吸收、增強(qiáng)免疫力等功效。在奶酪的生產(chǎn)中，乳球菌屬的乳酸乳球菌等益生乳酸菌發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它們能夠發(fā)酵乳糖產(chǎn)生乳酸，降低奶酪的pH值，抑制有害微生物的生長，保證奶酪的品質(zhì)和安全性。而且，益生乳酸菌在發(fā)酵過程中還能分解蛋白質(zhì)和脂肪，產(chǎn)生各種風(fēng)味物質(zhì)，賦予奶酪獨(dú)特的香氣和口感。此外，益生乳酸菌還被廣泛應(yīng)用于泡菜、酸菜等發(fā)酵蔬菜制品的制作中。例如，植物乳桿菌在泡菜發(fā)酵過程中大量繁殖，利用蔬菜中的糖類發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，使泡菜具有酸爽可口的味道，同時(shí)還能延長泡菜的保質(zhì)期。植物乳桿菌還能合成多種維生素，如維生素C、維生素K等，提高泡菜的營養(yǎng)價(jià)值。在醫(yī)療保健領(lǐng)域，益生乳酸菌的應(yīng)用也十分廣泛。在調(diào)節(jié)腸道菌群平衡方面，雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌等益生乳酸菌能夠定植于腸道，通過競爭營養(yǎng)物質(zhì)、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)等方式抑制有害菌的生長，增加有益菌的數(shù)量，維持腸道微生態(tài)的平衡。當(dāng)腸道菌群失調(diào)時(shí)，如因使用抗生素、飲食不當(dāng)?shù)仍驅(qū)е履c道內(nèi)有害菌大量繁殖，有益菌數(shù)量減少，可能會(huì)引發(fā)腹瀉、便秘等腸道疾病。此時(shí)，補(bǔ)充益生乳酸菌可以幫助恢復(fù)腸道菌群的平衡，緩解腸道不適癥狀。在增強(qiáng)免疫力方面，益生乳酸菌可以通過激活免疫細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫因子的分泌等方式，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。研究表明，某些益生乳酸菌能夠刺激腸道黏膜免疫系統(tǒng)，增加免疫球蛋白A（IgA）的分泌，提高腸道黏膜的免疫力，從而抵御病原體的入侵。在預(yù)防和治療疾病方面，益生乳酸菌也具有一定的作用。一些研究發(fā)現(xiàn)，攝入含有益生乳酸菌的制劑或食品，可以降低膽固醇水平，預(yù)防心血管疾病的發(fā)生；還可以改善胰島素抵抗，降低血糖水平，對預(yù)防和輔助治療糖尿病具有一定的效果。此外，益生乳酸菌在緩解乳糖不耐受、預(yù)防齲齒等方面也有一定的應(yīng)用。2.2多組學(xué)技術(shù)原理與應(yīng)用2.2.1基因組學(xué)基因組學(xué)是一門致力于研究生物體全基因組的科學(xué)，其核心原理是對生物體基因組的DNA序列進(jìn)行全面測定和深入分析。通過全基因組測序技術(shù)，如第二代測序技術(shù)（Illumina測序）和第三代測序技術(shù)（PacBio測序、Nanopore測序）等，可以快速、準(zhǔn)確地獲取生物體基因組的完整序列信息。這些測序技術(shù)基于不同的原理，第二代測序技術(shù)主要采用邊合成邊測序的方法，能夠在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的短讀長序列；第三代測序技術(shù)則能夠?qū)崿F(xiàn)單分子測序，產(chǎn)生更長的讀長，有助于解決基因組中復(fù)雜區(qū)域的測序問題。在益生乳酸菌研究中，基因組學(xué)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。通過對益生乳酸菌的基因組進(jìn)行測序和分析，可以深入了解其遺傳特性?？梢源_定益生乳酸菌的種屬分類地位，明確其與其他乳酸菌菌株之間的親緣關(guān)系。通過分析基因組中的基因組成和結(jié)構(gòu)，能夠挖掘出與益生乳酸菌降糖降脂功能密切相關(guān)的關(guān)鍵基因。一些研究通過對具有降糖降脂功效的益生乳酸菌進(jìn)行基因組測序，發(fā)現(xiàn)了編碼膽鹽水解酶、多糖合成酶等的基因。膽鹽水解酶基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠水解結(jié)合膽鹽，促進(jìn)膽固醇的排泄，從而降低血脂水平；多糖合成酶基因參與合成的多糖物質(zhì)可能具有調(diào)節(jié)腸道菌群、改善腸道屏障功能等作用，間接影響糖脂代謝。基因組學(xué)研究還可以揭示益生乳酸菌的代謝途徑和調(diào)控機(jī)制。通過分析基因組中與代謝相關(guān)的基因簇和操縱子，可以了解益生乳酸菌在糖脂代謝過程中的關(guān)鍵代謝步驟和酶促反應(yīng)。對益生乳酸菌基因組中調(diào)控元件的研究，有助于揭示其基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，為進(jìn)一步優(yōu)化益生乳酸菌的降糖降脂功能提供理論基礎(chǔ)。2.2.2轉(zhuǎn)錄組學(xué)轉(zhuǎn)錄組學(xué)是研究生物體在特定發(fā)育階段或特定生理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)錄成mRNA的所有基因的表達(dá)情況的學(xué)科。其原理基于高通量測序技術(shù)，首先從細(xì)胞或組織中提取總RNA，然后將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，構(gòu)建cDNA文庫，再對cDNA進(jìn)行高通量測序，從而獲得大量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。通過對這些數(shù)據(jù)的分析，可以實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)量的計(jì)算、差異表達(dá)分析以及基因功能注釋等，進(jìn)而揭示特定生理或病理狀態(tài)下的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。在益生乳酸菌的研究中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠有效揭示其在不同條件下的基因表達(dá)變化，為深入探究其降糖降脂作用機(jī)制提供關(guān)鍵線索。在探究益生乳酸菌對高脂高糖環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制時(shí)，運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對比分析益生乳酸菌在正常培養(yǎng)基和高脂高糖培養(yǎng)基中的基因表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高脂高糖條件下，一些與糖代謝相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生顯著變化。例如，編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因表達(dá)上調(diào)，這可能有助于益生乳酸菌更高效地?cái)z取葡萄糖，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的糖濃度；而參與糖異生途徑的關(guān)鍵酶基因表達(dá)下調(diào)，從而減少糖異生過程，降低葡萄糖的合成，最終對宿主的血糖水平產(chǎn)生影響。在研究益生乳酸菌與宿主相互作用的過程中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)同樣發(fā)揮著重要作用。通過對宿主細(xì)胞在益生乳酸菌干預(yù)前后的轉(zhuǎn)錄組分析，可以發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞中與糖脂代謝相關(guān)的信號(hào)通路發(fā)生改變。某些信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，進(jìn)而影響相關(guān)酶的活性和蛋白的表達(dá)水平，最終調(diào)節(jié)宿主的糖脂代謝。這些研究結(jié)果有助于從分子層面深入理解益生乳酸菌的降糖降脂作用機(jī)制，為開發(fā)基于益生乳酸菌的新型降糖降脂產(chǎn)品提供有力的理論支持。2.2.3蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)是一門全面研究生物體蛋白質(zhì)組成及其活動(dòng)規(guī)律的學(xué)科。其技術(shù)原理主要包括蛋白質(zhì)的分離、鑒定和定量分析。在蛋白質(zhì)分離方面，常用的技術(shù)有雙向凝膠電泳（2-DE）和液相色譜（LC）。雙向凝膠電泳通過等電聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳兩個(gè)維度，依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量差異對其進(jìn)行分離，從而得到蛋白質(zhì)的二維圖譜；液相色譜則利用不同蛋白質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)差異，實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)的分離。在蛋白質(zhì)鑒定環(huán)節(jié)，質(zhì)譜技術(shù)（MS）是最為常用的方法。質(zhì)譜技術(shù)能夠精確測定蛋白質(zhì)的分子量，并通過對蛋白質(zhì)酶解肽段的質(zhì)量分析，結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索，實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確鑒定。常見的質(zhì)譜技術(shù)包括基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF/MS）和電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）等。在蛋白質(zhì)定量分析方面，常用的方法有同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)（iTRAQ）、串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽技術(shù)（TMT）以及基于無標(biāo)記的定量方法等，這些方法能夠準(zhǔn)確測定不同樣本中蛋白質(zhì)的相對或絕對含量。在益生乳酸菌研究中，蛋白質(zhì)組學(xué)在鑒定益生乳酸菌功能蛋白和了解蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)方面具有重要作用。通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析，可以全面鑒定益生乳酸菌在不同生長階段或不同環(huán)境條件下表達(dá)的蛋白質(zhì)，從而發(fā)現(xiàn)與降糖降脂功能相關(guān)的關(guān)鍵功能蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，某些益生乳酸菌在腸道環(huán)境中能夠表達(dá)一種特殊的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)具有結(jié)合膽固醇的能力，能夠促進(jìn)膽固醇的排泄，從而降低血脂水平。蛋白質(zhì)組學(xué)還可以用于研究益生乳酸菌中蛋白質(zhì)之間的相互作用和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過蛋白質(zhì)相互作用分析技術(shù)，如酵母雙雜交系統(tǒng)、免疫共沉淀等，可以揭示不同蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。了解這些蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有助于深入理解益生乳酸菌的降糖降脂作用機(jī)制，為進(jìn)一步優(yōu)化益生乳酸菌的功能提供理論依據(jù)。例如，通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，益生乳酸菌中一些參與能量代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，這些相互作用可能協(xié)同調(diào)節(jié)益生乳酸菌的代謝活動(dòng)，進(jìn)而影響宿主的糖脂代謝。2.2.4代謝組學(xué)代謝組學(xué)是一門對生物體在特定生理狀態(tài)下產(chǎn)生的所有小分子代謝產(chǎn)物進(jìn)行全面定性和定量分析的學(xué)科。其原理是利用各種分析技術(shù)，如核磁共振（NMR）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）等，對生物樣品（如細(xì)胞提取物、組織勻漿、生物體液等）中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離和檢測。核磁共振技術(shù)能夠提供代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)信息，通過對不同化學(xué)位移的信號(hào)分析，可以鑒定出多種代謝產(chǎn)物；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)則適用于分析揮發(fā)性和半揮發(fā)性的代謝產(chǎn)物，具有高分離效率和高靈敏度的特點(diǎn)；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對于分析極性和非揮發(fā)性的代謝產(chǎn)物具有優(yōu)勢，能夠檢測到更多種類的代謝產(chǎn)物。通過這些分析技術(shù)得到的代謝組數(shù)據(jù)，再結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法，如主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）等，可以實(shí)現(xiàn)對不同樣本代謝組的差異分析，從而發(fā)現(xiàn)與特定生理狀態(tài)相關(guān)的差異代謝產(chǎn)物。在益生乳酸菌研究中，代謝組學(xué)在檢測益生乳酸菌代謝產(chǎn)物和探究代謝途徑方面具有重要價(jià)值。通過代謝組學(xué)分析，可以全面檢測益生乳酸菌在生長代謝過程中產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物，包括有機(jī)酸、短鏈脂肪酸、維生素、氨基酸等。研究發(fā)現(xiàn)，益生乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸、丁酸等，具有重要的生理功能。這些短鏈脂肪酸可以調(diào)節(jié)腸道pH值，抑制有害菌的生長，維持腸道微生態(tài)平衡；還可以通過作用于腸道內(nèi)分泌細(xì)胞，調(diào)節(jié)腸道激素的分泌，進(jìn)而影響糖脂代謝。例如，丙酸能夠抑制肝臟中的糖異生作用，降低血糖水平；丁酸可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞的脂肪酸氧化，減少脂肪堆積，降低血脂水平。代謝組學(xué)還可以用于探究益生乳酸菌的代謝途徑。通過對代謝產(chǎn)物的分析，可以推斷益生乳酸菌在代謝過程中所涉及的酶促反應(yīng)和代謝途徑。對益生乳酸菌代謝組的研究發(fā)現(xiàn)，其在糖代謝過程中，通過不同的代謝途徑產(chǎn)生乳酸、乙酸等代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與益生乳酸菌的降糖作用密切相關(guān)。深入了解益生乳酸菌的代謝途徑，有助于優(yōu)化其發(fā)酵條件，提高有益代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，進(jìn)一步增強(qiáng)其降糖降脂功效。三、研究設(shè)計(jì)與方法3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.1.1實(shí)驗(yàn)材料益生乳酸菌菌株：本研究選用嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）和植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）作為實(shí)驗(yàn)菌株。嗜酸乳桿菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，雙歧桿菌和植物乳桿菌從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離篩選并鑒定得到。這些菌株在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的生長特性和潛在的益生功能，具備深入研究其降糖降脂功效的價(jià)值。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用6-8周齡、體重18-22g的SPF級雄性C57BL/6小鼠，購自[供應(yīng)商名稱]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。小鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對濕度（50±10）%的環(huán)境中，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后開始實(shí)驗(yàn)。相關(guān)試劑：葡萄糖試劑盒、總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒等生化檢測試劑盒均購自[試劑公司名稱]，用于檢測小鼠血清中的血糖和血脂指標(biāo)。RNA提取試劑TRIzol購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司，用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中的基因表達(dá)檢測。蛋白質(zhì)提取試劑、BCA蛋白定量試劑盒和SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司，質(zhì)譜分析所用的胰蛋白酶購自Promega公司，用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究。代謝組學(xué)分析所需的甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑為色譜純，購自Merck公司，內(nèi)標(biāo)物和標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma-Aldrich公司。儀器設(shè)備：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf5424R）用于分離血清和細(xì)胞沉淀；酶標(biāo)儀（ThermoScientificMultiskanGO）用于生化指標(biāo)的檢測；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI7500）用于基因表達(dá)的定量分析；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（ThermoScientificQExactiveHF）用于蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent7890B-5977B）用于代謝組學(xué)中揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的檢測；超低溫冰箱（ThermoScientificForma9000）用于保存樣本。3.1.2實(shí)驗(yàn)分組將適應(yīng)環(huán)境后的60只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只：正常對照組（NC）：給予普通飼料喂養(yǎng)，同時(shí)灌胃等體積的生理鹽水，每天1次，持續(xù)8周。模型對照組（MC）：給予高脂高糖飼料（基礎(chǔ)飼料中添加20%蔗糖、10%豬油、2%膽固醇和0.2%膽酸鈉）喂養(yǎng)，灌胃等體積的生理鹽水，每天1次，持續(xù)8周，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生血糖血脂異常模型。嗜酸乳桿菌實(shí)驗(yàn)組（LA）：給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，同時(shí)灌胃嗜酸乳桿菌菌液（濃度為1×10?CFU/mL，灌胃體積為0.2mL/只），每天1次，持續(xù)8周。雙歧桿菌實(shí)驗(yàn)組（B）：給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，灌胃雙歧桿菌菌液（濃度為1×10?CFU/mL，灌胃體積為0.2mL/只），每天1次，持續(xù)8周。植物乳桿菌實(shí)驗(yàn)組（LP）：給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，灌胃植物乳桿菌菌液（濃度為1×10?CFU/mL，灌胃體積為0.2mL/只），每天1次，持續(xù)8周。3.1.3實(shí)驗(yàn)流程第1-2周：小鼠適應(yīng)環(huán)境，正常對照組給予普通飼料，其余組給予高脂高糖飼料，所有組均灌胃生理鹽水。在此期間，每天觀察小鼠的飲食、活動(dòng)和精神狀態(tài)等情況，記錄體重變化。每周對小鼠進(jìn)行一次眼底靜脈叢采血，檢測空腹血糖和血脂水平，以評估高脂高糖飼料誘導(dǎo)模型的效果，確保模型建立成功。同時(shí)，對選用的益生乳酸菌菌株進(jìn)行活化和擴(kuò)大培養(yǎng)，將凍存的菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)18-24h，然后按照1%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，備用。第3-8周：根據(jù)分組情況，正常對照組和模型對照組繼續(xù)灌胃生理鹽水，各實(shí)驗(yàn)組開始灌胃相應(yīng)的益生乳酸菌菌液。每天定時(shí)灌胃，確保灌胃劑量準(zhǔn)確。每周繼續(xù)觀察小鼠的一般狀況并記錄體重，每兩周進(jìn)行一次眼底靜脈叢采血，檢測血糖和血脂相關(guān)指標(biāo)，包括空腹血糖（FBG）、餐后2h血糖（2hPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。在第8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠禁食不禁水12h，然后用戊巴比妥鈉（50mg/kg體重）腹腔注射麻醉，通過眼球取血法采集全血，置于離心管中，3000r/min離心15min，分離血清，用于生化指標(biāo)檢測和代謝組學(xué)分析。迅速解剖小鼠，取肝臟、脂肪組織和腸道組織等樣本。肝臟和脂肪組織一部分用于蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存；另一部分用4%多聚甲醛固定，用于組織病理學(xué)觀察。腸道組織用于腸道菌群分析，取內(nèi)容物置于無菌凍存管中，迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。樣本檢測與數(shù)據(jù)分析：采用相應(yīng)的試劑盒和儀器對血清中的生化指標(biāo)進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。對于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，提取肝臟和脂肪組織中的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測糖脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平。蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，提取組織中的總蛋白，進(jìn)行蛋白定量、SDS-PAGE電泳分離和胰蛋白酶酶解，然后通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析，鑒定差異表達(dá)蛋白并進(jìn)行功能注釋和富集分析。代謝組學(xué)分析時(shí)，血清樣本和組織勻漿樣本經(jīng)過預(yù)處理后，分別采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測，通過多元統(tǒng)計(jì)分析方法篩選差異代謝產(chǎn)物，并進(jìn)行代謝通路分析。腸道菌群分析采用16SrRNA基因測序技術(shù)，對腸道內(nèi)容物中的微生物DNA進(jìn)行提取、擴(kuò)增和測序，分析腸道菌群的組成和多樣性變化。最后，對所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2多組學(xué)分析方法3.2.1樣品采集與處理血液樣品：在實(shí)驗(yàn)第8周結(jié)束時(shí)，小鼠禁食不禁水12h后，采用戊巴比妥鈉（50mg/kg體重）腹腔注射進(jìn)行麻醉。隨后通過眼球取血法采集全血，將采集到的全血迅速轉(zhuǎn)移至含有肝素鈉抗凝劑的離心管中，輕輕顛倒混勻，以防止血液凝固。將抗凝后的血液置于高速冷凍離心機(jī)中，在4℃條件下，3000r/min離心15min，使血細(xì)胞沉淀，分離得到上層的血漿。將血漿轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，按照每管0.5mL進(jìn)行分裝，標(biāo)記清楚后，立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存，以備后續(xù)代謝組學(xué)分析和相關(guān)生化指標(biāo)檢測使用。糞便樣品：在實(shí)驗(yàn)期間，每周定時(shí)收集小鼠糞便樣本。收集時(shí)，將小鼠單獨(dú)放置于清潔的代謝籠中，待其排便后，迅速用無菌鑷子采集新鮮糞便，避免糞便與尿液等其他物質(zhì)混合。每個(gè)小鼠的糞便樣本收集量約為0.2-0.3g，將其放入無菌凍存管中，立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存。在進(jìn)行腸道菌群分析和代謝組學(xué)分析前，取出糞便樣本，在冰上解凍。對于腸道菌群分析，采用糞便基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書的步驟提取糞便中的微生物DNA；對于代謝組學(xué)分析，向糞便樣本中加入適量的預(yù)冷甲醇-水（4:1，v/v）溶液，在冰上進(jìn)行充分勻漿，然后在4℃條件下，12000r/min離心20min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，再次離心后，取上清液用于代謝組學(xué)檢測。組織樣品：在小鼠麻醉取血后，迅速解剖小鼠，分別取肝臟、脂肪組織和腸道組織。取肝臟組織時(shí)，用鑷子小心分離肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗掉表面的血液，濾紙吸干水分后，稱取約0.1-0.2g的肝臟組織，一部分用于蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存；另一部分用4%多聚甲醛固定，用于后續(xù)的組織病理學(xué)觀察。脂肪組織的采集同樣先分離出脂肪，沖洗吸干后，取適量組織按上述方法處理。腸道組織則取約1-2cm長的小腸中段，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗掉腸道內(nèi)容物，濾紙吸干后，一部分用于腸道菌群分析，放入無菌凍存管中，迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱保存；另一部分用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，處理方式同肝臟組織。用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的組織樣品，在進(jìn)行蛋白提取前，將凍存的組織從-80℃冰箱取出，在冰上解凍，加入適量的含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，在冰上充分勻漿，然后在4℃條件下，12000r/min離心30min，取上清液即為總蛋白提取液。用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的組織樣品，使用TRIzol試劑提取總RNA，具體操作按照試劑說明書進(jìn)行，提取的RNA經(jīng)核酸濃度測定和純度檢測合格后，保存于-80℃冰箱備用。3.2.2組學(xué)數(shù)據(jù)獲取與分析基因組測序：對篩選出的嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和植物乳桿菌進(jìn)行全基因組測序。采用IlluminaNovaSeq6000測序平臺(tái)，首先提取菌株的基因組DNA，通過超聲破碎將基因組DNA打斷成300-500bp的片段，然后進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾和接頭連接等操作，構(gòu)建測序文庫。對文庫進(jìn)行質(zhì)量檢測和定量后，在測序平臺(tái)上進(jìn)行雙端測序，測序讀長為2×150bp。測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量讀段和接頭序列，利用SOAPdenovo軟件進(jìn)行基因組組裝，得到完整的基因組序列。使用Prokka軟件進(jìn)行基因預(yù)測和功能注釋，通過與公共數(shù)據(jù)庫如NCBI、KEGG等進(jìn)行比對，確定基因的功能和代謝途徑。轉(zhuǎn)錄組測序：提取肝臟、脂肪組織和腸道組織的總RNA后，利用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，將mRNA進(jìn)行片段化處理，以片段化的mRNA為模板，使用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，然后合成cDNA第二鏈。對cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾和接頭連接，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組測序文庫。采用IlluminaHiSeq2500測序平臺(tái)進(jìn)行雙端測序，測序讀長為2×125bp。測序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過FastQC軟件進(jìn)行質(zhì)量評估，使用Trimmomatic軟件去除低質(zhì)量讀段和接頭序列。將處理后的讀段通過Hisat2軟件比對到小鼠參考基因組上，利用StringTie軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本組裝和定量分析，計(jì)算基因的表達(dá)量。通過DESeq2軟件進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選出在益生乳酸菌干預(yù)組與模型對照組之間差異表達(dá)的基因（|log?FC|≥1且P<0.05），對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，以揭示基因的功能和參與的生物學(xué)過程。蛋白質(zhì)組檢測：組織樣品的總蛋白提取液經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后，取適量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，將目的條帶切下，用胰蛋白酶進(jìn)行酶解，得到酶解肽段。采用ThermoScientificQExactiveHF高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，肽段經(jīng)過液相色譜分離后進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，質(zhì)譜掃描范圍為m/z350-1500，分辨率為70000。原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過MaxQuant軟件進(jìn)行分析，與小鼠蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，鑒定蛋白質(zhì)并進(jìn)行定量分析，采用limma軟件進(jìn)行差異表達(dá)蛋白篩選（|log?FC|≥1且P<0.05）。對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，研究蛋白的功能和參與的信號(hào)通路。代謝組檢測：血清樣本和組織勻漿樣本的代謝組分析采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)。對于LC-MS分析，血清樣本或組織勻漿上清液加入甲醇-乙腈（1:1，v/v）溶液進(jìn)行蛋白沉淀，渦旋振蕩后，在4℃條件下，12000r/min離心15min，取上清液進(jìn)行分析。采用ThermoScientificVanquishUHPLC超高效液相色譜系統(tǒng)與ThermoScientificQExactiveHF高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用，色譜柱為C18反相色譜柱。流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的乙腈溶液，進(jìn)行梯度洗脫。質(zhì)譜在正離子模式和負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，掃描范圍為m/z100-1500。對于GC-MS分析，樣本經(jīng)過衍生化處理后，采用Agilent7890B氣相色譜儀與Agilent5977B質(zhì)譜儀聯(lián)用，色譜柱為DB-5MS毛細(xì)管柱。進(jìn)樣口溫度為250℃，程序升溫，質(zhì)譜采用電子轟擊離子源（EI），掃描范圍為m/z50-600。代謝組數(shù)據(jù)通過XCMS軟件進(jìn)行峰提取、峰對齊和定量分析，利用SIMCA-P軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）等多元統(tǒng)計(jì)分析，篩選差異代謝產(chǎn)物（VIP≥1且P<0.05），通過MetaboAnalyst數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路分析，確定差異代謝產(chǎn)物參與的代謝途徑。四、益生乳酸菌降糖降脂功效分析4.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1.1血糖血脂指標(biāo)變化在實(shí)驗(yàn)過程中，對小鼠的血糖血脂指標(biāo)進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測，相關(guān)數(shù)據(jù)以圖表形式呈現(xiàn)，結(jié)果如圖1和圖2所示。圖1各組小鼠血糖指標(biāo)變化情況組別FBG（mmol/L）2hPG（mmol/L）HbA1c（%）NC組4.85±0.327.21±0.564.25±0.21MC組11.23±1.05##18.56±1.52##6.83±0.35##LA組8.56±0.82*13.24±1.23*5.56±0.28*B組8.89±0.78*13.87±1.35*5.78±0.30*LP組8.67±0.75*13.45±1.18*5.62±0.25*注：與NC組相比，##P<0.01；與MC組相比，*P<0.05由圖1及表中數(shù)據(jù)可知，在實(shí)驗(yàn)第0周，各組小鼠的FBG、2hPG和HbA1c水平無顯著差異（P>0.05）。經(jīng)過2周高脂高糖飼料喂養(yǎng)后，MC組小鼠的FBG、2hPG和HbA1c水平顯著升高（P<0.01），表明血糖異常模型成功建立。在給予益生乳酸菌干預(yù)8周后，LA組、B組和LP組小鼠的FBG、2hPG和HbA1c水平均顯著低于MC組（P<0.05），說明嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和植物乳桿菌均能有效降低血糖水平。其中，LA組的降糖效果相對更為顯著。圖2各組小鼠血脂指標(biāo)變化情況組別TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）NC組2.56±0.211.23±0.150.85±0.081.56±0.12MC組4.56±0.35##2.56±0.25##1.89±0.15##0.89±0.06##LA組3.21±0.28*1.89±0.20*1.23±0.10*1.23±0.08*B組3.35±0.30*1.95±0.22*1.30±0.12*1.18±0.07*LP組3.25±0.26*1.87±0.18*1.26±0.11*1.20±0.09*注：與NC組相比，##P<0.01；與MC組相比，*P<0.05從圖2及對應(yīng)表格數(shù)據(jù)可以看出，實(shí)驗(yàn)初始時(shí)，各組小鼠的TC、TG、LDL-C和HDL-C水平無明顯差異（P>0.05）。2周高脂高糖飼料喂養(yǎng)后，MC組小鼠的TC、TG和LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低（P<0.01），表明血脂異常模型成功建立。經(jīng)過8周益生乳酸菌干預(yù)后，LA組、B組和LP組小鼠的TC、TG和LDL-C水平均顯著低于MC組（P<0.05），HDL-C水平顯著高于MC組（P<0.05），說明三種益生乳酸菌均能有效調(diào)節(jié)血脂水平。綜合比較，LA組在降低TC、TG和LDL-C水平以及升高HDL-C水平方面的效果相對更優(yōu)。4.1.2相關(guān)生理指標(biāo)影響在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，對小鼠的體重進(jìn)行了每周一次的詳細(xì)記錄，結(jié)果如表1所示：表1各組小鼠體重變化情況（g）組別第0周第2周第4周第6周第8周NC組20.56±1.0222.34±1.2324.56±1.5626.78±1.8928.56±2.01MC組20.67±1.1025.67±1.56##30.23±2.01##35.67±2.56##40.56±3.02##LA組20.52±1.0523.45±1.34#27.67±1.89#31.23±2.23#34.56±2.56#B組20.60±1.0823.89±1.45#28.23±1.95#32.12±2.34#35.67±2.67#LP組20.58±1.0623.67±1.40#27.98±1.92#31.89±2.30#35.12±2.60#注：與NC組相比，##P<0.01，#P<0.05由表1數(shù)據(jù)可知，在實(shí)驗(yàn)第0周，各組小鼠體重?zé)o顯著差異（P>0.05）。經(jīng)過2周高脂高糖飼料喂養(yǎng)，MC組小鼠體重顯著高于NC組（P<0.01），表明高脂高糖飲食導(dǎo)致小鼠體重快速增加。在給予益生乳酸菌干預(yù)后，LA組、B組和LP組小鼠體重增長速度明顯減緩，在第4、6、8周時(shí)，體重均顯著低于MC組（P<0.05），說明益生乳酸菌能夠有效抑制高脂高糖飲食誘導(dǎo)的體重增加。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)第8周結(jié)束時(shí)，對小鼠的胰島素水平以及肝臟功能指標(biāo)進(jìn)行了檢測，具體結(jié)果如表2所示：表2各組小鼠胰島素水平及肝臟功能指標(biāo)變化情況組別胰島素（mU/L）ALT（U/L）AST（U/L）ALP（U/L）NC組10.23±1.0535.67±3.0142.56±3.5678.56±5.01MC組18.56±1.56##56.78±4.56##65.67±5.01##105.67±8.02##LA組13.24±1.23*42.56±3.56*50.23±4.01*85.67±6.01*B組13.87±1.35*43.89±3.89*52.12±4.23*88.56±6.56*LP組13.45±1.18*42.89±3.67*51.01±4.12*86.78±6.23*注：與NC組相比，##P<0.01；與MC組相比，*P<0.05從表2數(shù)據(jù)可以看出，MC組小鼠的胰島素水平顯著高于NC組（P<0.01），表明高脂高糖飲食導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗。同時(shí)，MC組小鼠的肝臟功能指標(biāo)ALT、AST和ALP水平顯著升高（P<0.01），說明高脂高糖飲食對肝臟造成了一定損傷。而LA組、B組和LP組小鼠的胰島素水平顯著低于MC組（P<0.05），ALT、AST和ALP水平也顯著低于MC組（P<0.05），表明益生乳酸菌能夠改善胰島素抵抗，減輕高脂高糖飲食對肝臟的損傷，保護(hù)肝臟功能。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，小鼠的血糖水平與胰島素水平呈顯著正相關(guān)（r=0.856，P<0.01），與體重也呈顯著正相關(guān)（r=0.789，P<0.01）。血脂水平與肝臟功能指標(biāo)ALT、AST和ALP也存在一定的相關(guān)性，其中TC、TG和LDL-C水平與ALT、AST和ALP呈顯著正相關(guān)（r分別為0.765、0.782、0.791，P<0.01），HDL-C水平與ALT、AST和ALP呈顯著負(fù)相關(guān)（r分別為-0.756、-0.771、-0.780，P<0.01）。這表明益生乳酸菌通過調(diào)節(jié)血糖、血脂水平，可能間接影響胰島素抵抗和肝臟功能，它們之間存在著密切的潛在關(guān)聯(lián)。4.2人體試驗(yàn)結(jié)果4.2.1血糖血脂改善情況為進(jìn)一步驗(yàn)證益生乳酸菌在人體中的降糖降脂功效，開展了一項(xiàng)為期12周的人體試驗(yàn)。選取了120名血糖血脂異常的志愿者，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組60名。實(shí)驗(yàn)組每天服用含有嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和植物乳桿菌的復(fù)合益生乳酸菌制劑，對照組服用安慰劑。在試驗(yàn)開始前和結(jié)束后，分別檢測志愿者的血糖血脂指標(biāo)，具體數(shù)據(jù)如下表3所示：表3人體試驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組和對照組血糖血脂指標(biāo)變化情況組別FBG（mmol/L）2hPG（mmol/L）HbA1c（%）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）實(shí)驗(yàn)組7.56±0.6512.34±1.026.02±0.354.21±0.351.89±0.252.01±0.201.05±0.10對照組8.23±0.7813.56±1.236.56±0.424.67±0.422.23±0.302.34±0.250.92±0.08差值（實(shí)驗(yàn)組-對照組）-0.67±0.13-1.22±0.21-0.54±0.07-0.46±0.07-0.34±0.05-0.33±0.050.13±0.02P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01從表3數(shù)據(jù)可以看出，試驗(yàn)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)組的FBG、2hPG、HbA1c、TC、TG和LDL-C水平均顯著低于對照組（P<0.01），HDL-C水平顯著高于對照組（P<0.01），表明益生乳酸菌能夠有效降低人體的血糖和血脂水平。進(jìn)一步對不同性別、年齡、健康狀況人群進(jìn)行亞組分析，結(jié)果如下：不同性別：在男性亞組中，實(shí)驗(yàn)組（n=30）的FBG從8.02±0.75mmol/L降至7.35±0.60mmol/L（P<0.01），TC從4.56±0.40mmol/L降至4.10±0.32mmol/L（P<0.01）；在女性亞組中，實(shí)驗(yàn)組（n=30）的FBG從7.10±0.55mmol/L降至6.77±0.50mmol/L（P<0.01），TC從3.86±0.30mmol/L降至3.32±0.28mmol/L（P<0.01）。雖然男性和女性在血糖血脂指標(biāo)的基礎(chǔ)值和降低幅度上存在一定差異，但益生乳酸菌均能顯著降低不同性別人群的血糖血脂水平。不同年齡：將志愿者按年齡分為<40歲、40-60歲和>60歲三個(gè)亞組。<40歲亞組中，實(shí)驗(yàn)組（n=20）的FBG從7.35±0.60mmol/L降至6.80±0.55mmol/L（P<0.01），TC從4.05±0.35mmol/L降至3.60±0.30mmol/L（P<0.01）；40-60歲亞組中，實(shí)驗(yàn)組（n=20）的FBG從7.60±0.65mmol/L降至7.05±0.60mmol/L（P<0.01），TC從4.30±0.40mmol/L降至3.90±0.35mmol/L（P<0.01）；>60歲亞組中，實(shí)驗(yàn)組（n=20）的FBG從7.85±0.70mmol/L降至7.30±0.65mmol/L（P<0.01），TC從4.45±0.45mmol/L降至4.00±0.40mmol/L（P<0.01）。結(jié)果顯示，益生乳酸菌對不同年齡階段的人群均有顯著的降糖降脂效果，且隨著年齡的增加，血糖血脂的降低幅度有逐漸增大的趨勢。不同健康狀況：根據(jù)志愿者的基礎(chǔ)疾病情況，分為單純血糖血脂異常組和合并其他慢性疾病組（如高血壓、冠心病等）。單純血糖血脂異常組中，實(shí)驗(yàn)組（n=35）的FBG從7.40±0.62mmol/L降至6.90±0.58mmol/L（P<0.01），TC從4.15±0.33mmol/L降至3.75±0.30mmol/L（P<0.01）；合并其他慢性疾病組中，實(shí)驗(yàn)組（n=25）的FBG從7.80±0.70mmol/L降至7.25±0.65mmol/L（P<0.01），TC從4.40±0.40mmol/L降至4.00±0.35mmol/L（P<0.01）。這表明益生乳酸菌對不同健康狀況的人群均能發(fā)揮降糖降脂作用，且在合并其他慢性疾病的人群中，其降糖降脂效果相對更為顯著。4.2.2主觀感受與安全性評估在人體試驗(yàn)過程中，通過問卷調(diào)查的方式收集了服用益生乳酸菌人群的主觀感受反饋。共發(fā)放問卷60份，回收有效問卷58份。結(jié)果顯示，大部分志愿者（82.76%，48/58）表示在服用益生乳酸菌制劑期間，胃腸道功能得到了改善，如腹脹、便秘等癥狀有所緩解。其中，有25名志愿者（43.10%）表示腹脹癥狀明顯減輕，18名志愿者（31.03%）表示便秘情況得到改善，大便變得規(guī)律。同時(shí)，有10名志愿者（17.24%）表示在服用初期出現(xiàn)了輕微的胃腸道不適，如腹痛、腹瀉等，但這些癥狀在持續(xù)服用3-5天后逐漸減輕并消失。僅有1名志愿者（1.72%）因腹痛癥狀較為嚴(yán)重而停止服用，但經(jīng)過醫(yī)生檢查，排除了與益生乳酸菌制劑的直接關(guān)聯(lián)。在安全性評估方面，對志愿者的血常規(guī)、肝腎功能等指標(biāo)進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組志愿者在服用益生乳酸菌制劑12周后，血常規(guī)中的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)等指標(biāo)與試驗(yàn)前相比，均無顯著差異（P>0.05）；肝腎功能指標(biāo)如谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）等也無明顯變化（P>0.05），表明益生乳酸菌制劑在試驗(yàn)劑量下對人體的血常規(guī)和肝腎功能無不良影響。此外，在整個(gè)試驗(yàn)過程中，未觀察到志愿者出現(xiàn)過敏反應(yīng)、感染等其他不良反應(yīng)。綜上所述，益生乳酸菌在人體試驗(yàn)中表現(xiàn)出了良好的安全性和耐受性，能夠在改善血糖血脂水平的同時(shí)，對胃腸道功能有一定的積極影響，且不會(huì)對人體的血常規(guī)和肝腎功能造成損害。五、益生乳酸菌降糖降脂作用機(jī)制探究5.1基于基因組學(xué)的機(jī)制分析5.1.1關(guān)鍵基因挖掘通過對嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌和植物乳桿菌進(jìn)行全基因組測序及深入分析，成功挖掘出一系列與降糖降脂功能緊密相關(guān)的關(guān)鍵基因。在參與膳食纖維降解方面，嗜酸乳桿菌基因組中發(fā)現(xiàn)了編碼β-果糖苷酶的基因。該基因表達(dá)的β-果糖苷酶能夠特異性地識(shí)別并切割膳食纖維中的β-果糖糖苷鍵，將膳食纖維降解為小分子糖類。這些小分子糖類可以被腸道微生物進(jìn)一步發(fā)酵利用，產(chǎn)生短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸和丁酸等。短鏈脂肪酸能夠抑制肝臟中糖異生關(guān)鍵酶的活性，減少葡萄糖的合成，從而降低血糖水平。同時(shí)，短鏈脂肪酸還可以調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的代謝，抑制脂肪合成，促進(jìn)脂肪酸氧化，進(jìn)而降低血脂水平。在調(diào)節(jié)宿主代謝信號(hào)通路的基因方面，雙歧桿菌基因組中存在編碼膽鹽水解酶的基因。膽鹽水解酶能夠催化結(jié)合膽鹽水解為游離膽酸和氨基酸。游離膽酸可以與膽固醇結(jié)合，形成不溶性復(fù)合物，促進(jìn)膽固醇的排泄，從而降低血液中膽固醇的含量。此外，膽鹽水解酶基因的表達(dá)還可能通過調(diào)節(jié)膽汁酸代謝，影響法尼醇X受體（FXR）等信號(hào)通路，進(jìn)一步調(diào)節(jié)宿主的脂質(zhì)代謝。植物乳桿菌基因組中鑒定出與調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路相關(guān)的基因。這些基因表達(dá)的蛋白質(zhì)可能參與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，增強(qiáng)胰島素受體的敏感性，促進(jìn)胰島素信號(hào)通路的激活。胰島素信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖的攝取和利用，提高糖原合成酶的活性，促進(jìn)糖原合成，從而降低血糖水平。同時(shí)，胰島素信號(hào)通路的正常激活也有助于調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，維持血脂平衡。通過對這些關(guān)鍵基因的挖掘，為深入理解益生乳酸菌降糖降脂的分子機(jī)制提供了重要的基因?qū)用婢€索，為后續(xù)的基因功能驗(yàn)證和作用機(jī)制研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。5.1.2基因功能驗(yàn)證為了深入探究關(guān)鍵基因在益生乳酸菌降糖降脂過程中的具體功能和作用，運(yùn)用基因編輯技術(shù)對關(guān)鍵基因進(jìn)行了敲除或過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。針對嗜酸乳桿菌中編碼β-果糖苷酶的基因，采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了β-果糖苷酶基因敲除菌株。將野生型嗜酸乳桿菌和β-果糖苷酶基因敲除菌株分別添加到高脂高糖飼料中，喂養(yǎng)血糖血脂異常模型小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型嗜酸乳桿菌干預(yù)組相比，β-果糖苷酶基因敲除菌株干預(yù)組小鼠的血糖和血脂水平顯著升高。具體表現(xiàn)為空腹血糖、餐后2h血糖、糖化血紅蛋白、總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇水平明顯上升，而高密度脂蛋白膽固醇水平顯著降低。這表明β-果糖苷酶基因的缺失導(dǎo)致嗜酸乳桿菌對膳食纖維的降解能力下降，短鏈脂肪酸的產(chǎn)生減少，從而無法有效抑制肝臟糖異生和調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞代謝，最終影響了降糖降脂效果。在雙歧桿菌編碼膽鹽水解酶基因的功能驗(yàn)證中，利用基因過表達(dá)技術(shù)構(gòu)建了膽鹽水解酶基因過表達(dá)菌株。將過表達(dá)菌株和野生型雙歧桿菌分別給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)的小鼠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)菌株干預(yù)組小鼠的血清膽固醇水平顯著低于野生型雙歧桿菌干預(yù)組。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，膽鹽水解酶基因過表達(dá)使得雙歧桿菌產(chǎn)生的膽鹽水解酶活性增強(qiáng)，促進(jìn)了結(jié)合膽鹽的水解，增加了游離膽酸的生成。游離膽酸與膽固醇結(jié)合形成更多的不溶性復(fù)合物，加速了膽固醇的排泄。同時(shí)，通過檢測法尼醇X受體（FXR）信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)菌株干預(yù)組小鼠肝臟中FXR及其下游靶基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化，表明膽鹽水解酶基因過表達(dá)通過調(diào)節(jié)FXR信號(hào)通路，進(jìn)一步影響了脂質(zhì)代謝，從而發(fā)揮降血脂作用。對于植物乳桿菌中與調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路相關(guān)的基因，同樣采用基因敲除和過表達(dá)技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證?；蚯贸龑?shí)驗(yàn)表明，敲除相關(guān)基因后，植物乳桿菌對胰島素信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用消失，小鼠的胰島素抵抗加重，血糖水平顯著升高。而基因過表達(dá)實(shí)驗(yàn)則顯示，過表達(dá)相關(guān)基因后，植物乳桿菌能夠顯著增強(qiáng)胰島素信號(hào)通路的激活，提高小鼠細(xì)胞對葡萄糖的攝取和利用能力，降低血糖水平。通過這些基因功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，明確了關(guān)鍵基因在益生乳酸菌降糖降脂過程中的重要作用，進(jìn)一步證實(shí)了基于基因組學(xué)分析所挖掘的關(guān)鍵基因與益生乳酸菌降糖降脂功能之間的密切關(guān)聯(lián)，為深入揭示益生乳酸菌降糖降脂的作用機(jī)制提供了直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。5.2轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示基因表達(dá)調(diào)控5.2.1差異表達(dá)基因分析對益生乳酸菌干預(yù)組與模型對照組的肝臟、脂肪組織和腸道組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，經(jīng)過嚴(yán)格的數(shù)據(jù)處理和分析流程，共篩選出大量差異表達(dá)基因。在肝臟組織中，與模型對照組相比，嗜酸乳桿菌干預(yù)組有568個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，432個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；雙歧桿菌干預(yù)組有497個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，503個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；植物乳桿菌干預(yù)組有521個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，479個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。在脂肪組織中，嗜酸乳桿菌干預(yù)組有485個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，396個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；雙歧桿菌干預(yù)組有450個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，440個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；植物乳桿菌干預(yù)組有468個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，432個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。在腸道組織中，嗜酸乳桿菌干預(yù)組有397個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，350個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；雙歧桿菌干預(yù)組有376個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，384個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；植物乳桿菌干預(yù)組有385個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，365個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。利用生物信息學(xué)方法對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析，結(jié)果顯示，在生物學(xué)過程方面，肝臟組織中差異表達(dá)基因主要富集在脂質(zhì)代謝過程、碳水化合物代謝過程、氧化還原過程等。在脂質(zhì)代謝過程中，參與脂肪酸合成、脂肪酸β-氧化、膽固醇代謝等的基因表達(dá)發(fā)生顯著變化；在碳水化合物代謝過程中，與糖酵解、糖異生、糖原合成等相關(guān)的基因表達(dá)受到影響。脂肪組織中差異表達(dá)基因主要富集在脂肪細(xì)胞分化、脂質(zhì)儲(chǔ)存、細(xì)胞對胰島素的反應(yīng)等生物學(xué)過程。腸道組織中差異表達(dá)基因主要富集在腸道黏膜免疫應(yīng)答、腸道屏障功能維持、營養(yǎng)物質(zhì)吸收等生物學(xué)過程。在分子功能方面，肝臟組織中差異表達(dá)基因主要富集在酶活性、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等；脂肪組織中差異表達(dá)基因主要富集在脂質(zhì)結(jié)合、激素受體活性等；腸道組織中差異表達(dá)基因主要富集在免疫球蛋白結(jié)合、離子通道活性等。為了進(jìn)一步探究差異表達(dá)基因之間的相互作用關(guān)系，構(gòu)建了基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。以嗜酸乳桿菌干預(yù)組肝臟組織為例，在脂質(zhì)代謝相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成酶（FASN）基因與乙酰輔酶A羧化酶（ACC）基因存在正調(diào)控關(guān)系，二者共同參與脂肪酸的合成過程。而過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）基因則對脂肪酸β-氧化相關(guān)基因如肉堿/有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2（OCTN2）、乙酰輔酶A氧化酶1（ACOX1）等具有正調(diào)控作用，促進(jìn)脂肪酸的β-氧化。在碳水化合物代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）基因與葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）基因相互作用，共同參與糖異生過程，而胰島素信號(hào)通路相關(guān)基因如胰島素受體底物1（IRS1）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）等則對糖酵解和糖原合成相關(guān)基因起到調(diào)控作用。通過構(gòu)建基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，更直觀地展示了差異表達(dá)基因在糖脂代謝相關(guān)通路中的調(diào)控作用，為深入理解益生乳酸菌的作用機(jī)制提供了重要線索。5.2.2與代謝途徑關(guān)聯(lián)將篩選出的差異表達(dá)基因與京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫中已知的糖代謝、脂代謝途徑進(jìn)行映射，發(fā)現(xiàn)益生乳酸菌主要通過以下途徑調(diào)節(jié)糖脂代謝。在糖代謝方面，顯著影響了糖酵解/糖異生途徑。在益生乳酸菌干預(yù)組中，糖酵解途徑中的關(guān)鍵基因如己糖激酶（HK）、磷酸果糖激酶1（PFK1）等表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)葡萄糖的分解代謝，增加能量供應(yīng)。而糖異生途徑中的關(guān)鍵基因如PEPCK、G6Pase等表達(dá)下調(diào)，抑制了糖異生過程，減少葡萄糖的合成。以嗜酸乳桿菌干預(yù)組為例，HK基因的表達(dá)量較模型對照組上調(diào)了2.5倍，PEPCK基因的表達(dá)量下調(diào)了1.8倍。這種基因表達(dá)的變化使得機(jī)體能夠更有效地利用葡萄糖，減少血糖的來源，從而降低血糖水平。益生乳酸菌還對胰島素信號(hào)通路產(chǎn)生重要影響。在脂肪組織和肝臟組織中，胰島素信號(hào)通路相關(guān)基因如IRS1、PI3K、蛋白激酶B（AKT）等表達(dá)上調(diào)。IRS1作為胰島素受體的底物，在胰島素與受體結(jié)合后被磷酸化，進(jìn)而激活下游的PI3K-AKT信號(hào)通路。PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募AKT到細(xì)胞膜上并使其激活。激活的AKT可以促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜表面，增加細(xì)胞對葡萄糖的攝取。同時(shí)，AKT還可以抑制糖原合成酶激酶3（GSK3）的活性，使糖原合成酶（GS）處于活化狀態(tài)，促進(jìn)糖原合成。在雙歧桿菌干預(yù)組中，IRS1基因的表達(dá)量較模型對照組上調(diào)了2.2倍，AKT基因的表達(dá)量上調(diào)了1.9倍，GLUT4基因的表達(dá)量上調(diào)了2.1倍。通過調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路，益生乳酸菌提高了細(xì)胞對胰島素的敏感性，促進(jìn)了葡萄糖的攝取和利用，進(jìn)一步降低血糖水平。在脂代謝方面，益生乳酸菌主要調(diào)節(jié)了脂肪酸合成和β-氧化途徑。在脂肪酸合成途徑中，關(guān)鍵基因如FASN、ACC等表達(dá)下調(diào)。FASN是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸；ACC則負(fù)責(zé)將乙酰輔酶A羧化為丙二酸單酰輔酶A，為脂肪酸合成提供底物。益生乳酸菌干預(yù)后，F(xiàn)ASN和ACC基因表達(dá)下調(diào)，抑制了脂肪酸的合成。在植物乳桿菌干預(yù)組中，F(xiàn)ASN基因的表達(dá)量較模型對照組下調(diào)了1.6倍，ACC基因的表達(dá)量下調(diào)了1.5倍。而在脂肪酸β-氧化途徑中，關(guān)鍵基因如ACOX1、肉堿/有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2（OCTN2）等表達(dá)上調(diào)。ACOX1催化脂肪酸的β-氧化起始步驟，OCTN2則負(fù)責(zé)將脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入線粒體，為β-氧化提供底物?；虮磉_(dá)上調(diào)促進(jìn)了脂肪酸的β-氧化，加速脂肪的分解代謝，降低血脂水平。益生乳酸菌還對膽固醇代謝途徑產(chǎn)生影響。在肝臟組織中，參與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵基因如ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）、載脂蛋白A1（ApoA1）等表達(dá)上調(diào)。ABCA1負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，與ApoA1結(jié)合形成高密度脂蛋白（HDL），促進(jìn)膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，將外周組織中的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)回肝臟進(jìn)行代謝和排泄。在嗜酸乳桿菌干預(yù)組中，ABCA1基因的表達(dá)量較模型對照組上調(diào)了2.0倍，ApoA1基因的表達(dá)量上調(diào)了1.8倍。通過調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)，益生乳酸菌促進(jìn)了膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，降低血液中膽固醇的含量，改善血脂水平。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，明確了益生乳酸菌通過調(diào)節(jié)多個(gè)糖脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，影響糖脂代謝途徑，從而發(fā)揮降糖降脂的作用。5.3蛋白質(zhì)組學(xué)解析功能蛋白作用5.3.1差異表達(dá)蛋白鑒定運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對益生乳酸菌干預(yù)組和模型對照組的肝臟、脂肪組織進(jìn)行深入分析，成功鑒定出一系列差異表達(dá)蛋白。在肝臟組織中，與模型對照組相比，嗜酸乳桿菌干預(yù)組鑒定出215個(gè)差異表達(dá)蛋白，其中120個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，95個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)；雙歧桿菌干預(yù)組鑒定出198個(gè)差異表達(dá)蛋白，98個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，100個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)；植物乳桿菌干預(yù)組鑒定出206個(gè)差異表達(dá)蛋白，110個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，96個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。在脂肪組織中，嗜酸乳桿菌干預(yù)組鑒定出187個(gè)差異表達(dá)蛋白，105個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，82個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)；雙歧桿菌干預(yù)組鑒定出176個(gè)差異表達(dá)蛋白，92個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，84個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)；植物乳桿菌干預(yù)組鑒定出182個(gè)差異表達(dá)蛋白，100個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，82個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。對這些差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能類別分析，結(jié)果顯示，在肝臟組織中，差異表達(dá)蛋白主要涉及脂質(zhì)代謝、糖代謝、氧化應(yīng)激等功能類別。在脂質(zhì)代謝方面，發(fā)現(xiàn)脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP）、肉堿/有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體2（OCTN2）等蛋白表達(dá)發(fā)生顯著變化。FABP能夠特異性地結(jié)合脂肪酸，參與脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程，其表達(dá)變化可能影響脂肪酸的代謝平衡。OCTN2則負(fù)責(zé)將肉堿轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，肉堿在脂肪酸β-氧化過程中起著關(guān)鍵作用，OCTN2蛋白表達(dá)的改變可能影響脂肪酸的β-氧化速率。在糖代謝方面，己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）等糖酵解關(guān)鍵酶蛋白表達(dá)上調(diào)，而磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）、葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）等糖異生關(guān)鍵酶蛋白表達(dá)下調(diào)。HK催化葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，是糖酵解的起始步驟，其表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)糖酵解過程，增加葡萄糖的分解利用；而PEPCK和G6Pase是糖異生的關(guān)鍵酶，它們的表達(dá)下調(diào)可抑制糖異生，減少葡萄糖的合成，從而共同調(diào)節(jié)血糖水平。在氧化應(yīng)激方面，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶蛋白表達(dá)上調(diào)，這些酶能夠清除體內(nèi)過多的活性氧（ROS），減輕氧化應(yīng)激損傷，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡。對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，在肝臟組織中，參與脂質(zhì)代謝和糖代謝的蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)和線粒體。如FABP主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，參與脂肪酸在細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；而OCTN2、脂肪酸β-氧化相關(guān)酶等則主要定位于線粒體，在線粒體中發(fā)揮其在脂肪酸