[13]，目前還沒有能夠直接激活蛋白酶體功能的藥物[10]。近年來，一些科研團(tuán)隊(duì)通過虛擬篩選、分子對(duì)接等計(jì)算化學(xué)方法，成功篩選出多個(gè)具有蛋白酶體激動(dòng)作用的小分子，并在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了其生物活性[14-19]。不過總體來看，這些化合物的結(jié)構(gòu)多樣性相對(duì)較弱，活性也不夠理想，并且缺乏較好的選擇性，所以在機(jī)制研究、藥物優(yōu)化以及臨床轉(zhuǎn)化等方面仍需要進(jìn)一步深入探索。盡管在一些實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校@些分子展現(xiàn)出一定的效果，但它們?cè)谔囟膊∧Ｐ椭械难芯肯鄬?duì)較少，且尚未得到充分驗(yàn)證。尤其是在一些關(guān)鍵臨床適應(yīng)癥中，現(xiàn)有激動(dòng)分子的作用機(jī)制、療效和安全性仍缺乏足夠的研究支持。所以這些分子在治療相關(guān)疾病中的潛力和臨床價(jià)值尚未完全顯現(xiàn)，需要進(jìn)一步的優(yōu)化與改進(jìn)。1.3研究?jī)?nèi)容本研究將憑借虛擬篩選的做法，精準(zhǔn)篩選20S蛋白酶體α3/4口袋區(qū)域的潛在激動(dòng)劑，并保障篩選出的化合物具備較高的激動(dòng)活性，基于這個(gè)基礎(chǔ)，將對(duì)取得的先導(dǎo)化合物開展結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與優(yōu)化事宜，期望得到一批具有良好理化性質(zhì)、一定活性以及代謝穩(wěn)定性的目標(biāo)化合物，針對(duì)這些先導(dǎo)化合物實(shí)施生物學(xué)評(píng)價(jià)，獲得對(duì)應(yīng)的活性數(shù)值，并結(jié)合其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)開展相應(yīng)調(diào)整，進(jìn)一步考察不同基團(tuán)對(duì)活性起到的影響。1.4擬解決的問題本課題的重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容是探索新型先導(dǎo)化合物，并通過結(jié)構(gòu)優(yōu)化獲得具有更優(yōu)活性和理化性質(zhì)的蛋白酶體激動(dòng)劑。同時(shí)，還將開展其作用機(jī)制的深入研究，這也是當(dāng)前蛋白酶體激動(dòng)劑研究領(lǐng)域的核心方向。PAGE2PAGE2浙江大學(xué)城市學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第2章材料與方法第2章材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)儀器表2.1實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)儀器產(chǎn)品型號(hào)生產(chǎn)廠家暗箱三用紫外分析儀ZF-20D上海越眾儀器設(shè)備有限公司電子天平FA2004上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司超聲波清洗器PM3-900TDPRIMA公司旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE212-B雅馬拓科技貿(mào)易（上海）有限公司低溫恒溫槽DC-2006常州諾基儀器有限公司循環(huán)水式真空泵SHZ-D（III）杭州瑞佳精密儀器有限公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9123A上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器ZNCL-G130*70杭州惠創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司磁力攪拌器85-2型杭州瑞佳精密儀器有限公司水浴鍋BM312-B雅馬拓科技貿(mào)易（上海）有限公司2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑表2.2實(shí)驗(yàn)試劑試劑名稱產(chǎn)品批號(hào)生產(chǎn)廠家硅膠2306321于成化工（上海）有限公司石油醚20180305天津市永大化學(xué)試劑有限公司二氯甲烷TIEEREU5安徽澤升科技有限公司無(wú)水甲醇20231206杭州青辰化學(xué)試劑廠無(wú)水乙醇20230322杭州青辰化學(xué)試劑廠DMF20230607上海凌峰化學(xué)試劑有限公司HATUDH23-1387784-1蘇州艾康生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司NH4Cl20190722福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司無(wú)水硫酸鈉20230513天津市永大化學(xué)試劑有限公司氯化鈉YD20230504天津市永大化學(xué)試劑有限公司三乙胺20230406天津市永大化學(xué)試劑有限公司草酰氯OOEKPELX安徽澤升科技有限公司三氟乙酸OOWERAYK安徽澤升科技有限公司DIPEAOORX1R7K安徽澤升科技有限公司HOBtD05010253安徽澤升科技有限公司EDCA0109380050安徽澤升科技有限公司TBTUE0700010050安徽澤升科技有限公司2.1.3試驗(yàn)藥品表2.3實(shí)驗(yàn)藥品藥品名稱產(chǎn)品批號(hào)生產(chǎn)廠家或購(gòu)買網(wǎng)址大黃酸C15465740上海麥克林生化科技股份有限公司3-甲基苯胺GC060223安徽澤升科技有限公司異丁胺GC290201薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司4-（4-甲基-1-哌嗪基）苯胺Fl150107薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司二苯甲基哌嗪Lg0222204206上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司4-（4-嗎啉基）苯胺20171210薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司對(duì)甲氧基苯胺C11292964上海麥克林生化科技股份有限公司4-苯基哌啶Lf1210189334上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司N-甲基-beta-苯乙胺220903100016上海邁瑞爾生化科技有限公司1,2,3,4-四氫異喹啉03DXR87D安徽澤升科技有限公司N-（2-氨基乙基）嗎啉9O2RR4HK安徽澤升科技有限公司1-（噻唑-2-基）哌嗪P2419811上海泰坦科技股份有限公司2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)及結(jié)構(gòu)優(yōu)化本課題在實(shí)驗(yàn)室先前工作基礎(chǔ)上，利用MolProphet?平臺(tái)對(duì)α3/4亞基間口袋進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選并進(jìn)行活性測(cè)試（圖2.1），綜合考慮化合物的結(jié)構(gòu)新穎性、合成可行性以及后續(xù)結(jié)構(gòu)優(yōu)化潛力，從虛擬篩選得到的Top100分子中最終選出15個(gè)有著潛在活性的候選化合物進(jìn)行活性測(cè)試。活性測(cè)試結(jié)果表明，化合物ZGRX-C06表現(xiàn)出一定的蛋白酶體激動(dòng)活性（圖2.2），在20μM濃度下可將20S蛋白酶體的基準(zhǔn)活性提高至基準(zhǔn)水平的389%左右，最大激動(dòng)倍數(shù)為5.24倍左右，該骨架類型的分子具有顯著的蛋白酶體激動(dòng)活性潛力，為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和功能研究提供了重要的先導(dǎo)化合物基礎(chǔ)。因此在改造化合物時(shí)我們決定保留其特異性骨架，對(duì)其側(cè)鏈進(jìn)行優(yōu)化?；诖?，我們?cè)谙葘?dǎo)分子的R1和R2位引入不同的基團(tuán)，考察對(duì)活性的影響，設(shè)計(jì)如圖2.3目標(biāo)化合物。2.2.2目標(biāo)化合物的合成路線根據(jù)目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)，通過逆合成反應(yīng)分析，設(shè)計(jì)了相應(yīng)的合成路線（圖2.4），在獲得目標(biāo)化合物后，對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行體外20S蛋白酶體激動(dòng)活性測(cè)試，以考察不同基團(tuán)對(duì)活性的影響。2.2.3先導(dǎo)化合物ZGRX-C06的合成（1）N-環(huán)己基丙烯酰胺(1)（圖2.5）的合成將環(huán)己胺（2g，20.2mmol）和三乙胺（4.09g，40.4mmol）溶于10.0mL的DCM中，冰浴，逐滴加入丙烯酰氯（1.83g，20.2mmol）的二氯甲烷（5mL）溶液，滴加完畢后，撤去冰浴，繼續(xù)反應(yīng)5min。TLC點(diǎn)板顯示完全反應(yīng)后，加入50mL飽和氯化銨水溶液淬滅，萃取，取有機(jī)層，水層再用DCM（10mL×2）萃取，有機(jī)層合并，旋干得2.94g白色固體。收率：95.1%。（2）N-環(huán)丙基丙烯酰胺(2)（圖2.6）的合成制備方法同上，環(huán)丙胺代替環(huán)己胺，得無(wú)色油狀物。收率：96.1%。（3）N-苯基丙烯酰胺(3)（圖2.7）的合成制備方法同上，苯胺代替環(huán)己胺，得白色固體。收率：93.4%。（4）叔丁基2-[3-（環(huán)己基氨基）-3-氧代丙基]肼基-1-羧酸酯(4)（圖2.8）的合成將化合物1（2.94g，19.2mmol）和Boc-肼（5.07g，38.4mmol）溶解于30mL異丙醇中，120℃反應(yīng)3天。TLC點(diǎn)板監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完畢后，旋干異丙醇，加入50mL二氯甲烷稀釋，再加入100mL水，萃取，取有機(jī)層，有機(jī)層再用水（100mL×2）萃取，有機(jī)層合并，旋干得黃色油狀粗品，粗品經(jīng)柱層析純化得白色固體2.7g。收率：49.3%。（5）叔丁基2-[3-（環(huán)丙基氨基）-3-氧代丙基]肼基-1-羧酸酯(5)（圖2.9）的合成制備方法同上，2代替1，得白色固體5。收率：39.8%。（6）叔丁基2-[3-（苯基氨基）-3-氧代丙基]肼基-1-羧酸酯(6)（圖2.10）的合成制備方法同上，3代替1，得白色固體6。收率：50.2%。（7）3-氯苯并[d]異噻唑-1,1-二氧化物(7)（圖2.11）的合成將糖精（10g，54.6mmol）溶于60mL的1，4-二氧六環(huán)，加入SOCl2（32.47g，273.0mmol）和DMF（0.5ml），100℃反應(yīng)12h。反應(yīng)完畢后，旋干1，4-二氧六環(huán)，加入50mL乙醚洗滌，抽濾，濾餅再用乙醚（30mL×2）洗滌，得白色固體10.3g。收率：93.6%。（8）叔丁基2-[3-(環(huán)己基氨基)-3-氧代丙基]-2-(1,1-二氧化苯并[d]異噻唑-3-基)肼基-1-羧酸酯(8)（圖2.12）的合成將化合物4（2.7g，9.46mmol）溶于20mLDCM，加入三乙胺（1.91g，18.92mmol），冰浴，滴加化合物7（1.91g，9.46mmol）的DCM（10mL）溶液，滴加完畢后，繼續(xù)室溫反應(yīng)5-10min。TLC點(diǎn)板監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全，加入飽和氯化銨溶液（30mL）淬滅，萃取，取有機(jī)層，有機(jī)層旋干，粗品經(jīng)柱層析純化得白色固體3.96g。收率：92.9%。（9）叔丁基2-[3-(環(huán)丙基氨基)-3-氧代丙基]-2-(1,1-二氧化苯并[d]異噻唑-3-基)肼基-1-羧酸酯(9)（圖2.13）的合成制備方法同上，5代替4，得白色固體9。收率：95.0%。（10）叔丁基2-[3-(環(huán)丙基氨基)-3-氧代丙基]-2-(1,1-二氧化苯并[d]異噻唑-3-基)肼基-1-羧酸酯(10)（圖2.14）的合成制備方法同上，6代替4，得白色固體10。收率：93.1%。（11）N-環(huán)己基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]異噻唑-3-基)肼基]丙酰胺(11)（圖2.15）的合成將化合物8（3.96g,8.79mmol）溶于20.0mL的二氯甲烷中，緩慢加入5.0mL的三氟乙酸，室溫反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束后將溶劑旋干，得黃色油狀物11，直接用于下一步反應(yīng)。（12）N-環(huán)丙基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]異噻唑-3-基)肼基]丙酰胺(12)（圖2.16）的合成制備方法同實(shí)驗(yàn)上，9代替8，得黃色油狀物12。（13）N-苯基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]異噻唑-3-基)肼基]丙酰胺(13)（圖2.17）的合成制備方法同上，10代替8，得黃色油狀物13。（14）N-環(huán)己基-3-(1-(1,1-二氧化苯并[d]異噻唑-3-基)-2-((5-硝基呋喃-2-基)亞甲基)肼基)丙酰胺ZGRX-C06（圖2.18）的合成將化合物11（70mg，0.16mmol）和5-硝基呋喃-2-甲醛（26.8mg，0.19mmol）溶于2mL異丙醇，加入醋酸（100μL），80℃反應(yīng)12h。TLC點(diǎn)板監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全，旋干溶劑，粗品經(jīng)柱層析純化得黃色固體ZGRX-C0650.3mg。收率：68.1%。2.2.4目標(biāo)化合物D-1的合成目標(biāo)化合物D-1（圖2.19）即N-環(huán)己基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]異噻唑-3-基)-2-(呋喃-2-基亞甲基)肼基]丙酰胺的合成方法與先導(dǎo)化合物ZGRX-C06類似，將呋喃-2-甲醛代替5-硝基呋喃-2-甲醛，其余方法不變，得白色固體。收率：62.7%。2.2.5目標(biāo)化合物D-2的合成目標(biāo)化合物D-2（圖2.20）即N-環(huán)己基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]異噻唑-3-基)-2-(噻吩-2-基亞甲基)肼基]丙酰胺的合成方法與先導(dǎo)化合物ZGRX-C06類似，將苯乙醛代替5-硝基呋喃-2-甲醛，其余方法不變，得白色固體。收率：61.7%。2.2.6目標(biāo)化合物D-3的合成目標(biāo)化合物D-3（圖2.21）即N-環(huán)己基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]異噻唑-3-基)-2-(2-(4-氟苯基)乙基亞甲基)肼基]丙酰胺的合成方法與先導(dǎo)化合物ZGRX-C06類似，將4-氟苯乙醛代替5-硝基呋喃-2-甲醛，其余方法不變，得白色固體。收率：64.0%。2.2.7目標(biāo)化合物D-4的合成目標(biāo)化合物D-4（圖2.22）即N-環(huán)己基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]異噻唑-3-基)-2-(2-(4-氯苯基)乙基亞甲基)肼基]的合成方法與先導(dǎo)化合物ZGRX-C06類似，將4-氯苯乙醛代替5-硝基呋喃-2-甲醛，其余方法不變，得白色固體。收率：64.0%。2.2.8目標(biāo)化合物D-5的合成目標(biāo)化合物D-5（圖2.23）即N-環(huán)己基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]異噻唑-3-基)-2-(2-(4-溴苯基)乙基亞甲基)肼基]丙酰胺的合成方法與先導(dǎo)化合物ZGRX-C06類似，將4-溴苯乙醛代替5-硝基呋喃-2-甲醛，其余方法不變，得白色固體。收率：61.9%。2.2.9目標(biāo)化合物D-6的合成目標(biāo)化合物D-6（圖2.24）即N-環(huán)丙基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]異噻唑-3-基)-2-(2-苯乙基亞甲基)肼基]丙酰胺的合成方法與先導(dǎo)化合物ZGRX-C06類似，將化合物12替代11，苯乙醛代替5-硝基呋喃-2-甲醛，其余方法不變，得白色固體。收率：66.1%。2.2.10目標(biāo)化合物D-7的合成目標(biāo)化合物D-7（圖2.25）即N-苯基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]異噻唑-3-基)-2-(2-苯乙基亞甲基)肼基]丙酰胺的合成方法與先導(dǎo)化合物ZGRX-C06類似，將化合物13替代11，苯乙醛代替5-硝基呋喃-2-甲醛，其余方法不變，得白色固體。收率：65.4%。2.2.11活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法（1）蛋白酶體激動(dòng)活性采用熒光底物Suc-LLVY-AMC檢測(cè)活性，觀察不同化合物對(duì)酶的激活能力。首先測(cè)試目標(biāo)化合物在20μM濃度下對(duì)ChT-L水解位點(diǎn)的激動(dòng)百分比（Activity(%)@20μM），初步評(píng)價(jià)化合物的激活效果。對(duì)Activity(%)@20μM值大于150%的化合物進(jìn)行下一步的測(cè)試：20S蛋白酶體中的ChT-L蛋白酶會(huì)水解底物中的Tyr-AMC，釋放出AMC，利用動(dòng)態(tài)法檢測(cè)單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的產(chǎn)物熒光值，通過帶有355nm激發(fā)光和460nm發(fā)射光的多功能酶標(biāo)儀(PerkinElmer,USA)檢測(cè)AMC的熒光吸收值，化合物對(duì)20S蛋白酶體的半數(shù)激動(dòng)濃度（EC50）和最大激動(dòng)倍數(shù)（MaxFold）用GraphpadPrism4計(jì)算，采用sigmoidaldose-response(varibleslope)模型進(jìn)行擬合。（2）低氧心肌細(xì)胞保護(hù)活性測(cè)試使用MTT分析法檢測(cè)細(xì)胞存活率，將H9c2細(xì)胞（1×104/well）鋪在96孔板中，孵育過夜后，用受試化合物（1、2.5、5和10μM）處理細(xì)胞24小時(shí)。向每個(gè)孔中加入10μLMTT溶液（5mg/mL），共孵育4小時(shí)后，吸棄上清液，加入150μL的DMSO溶解所得的甲晶體，使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定讀取器（Labsystems，F(xiàn)inland）測(cè)量570nm處的吸光度值，細(xì)胞存活率計(jì)算如下：細(xì)胞存活率（%）=試驗(yàn)組的OD/對(duì)照組的OD*100%。（3）AlphaFold3預(yù)測(cè)分析由DeepMind實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的AlphaFold是一種解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的技術(shù)，2020這一個(gè)年份，AlphaFold2在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)范疇實(shí)現(xiàn)突破性進(jìn)展，可以從DNA序列里精準(zhǔn)預(yù)測(cè)多數(shù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，這一成就被看作是該領(lǐng)域的革命性突破。作為最新出爐的版本，2024年5月所發(fā)布的AlphaFold3在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)上進(jìn)一步拓展了能力，除了能高精度地對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用予以預(yù)測(cè)，AlphaFold3，還可預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跟核酸、小分子等其他樣式生物分子的相互作用關(guān)系。?。

浙江大學(xué)城市學(xué)院畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)） 第3章結(jié)果與討論第三章結(jié)果與討論3.1目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)信息目前共合成目標(biāo)先導(dǎo)化合物1個(gè)、目標(biāo)化合物7個(gè)，以下是1個(gè)目標(biāo)先導(dǎo)化合物及7個(gè)目標(biāo)化合物的分子結(jié)構(gòu)及核磁共振氫譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)：ZGRX-C061HNMR(400MHz,DMSO-D6)δ8.94(d,J=7.6Hz,1H),8.41(s,1H),8.07(d,J=6.9Hz,1H),7.92(d,J=7.6Hz,1H),7.89-7.79(m,3H),7.33(d,J=3.9Hz,1H),4.45(t,J=7.2Hz,2H),3.49-3.41(m,1H),2.53(t,J=7.2Hz,2H),1.70-1.63(m,2H),1.58(dd,J=9.5,3.3Hz,2H),1.47(dd,J=8.6,3.5Hz,1H),1.17(dd,J=24.2,12.2Hz,2H),1.10-1.01(m,3H).13CNMR(101MHz,DMSO-D6)δ168.73,160.52,152.60,151.55,143.78,134.45,134.28,134.05,131.33,127.41,122.30,117.06,114.83,48.15,43.13,32.77,31.78,25.68,24.92.ESI-MS:m/z=474.1425[M+H]+.（2）D-11HNMR(400MHz,DMSO-D6)δ8.99-8.88(m,1H),8.32(s,1H),8.06-8.01(m,1H),7.98-7.90(m,2H),7.87-7.81(m,2H),7.05(d,J=2.8Hz,1H),6.70(s,1H),4.44(t,J=6.7Hz,2H),3.50-3.43(m,1H),2.51(t,J=6.9Hz,2H),1.65(d,J=10.9Hz,2H),1.58(d,J=12.8Hz,2H),1.47(d,J=11.9Hz,1H),1.17(dd,J=23.4,11.4Hz,2H),1.03(dd,J=21.5,10.8Hz,3H).13CNMR(101MHz,DMSO-D6)δ168.81,159.79,149.52,146.69,143.80,136.46,134.20,134.11,131.34,127.75,122.21,116.81,113.14,48.07,42.69,32.80,31.90,25.66,24.98.ESI-MS:m/z=429.1577[M+H]+.（3）D-21HNMR(400MHz,DMSO-D6)δ8.01-7.88(m,4H),7.75(t,J=7.5Hz,1H),7.47(t,J=7.6Hz,1H),7.39(dd,J=11.2,4.6Hz,2H),7.33(t,J=8.0Hz,2H),7.21(ddd,J=20.7,14.0,7.6Hz,1H),4.34(t,J=7.2Hz,2H),3.85(d,J=4.2Hz,2H),3.53-3.42(m,1H),2.45(d,J=7.4Hz,2H),1.72-1.60(m,4H),1.55-1.48(m,1H),1.22(dd,J=24.2,12.1Hz,2H),1.08(dt,J=16.8,6.3Hz,3H).13CNMR(101MHz,DMSO-D6)δ168.66,159.65,151.09,143.73,136.75,133.95,133.68,131.41,130.04,129.16,127.47,127.27,121.95,48.02,42.44,38.95,32.85,31.80,25.67,25.01.ESI-MS:m/z=453.1944[M+H]+.（4）D-31HNMR(400MHz,DMSO-D6)δ8.07(d,J=8.0Hz,1H),8.00(d,J=7.6Hz,1H),7.96(t,J=4.2Hz,1H),7.90(d,J=7.6Hz,1H),7.81(t,J=7.5Hz,1H),7.51(t,J=7.7Hz,1H),7.42-7.34(m,2H),7.23(t,J=8.8Hz,2H),4.36(t,J=7.1Hz,2H),3.87(d,J=4.1Hz,2H),3.55-3.44(m,1H),2.48(d,J=7.2Hz,2H),1.68(t,J=15.5Hz,4H),1.54(d,J=11.7Hz,1H),1.24(dd,J=23.9,11.9Hz,2H),1.15–1.04(m,3H).13CNMR(101MHz,DMSO-D6)δ168.70,159.70,150.99,143.84,134.06,133.44,132.96,131.98,131.90,131.30,127.53,122.00,115.98,115.77,48.06,42.51,38.08,32.85,31.88,25.70,25.01.ESI-MS:m/z=471.1854[M+H]+.（5）D-41HNMR(400MHz,DMSO-D6)δ8.02-7.94(m,3H),7.90(d,J=7.5Hz,1H),7.81(t,J=7.5Hz,1H),7.48(dd,J=14.7,7.9Hz,3H),7.37(d,J=8.2Hz,2H),4.36(t,J=7.0Hz,2H),3.88(d,J=3.8Hz,2H),3.54-3.44(m,1H),2.48(d,J=7.3Hz,2H),1.68(t,J=15.2Hz,4H),1.54(d,J=11.7Hz,1H),1.24(dd,J=23.6,11.6Hz,2H),1.09(dt,J=16.6,8.4Hz,3H).13CNMR(101MHz,DMSO-D6)δ168.69,159.70,150.80,143.85,135.92,134.05,133.30,132.00,131.25,129.09,127.50,122.01,48.06,42.48,38.22,32.85,31.85,25.70,25.00.ESI-MS:m/z=487.1596[M+H]+.（6）D-51HNMR(400MHz,DMSO-D6)δ7.98(dd,J=11.3,8.1Hz,3H),7.89(d,J=7.6Hz,1H),7.80(t,J=7.5Hz,1H),7.59(d,J=8.1Hz,2H),7.49(t,J=7.7Hz,1H),7.30(d,J=8.1Hz,2H),4.35(t,J=7.1Hz,2H),3.85(d,J=3.9Hz,2H),3.53-3.43(m,1H),2.47(d,J=7.1Hz,2H),1.67(t,J=15.2Hz,4H),1.53(d,J=12.1Hz,1H),1.23(dd,J=24.0,12.1Hz,2H),1.13-1.05(m,3H).13CNMR(101MHz,DMSO-D6)δ168.70,159.70,150.75,143.84,136.33,134.04,133.31,132.38,132.02,131.24,127.49,122.02,120.49,48.06,42.47,38.28,32.85,31.85,25.70,25.01.ESI-MS:m/z=531.1093[M+H]+.（7）D-61HNMR(400MHz,DMSO-D6)δ8.08(d,J=3.6Hz,1H),8.02(d,J=8.0Hz,1H),7.96(d,J=6.9Hz,2H),7.76(t,J=7.5Hz,1H),7.48(t,J=7.6Hz,1H),7.42-7.36(m,2H),7.35-7.31(m,2H),7.21(ddd,J=21.1,14.3,7.3Hz,1H),4.35(t,J=7.3Hz,2H),3.86(d,J=4.3Hz,2H),2.58(ddd,J=10.9,7.3,3.7Hz,1H),2.42(s,2H),0.58(td,J=6.8,5.0Hz,2H),0.39-0.33(m,2H).13CNMR(101MHz,DMSO-D6)δ170.90,159.76,151.16,143.85,136.85,134.01,133.73,131.48,130.11,129.24,127.56,127.33,122.00,42.42,39.03,31.69,22.81,6.11.ESI-MS:m/z=411.1377[M+H]+.（8）D-71HNMR(400MHz,DMSO-D6)δ10.10(s,1H),8.05(t,J=4.4Hz,1H),8.00(dd,J=13.2,7.8Hz,2H),7.76(t,J=7.5Hz,1H),7.55(d,J=7.7Hz,2H),7.48(t,J=7.7Hz,1H),7.38-7.27(m,7H),7.03(t,J=7.4Hz,1H),4.45(t,J=7.3Hz,2H),3.84(d,J=4.3Hz,2H),2.75(t,J=7.3Hz,2H).13CNMR(101MHz,DMSO-D6)δ168.85,159.75,151.28,143.75,139.37,136.75,133.99,133.71,131.44,130.03,129.23,129.16,127.49,127.26,123.83,121.98,119.69,42.08,38.96,32.71.ESI-MS:m/z=469.1293[M+Na]+.3.2目標(biāo)化合物蛋白酶體激動(dòng)活性評(píng)價(jià)選取化合物TCH-165為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)合成的7個(gè)目標(biāo)化合物進(jìn)行分子水平蛋白酶體激動(dòng)活性篩選。首先測(cè)試化合物在20μM時(shí)對(duì)20S蛋白酶體CT-L水解活性的影響，若活性水平提高至基準(zhǔn)水平的150%及以上，則判定具有一定的20S蛋白酶體激動(dòng)能力，并繼續(xù)測(cè)定半數(shù)有效濃度（EC50）和活性最大增加倍數(shù)（Emax），以量化活性強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表3.2），除D-6外，其余6個(gè)目標(biāo)化合物均具有較好的蛋白酶體激動(dòng)活性且活性優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照TCH-165。表3.1目標(biāo)化合物蛋白酶體激動(dòng)活性序號(hào)結(jié)構(gòu)20μM激動(dòng)倍數(shù)(%)EC50(μM)EmaxD-1205.53±9.398.13±0.684.76±0.34D-2345.70±22.784.06±1.103.83±0.61D-3260.41±3.472.95±0.262.82±0.41D-4255.96±12.582.68±0.672.80±0.61D-5257.63±18.811.56±0.142.73±0.16D-6131.86±89.28--D-7270.94±0.392.43±0.032.85±0.003.2低氧心肌細(xì)胞保護(hù)活性測(cè)試在常氧條件下（圖3.1），七個(gè)受試化合物在1-10μM濃度范圍內(nèi)未表現(xiàn)出明顯細(xì)胞毒性，且呈現(xiàn)輕微促增殖效應(yīng)，表明其具有優(yōu)良的生物安全性。在缺氧損傷模型中（圖3.2）所有化合物均顯示出細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)，且具有一定的濃度依賴性。3.3AlphaFold3預(yù)測(cè)分析我們基于Alphafold3對(duì)小分子和蛋白酶體的結(jié)合口袋和結(jié)合能力進(jìn)行預(yù)測(cè)，以驗(yàn)證基于虛篩及結(jié)構(gòu)優(yōu)化發(fā)現(xiàn)化合物的可靠性。為了確保預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，首先對(duì)蛋白酶體的頂部“蓋子”的α1-7亞基進(jìn)行了結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，同時(shí)與已有的晶體解析結(jié)構(gòu)（PDBID:4R3O）進(jìn)行比較（圖3.3），兩者的RMSD（均方根誤差）僅為0.343372,即α1-7亞基各個(gè)部分原子偏離平均位置的程度極低，這說明蛋白酶體蓋子的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際的蛋白酶體晶體解析結(jié)構(gòu)幾乎完全一致。同時(shí)預(yù)測(cè)的ipTM（界面預(yù)測(cè)TM分?jǐn)?shù)）得分達(dá)到0.88（ipTM＞0.8代表結(jié)果優(yōu)秀），也說明了預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。隨后，我們選化合物D-2采用AlphaFold3對(duì)其結(jié)合口袋進(jìn)行預(yù)測(cè)分析（圖3.4），驗(yàn)證結(jié)構(gòu)修飾后的化合物是否仍能特異性結(jié)合于α3/4口袋。如圖所示，預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該化合物對(duì)α1/2口袋比對(duì)α3/4口袋具有更強(qiáng)的親和力，但仍結(jié)合與蛋白酶體α亞基間口袋，促進(jìn)20S蛋白酶體門控的開啟與活性激動(dòng)。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步利用分子對(duì)接研究了化合物D-2在α1/2口袋的結(jié)合模式，并計(jì)算了其最低結(jié)合自由能。結(jié)果如圖3.5所示，化合物D-2的鄰磺酰苯甲酰亞胺片段作為氫鍵受體分別與α1亞基的Tyr159和α2亞基的Lys64相互作用。此外，與該片段相鄰的苯環(huán)以及與肼連接的苯環(huán)能夠與周圍氨基酸殘基形成疏水相互作用。根據(jù)分子對(duì)接模擬計(jì)算結(jié)果顯示，化合物D-2的最低結(jié)合能為-8.2kcal/mol。3.4討論本研究試圖運(yùn)用虛擬篩選及結(jié)構(gòu)優(yōu)化策略，開展設(shè)計(jì)與篩選工作，得到靶向蛋白酶體α3/4口袋的激動(dòng)劑，我們對(duì)相關(guān)分子的結(jié)構(gòu)實(shí)施了分析，還針對(duì)不同結(jié)構(gòu)修飾的化合物進(jìn)行了活性篩選，某些有著特定結(jié)構(gòu)的化合物表現(xiàn)出顯著的蛋白酶體激動(dòng)活性。若在R1位引入環(huán)己基或者苯基，當(dāng)在R2位引入硝基呋喃或鹵代苯乙基之際，衍生物（如D-5）明顯強(qiáng)化了蛋白酶體的激動(dòng)特性，該效應(yīng)可能跟硝基基團(tuán)的強(qiáng)吸電子效應(yīng)有關(guān)系，進(jìn)而提高了分子與蛋白酶體α1亞基的氫鍵相互作用強(qiáng)度；鹵素取代的苯乙基基團(tuán)大概利用疏水作用促進(jìn)了化合物跟蛋白酶體的結(jié)合，令它的構(gòu)象穩(wěn)定不變，活性得到了進(jìn)一步增強(qiáng)。