DB61/T2134—2025

目??次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語和定義.........................................................................1

4樣品采集...........................................................................1

5LAMP技術(shù)檢測.......................................................................2

6防治技術(shù)...........................................................................2

7檔案記錄...........................................................................2

8證實方法...........................................................................2

附錄A（資料性附錄）蘋果褐斑病相關(guān)資料...............................................3

附錄B（資料性附錄）LAMP檢測技術(shù)和推薦藥劑及使用方法................................4

I

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前??言

本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。

本文件由陜西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。

本文件起草單位：西北農(nóng)林科技大學、陜西省植物保護工作總站、乾縣果業(yè)服務(wù)中心、米脂縣植保

植檢站。

本文件主要起草人：徐亮勝、黃麗麗、馮浩、王亞紅、吳曉政，鞏玉峰。

本文件由西北農(nóng)林科技大學負責解釋。

本文件首次發(fā)布。

聯(lián)系信息如下：

單位：西北農(nóng)林科技大學

電話：029—87091312

地址：陜西省楊凌區(qū)邰成路西北農(nóng)林科技大學

郵編：712100

II

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蘋果褐斑病早期監(jiān)測技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了蘋果褐斑病的樣品采集、LAMP技術(shù)檢測、結(jié)果判定、防治技術(shù)、檔案記錄等技術(shù)要

求，描述了對應(yīng)證實方法。

本文件適用于環(huán)介導等溫擴增分子檢測技術(shù)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T8321農(nóng)藥合理使用準則

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)loop-mediatedisothermalamplification，LAMP

一種在特定恒溫條件下，實現(xiàn)短時間內(nèi)對靶標序列高效擴增的技術(shù)。檢測結(jié)果通過肉眼觀察綠色熒

光的生成進行判斷。

3.2

蘋果褐斑病

又稱綠緣褐斑病，由蘋果雙殼菌侵染所引起的真菌病害，造成生長季大量落葉，樹勢衰弱，影響蘋

果產(chǎn)量。

3.3

帶菌率

也稱田間樣品帶菌檢出率，指利用蘋果褐斑病LAMP技術(shù)檢出的陽性結(jié)果數(shù)占總樣品數(shù)的百分率。

4樣品采集

4.1時間

開花后至套袋前，每隔10d采集一次樣品。

4.2方法

1

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采取五點取樣法，每點1株，在東、西、南、北四個方位各固定1個枝條，每枝條采1張葉片，用吸

水紙包好，保存于4℃冰箱備用。

4.3處理

樣品用0.6%次氯酸鈉表面消毒5min后，無菌水清洗3次，用無菌手術(shù)刀切取5g組織，裝進無菌2mL

離心管中提取DNA進行LAMP檢測。

5LAMP技術(shù)檢測

5.1操作方法

見附錄B。

5.2結(jié)果判定

待檢樣品加入反應(yīng)試劑50min后，液體呈綠色，判定為樣品帶菌。

6防治技術(shù)

6.1防治要求

氣象條件適宜于褐斑病發(fā)生時，以LAMP技術(shù)檢測的田間葉片帶菌率為依據(jù)，確定化學防控時期和

藥劑種類。農(nóng)藥使用按照GB/T8321（所有部分）和NY/T1276規(guī)定執(zhí)行。藥劑種類選擇見附錄B。

6.2防治方法

6.2.1當檢測帶菌率小于5%時，不需要采取化學藥劑防治。

6.2.2當檢測帶菌率為5%~20%時，全園使用2次保護性殺菌劑，每次噴藥時間間隔10d~15d。

6.2.3當檢測帶菌率為21%~30%時，全園使用1次~2次內(nèi)吸性治療劑，每次噴藥時間間隔15d。

6.2.4當檢測帶菌率大于30%時，增加防治次數(shù)，縮短噴藥間隔時間。

7檔案記錄

7.1樣品記錄包括樣品來源、種類（品種）、時間、檢測時間、地點、方法和結(jié)果等；

7.2防治效果記錄包括果園地點、品種、樹齡、噴施藥劑名稱、噴施藥劑前的病情指數(shù)、噴施藥劑后

的病情指數(shù)、防治效果。

7.3記錄要有檢測人員、審核人員簽字，檔案妥善保存。

8證實方法

采用實驗室對照驗證的方法對5的條款進行證實。采用實驗室檢測與田間試驗相結(jié)合對6進行證實。

通過檢查LAMP數(shù)據(jù)、對照氣象記錄、檢查農(nóng)藥使用情況的方法對6.1的條款進行證實。采用核查用藥記

錄和實驗室研究相結(jié)合的方法對6.2的條款進行證實。

2

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AA

附錄A

（資料性）

蘋果褐斑病相關(guān)資料

A.1病原

為子囊菌門蘋果雙殼菌DiplocarponmaliY.Harada&K.Sawamura。

A.2發(fā)病特征

A.2.1葉片發(fā)病特征

一般樹冠下部和內(nèi)膛葉片先發(fā)病，常見的有針芒型、同心輪紋型、混合型和褐點型4種癥狀。

A.2.2果實發(fā)病癥狀

先出現(xiàn)淡褐色小斑點，逐漸擴大為圓形、褐色、凹陷、表面有黑色小粒點，病部果肉褐色，海綿狀

干腐。

A.3發(fā)病規(guī)律

病菌主要以菌絲體在病落葉中越冬，翌年春季產(chǎn)生分生孢子和子囊孢子隨風雨傳播，直接入侵造成

初侵染，條件適宜時存在多次再侵染。冬季溫暖潮濕，春雨早、雨量大，夏季陰雨連綿，發(fā)病早且重。

樹冠內(nèi)膛密閉部位葉片以及樹冠下部葉片發(fā)病早且重。

3

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BB

附錄B

（資料性）

LAMP檢測技術(shù)和推薦藥劑及使用方法

B.1LAMP檢測技術(shù)

B.1.1擴增模板

以提取的蘋果葉片樣品DNA為模板，以蘋果褐斑菌株105基因組DNA為陽性模板，以無菌水為陰性

模板，采用特異性引物對待測樣品進行LAMP檢測，引物見表B.1，表B.1給出了蘋果樹褐斑病LAMP檢

測引物。

表B.1蘋果樹褐斑病LAMP檢測引物序列

引物類型引物序列

上游外引物（F3）GTAGTAGCCATCCTCGCGTCTGTGGAAGTGGGGGGGGTT

下游外引物（B3）GCGGCACCGCCACTGATTGCCCTGGCTTGGTCTTGG

上游內(nèi)引物（FIP）TGATCCGAGGTCACCGG

下游內(nèi)引物（BIP）CCGAGCGTCATTGACAACC

B.1.2擴增體系

擴增反應(yīng)在25μL體系中進行，反應(yīng)體系見表B.2，表B.2給出了蘋果褐斑病的LAMP檢測體系。

表B.2蘋果褐斑病LAMP反應(yīng)體系（25μL）

組分工作液濃度加樣量/μL

10×IsothermalAmplificationBuffer10×2.5

dNTPs10mM3.5

MgSO4100mM1

betaine（甜菜堿）10M0.5

上游外引物（F3）10μmol/L1.6

下游外引物（B3）10μmol/L1.6

上游內(nèi)引物（FIP）10μmol/L0.5

下游內(nèi)引物（BIP）10μmol/L0.5

BstDNApolymerase8U/μL/1

無菌水/6.5

模板/1

B.1.3擴增條件

4

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62℃擴增50min，80℃10min使酶熱變性失活終止反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入1μLSYBRGreen1染