ICS11.220DB43DB43/T1076—2015犬貓血清中狂犬病抗體的測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附法ofDogsandCatsEnzyme-linkedImmunosorbentAssay2015-07-20發(fā)布2015-09-20實(shí)施湖南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I前言 Ⅱ 2規(guī)范性引用文件 4儀器與設(shè)備 5試劑與材料 6操作程序 7檢測(cè)有效性及結(jié)果判定 附錄A（資料性附錄）試劑盒的組成、說(shuō)明及使用注意事項(xiàng) 本標(biāo)準(zhǔn)按GB／T1.1—2009的規(guī)則編制。本標(biāo)準(zhǔn)某些內(nèi)容可能涉及專利，本標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由湖南省畜牧水產(chǎn)局提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：長(zhǎng)沙市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：劉增再、寧華杰、陳智、鄭冠偉、丑亞琴、鄭姣妹、唐愛(ài)明、黃瓊、劉偉、歐建偉、薛爽、龍燕。犬貓血清中狂犬病抗體的測(cè)定酶聯(lián)免疫吸附法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了犬貓血清中狂犬病免疫抗體的測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于接種狂犬病疫苗的犬貓血清中狂犬病免疫抗體的定性檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法向包被有狂犬病病毒抗原的酶標(biāo)板中加入犬貓血清，犬貓血清中的狂犬病抗體與酶標(biāo)板中的抗原相結(jié)合，然后加入酶標(biāo)記物，酶標(biāo)記物與酶標(biāo)板上的抗原抗體結(jié)合物形成復(fù)合物，最后加入底物，底物與酶標(biāo)記物反應(yīng)形成有顏色的化合物，終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀測(cè)量其OD值，通過(guò)陽(yáng)性質(zhì)控的OD值確定犬貓血清中有無(wú)狂犬病免疫抗體。4儀器與設(shè)備4.1酶標(biāo)儀：內(nèi)置450nm和630nm濾光片。4.4恒溫培養(yǎng)箱。4.5振蕩混勻器。5試劑與材料犬貓狂犬病免疫抗體ELISA檢測(cè)試劑盒：試劑盒的組成、說(shuō)明及使用注意事項(xiàng)參見(jiàn)附錄A。實(shí)驗(yàn)用6操作程序6.1質(zhì)控分布與稀釋用單道移液器向A1，A2，B1，B2酶標(biāo)板微孔里各加90μL樣品稀釋液，分別向A1，A2孔里加 DB43/T1076—20156.2樣品的預(yù)稀釋向每個(gè)血清稀釋板微孔里各加入90μL樣品稀釋液，然后分別加入10μL待檢血清，使樣品預(yù)稀釋液的稀釋比例為1：10。6.3樣品的分布與稀釋向剩余每個(gè)酶標(biāo)板微孔里加入90μL樣品稀釋液，然后分別加入10μL樣品預(yù)稀釋液，用振蕩混勻器充分混勻后，用封口膜封好，使樣品最終稀釋比例為1：100。6.4孵育（37±1）℃孵育（60±5）min。6.5洗液的配制按1：10的比例，用實(shí)驗(yàn)用水稀釋濃縮洗滌液。6.6洗板取掉封口膜，先甩去酶標(biāo)板微孔里的液體，然后用多道移液器向每個(gè)酶標(biāo)板微孔里加入300μL洗液，每次浸泡30s，再棄去洗液，先后洗滌5次，最后在吸水紙上拍干。6.7加酶標(biāo)記物按1：10的比例，用酶標(biāo)記物稀釋液稀釋酶標(biāo)記物后，向每個(gè)酶標(biāo)板微孔里加入100μL稀釋好的酶標(biāo)記物，用振蕩混勻器充分混勻后，用封口膜封好。6.8孵育6.9洗板6.10底物反應(yīng)向每個(gè)酶標(biāo)板微孔里加入100μL過(guò)氧化物酶底物，室溫（20～25）℃,避光孵育（30±5）min。6.11終止反應(yīng)向每個(gè)酶標(biāo)板微孔里加入50μL終止液，輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板使之混勻，使孔內(nèi)無(wú)氣泡。6.12測(cè)量OD值用酶標(biāo)儀在雙波長(zhǎng)450nm和630nm，或者單波長(zhǎng)450nm下測(cè)量OD值。7檢測(cè)有效性及結(jié)果判定7.1當(dāng)陽(yáng)性質(zhì)控OD值≥0.300，并且當(dāng)陰性質(zhì)控OD值<0.5×陽(yáng)性質(zhì)控OD值時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。7.2樣品的OD值≥陽(yáng)性O(shè)D值，則可判定為狂犬病免疫抗體陽(yáng)性。（資料性附錄）試劑盒的組成、說(shuō)明及使用注意事項(xiàng)A.1試劑盒的組成A.2注意事項(xiàng)A.2.1使用前所有的試劑應(yīng)在（18～25）℃回溫2h。A.2.2將所有的試劑和樣品作為危險(xiǎn)生物品處理。A.2.3