ICS11.040.30CCSC30T/CSBMT/CSBM0050.2—2024創(chuàng)面修復(fù)材料有效性評(píng)價(jià)Effectivenessevalu2024-05-14發(fā)布中國(guó)生物材料學(xué)會(huì)發(fā)布IT/CSBM0050.2—2024前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14浸提液制備 15細(xì)胞增殖試驗(yàn) 16細(xì)胞遷移試驗(yàn) 3參考文獻(xiàn) 5T/CSBM0050.2—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是T/CSBM0050—2024《創(chuàng)面修復(fù)材料有效性評(píng)價(jià)》的第2部分。包括以下部分：——第1部分：水溶性材料體外評(píng)價(jià)方法；——第2部分：水不溶性材料體外浸提液評(píng)價(jià)方法；——第3部分：刺激因子屏蔽評(píng)價(jià)方法；——第4部分：體外微血管形成試驗(yàn)評(píng)價(jià)方法；——第5部分：體外細(xì)胞粘附和增殖直接接觸評(píng)價(jià)法；——第6部分：動(dòng)物食管創(chuàng)面模型促修復(fù)愈合評(píng)價(jià)方法；——第7部分：動(dòng)物胃創(chuàng)面模型促修復(fù)愈合評(píng)價(jià)方法；——第8部分：動(dòng)物腸道創(chuàng)面模型促修復(fù)愈合評(píng)價(jià)方法；——第9部分：動(dòng)物皮膚創(chuàng)面模型促修復(fù)愈合質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由中國(guó)生物材料學(xué)會(huì)提出。本文件由中國(guó)生物材料學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：杭州英健生物科技有限公司、中國(guó)食品藥品檢定研究院、四川大學(xué)。本文件主要起草人：戴建英、韓倩倩、梁潔、高欣怡、于棟杰、李銳、王涵、虞朝輝、李娜、王春仁、陳壇辀。T/CSBM0050.2—2024早期的創(chuàng)面愈合材料為普通無(wú)菌的敷料，主要起到物理隔離保護(hù)創(chuàng)面的作用。隨著生物材料的不斷發(fā)展，具有組織再生能力的材料不斷出現(xiàn)，這些材料不僅具有保護(hù)創(chuàng)面，而且具有促進(jìn)創(chuàng)面細(xì)胞再生遷移，加速創(chuàng)面愈合速度和提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量的作用。目前評(píng)價(jià)創(chuàng)面材料的有效性主要是評(píng)價(jià)對(duì)細(xì)菌的隔離作用，尚無(wú)從細(xì)胞水平評(píng)價(jià)材料促進(jìn)創(chuàng)面愈合的方法。創(chuàng)面修復(fù)材料主要包括水溶性材料和水不溶性材料。本文件主要是針對(duì)水不溶性生物材料，采用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法評(píng)價(jià)材料對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響，確定材料促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的有效量。水不溶性生物材料主要是水溶性生物材料采用交聯(lián)的方式制備的海綿狀多孔材料、水凝膠等型式的材料，這類(lèi)材料不溶于水，但是這類(lèi)材料在水溶液中可以游離出沒(méi)有交聯(lián)的分子或降解的小分子。這些游離的分子可能會(huì)具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的作用，另外在制備交聯(lián)材料時(shí)可以添加具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的作用的材料，這些材料可以游離到浸提液中，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的作用。本文件采用浸提液的方法評(píng)價(jià)創(chuàng)面修復(fù)材料是否具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移的作用。T/CSBM0050.2—20241創(chuàng)面修復(fù)材料有效性評(píng)價(jià)第2部分：水不溶性材料體外浸提液評(píng)價(jià)方法本文件規(guī)定了水不溶性創(chuàng)面修復(fù)材料體外評(píng)價(jià)的浸提液制備、細(xì)胞增殖試驗(yàn)和細(xì)胞遷移試驗(yàn)。本文件適用于水不溶性創(chuàng)面修復(fù)生物材料促進(jìn)創(chuàng)面細(xì)胞增殖和遷移效果的評(píng)價(jià)，如海綿多孔材料、水凝膠材料等。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T16886.12—2023醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第12部分：樣品制備與參照樣品T/CSBM0050.1創(chuàng)面修復(fù)材料有效性評(píng)價(jià)第1部分：水溶性材料體外評(píng)價(jià)方法3術(shù)語(yǔ)和定義T/CSBM0050.1界定的術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。4浸提液制備在無(wú)菌狀態(tài)下，按照以下條件制備浸提液：b)浸提時(shí)間：24h±2h或48h±2h或72h±2h；c)浸提介質(zhì)：無(wú)血清培養(yǎng)基；d)浸提條件：120r/min搖床中震蕩；e)樣品和浸提介質(zhì)的比例：按照GB/T16886.12—2023中表1的規(guī)定進(jìn)行。5細(xì)胞增殖試驗(yàn)在無(wú)血清培養(yǎng)基條件下測(cè)定細(xì)胞增殖的情況，以無(wú)血清培養(yǎng)基為空白對(duì)照，含血清培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照。若材料具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，則和空白對(duì)照相比具有明顯細(xì)胞增殖反應(yīng)。5.2器具、試劑和耗材、細(xì)胞系5.2.1器具試驗(yàn)器具如下：T/CSBM0050.2—20242a)二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱；b)恒溫水浴搖床；c)高壓蒸汽滅菌鍋；d)倒置熒光顯微鏡；e)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀；f)恒溫水浴搖床；g)酶標(biāo)儀；j)冷凍離心機(jī)；k)96孔板；l)細(xì)胞培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)皿。5.2.2試劑和耗材試驗(yàn)試劑和耗材如下：a)含10％新生胎牛血清DMEM低糖培養(yǎng)基（含10％FBSDMEM低糖培養(yǎng)基）；b)無(wú)血清培養(yǎng)基；c)CCK-8試劑。5.2.3細(xì)胞系5.2.3.1試驗(yàn)可使用的細(xì)胞系如下：a)成纖維細(xì)胞；b)皮膚上皮細(xì)胞；c)食管上皮細(xì)胞；e)腸黏膜上皮細(xì)胞。5.2.3.2對(duì)于用于不同部位的修復(fù)材料選擇合適的細(xì)胞系，如用于皮膚的修復(fù)材料可用皮膚細(xì)胞，用于食管的材料可選擇食管上皮細(xì)胞。5.3樣品制備5.3.1試驗(yàn)樣品5.3.2陽(yáng)性對(duì)照含10％FBSDMEM低糖培養(yǎng)基，37℃、120r/min搖床中震蕩24h。5.3.3空白對(duì)照無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃、120r/min搖床中震蕩24h。5.4試驗(yàn)方法將在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)的細(xì)胞按照1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度加入到96孔板內(nèi)，每孔100μL，6個(gè)復(fù)孔。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后棄去舊培養(yǎng)基，按照表1規(guī)定加入對(duì)照組和試驗(yàn)組溶液。于24h、48h和72h分別觀察細(xì)胞增殖情況，棄去孔內(nèi)液體，加入CCK-8溶液，放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3h。孵育結(jié)束使用酶標(biāo)儀測(cè)量T/CSBM0050.2—20243450nm的吸光度值，按照式（1）計(jì)算細(xì)胞增殖率，評(píng)估試驗(yàn)樣品溶液不同濃度對(duì)細(xì)胞的增殖作用，并篩選出最佳增殖濃度。表1細(xì)胞增殖試驗(yàn)×100%·································································(1)P1——細(xì)胞增殖率，%;A450nm——陽(yáng)性對(duì)照組不同濃度樣品組平均吸光度；B450nm——空白對(duì)照組平均吸光度。5.5結(jié)果分析采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果，并對(duì)空白對(duì)照組、試驗(yàn)組和/或陽(yáng)性對(duì)照品組各組結(jié)果進(jìn)行綜合分析評(píng)估。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：a)在陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照應(yīng)有顯著性差異（p＜0.05）條件下，試驗(yàn)組和空白對(duì)照組比較p＜0.05，則認(rèn)為該材料具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果，否則材料沒(méi)有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用；b)若陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05），則試驗(yàn)不成立。6細(xì)胞遷移試驗(yàn)6.1原理當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到融合成單層狀態(tài)時(shí)，在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個(gè)細(xì)胞空白區(qū)域，即為“劃痕”，劃痕邊緣的細(xì)胞會(huì)逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使“劃痕”愈合。通過(guò)對(duì)不同時(shí)期劃痕區(qū)域細(xì)胞狀態(tài)的觀察，對(duì)細(xì)胞的遷移能力進(jìn)行判斷。該方法模擬了細(xì)胞在體內(nèi)愈合過(guò)程中的遷移過(guò)程。在細(xì)胞單層中創(chuàng)建一個(gè)“傷口”，在細(xì)胞遷移過(guò)程中在開(kāi)始和定期捕獲圖像以關(guān)閉傷口，以及比較圖像以確定細(xì)胞遷移速率。6.2器具、試劑和耗材、細(xì)胞系6.2.1器具試驗(yàn)器具如下：a)二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱；b)恒溫水浴搖床；c)高壓蒸汽滅菌鍋；d)倒置熒光顯微鏡；e)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀；f)恒溫水浴搖床；g)酶標(biāo)儀；T/CSBM0050.2—20244k)細(xì)胞T75培養(yǎng)瓶；6.2.2試劑和耗材試驗(yàn)試劑和耗材如下：a)含10％新生胎牛血清DMEM低糖培養(yǎng)基（含10％FBSDMEM低糖培養(yǎng)基）；b)無(wú)血清培養(yǎng)基。6.2.3細(xì)胞系6.3樣品制備6.4試驗(yàn)方法按照表2規(guī)定將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按照1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度鋪于24孔板內(nèi)，每孔加入1mL，3個(gè)復(fù)孔，24h后將一滅菌直尺放置于孔板孔上方，用1mL槍垂直于孔板和直尺間劃一道橫線(xiàn)，在10×顯微鏡下觀察，拍攝0h、以及培養(yǎng)12h、24h時(shí)細(xì)胞圖片，應(yīng)用ImageJ按式（2）計(jì)算不同時(shí)間的細(xì)胞遷移率，評(píng)估生物材料作用后的對(duì)細(xì)胞遷移的影響。表2細(xì)胞遷移試驗(yàn)P2——細(xì)胞遷移率，%;S0——細(xì)胞劃痕后0h細(xì)胞未覆蓋的區(qū)域面積；S12——細(xì)胞劃痕后12h細(xì)胞未覆蓋的區(qū)域面積；S24——細(xì)胞劃痕后24h細(xì)胞未覆蓋的區(qū)域面積。6.5結(jié)果分析采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果，并對(duì)空白對(duì)照組、試驗(yàn)組和/或陽(yáng)性對(duì)照品組各組結(jié)果進(jìn)行綜合分析評(píng)估。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：a)在陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照應(yīng)有顯著性差異（p＜0.05）條件下，試驗(yàn)組和空白對(duì)照組比較p＜0.05，則認(rèn)為該材料具有促進(jìn)細(xì)胞遷移的效果，否則材料沒(méi)有促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用；b)若陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05），則試驗(yàn)不成立。T/CSBM0050.2—20245參考文獻(xiàn)[1]楊敏一,王涵,曾行,等.離子溫度雙敏感型黏膜創(chuàng)面保護(hù)膠性能及黏膜修復(fù)有效性體外評(píng)價(jià)研究[J].北京生物醫(yī)學(xué)工程,2022,41(04):405-412.[