2.2.2動物細(xì)胞融合與單克隆抗體“生物導(dǎo)彈”追蹤癌細(xì)胞抗體植物體細(xì)胞雜交植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)溫故而知新：植物體細(xì)胞雜交技術(shù)跨越不同種植物之間生殖隔離的屏障，克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，培育出新的作物類型。

1970年熒光標(biāo)記的人-鼠細(xì)胞融合實驗?zāi)Ｊ綀D實例：

如果讓動物細(xì)胞進(jìn)行融合，與植物有哪些不同之處？無需去除細(xì)胞壁全能性受限制，不能培育成新的動物個體思考：請同學(xué)們快速閱讀課本P48頁回答以下問題

1.什么是動物細(xì)胞融合技術(shù)（概念）？原理是什么？2.所形成的雜種細(xì)胞有什么特點？3.誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合的方法有哪些？4.

動物細(xì)胞融合技術(shù)的意義和應(yīng)用有哪些？一、動物細(xì)胞融合技術(shù)1、概念：指兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的技術(shù)。4、結(jié)果：形成雜交細(xì)胞。即融合后形成的原來兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的單核細(xì)胞。2、原理：細(xì)胞膜的流動性3、誘導(dǎo)方式物理法：離心、振動、電激化學(xué)法：聚乙二醇（PEG)生物法：滅活的病毒時間成果19世紀(jì)30年代觀察到肺結(jié)核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理組織中有多核細(xì)胞1858年觀察到正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。1875年第一個觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過程。1876年在無脊椎動物中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。1962年日本學(xué)者岡田發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有觸發(fā)動物細(xì)胞融合的效應(yīng)。1965年英國科學(xué)家證實了滅活的病毒可誘發(fā)動物細(xì)胞融合1974年華裔加拿大學(xué)者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌穩(wěn)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。20世紀(jì)80年代發(fā)展出了電融合技術(shù)(1985年酵母原生質(zhì)體電融合)（1）補充資料：動物細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展歷史仙臺病毒紫外線滅活喪失感染活性（不感染細(xì)胞）保留融合活性（誘導(dǎo)細(xì)胞融合）1、什么是病毒的滅活？

滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒失去感染能力，但是并不破壞病毒的抗原結(jié)構(gòu)。病毒表面的糖蛋白和一些酶與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。2、滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理（2）問題：用滅活的病毒誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合過程：滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面↓細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通↓細(xì)胞膜連接↓細(xì)胞核融合，形成雜交細(xì)胞（三）滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合過程：不同DNA的兩個細(xì)胞滅活的病毒融合有絲分裂兩個完整的雜交細(xì)胞5.動物細(xì)胞融合技術(shù)全過程:動物細(xì)胞融合動物細(xì)胞培養(yǎng)知識點一動物細(xì)胞融合1.動物細(xì)胞融合過程解讀:(1)操作過程:細(xì)胞膜融合→細(xì)胞質(zhì)融合→細(xì)胞核融合(實質(zhì))。(2)篩選意義:誘導(dǎo)融合的手段只是促使細(xì)胞間的融合,不能保證所有的細(xì)胞都發(fā)生融合,形成的融合細(xì)胞也有多種。(3)融合細(xì)胞特點:具有兩個細(xì)胞的遺傳信息,通過動物細(xì)胞的培養(yǎng),雜交細(xì)胞表現(xiàn)出兩個親本的特點。正在融合的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞

正在融合的雞血細(xì)胞6.動物細(xì)胞融合實例：（六）植物體細(xì)胞雜交和動物細(xì)胞融合的比較比較項目植物體細(xì)胞雜交動物細(xì)胞融合原理融合前處理誘導(dǎo)融合的方法意義和用途克服遠(yuǎn)源雜交的障礙，獲得雜種植株細(xì)胞膜的流動性細(xì)胞膜的流動性植物細(xì)胞的全能性去除細(xì)胞壁后誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合使細(xì)胞分散后誘導(dǎo)細(xì)胞融合物理（離心、振蕩、電激）化學(xué)（PEG）物理、化學(xué)方法（PEG）

滅活的病毒突破有性雜交局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。獲得雜交細(xì)胞制備單克隆抗體意義：突破了有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交（種間、屬間、科間、動植物之間）成為可能。成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。特別是利用雜交瘤技術(shù)制造單克隆抗體應(yīng)用：

一.動物細(xì)胞融合技術(shù)4.動物細(xì)胞融合技術(shù)的意義和應(yīng)用有哪些？2.植物體細(xì)胞雜交與動物細(xì)胞融合:項目植物體細(xì)胞雜交動物細(xì)胞融合原理細(xì)胞膜的流動性細(xì)胞全能性細(xì)胞的增殖融合過程酶解法除去細(xì)胞壁注射特定的抗原原生質(zhì)體融合動物細(xì)胞融合雜種細(xì)胞的篩選雜交瘤細(xì)胞的篩選培養(yǎng)獲得雜種植株提取提純單克隆抗體融合方法物理法:電融合法、離心法化學(xué)法:PEG、高Ca2+—高pH融合法物理法:電融合法化學(xué)法:PEG融合法生物法:滅活病毒誘導(dǎo)法實例番茄—馬鈴薯植株單克隆抗體用途培育作物新品種疾病的診斷和治療1.概念：2.結(jié)果：3.原理：細(xì)胞膜的流動性5.意義：突破了有性雜交方法的局限，使遠(yuǎn)緣雜交（種間、屬間、科間、動植物之間）成為可能。成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和生物新品種培育等的重要手段。特別是利用雜交瘤技術(shù)制造單克隆抗體。6.應(yīng)用：4.誘導(dǎo)方法：物理法;化學(xué)法和生物法動物細(xì)胞融合技術(shù)是指使_________動物細(xì)胞結(jié)合成一個細(xì)胞的技術(shù)。

形成的具有原來兩個或多個細(xì)胞遺傳信息的細(xì)胞，稱為________。（七）小結(jié)：抗原不純抗體不純（八）傳統(tǒng)抗體制備方法及缺陷缺陷：

產(chǎn)量低、純度低，

且抗體的特異性差、靈敏度低。不能無限增殖產(chǎn)生大量抗體動物體內(nèi)抗原

刺激漿細(xì)胞抗體篩選單一B細(xì)胞增殖分化

１）體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類多達(dá)百萬種以上２）每個B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性的抗體1、科學(xué)家發(fā)現(xiàn)：單克隆抗體

一個B淋巴細(xì)胞

抗體

細(xì)胞群克隆如何獲得大量、單一的抗體？體外培養(yǎng)時，一個B淋巴細(xì)胞不能無限增殖2、需解決問題：3、遺憾：如何解決這一難題？癌細(xì)胞動物細(xì)胞融合思考１：我們所學(xué)的哪種細(xì)胞是可以無限增殖的思考２：有什么方法能使B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的能力和無限增殖能力同時具備思考：一個極富創(chuàng)造力的方案：動物細(xì)胞融合雜交細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生專一抗體骨髓瘤細(xì)胞（癌細(xì)胞）能無限增殖一個B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體1975年，米爾斯坦和柯勒1984年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎

二、單克隆抗體及其應(yīng)用由單個B淋巴細(xì)胞經(jīng)過無性繁殖（克?。?，形成基因型相同的細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體稱為單克隆抗體。1、單克隆抗體：篩選雜交瘤細(xì)胞要使用特殊的培養(yǎng)基，一般用HAT培養(yǎng)基。HAT培養(yǎng)基根據(jù)細(xì)胞內(nèi)嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成途徑設(shè)計，通過在DMEM(或RPM-1640)培養(yǎng)基中加入次黃嘌呤(hypoxanthineH)、氨基蝶呤(aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)3種關(guān)鍵成分配制而成。DMEM是Dulbecco＂sModifiedEagleMedium的縮寫，該培養(yǎng)基應(yīng)用廣泛，常用于壁細(xì)胞的培養(yǎng)。RPMI-1640培養(yǎng)基是美國洛斯維?帕克紀(jì)念研究所(RoswellParkMemorialInstitute)研發(fā)的，RPMI由該研究所名稱的首字母組成，1640是培養(yǎng)基的編號，該培養(yǎng)基也是種常用的培養(yǎng)基，主要用于一些懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。哺乳動物細(xì)胞中合成DNA的途徑有兩條，一條是從頭合成途徑(denovosynthesispathway)，簡稱D途徑，該途徑是指從氨基酸和其他小分子化合物合成核苷酸開始，合成DNA的過程。在D途徑中，葉酸及其行生物是必不可少的，它們參與嘌呤環(huán)和啶甲基的合成。HAT培養(yǎng)基中加入的氨基蝶呤是葉酸的拮抗劑，因此它可以阻斷細(xì)胞利用D途徑合成DNA。另一條是補救途徑(即salvagepathway，或稱為替代途徑)，簡稱S途徑。該途徑需要次黃呤嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的參與，這兩種酶可以催化次黃嘌呤和胸腺啶核苷分產(chǎn)生肌苷酸和胸腺啶脫氧核苷酸，它們可以用來合成DNA骨髓瘤細(xì)胞是經(jīng)過人工篩選的基因缺陷型細(xì)胞，缺乏HGPRT和TK。9當(dāng)它處于HAT培養(yǎng)基中時，它合成DNA的D途徑被氨基呤阻斷;同時，它由于缺乏HGPRT和TK，所以不能利用S途徑合成DNA，會很快死亡。而雜交瘤細(xì)胞從B淋巴細(xì)胞中獲得了HGPRT和TK，可以利用補充在培養(yǎng)基中的次黃嘌呤和胸腺啶核苷經(jīng)過S途徑來合成DNA，這樣在HAT培養(yǎng)基中它可以生存并增殖。(六)雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測及克降化培養(yǎng)用選擇培養(yǎng)基(HAT)篩選出的雜交瘤細(xì)胞，大多數(shù)不能分泌抗體，僅有少數(shù)細(xì)胞能分泌所需的特異性抗體，因此需要將這些雜交箱細(xì)胞挑選出米如何挑選呢可以根據(jù)抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，運用免疫酶測定法(如常用的酶聯(lián)免疫吸附試驗法)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫測定法等檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體。一般在雜交瘤細(xì)胞布滿孔底1/10面積時進(jìn)行檢測(對小鼠的雜交瘤細(xì)胞來說，一般在融合后的10～14d進(jìn)行檢測)。另外，新融合的雜交細(xì)胞不穩(wěn)定，容易失去分抗體的性質(zhì)，所以一般需要進(jìn)行幾次檢測以確保其穩(wěn)定性。當(dāng)經(jīng)過2~3次檢測證實在培養(yǎng)孔中存在特異性抗體時，就可以對雜交細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)克隆化培養(yǎng)了?？寺』侵赣蓡蝹€細(xì)胞分裂增殖獲得細(xì)胞的培養(yǎng)過程。常用的克隆化培養(yǎng)方法包括有限稀釋法、軟瓊脂培養(yǎng)法等。下面以有限稀釋法為例進(jìn)行簡要說明將處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞用培養(yǎng)液充分稀釋，使分配到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每個孔中的細(xì)胞數(shù)不超過1，通過培養(yǎng)讓它增殖為單克隆。一般培養(yǎng)4～5d后，如果在倒置顯微鏡下見到簇緊密生長的細(xì)胞，可認(rèn)為這是單一克隆。經(jīng)過一次克隆化培養(yǎng)的細(xì)胞不能保證其來自單個細(xì)胞，一般經(jīng)過3~4次培養(yǎng)才可以獲得穩(wěn)定的單克隆。這時候，如果再次檢測抗體為陽性，就可以進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)了。二、單克隆抗體的制備B、瘤、BB、B瘤、瘤瘤√第1次篩選目的：得到雜交瘤細(xì)胞（多種）。

注射特定抗原

從脾臟中獲取多種B淋巴細(xì)胞

骨髓瘤細(xì)胞

培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞目的是獲得產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合誘導(dǎo)融合2、單克隆抗體的制備過程B、瘤、BB、B瘤、瘤瘤√多種雜交細(xì)胞第一次篩選選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)多種雜交瘤細(xì)胞第1次篩選目的：得到雜交瘤細(xì)胞（多種）。雜交瘤細(xì)胞第二次篩選多孔培養(yǎng)板篩選抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)和抗體檢測既能迅速大量增殖又能產(chǎn)生特異性抗體特點既能迅速大量增殖又能產(chǎn)生抗體特點(抗原-抗體特異性結(jié)合)第2次篩選目的：在雜交瘤細(xì)胞中篩選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞。陽性細(xì)胞單克隆抗體的制備在體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔內(nèi)培養(yǎng)液中獲取從腹水中獲取單克隆抗體

補充資料：第一次篩選獲得雜交瘤細(xì)胞①細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。②人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但不能分裂增殖。

③鼠骨髓瘤細(xì)胞中只有D途徑，沒有S途徑，但能不斷分裂增殖。篩選出雜交瘤細(xì)胞方法？培養(yǎng)基中加入氨基嘌呤B淋巴細(xì)胞及同型融合細(xì)胞不能無限增殖，死亡骨髓瘤細(xì)胞及同型融合細(xì)胞不能無限增殖，死亡雜交瘤細(xì)胞能無限增殖，生長多孔細(xì)胞培養(yǎng)板抗體檢測板陽性孔抗體檢測的方法——抗原-抗體雜交法將雜交瘤細(xì)胞群稀釋，約每孔1個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)（克隆化培養(yǎng)）一段時間后，檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔分泌抗體能跟特定抗原結(jié)合的細(xì)胞即為所需雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體的制備過程誘導(dǎo)融合選擇培養(yǎng)基克隆化培養(yǎng)，專一抗體檢驗體外培養(yǎng)或小鼠腹腔內(nèi)增殖動物細(xì)胞融合動物細(xì)胞培養(yǎng)給小鼠注射特定的抗原蛋白B淋巴細(xì)胞（免疫）骨髓瘤細(xì)胞雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞單克隆抗體能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞第一次篩選第二次篩選第1次篩選目的：得到雜交瘤細(xì)胞（多種）。第2次篩選目的：在雜交瘤細(xì)胞中篩選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞。3.三種細(xì)胞的比較:細(xì)胞類型來源特點已免疫的B淋巴細(xì)胞由B淋巴細(xì)胞受抗原刺激后增殖分化而來能產(chǎn)生單一抗體,但不能無限增殖骨髓瘤細(xì)胞從骨髓腫瘤中提取能無限增殖,但不能產(chǎn)生抗體雜交瘤細(xì)胞漿細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而成既能產(chǎn)生抗體,又能無限增殖1、診斷試劑——最廣泛應(yīng)用抗原-抗體雜交法抗人絨毛促性腺激素單克隆抗體比原來診斷方法提前了