生物類(lèi)似藥研發(fā)中的下游純化工藝優(yōu)化演講人01生物類(lèi)似藥研發(fā)中的下游純化工藝優(yōu)化02引言：下游純化工藝在生物類(lèi)似藥研發(fā)中的戰(zhàn)略地位03下游純化工藝開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)認(rèn)知：從“目標(biāo)導(dǎo)向”到“系統(tǒng)思維”04關(guān)鍵純化單元技術(shù)的優(yōu)化策略：分步突破與協(xié)同增效05工藝放大與轉(zhuǎn)移：從“實(shí)驗(yàn)室到工廠”的平穩(wěn)落地06質(zhì)量控制的整合：從“終點(diǎn)檢測(cè)”到“過(guò)程監(jiān)控”07總結(jié)與展望：下游純化工藝優(yōu)化的“核心要義”與未來(lái)方向目錄01生物類(lèi)似藥研發(fā)中的下游純化工藝優(yōu)化02引言：下游純化工藝在生物類(lèi)似藥研發(fā)中的戰(zhàn)略地位引言：下游純化工藝在生物類(lèi)似藥研發(fā)中的戰(zhàn)略地位生物類(lèi)似藥的研發(fā)是一場(chǎng)“精準(zhǔn)復(fù)制”與“創(chuàng)新超越”的平衡藝術(shù)，而下游純化工藝作為連接上游表達(dá)與最終產(chǎn)品質(zhì)量的“咽喉要道”，其優(yōu)化水平直接決定了產(chǎn)品的安全性與有效性。與原研藥相比，生物類(lèi)似藥雖需遵循“相似性”原則，但并不意味著簡(jiǎn)單復(fù)制工藝——原研工藝的“黑箱特性”、原材料差異、生產(chǎn)規(guī)模放大帶來(lái)的挑戰(zhàn)，均要求我們必須通過(guò)系統(tǒng)性的工藝優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）”的理念落地。在近十年的從業(yè)經(jīng)歷中，我深刻體會(huì)到：下游純化工藝的優(yōu)化絕非單一技術(shù)的改良，而是涉及科學(xué)認(rèn)知、工程實(shí)踐與質(zhì)量體系的系統(tǒng)工程。本文將從工藝開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)邏輯出發(fā)，系統(tǒng)梳理關(guān)鍵優(yōu)化策略、技術(shù)路徑與實(shí)施要點(diǎn)，為行業(yè)同仁提供一套兼具理論深度與實(shí)踐價(jià)值的參考框架。03下游純化工藝開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)認(rèn)知：從“目標(biāo)導(dǎo)向”到“系統(tǒng)思維”生物類(lèi)似藥下游純化的核心目標(biāo)與挑戰(zhàn)生物類(lèi)似藥的下游純化工藝需同時(shí)滿(mǎn)足三大核心目標(biāo)：產(chǎn)品質(zhì)量一致性、工藝穩(wěn)健性與成本可控性。其中，產(chǎn)品質(zhì)量一致性是底線，需確保與原研藥在結(jié)構(gòu)、純度、生物學(xué)活性等方面高度相似；工藝穩(wěn)健性是保障，需通過(guò)參數(shù)控制實(shí)現(xiàn)不同批次間的質(zhì)量穩(wěn)定；成本可控性是競(jìng)爭(zhēng)力，需在滿(mǎn)足質(zhì)量前提下降低生產(chǎn)成本，提高可及性。然而，實(shí)際開(kāi)發(fā)中常面臨多重挑戰(zhàn)：1.原研工藝信息缺失：原研企業(yè)通常不公開(kāi)完整的下游工藝細(xì)節(jié)，僅能通過(guò)專(zhuān)利文獻(xiàn)與公開(kāi)反推，導(dǎo)致“復(fù)制起點(diǎn)”不明確；2.原料variability傳導(dǎo)：細(xì)胞株、培養(yǎng)基、緩沖液等原材料的批次差異可能影響雜質(zhì)譜，需工藝具備足夠的“抗干擾能力”；生物類(lèi)似藥下游純化的核心目標(biāo)與挑戰(zhàn)3.雜質(zhì)譜復(fù)雜性：生物藥中的雜質(zhì)包括宿主細(xì)胞蛋白（HCP）、宿主細(xì)胞DNA（hcDNA）、內(nèi)毒素、聚體、電荷異構(gòu)體等，不同雜質(zhì)的理化性質(zhì)差異大，需“分而治之”；4.法規(guī)與成本的雙重約束：需滿(mǎn)足EMA、FDA、NMPA等機(jī)構(gòu)的嚴(yán)格要求，同時(shí)避免過(guò)度純化導(dǎo)致的成本飆升。例如，在單抗類(lèi)似藥的開(kāi)發(fā)中，HCP殘留是常見(jiàn)難題——原研藥中HCP控制在100ppm以下，而某早期項(xiàng)目因親和層析（ProteinA）載量不足與陰離子交換層析（AEX）清洗條件優(yōu)化不當(dāng)，導(dǎo)致HCP殘留達(dá)300ppm，最終不得不通過(guò)增加額外精制步驟解決，不僅推高了成本，還延長(zhǎng)了工藝周期。這一教訓(xùn)讓我深刻認(rèn)識(shí)到：下游工藝優(yōu)化必須始于對(duì)雜質(zhì)譜的深度解析，而非盲目套用模板。生物類(lèi)似藥下游純化的核心目標(biāo)與挑戰(zhàn)（二）QbD理念下的工藝開(kāi)發(fā)框架：從“經(jīng)驗(yàn)試錯(cuò)”到“科學(xué)設(shè)計(jì)”傳統(tǒng)下游工藝開(kāi)發(fā)依賴(lài)“試錯(cuò)法”，通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)摸索參數(shù)，不僅效率低下，且難以保證工藝穩(wěn)健性?；赒bD理念的開(kāi)發(fā)框架則強(qiáng)調(diào)“目標(biāo)明確、風(fēng)險(xiǎn)可控、持續(xù)優(yōu)化”，其核心邏輯包括：1.定義目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量概況（QTPP）：明確關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA，如純度、活性、雜質(zhì)限度等），并將其與下游工藝單元關(guān)聯(lián)；2.識(shí)別關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）與關(guān)鍵物料屬性（CMA）：通過(guò)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估（如FMEA、DoE）確定影響CQA的關(guān)鍵因素；3.建立設(shè)計(jì)空間（DesignSpace）：通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)確定CPP的合理范圍，在此范圍內(nèi)工藝可保證質(zhì)量；生物類(lèi)似藥下游純化的核心目標(biāo)與挑戰(zhàn)4.工藝驗(yàn)證與持續(xù)改進(jìn)：通過(guò)商業(yè)化生產(chǎn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證工藝穩(wěn)健性，并根據(jù)反饋持續(xù)優(yōu)化。以某重組蛋白類(lèi)似藥的開(kāi)發(fā)為例，團(tuán)隊(duì)首先通過(guò)QTPP明確“聚體含量≤5%”為核心CQA，隨后通過(guò)DoE實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在ultrafiltration/diafiltration（UF/DF）過(guò)程中，跨膜壓（TMP）與循環(huán)流速對(duì)聚體形成影響顯著。最終將TMP控制在1.5-2.5bar、循環(huán)流速控制在150-200L/h2，建立了設(shè)計(jì)空間，使聚體含量穩(wěn)定在3%-4%，較原工藝提升了30%的收率。這一案例充分證明：QbD理念的引入，可使工藝開(kāi)發(fā)從“被動(dòng)響應(yīng)”轉(zhuǎn)向“主動(dòng)控制”。04關(guān)鍵純化單元技術(shù)的優(yōu)化策略：分步突破與協(xié)同增效關(guān)鍵純化單元技術(shù)的優(yōu)化策略：分步突破與協(xié)同增效下游純化工藝通常由多個(gè)單元操作組成（如capture、polishing、viralclearance等），每個(gè)單元技術(shù)需針對(duì)特定雜質(zhì)進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)實(shí)現(xiàn)各單元間的“無(wú)縫銜接”。以下將結(jié)合生物類(lèi)似藥的特性，分技術(shù)類(lèi)別闡述優(yōu)化要點(diǎn)。捕獲步驟：效率與載量的平衡藝術(shù)捕獲步驟是下游工藝的“第一道關(guān)卡”，通常采用親和層析（如ProteinA、親和標(biāo)簽層析），其核心目標(biāo)是最大化目標(biāo)產(chǎn)物收率與最小化宿主蛋白與DNA的清除，同時(shí)控制成本（填料壽命、上樣量）。1.ProteinA層析的優(yōu)化：從“固定參數(shù)”到“動(dòng)態(tài)控制”P(pán)roteinA是單抗類(lèi)生物類(lèi)似藥捕獲的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，但其存在成本高（填料價(jià)格昂貴）、易受污染（如蛋白A脫落）、低pH洗脫易導(dǎo)致抗體變性等缺點(diǎn)。優(yōu)化方向包括：-上樣載量?jī)?yōu)化：需平衡“高載量”（降低填料使用量）與“雜質(zhì)穿透”（HCP、DNA穿透增加）。通過(guò)動(dòng)態(tài)載量（DLC）實(shí)驗(yàn)，結(jié)合進(jìn)料液中抗體濃度與雜質(zhì)含量，可確定最優(yōu)載量。例如，某項(xiàng)目通過(guò)調(diào)整上樣流速（從2CV/h提升至5CV/h）與進(jìn)料液pH（從7.0調(diào)至7.2），在DLC維持在30mg/mL的前提下，將HCP清除率從85%提升至92%；捕獲步驟：效率與載量的平衡藝術(shù)-洗脫條件優(yōu)化：低pH洗脫（如pH3.0-3.5）是常用方法，但易導(dǎo)致抗體聚集?？赏ㄟ^(guò)添加穩(wěn)定劑（如精氨酸、NaCl）或采用梯度洗替代步進(jìn)洗，降低聚體形成。例如，在單抗類(lèi)似藥中，添加0.4M精氨酸的pH3.2洗脫緩沖液，可使聚體含量從8%降至3.5%；-填料壽命管理：ProteinA填料壽命通常受機(jī)械強(qiáng)度與化學(xué)穩(wěn)定性限制。通過(guò)優(yōu)化清洗策略（如0.1MNaOH定期消毒）、避免高流速剪切，可將填料壽命從100個(gè)循環(huán)提升至200個(gè)以上，顯著降低單批次成本。捕獲步驟：效率與載量的平衡藝術(shù)親和標(biāo)簽層析的替代方案：降低成本與工藝復(fù)雜度對(duì)于非單抗類(lèi)生物類(lèi)似藥（如重組胰島素、生長(zhǎng)激素），可采用組氨酸標(biāo)簽（His-tag）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)簽等親和層析。優(yōu)化重點(diǎn)包括：12-競(jìng)爭(zhēng)洗脫條件優(yōu)化：咪唑是His-tag層析的常用洗脫劑，但高濃度咪唑可能影響產(chǎn)物活性。通過(guò)梯度洗脫（從0-500mM咪唑）替代步進(jìn)洗，可在保證收率（≥95%）的前提下，將殘留咪唑控制在10ppm以下，滿(mǎn)足后續(xù)制劑要求。3-標(biāo)簽位點(diǎn)選擇：標(biāo)簽的插入位置需不影響目標(biāo)產(chǎn)物的生物學(xué)活性。例如，某重組融合蛋白項(xiàng)目將His-tag插入蛋白C端，較N端插入時(shí)的表達(dá)量提升20%，且親和純化收率從65%提高至85%；精制步驟：雜質(zhì)清除與產(chǎn)品穩(wěn)定性的雙重保障精制步驟是下游工藝的“凈化核心”，通常包括離子交換層析（IEX）、疏水作用層析（HIC）、體積排阻層析（SEC）等，目標(biāo)是深度清除殘留雜質(zhì)（如HCP、聚體、電荷異構(gòu)體），同時(shí)保證產(chǎn)品構(gòu)象穩(wěn)定。1.離子交換層析（IEX）：電荷異構(gòu)體與HCP的“精準(zhǔn)分離”IEX基于電荷差異分離目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)，分為陽(yáng)離子交換（CEX）和陰離子交換（AEX）。對(duì)于單抗類(lèi)似藥，CEX常用于清除酸性/堿性電荷異構(gòu)體，AEX則用于清除HCP與DNA。-CEX優(yōu)化：關(guān)鍵參數(shù)包括結(jié)合緩沖液pH、鹽濃度、洗脫梯度。例如，某單抗類(lèi)似藥通過(guò)DoE實(shí)驗(yàn)確定，當(dāng)緩沖液pH為5.0（接近抗體等電點(diǎn)pI）、NaCl梯度為0-300mM時(shí)，可高效分離主峰與酸性雜質(zhì)（脫酰胺化、糖基化缺失），且收率≥90%；精制步驟：雜質(zhì)清除與產(chǎn)品穩(wěn)定性的雙重保障-AEX優(yōu)化：AEX的“流穿模式”是清除HCP的高效策略，需優(yōu)化電導(dǎo)率（≤5mS/cm）、pH（≥8.0）與流速。例如，在項(xiàng)目中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)進(jìn)料液電導(dǎo)率控制在3mS/cm以下時(shí)，HCP清除率可達(dá)99%，且抗體回收率≥98%。精制步驟：雜質(zhì)清除與產(chǎn)品穩(wěn)定性的雙重保障疏水作用層析（HIC）：聚體與HCP的“補(bǔ)充清除”HIC基于疏水相互作用分離雜質(zhì)，常用于清除聚體與疏水性HCP。其優(yōu)化需重點(diǎn)關(guān)注高鹽結(jié)合與低鹽洗脫的條件設(shè)計(jì)：-沉淀劑選擇：硫酸銨是常用沉淀劑，但高濃度可能影響產(chǎn)物活性。通過(guò)對(duì)比（NH?）?SO?與NaCl發(fā)現(xiàn)，1.5M(NH?)?SO?結(jié)合時(shí)的聚體清除效率較NaCl高20%，且產(chǎn)物活性損失≤5%；-洗脫梯度優(yōu)化：線性洗脫較步進(jìn)洗可提高分離度。例如，某項(xiàng)目將洗脫梯度從0-100%洗脫劑（含0.5MNaCl）調(diào)整為0-60%線性梯度，使聚體含量從5%降至2.5%，同時(shí)HCP殘留從50ppm降至20ppm。精制步驟：雜質(zhì)清除與產(chǎn)品穩(wěn)定性的雙重保障體積排阻層析（SEC）：聚體與片段的“終極把關(guān)”SEC基于分子大小分離雜質(zhì)，是控制聚體含量的“最后一道防線”，但其通量低、溶劑消耗大，需嚴(yán)格控制使用場(chǎng)景。優(yōu)化方向包括：01-上樣量控制：過(guò)高的上樣量會(huì)導(dǎo)致分離度下降。通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定，當(dāng)上樣量≤5%柱體積時(shí)，聚體與主峰的分離度（Rs）≥1.5，滿(mǎn)足質(zhì)量要求；02-流動(dòng)相優(yōu)化：添加穩(wěn)定劑（如蔗糖、甘氨酸）可減少SEC過(guò)程中的聚集。例如，在含0.25M蔗糖的PBS緩沖液中運(yùn)行SEC，可使單抗類(lèi)似藥的聚體含量在儲(chǔ)存3個(gè)月后仍≤3%。03病毒清除步驟：安全性的“紅線不可逾越”生物類(lèi)似藥的生產(chǎn)需通過(guò)病毒清除驗(yàn)證（包括病毒滅活與病毒去除），這是滿(mǎn)足法規(guī)要求的“硬性指標(biāo)”。常見(jiàn)的病毒清除方法包括低pH孵育、有機(jī)溶劑/表面活性劑處理（S/D）、納米過(guò)濾（NF）等。-低pH孵滅活：適用于包膜病毒（如HIV、HBV），關(guān)鍵參數(shù)為pH、溫度與時(shí)間。需確保pH在整個(gè)孵育過(guò)程中穩(wěn)定（±0.1），例如某項(xiàng)目通過(guò)在線pH監(jiān)測(cè)與自動(dòng)滴加系統(tǒng)，將低pH孵育的pH控制在3.8±0.1，30℃孵育60分鐘后，病毒滴度下降≥4log，且抗體活性損失≤8%；-納米過(guò)濾（NF）：適用于非包膜病毒（如HCV、Parvovirus），通過(guò)孔徑大?。?0-40nm）截留病毒顆粒。優(yōu)化需關(guān)注濾膜兼容性（如避免吸附）與通量控制。例如，某項(xiàng)目選擇35nm孔徑的Planova濾膜，在跨膜壓≤3bar條件下，病毒去除率≥6log，抗體回收率≥95%。05工藝放大與轉(zhuǎn)移：從“實(shí)驗(yàn)室到工廠”的平穩(wěn)落地工藝放大與轉(zhuǎn)移：從“實(shí)驗(yàn)室到工廠”的平穩(wěn)落地實(shí)驗(yàn)室工藝開(kāi)發(fā)的成功不代表商業(yè)化生產(chǎn)的可行，下游工藝的放大與轉(zhuǎn)移是“從0到1”的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需解決“規(guī)模效應(yīng)”帶來(lái)的參數(shù)變化與質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)。放大的核心原則：保持“相似性”而非“等同性”工藝放大的核心目標(biāo)是確保放大后工藝的產(chǎn)品質(zhì)量與實(shí)驗(yàn)室工藝一致，而非簡(jiǎn)單放大設(shè)備尺寸。關(guān)鍵原則包括：1.關(guān)鍵參數(shù)等效：如層析工藝中，需保持“residencetime（RT）”“線性流速（LV）”等參數(shù)一致，而非“體積流量”一致。例如，實(shí)驗(yàn)室層析柱直徑5cm，流速10mL/min（LV=50cm/h），放大至直徑50cm時(shí)，需將流量提升至10L/min（LV仍為50cm/h），以保證傳質(zhì)效率一致；2.混合與傳熱控制：UF/DF過(guò)程中，放大后的混合效果可能變差，導(dǎo)致濃度梯度與局部pH變化。通過(guò)增加靜態(tài)混合器或調(diào)整循環(huán)流速，可確?；旌暇鶆蛐?；3.過(guò)程分析技術(shù)（PAT）的應(yīng)用：通過(guò)在線監(jiān)測(cè)pH、電導(dǎo)率、UVabsorbance等參數(shù)，實(shí)時(shí)調(diào)整工藝條件，避免放大過(guò)程中的“參數(shù)漂移”。工藝轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)管理：從“文件交接”到“協(xié)同驗(yàn)證”工藝轉(zhuǎn)移是研發(fā)部門(mén)與生產(chǎn)部門(mén)的“接力棒”，需建立系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)管理機(jī)制：1.工藝描述文件（PDS）的完善：明確實(shí)驗(yàn)室工藝的關(guān)鍵參數(shù)、操作范圍與接受標(biāo)準(zhǔn)，作為轉(zhuǎn)移的“基準(zhǔn)文件”；2.差距分析（GapAnalysis）：對(duì)比實(shí)驗(yàn)室設(shè)備與生產(chǎn)設(shè)備的差異（如層析柱規(guī)模、UF/DF膜面積），評(píng)估潛在風(fēng)險(xiǎn)并制定解決方案。例如，實(shí)驗(yàn)室UF/DF使用10kDa膜包面積0.5m2，生產(chǎn)設(shè)備為10m2，需通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證放大后的通量與截留率是否一致；3.分階段驗(yàn)證：先進(jìn)行“實(shí)驗(yàn)室-中試”轉(zhuǎn)移（10-100L規(guī)模），驗(yàn)證工藝穩(wěn)健性；再進(jìn)行“中試-生產(chǎn)”轉(zhuǎn)移（1000L以上規(guī)模），確認(rèn)商業(yè)化生產(chǎn)的可行性。每個(gè)階段需完成工藝性能確認(rèn)（PPQ），確保產(chǎn)品符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。06質(zhì)量控制的整合：從“終點(diǎn)檢測(cè)”到“過(guò)程監(jiān)控”質(zhì)量控制的整合：從“終點(diǎn)檢測(cè)”到“過(guò)程監(jiān)控”下游工藝優(yōu)化的最終目標(biāo)是保證產(chǎn)品質(zhì)量，而質(zhì)量控制需貫穿工藝始終，從“終點(diǎn)檢測(cè)”轉(zhuǎn)向“過(guò)程監(jiān)控”，實(shí)現(xiàn)對(duì)質(zhì)量的實(shí)時(shí)控制。關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）的監(jiān)測(cè)策略生物類(lèi)似藥的CQA需與原研藥保持一致，核心包括：1.結(jié)構(gòu)確證：通過(guò)質(zhì)譜（MS）、肽圖分析確認(rèn)一級(jí)結(jié)構(gòu)與翻譯后修飾（如糖基化、氧化）；2.純度與雜質(zhì)：通過(guò)SEC檢測(cè)聚體含量（≤5%）、CEX檢測(cè)電荷異構(gòu)體（與原研藥差異≤±10%）、ELISA檢測(cè)HCP殘留（≤100ppm）；3.生物學(xué)活性：通過(guò)細(xì)胞生物活性assay（如IC??、EC??）確保與原研藥相似（potencyratio0.8-1.25）。例如，某項(xiàng)目在工藝優(yōu)化過(guò)程中，通過(guò)引入“在線SEC監(jiān)測(cè)系統(tǒng)”，實(shí)時(shí)跟蹤UF/DF步驟后的聚體含量，當(dāng)檢測(cè)到聚體異常升高時(shí)，自動(dòng)調(diào)整TMP與循環(huán)流速，使聚體含量始終控制在3%以下，避免了傳統(tǒng)“終點(diǎn)檢測(cè)”帶來(lái)的滯后性。工藝analytical技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用隨著技術(shù)的發(fā)展，PAT工具為工藝質(zhì)量控制提供了“眼睛”：01-拉曼光譜：可用于UF/DF過(guò)程中緩沖液成分的在線監(jiān)測(cè)，如透析液的鹽濃度；03這些技術(shù)的應(yīng)用，不僅提高了檢測(cè)效率，更實(shí)現(xiàn)了工藝的“實(shí)時(shí)反饋控制”，為質(zhì)量持續(xù)改進(jìn)提供了數(shù)據(jù)支撐。05-傅里葉變換紅外光譜（FTIR）：可實(shí)時(shí)層析流分中的蛋白濃度與純度，替代傳統(tǒng)的UV???檢測(cè)；02-微量熱泳動(dòng)（MST）：用于分析抗體與ProteinA的結(jié)合親和力，確保層