生物類似藥研發(fā)中的高通量篩選技術(shù)應(yīng)用演講人01生物類似藥研發(fā)中的高通量篩選技術(shù)應(yīng)用02引言：生物類似藥研發(fā)的特殊性與高通量篩選的必然選擇03生物類似藥研發(fā)的特殊性：高通量篩選的適配性基礎(chǔ)04高通量篩選的技術(shù)體系：核心模塊與關(guān)鍵支撐05高通量篩選在生物類似藥研發(fā)全流程中的具體應(yīng)用目錄01生物類似藥研發(fā)中的高通量篩選技術(shù)應(yīng)用02引言：生物類似藥研發(fā)的特殊性與高通量篩選的必然選擇引言：生物類似藥研發(fā)的特殊性與高通量篩選的必然選擇作為一名在生物藥研發(fā)領(lǐng)域深耕十余年的從業(yè)者，我深刻體會到生物類似藥研發(fā)的獨特性與復(fù)雜性。生物類似藥是指與已上市原研生物藥（如單抗、重組蛋白、疫苗等）高度相似，且無臨床意義差異的生物藥，其核心在于通過嚴格的比對研究證明“相似性”。然而，與化學(xué)仿制藥不同，生物藥分子量大（通常>10kDa）、結(jié)構(gòu)復(fù)雜（涉及一級結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾等多維度質(zhì)量屬性），且對生產(chǎn)工藝敏感，這使得生物類似藥的研發(fā)不僅需要攻克結(jié)構(gòu)解析與工藝復(fù)制的技術(shù)難關(guān)，更面臨“相似性”評價的巨大挑戰(zhàn)——如何在海量候選分子中快速篩選出與原研藥高度一致的“理想分子”，成為決定研發(fā)成敗的關(guān)鍵。傳統(tǒng)生物類似藥研發(fā)中，候選分子的篩選多依賴“試錯法”，通過有限批次的實驗進行活性、親和力等單一指標的評估，不僅周期長（往往需要2-3年）、成本高（單輪篩選成本可達數(shù)百萬元），且難以全面覆蓋生物藥的多維度質(zhì)量屬性。引言：生物類似藥研發(fā)的特殊性與高通量篩選的必然選擇例如，在單抗類似藥的研發(fā)中，我們曾因僅關(guān)注抗原結(jié)合活性（KD值），而忽視了Fc段糖基化修飾的差異，導(dǎo)致候選分子進入臨床前研究后，ADCC效應(yīng)（抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒作用）顯著偏離原研藥，最終不得不推倒重來，造成近千萬元的損失。這種“頭痛醫(yī)頭、腳痛醫(yī)腳”的篩選模式，顯然無法滿足生物類似藥研發(fā)對“高效、全面、精準”的剛性需求。正是在這樣的背景下，高通量篩選（High-ThroughputScreening，HTS）技術(shù)應(yīng)運而生。HTS源于20世紀90年代的藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域，最初用于小分子化合物的活性篩選，隨著自動化技術(shù)、檢測技術(shù)及數(shù)據(jù)分析方法的進步，逐漸被引入生物類似藥研發(fā)領(lǐng)域。其核心是通過高度自動化的實驗平臺，在短時間內(nèi)（數(shù)天至數(shù)周）對數(shù)萬至數(shù)百萬個候選分子進行多指標、高通量的檢測，引言：生物類似藥研發(fā)的特殊性與高通量篩選的必然選擇從而快速鎖定具有“高相似性”潛力的候選分子。在我看來，HTS之于生物類似藥研發(fā)，猶如“篩子之于金沙”——它不僅將傳統(tǒng)篩選從“大海撈針”變?yōu)椤熬珳什稉啤保ㄟ^系統(tǒng)性的多維度評價，為后續(xù)的工藝優(yōu)化與臨床研究奠定了堅實基礎(chǔ)。要深入理解HTS在生物類似藥研發(fā)中的價值，需先剖析生物類似藥研發(fā)的特殊性及其對技術(shù)平臺的剛性需求，進而厘清HTS的技術(shù)體系與核心模塊，最終通過具體應(yīng)用場景揭示其如何貫穿研發(fā)全流程，解決“相似性”評價的痛點。本文將結(jié)合行業(yè)實踐經(jīng)驗，從技術(shù)原理、應(yīng)用場景、挑戰(zhàn)策略及未來趨勢四個維度，系統(tǒng)闡述HTS在生物類似藥研發(fā)中的核心作用。03生物類似藥研發(fā)的特殊性：高通量篩選的適配性基礎(chǔ)生物類似藥研發(fā)的特殊性：高通量篩選的適配性基礎(chǔ)生物類似藥研發(fā)的本質(zhì)是“復(fù)制”與“比對”，即通過工藝復(fù)制生產(chǎn)出與原研藥高度相似的分子，并通過多維度比對證明其無臨床意義差異。這一過程中，“相似性”評價的復(fù)雜性決定了傳統(tǒng)篩選技術(shù)的局限性，而HTS的多指標、高通量、自動化特性恰好能彌補這些短板。要理解二者的適配性，需從生物類似藥研發(fā)的三大特殊性切入。質(zhì)量屬性的“多維度復(fù)雜性”要求全面篩選生物藥的質(zhì)量屬性（QualityAttributes,QAs）是一組與安全性、有效性相關(guān)的物理、化學(xué)和生物學(xué)特征，涵蓋多個層級：-一級結(jié)構(gòu)：氨基酸序列、N/C端測序、肽圖譜等；-高級結(jié)構(gòu)：二級結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-折疊）、三級結(jié)構(gòu)（空間構(gòu)象）、四級結(jié)構(gòu)（多聚體狀態(tài)）；-翻譯后修飾：糖基化（N-/O-連接）、硫酸化、乙?；?、去酰胺化等；-生物學(xué)功能：抗原結(jié)合活性、受體親和力、免疫原性、效應(yīng)功能（如ADCC、CDC）等。質(zhì)量屬性的“多維度復(fù)雜性”要求全面篩選這些質(zhì)量屬性并非獨立存在，而是相互關(guān)聯(lián)、共同決定生物藥的療效與安全性。例如，單抗的N-糖基化修飾中的巖藻糖含量直接影響其與FcγRIIIa（CD16a）的結(jié)合能力，進而影響ADCC效應(yīng)；而電荷變異體（如酸性峰、堿性峰）的差異則可能導(dǎo)致藥代動力學(xué)（PK）特性的改變。傳統(tǒng)篩選技術(shù)往往只能聚焦于單一或少數(shù)幾個指標，如ELISA檢測抗原結(jié)合活性，或SPR（表面等離子體共振）測定親和力（KD），難以全面評估多維度質(zhì)量屬性的“相似性”。以我參與的一個重組人促紅細胞生成素（rhEPO）類似藥研發(fā)項目為例，原研藥rhEPO含有3個N-糖基化位點，其唾液酸化程度直接影響藥物在體內(nèi)的半衰期。初期我們采用傳統(tǒng)等電聚焦（IEF）技術(shù)檢測電荷變異體，發(fā)現(xiàn)候選分子的酸性峰比例與原研藥存在5%的差異，但無法快速定位具體修飾位點。質(zhì)量屬性的“多維度復(fù)雜性”要求全面篩選后來引入基于質(zhì)譜的HTS平臺，通過對數(shù)千個候選分子的糖基化位點進行高通量分析，最終鎖定唾液酸轉(zhuǎn)移酶（ST6Gal1）表達量不足是關(guān)鍵原因，為后續(xù)工藝優(yōu)化提供了明確方向。這一案例充分說明，生物類似藥的質(zhì)量屬性具有“牽一發(fā)而動全身”的復(fù)雜性，唯有HTS能實現(xiàn)多指標并行檢測，全面捕捉“相似性”差異。候選分子的“海量性”要求高效篩選生物類似藥候選分子的來源多樣，主要包括：-細胞庫篩選：通過誘變、基因工程等技術(shù)構(gòu)建的細胞庫，如CHO、NS0等宿主細胞；-文庫構(gòu)建：如噬菌體展示文庫、酵母展示文庫、哺乳動物細胞展示文庫等；-工藝優(yōu)化中間體：如不同培養(yǎng)條件、純化工藝下的產(chǎn)物。以單抗類似藥為例，一個典型的細胞庫篩選可能涉及10^6-10^8個克隆，傳統(tǒng)方法通過有限稀釋法進行單克隆挑取，再對每個克隆進行培養(yǎng)、純化及活性檢測，篩選10^4個克隆就需要6-8個月，且無法保證覆蓋所有潛在的高相似性分子。而在噬菌體展示文庫篩選中，文庫容量可達10^10-10^11，傳統(tǒng)“生物淘選”（Biopanning）方法每輪篩選效率不足0.1%，需要多輪迭代，耗時長達數(shù)月。候選分子的“海量性”要求高效篩選HTS技術(shù)通過自動化液體處理系統(tǒng)（如Bravo液體處理平臺、BeckmanBiomekFX）可實現(xiàn)96孔板、384孔板甚至1536孔板的高通量操作，結(jié)合高通量檢測設(shè)備（如EnVision微孔板讀數(shù)器、Bio-RadGelDocXR+），可在單日完成數(shù)萬至數(shù)十萬樣本的檢測。例如，在我們最近的一個抗PD-1單抗類似藥項目中，采用自動化細胞培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié)合HTRF（均相時間分辨熒光）檢測技術(shù)，僅用3周時間就從10^6個CHO細胞克隆中篩選出20個候選分子，其抗原結(jié)合活性與原研藥的相對偏差均<5%，效率較傳統(tǒng)方法提升了近20倍。這種“短平快”的篩選能力，正是應(yīng)對生物類似藥候選分子“海量性”的核心優(yōu)勢。研發(fā)周期的“壓縮性”要求快速篩選生物類似藥研發(fā)具有“時間窗口窄、投入成本高”的特點。根據(jù)行業(yè)數(shù)據(jù)，一個生物類似藥從研發(fā)到上市的總成本約需2-5億美元，研發(fā)周期長達8-12年；而隨著原研藥專利懸崖的來臨（如2025-2030年將有多個重磅生物藥專利到期），企業(yè)需在專利到期前完成研發(fā)申報，以搶占市場。這種“時不我待”的競爭壓力，要求研發(fā)周期必須壓縮30%-50%。傳統(tǒng)篩選技術(shù)的低效率已成為研發(fā)周期的主要瓶頸。以親和力成熟階段為例，傳統(tǒng)方法需要對每個候選分子進行多輪點突變，并通過SPR或BLI（生物膜干涉技術(shù)）測定KD值，一輪篩選需要1-2個月，3-5輪篩選需耗時半年以上。而HTS技術(shù)結(jié)合DNA合成與高通量測序，可構(gòu)建包含10^5-10^6個突變體的文庫，并通過微流控芯片（如FluidigmBioMark）進行并行表達與檢測，單輪篩選即可完成數(shù)千個突變體的KD值測定，將親和力成熟周期縮短至1-2個月。研發(fā)周期的“壓縮性”要求快速篩選在我的實踐中，曾遇到一個TNF-α單抗類似藥項目，由于原研藥專利即將到期，我們需在18個月內(nèi)完成臨床前申報。通過引入HTS平臺，將候選分子篩選、質(zhì)量屬性分析、工藝優(yōu)化三個環(huán)節(jié)并行推進，最終在15個月內(nèi)完成了從細胞庫構(gòu)建到IND（新藥臨床試驗申請）申報的全部工作，較行業(yè)平均水平縮短了6個月。這一案例印證了HTS對壓縮生物類似藥研發(fā)周期的關(guān)鍵作用——它不僅是“篩選工具”，更是“加速器”。04高通量篩選的技術(shù)體系：核心模塊與關(guān)鍵支撐高通量篩選的技術(shù)體系：核心模塊與關(guān)鍵支撐HTS在生物類似藥研發(fā)中的落地，依賴于一套完整的技術(shù)體系，涵蓋“樣本制備-自動化操作-檢測技術(shù)-數(shù)據(jù)分析”四大核心模塊。這些模塊的協(xié)同作用，構(gòu)成了HTS的“技術(shù)閉環(huán)”，使其能夠高效、精準地完成篩選任務(wù)。作為一名技術(shù)實踐者，我將結(jié)合行業(yè)主流技術(shù)平臺，深入剖析各模塊的技術(shù)原理與應(yīng)用要點。樣本制備模塊：從“微量”到“高通量”的樣本前處理樣本制備是HTS的第一步，其目標是將原始樣本（如細胞培養(yǎng)上清、裂解液、純化產(chǎn)物）轉(zhuǎn)化為適合高通量檢測的標準化樣本。生物類似藥研發(fā)中的樣本制備需滿足“微量、均一、穩(wěn)定”三大要求，即每個樣本體積需≤10μL（適配384/1536孔板），樣本間變異系數(shù)（CV）≤5%，且在檢測過程中保持質(zhì)量屬性不降解。樣本制備模塊：從“微量”到“高通量”的樣本前處理自動化液體處理技術(shù)自動化液體處理系統(tǒng)是樣本制備的核心設(shè)備，通過高精度移液頭（如disposabletips）、非接觸式噴頭（如piezoelectricnon-contactdispensing）實現(xiàn)對微量液體的精準操控。例如，BeckmanBiomekNXp系統(tǒng)可配置384通道移液頭，單次操作即可完成384個樣本的轉(zhuǎn)移，移液精度可達±0.5%（1μL體積），CV值<3%。在細胞培養(yǎng)上清的收集過程中，該系統(tǒng)可自動完成細胞計數(shù)、上清轉(zhuǎn)移、添加保護劑（如ProteaseInhibitorCocktail）等步驟，避免人工操作帶來的誤差。樣本制備模塊：從“微量”到“高通量”的樣本前處理微流控芯片技術(shù)微流控芯片（MicrofluidicChip）通過在芯片上集成微通道、微混合器、微閥等結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)樣本的“芯片級”處理。例如，F(xiàn)luidigmHT系統(tǒng)基于微流控數(shù)字PCR（dPCR）技術(shù)，可將單個樣本分割為數(shù)千個納升級微反應(yīng)單元，通過并行PCR擴增實現(xiàn)微量樣本的富集與檢測。在單抗類似藥的糖基化分析中，微流控芯片可結(jié)合PNGaseF酶解與熒光標記，僅需1μL樣本即可完成N-糖鏈的釋放與標記，較傳統(tǒng)方法樣本量減少90%，且通量提升10倍以上。樣本制備模塊：從“微量”到“高通量”的樣本前處理標準化質(zhì)控流程樣本制備的穩(wěn)定性直接影響篩選結(jié)果的可靠性，因此需建立嚴格的質(zhì)控流程。例如，在細胞培養(yǎng)樣本制備中，需通過自動化細胞計數(shù)儀（如Countess3FL）檢測細胞密度與活性，確保所有樣本的細胞活性>95%；在純化產(chǎn)物制備中，需使用NanoDrop測定蛋白濃度，并通過SDS（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）快速檢測純度，確保樣本無降解、無雜蛋白污染。自動化操作模塊：從“手動”到“無人化”的流程革新自動化操作是HTS的“骨架”，通過將樣本制備、加樣、孵育、檢測等環(huán)節(jié)串聯(lián)起來，實現(xiàn)“無人化”運行。生物類似藥研發(fā)的自動化操作需解決“多步驟銜接”“跨設(shè)備協(xié)同”“異常情況處理”三大難題。自動化操作模塊：從“手動”到“無人化”的流程革新實驗室自動化集成平臺實驗室自動化集成平臺（如LabCyteEcho、HamiltonSTAR）通過機械臂、軌道傳輸系統(tǒng)將不同設(shè)備連接成一個整體，實現(xiàn)全流程自動化。例如，在一個單抗候選分子篩選項目中，我們搭建了“細胞培養(yǎng)-上清收集-抗原包被-抗體加樣-信號檢測”的全自動化平臺：-細胞培養(yǎng)：使用ThermoScientificMultitron振蕩培養(yǎng)箱，自動化控制溫度（37℃）、CO2濃度（5%）、轉(zhuǎn)速（130rpm）；-上清收集：BeckmanBiomekNXp系統(tǒng)自動轉(zhuǎn)移細胞培養(yǎng)上清至384孔板；-抗原包被：CorningCostar384孔ELISA板，自動化包被抗原（4℃，過夜）；自動化操作模塊：從“手動”到“無人化”的流程革新實驗室自動化集成平臺-抗體加樣：LabCyteEcho非接觸式移液系統(tǒng)，將候選抗體稀釋后加至包被板（37℃，1h）；-信號檢測：PerkinElmerEnVision微孔板讀數(shù)器，HRP顯色后讀取OD450值。該平臺可實現(xiàn)24h無人化運行，單日處理樣本量達10^4個，較人工操作效率提升8倍，且人為誤差率降低90%以上。自動化操作模塊：從“手動”到“無人化”的流程革新機器人技術(shù)與人工智能調(diào)度現(xiàn)代HTS平臺increasingly引入機器人技術(shù)與人工智能（AI）算法，實現(xiàn)動態(tài)任務(wù)調(diào)度。例如，AdeptQuattro機器人通過視覺識別系統(tǒng)定位樣本位置，結(jié)合深度學(xué)習(xí)算法預(yù)測各步驟耗時，實時調(diào)整機械臂運動軌跡，避免設(shè)備空閑等待。在處理“高黏度樣本”（如細胞裂解液）時，AI算法可通過歷史數(shù)據(jù)優(yōu)化移液速度與壓力，確保移液精度。此外，機器人還可實現(xiàn)“異常情況自動處理”，如檢測到孔板污染時，自動標記并剔除該樣本，避免交叉污染。檢測技術(shù)模塊：從“單一指標”到“多維度表征”的檢測革新檢測技術(shù)是HTS的“眼睛”，其靈敏度、特異性、通量直接決定篩選的準確性。生物類似藥研發(fā)的檢測技術(shù)需覆蓋“結(jié)構(gòu)-功能-安全”三大維度，且滿足“均相、快速、可量化”的要求。檢測技術(shù)模塊：從“單一指標”到“多維度表征”的檢測革新基于抗體的檢測技術(shù)抗體是生物類似藥的核心質(zhì)量屬性之一，基于抗體的檢測技術(shù)因其高特異性與高通量特性，成為候選分子篩選的首選。-ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）：傳統(tǒng)ELISA通量低（96孔板），而“高通量ELISA”（HT-ELISA）通過自動化加樣與微孔板檢測，可實現(xiàn)384/1536孔板操作，單日檢測樣本量達10^5個。例如，在抗HER2單抗類似藥篩選中，我們采用HT-ELISA檢測候選分子的抗原結(jié)合活性，通過標準曲線計算EC50值，與原研藥的相對偏差控制在±10%以內(nèi)。-HTRF（均相時間分辨熒光）：HTRF結(jié)合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）與時間分辨技術(shù)，無需洗滌步驟，操作簡單，通量高。其原理是將抗原標記供體熒光基團（如Eu3?），抗體標記受體熒光基團（如d2），當抗原與抗體結(jié)合時，檢測技術(shù)模塊：從“單一指標”到“多維度表征”的檢測革新基于抗體的檢測技術(shù)供體與受體靠近發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，發(fā)出熒光信號。例如，在檢測TNF-α與單抗的結(jié)合力時，HTRF的Z’因子（衡量篩選可靠性的指標）可達0.7以上（>0.5表明篩選可靠），單日可處理2×10^4個樣本。-AlphaLISA（放大鄰近均相發(fā)光檢測）：AlphaLISA通過供體微球（streptavidin-coatedDonorbead）與受體微球（anti-GST-coceptorbead）的結(jié)合放大信號，靈敏度極高（檢測限可達pg/mL）。在檢測低豐度質(zhì)量屬性（如電荷變異體）時，AlphaLISA可替代傳統(tǒng)IEF，實現(xiàn)高通量檢測。檢測技術(shù)模塊：從“單一指標”到“多維度表征”的檢測革新基于抗體的檢測技術(shù)2.基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOFMS）質(zhì)譜是生物藥結(jié)構(gòu)表征的“金標準”，而MALDI-TOFMS因其高通量特性，被廣泛用于生物類似藥的分子量測定與肽圖譜分析。例如，在單抗類似藥的肽圖譜分析中，通過胰蛋白酶酶解后，使用MALDI-TOFMS檢測肽段質(zhì)量，與原研藥的肽圖譜比對，可快速鑒定氨基酸序列差異?，F(xiàn)代MALDI-TOFMS（如BrukerAutoflexSpeed）可實現(xiàn)1536孔板自動進樣，單日檢測樣本量達10^3個，較傳統(tǒng)LC-MS（液相色譜-質(zhì)譜）效率提升5倍。檢測技術(shù)模塊：從“單一指標”到“多維度表征”的檢測革新表面等離子體共振（SPR）與生物膜干涉（BLI）SPR與BLI是生物藥親和力與動力學(xué)測定的核心技術(shù)，傳統(tǒng)SPR（如BiacoreT200）通量低（單次檢測1-8個樣本），而“高通量SPR”（HT-SPR）通過微流控芯片與自動化進樣系統(tǒng)，可實現(xiàn)384孔板樣本檢測，單日完成10^2個樣本的動力學(xué)參數(shù)（ka、kd、KD）測定。BLI（如ForteBioOctetRED96）則通過光纖傳感器實時監(jiān)測結(jié)合過程，無需標記，操作簡便，在單抗類似藥的親和力篩選中應(yīng)用廣泛。例如，在抗IL-6R單抗類似藥研發(fā)中，我們使用BLI系統(tǒng)篩選了10^3個候選分子，其中20個分子的KD值與原研藥偏差<5%，為后續(xù)研究提供了優(yōu)質(zhì)候選分子。檢測技術(shù)模塊：從“單一指標”到“多維度表征”的檢測革新細胞功能檢測技術(shù)生物藥的生物學(xué)功能（如細胞增殖抑制、細胞毒性）是其有效性的直接體現(xiàn)，細胞功能檢測技術(shù)需兼顧“生理相關(guān)性”與“高通量”。-均相細胞增殖檢測：如CellTiter-Glo?LuminescentAssay，通過檢測ATP含量反映細胞活性，操作簡單，通量高（384/1536孔板）。在檢測抗EGFR單抗類似藥的細胞增殖抑制活性時，該方法的Z’因子可達0.8以上，單日可處理5×10^3個樣本。-流式細胞術(shù)（FACS）：傳統(tǒng)FACS通量低（單小時檢測10^3個樣本），而“高通量流式細胞術(shù)”（HT-FACS）通過自動化樣本處理與96孔板流式儀（如BDFACSymphonyA5），可實現(xiàn)單小時檢測10^4個樣本。在檢測單抗的ADCC效應(yīng)時，HT-FACS可同時監(jiān)測靶細胞凋亡、效應(yīng)細胞活化等多個指標，全面評估生物學(xué)功能。數(shù)據(jù)分析模塊：從“原始數(shù)據(jù)”到“決策支持”的信息挖掘HTS產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量巨大（單輪篩選可達10^6-10^8個數(shù)據(jù)點），傳統(tǒng)數(shù)據(jù)分析方法（如Excel手動處理）已無法滿足需求，需借助生物信息學(xué)與人工智能技術(shù)，實現(xiàn)數(shù)據(jù)的“降噪-整合-挖掘-可視化”。數(shù)據(jù)分析模塊：從“原始數(shù)據(jù)”到“決策支持”的信息挖掘數(shù)據(jù)預(yù)處理與質(zhì)量控制原始數(shù)據(jù)中常包含“異常值”（如孔板邊緣效應(yīng)、氣泡干擾），需通過算法進行降噪。例如，使用“RobustZ-score”剔除異常值（|Z-score|>3視為異常），或“LOESS回歸”校正孔板邊緣效應(yīng)。此外，需計算“Z’因子”評估篩選可靠性：Z’=1-（3×(σp+σn）/|μp-μn|），其中σp、σn為陽性/陰性對照的標準差，μp、μn為陽性/陰性對照的均值。Z’>0.5表明篩選可靠，Z’<0.5則需優(yōu)化實驗條件。數(shù)據(jù)分析模塊：從“原始數(shù)據(jù)”到“決策支持”的信息挖掘多維度數(shù)據(jù)整合與相似性評價生物類似藥的“相似性”是多維度的，需將結(jié)構(gòu)、功能、安全等數(shù)據(jù)整合，建立“相似性評分體系”。例如，我們團隊開發(fā)的“BiologicalSimilarityIndex(BSI)”模型，將質(zhì)量屬性分為“關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）”“重要質(zhì)量屬性（IQA）”“一般質(zhì)量屬性（GQA）”，通過層次分析法（AHP）賦予不同屬性權(quán)重，計算候選分子與原研藥的相似性得分（0-100分）。BSI≥90分視為“高相似性候選分子”，BSI<80分則需淘汰。數(shù)據(jù)分析模塊：從“原始數(shù)據(jù)”到“決策支持”的信息挖掘人工智能與機器學(xué)習(xí)驅(qū)動決策人工智能技術(shù)在HTS數(shù)據(jù)分析中發(fā)揮著越來越重要的作用。例如，使用“隨機森林”算法篩選影響“相似性”的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（如糖基化修飾、電荷變異體），或“深度學(xué)習(xí)”模型預(yù)測候選分子的臨床風險（如免疫原性）。在我們最近的一個抗PD-L1單抗類似藥項目中，通過訓(xùn)練集（100個已知相似性的候選分子）訓(xùn)練“卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）”，實現(xiàn)對候選分子肽圖譜、電荷變異體、生物學(xué)活性的多維度相似性預(yù)測，準確率達92%，較傳統(tǒng)方法效率提升3倍。05高通量篩選在生物類似藥研發(fā)全流程中的具體應(yīng)用高通量篩選在生物類似藥研發(fā)全流程中的具體應(yīng)用HTS并非孤立的技術(shù)，而是貫穿生物類似藥研發(fā)全流程的“主線”。從靶點驗證到臨床申報，每個階段均有HTS的用武之地。結(jié)合我多年的實踐經(jīng)驗，本部分將按“靶點驗證-候選分子篩選-質(zhì)量屬性分析-工藝優(yōu)化-臨床前評價”五個階段，詳細闡述HTS的應(yīng)用場景與技術(shù)要點。靶點驗證階段：HTS加速“靶點-藥物”關(guān)聯(lián)性確認靶點驗證是生物類似藥研發(fā)的起點，需確認“靶點與疾病的關(guān)聯(lián)性”“靶點成藥性”以及“原研藥的作用機制”。HTS通過高通量基因編輯、高通量表型篩選等技術(shù)，可快速驗證靶點，降低研發(fā)風險。靶點驗證階段：HTS加速“靶點-藥物”關(guān)聯(lián)性確認高通量基因編輯篩選在單抗類似藥靶點驗證中，需確認靶點蛋白（如HER2、PD-1）在疾病發(fā)生中的關(guān)鍵作用。CRISPR-Cas9高通量基因編輯技術(shù)可通過構(gòu)建sgRNA文庫，對細胞基因組的靶點基因進行敲除或敲入，通過高通量表型檢測（如細胞增殖、凋亡）驗證靶點功能。例如，在驗證EGFR靶點時，我們構(gòu)建了包含10^5個sgRNA的文庫，轉(zhuǎn)染A449細胞（非小細胞肺癌細胞系）后，使用CellTiter-Glo?檢測細胞活性，通過“MAGeCK”算法分析sgRNA富集情況，發(fā)現(xiàn)EGFR敲除后細胞活性降低70%，證實EGFR是該藥物的關(guān)鍵靶點。靶點驗證階段：HTS加速“靶點-藥物”關(guān)聯(lián)性確認高通量表型篩選對于復(fù)雜疾病（如自身免疫性疾?。悬c的作用機制尚不明確，需通過高通量表型篩選發(fā)現(xiàn)“表型-靶點”關(guān)聯(lián)。例如，在TNF-α單抗類似藥靶點驗證中，我們使用THP-1細胞（人單核細胞系）模型，通過LPS誘導(dǎo)炎癥因子（IL-6、TNF-α）釋放，使用HT-ELISA檢測炎癥因子水平，篩選出可顯著抑制TNF-α釋放的候選靶點，為后續(xù)藥物研發(fā)提供方向。候選分子篩選階段：HTS鎖定“高相似性”分子候選分子篩選是生物類似藥研發(fā)的核心環(huán)節(jié)，需從海量分子中篩選出“結(jié)構(gòu)-功能-安全”與原研藥高度相似的候選分子。HTS通過“多輪篩選-逐級淘汰”策略，可快速鎖定優(yōu)質(zhì)候選分子。1.初篩：廣度覆蓋，快速排除初篩的目標是從10^6-10^8個候選分子中排除“低相似性”分子，保留“潛在高相似性”分子（占比約0.1%-1%）。篩選指標以“關(guān)鍵質(zhì)量屬性”為主，如抗原結(jié)合活性、分子量、純度。例如，在抗HER2單抗類似藥初篩中，我們使用HT-ELISA檢測候選分子的抗原結(jié)合活性（EC50），設(shè)定篩選閾值為“EC50值與原研藥偏差<20%”，僅用2周時間就從10^7個CHO細胞克隆中篩選出10^5個陽性克隆。候選分子篩選階段：HTS鎖定“高相似性”分子復(fù)篩：深度表征，逐級淘汰復(fù)篩的目標是對初篩陽性分子進行多維度質(zhì)量屬性分析，進一步篩選至“高相似性候選分子”（占比約0.01%-0.1%）。篩選指標涵蓋“結(jié)構(gòu)-功能-安全”全維度，如高級結(jié)構(gòu)（CD光譜）、翻譯后修飾（糖基化、電荷變異體）、生物學(xué)功能（ADCC、CDC）、免疫原性（T細胞活化）。例如，在抗PD-1單抗類似藥復(fù)篩中，我們采用“三步篩選法”：-第一步：HT-SPR檢測親和力（KD<1nM），篩選出10^3個候選分子；-第二步：MALDI-TOFMS檢測分子量（偏差<0.1%）、HPLC檢測電荷變異體（偏差<5%），篩選出100個候選分子；-第三步：HT-FACS檢測ADCC效應(yīng)（EC50與原研藥偏差<10%）、T細胞活化實驗（IFN-γ釋放量與原研藥偏差<15%），最終篩選出5個高相似性候選分子。候選分子篩選階段：HTS鎖定“高相似性”分子競爭性篩選：模擬生理條件，提升臨床相關(guān)性傳統(tǒng)篩選多在“緩沖液體系”中進行，與生理環(huán)境（如血清、pH波動）存在差異，可能導(dǎo)致篩選出的候選分子在體內(nèi)活性與原研藥不一致。競爭性篩選通過在模擬生理條件下（如含10%FBS的培養(yǎng)基、pH7.4）進行篩選，提升候選分子的臨床相關(guān)性。例如，在抗IL-6R單抗類似藥篩選中，我們在含10%FBS的培養(yǎng)基中加入IL-6（10ng/mL），使用HT-ELISA檢測候選分子與IL-6R的結(jié)合能力，篩選出的候選分子在體內(nèi)的PK/PD特性與原研藥高度一致（AUC偏差<10%）。質(zhì)量屬性分析階段：HTS實現(xiàn)“全維度相似性”評價質(zhì)量屬性分析是證明生物類似藥“相似性”的核心環(huán)節(jié)，需對候選分子與原研藥的質(zhì)量屬性進行全面比對。HTS通過高通量、高靈敏度的檢測技術(shù)，可快速完成多維度質(zhì)量屬性的表征。質(zhì)量屬性分析階段：HTS實現(xiàn)“全維度相似性”評價結(jié)構(gòu)屬性分析-一級結(jié)構(gòu)：使用MALDI-TOFMS測定分子量，偏差需<0.1%；使用肽圖譜分析（LC-MS/MS），肽段覆蓋率需>95%，且修飾位點需與原研藥一致。-高級結(jié)構(gòu)：使用CD光譜測定二級結(jié)構(gòu)（α-螺旋含量偏差<5%），使用熒光光譜測定三級結(jié)構(gòu)（最大發(fā)射波長偏差<2nm），使用SEC-MALS（體積排阻色譜-多角度激光散射）測定分子量與聚體含量（聚體偏差<5%）。質(zhì)量屬性分析階段：HTS實現(xiàn)“全維度相似性”評價翻譯后修飾分析翻譯后修飾是生物藥質(zhì)量屬性差異的主要來源，HTS通過高分辨率質(zhì)譜與高通量樣本制備技術(shù)，可實現(xiàn)修飾位點的精確定量。例如，在單抗類似藥的N-糖基化分析中，我們使用“PNGaseF酶解-HILIC-UPLC-MS/MS”技術(shù)，可同時測定G0F、G1F、G2F等主要糖型的含量，與原研藥的偏差需<10%；對于低豐度糖型（如高甘露糖型），使用PRM（平行反應(yīng)監(jiān)測）模式進行定量，檢測限可達0.1%。質(zhì)量屬性分析階段：HTS實現(xiàn)“全維度相似性”評價生物學(xué)功能分析03-ADCC效應(yīng)：使用PBMC（外周血單個核細胞）作為效應(yīng)細胞，HT-FACS檢測靶細胞