ICS11.220

CCSB41

DB51

四川省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB51/T3303—2025

鵝星狀病毒病診斷與防控技術(shù)規(guī)范

2025-09-15發(fā)布2025-10-15實(shí)施

四川省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB51/T3303—2025

目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語和定義.........................................................................1

4縮略語.............................................................................1

5實(shí)驗(yàn)室生物安全措施.................................................................1

6臨床診斷...........................................................................2

7實(shí)驗(yàn)室診斷.........................................................................2

8鵝星狀病毒病綜合判定...............................................................3

9防控措施...........................................................................3

附錄A（規(guī)范性）RNA提取及反轉(zhuǎn)錄.....................................................5

附錄B（規(guī)范性）鵝星狀病毒RT-PCR檢測................................................6

附錄C（規(guī)范性）鵝星狀病毒RT-qPCR檢測...............................................8

參考文獻(xiàn).............................................................................10

I

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由四川省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出、歸口、解釋并組織實(shí)施。

本文件起草單位：西南民族大學(xué)。

本文件主要起草人：張煥容、楊發(fā)龍、張凱、陳果。

II

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鵝星狀病毒病診斷與防控技術(shù)規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了鵝星狀病毒病的臨床診斷、實(shí)驗(yàn)室診斷和防控措施，包括流行特征、臨床癥狀、剖檢

病變、分子生物學(xué)診斷、病毒分離鑒定等診斷依據(jù)，以及預(yù)防措施、疫情處置等防控技術(shù)。

本文件適用于鵝星狀病毒病的診斷、預(yù)防和控制。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T45093水禽新型星狀病毒病診斷技術(shù)

NY/T541獸醫(yī)診斷樣本采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

鵝星狀病毒病gooseastrovirusdisease

又稱“鵝痛風(fēng)”，是由鵝星狀病毒（GooseAstrovirus,GoAstV）感染雛鵝引發(fā)的一種病毒性傳染病。

該病毒主要感染1周~3周齡雛鵝，病鵝主要表現(xiàn)為跛行、全身多組織器官表面廣泛性尿酸鹽沉積。

4縮略語

下列縮略語適用于本文件。

Ct值：循環(huán)閾值（CycleThreshold）

cDNA：互補(bǔ)DNA（ComplementaryDNA）

GoAstV：鵝星狀病毒（GooseAstrovirus）

LMH：雞肝癌細(xì)胞系（ChickenHepatomaCellLine）

PBS：磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferedSalineBuffer）

RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）

RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）

RT-qPCR：實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR（Real-TimeQuantitativeReverseTranscriptionPCR）

TAE：三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸緩沖液(Tris-aceticacid-EDTABuffer)

5實(shí)驗(yàn)室生物安全措施

實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在生物安全二級(jí)及以上實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，按照GB19489的規(guī)定執(zhí)行。

1

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6臨床診斷

6.1流行特征

病鵝、隱性帶毒鵝、帶毒種蛋是主要傳染源，自然感染潛伏期3d左右，既可垂直傳播，也可水平

傳播，1月齡以內(nèi)各品種鵝均易感，最早可在3日齡發(fā)病，以5日齡～20日齡最為常見，發(fā)病率為60%～90%，

死亡率為30%～50%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)60%。

6.2臨床癥狀

病鵝精神沉郁，食欲減退或廢絕，消瘦，翅下垂，關(guān)節(jié)腫大，雙腿癱瘓倒地，排白色稀便，泄殖腔

周圍稀便污染。

6.3剖檢病變

患病鵝心、肝、脾、肺、腎、胃腸道等器官表面，各關(guān)節(jié)周圍及關(guān)節(jié)腔內(nèi)，甚至血管周圍，可見白

色尿酸鹽沉積。

6.4臨床診斷結(jié)果判定

同時(shí)符合6.1、6.2和6.3可判定為鵝星狀病毒病疑似病例。

7實(shí)驗(yàn)室診斷

7.1器材

同GB/T45093。

7.2樣品采集與處理

按照NY/T541要求，采集病鵝的泄殖腔棉拭子，或采集死亡鵝及瀕死鵝的肝、脾、腎等實(shí)質(zhì)性器官。

棉拭子采集后立即置于含有RNA保存液的離心管中，-20℃或以下保存；實(shí)質(zhì)器官樣品取5?g～10?g，置于

RNA保存液中，-20℃或以下保存。所有樣品應(yīng)在48h內(nèi)完成運(yùn)輸。隨后，按照附錄A或使用等效的商業(yè)

試劑盒提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

7.3RT-PCR檢測

以7.2的cDNA為模板，采用附錄B規(guī)定的方法檢測。

7.4RT-qPCR檢測

以7.2的cDNA為模板，采用附錄C規(guī)定的方法檢測。

7.5病毒分離培養(yǎng)

7.5.1病毒分離樣品的處理

取10g～20g在7.2或7.3中檢測為陽性的病死鵝肝、脾、腎等組織樣品剪碎，與無菌生理鹽水按1:5

（W/V)比例混合并磨碎，反復(fù)凍融三次，8000r/m、4℃離心15min后取上清，0.22μm濾膜過濾除菌

后備用。

7.5.2細(xì)胞分離病毒

2

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7.5.2.1LMH細(xì)胞準(zhǔn)備

當(dāng)LMH細(xì)胞培養(yǎng)至80%匯合度后，備用于病毒分離。

7.5.2.2病毒分離培養(yǎng)

吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用無菌PBS洗滌細(xì)胞3次后，將7.5.1處理好的樣品1mL接種到25cm2細(xì)胞瓶的單

層細(xì)胞上，在CO2培養(yǎng)箱中37℃感作，期間每間隔約15min水平輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶，感作1h后棄去接種液，

添加細(xì)胞維持培養(yǎng)液，在CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)5d，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)；待細(xì)胞液變黃，-80℃

反復(fù)凍融3次，經(jīng)5000r/m離心10min，取上清，其中300μL用于提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板，

用7.2或7.3的方法檢測，其余上清置-80℃保存。

7.5.3鵝胚分離病毒

7.5.3.1鵝胚準(zhǔn)備

將鵝星狀病毒抗原抗體雙陰性的非免疫鵝胚置于孵化器中37℃下孵育至11日齡～13日齡，用于病毒

分離。

7.5.3.2鵝胚接種

取7.5.1中處理的樣品液每胚0.5mL接種鵝胚尿囊腔，同時(shí)設(shè)生理鹽水接種對(duì)照胚，置于孵化器中

37℃下孵育并每天觀察鵝胚2次～3次。棄去24h內(nèi)死亡鵝胚，其余鵝胚死亡后及時(shí)收獲胚體和尿囊液。

未死亡鵝胚觀察5d后，于4℃冰箱過夜后收獲胚體和尿囊液，取300μL尿囊液按附錄A提取RNA并反轉(zhuǎn)錄

合成cDNA后作為模板，用7.3或7.4的方法檢測，其余尿囊液和胚體置-80℃保存。

7.6實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果判定

7.6.1結(jié)果判定總則

臨床樣品或經(jīng)LMH細(xì)胞、鵝胚分離的病毒樣品，經(jīng)RT-PCR或RT-qPCR檢測，檢測過程中必須設(shè)置陽性

對(duì)照和陰性對(duì)照，且對(duì)照結(jié)果有效，方可對(duì)樣品檢測結(jié)果進(jìn)行判定。符合7.6.2或7.6.3中任一標(biāo)準(zhǔn)，即

可判定為實(shí)驗(yàn)室診斷陽性。

7.6.2RT-PCR檢測判定標(biāo)準(zhǔn)

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，出現(xiàn)約330bp的特異性擴(kuò)增條帶，與陽性對(duì)照擴(kuò)增條帶片段大小

一致，且陰性對(duì)照無擴(kuò)增條帶的，判為陽性。

7.6.3RT-qPCR檢測判定標(biāo)準(zhǔn)

樣品Ct值小于30.0，擴(kuò)增曲線典型，熔解曲線在80℃左右出現(xiàn)明顯峰值的，判為陽性；

樣品Ct值在30.0～35.0之間，若重復(fù)雙孔檢測中任一孔檢測陽性，判定為陽性。

8鵝星狀病毒病綜合判定

病鵝癥狀與6.1、6.2和6.3中所描述相符或部分相符，且實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果陽性者，判定為鵝星狀病

毒病。

9防控措施

3

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9.1預(yù)防措施

9.1.1加強(qiáng)飼養(yǎng)管理

減少各種應(yīng)激因素，如鵝舍溫度、濕度突然變化，光照驟變、噪音、驚嚇等。避免飼喂發(fā)霉和變質(zhì)

飼料，飼料應(yīng)易消化，做到蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等的科學(xué)搭配。糞便和墊料應(yīng)及時(shí)清理和處理，確

保鵝舍干凈衛(wèi)生，通風(fēng)良好。

9.1.2日常消毒

應(yīng)定期對(duì)鵝舍、器具、飲水系統(tǒng)和通道進(jìn)行消毒。常用消毒劑包括酚類、酸類、堿類、含氯制劑、

復(fù)合碘制劑和季銨鹽類等。人員進(jìn)出應(yīng)更換鞋靴，通過消毒池或噴霧方式消毒。

9.2疫情處置

9.2.1隔離

疑似或確診患病鵝應(yīng)立即隔離飼養(yǎng)，嚴(yán)禁與健康鵝接觸。隔離區(qū)設(shè)置專人管理，限制人員、車輛進(jìn)

入隔離區(qū)，防止疫情擴(kuò)散。

9.2.2緊急消毒

對(duì)病鵝污染的場所、用具、物品等徹底消毒。對(duì)鵝舍地面和糞便溝槽清潔后消毒，可采用3%～5%

的來蘇爾溶液噴霧消毒，或用20%的生石灰涂墻和地面消毒。飼養(yǎng)用具、料槽和水槽等可采用5%～10%

的熱堿水或3%的苛性鈉溶液或3%～5%的來蘇爾溶液洗滌消毒，消毒后2h～6h，用清水洗凈，待干燥后

方可使用。運(yùn)動(dòng)場地清除糞便和雜草后，用5%～10%的熱堿水或者撒上生石灰消毒。

9.2.3無害化處理

病死鵝必須按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于《病死及病害動(dòng)物無害化處理技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行無害化處理。

4

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

A.1Trizol法提取核酸

A.1.1取300μL樣品處理液置于1.5mL去酶EP管中，加入700μLTrizol，劇烈混合15s，冰上靜置10

min，加入200μL氯仿，劇烈混合15s，冰上靜置10min，4℃12000r/m離心15min。

A.1.2取500μL上清液至新的EP管，加入500μL異丙醇，上下顛倒混勻10次，冰上靜置10min，4℃12000

r/m離心15min。

A.1.3棄上清，加入1mL75%DEPC冰乙醇洗滌一次，4℃12000r/m離心10min；A.1.4盡量吸除上

清，室溫干燥5min~10min，用20μLDEPC水溶解，-80℃保存。

注：也可采用等效的RNA提取試劑盒提取RNA。

A.2反轉(zhuǎn)錄

采用商品化試劑盒，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系總體積為20μL，具體包括：RNA模板7μL、DEPC處理水6μL、

5×反應(yīng)緩沖液4μL、反轉(zhuǎn)錄酶混合物3μL。將配制好的反應(yīng)體系置于PCR擴(kuò)增儀中，按照以下程序進(jìn)

行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：25℃10min，55℃15min，85℃5min，4℃保溫或立即取出，進(jìn)行后續(xù)檢測或-20℃

保存。

5

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B

B

附錄B

（規(guī)范性）

鵝星狀病毒RT-PCR檢測

B.1引物（10μmol/L）

B.1.1上游引物F:5'-AAGCCTCTTTTCTGGCGGATAC-3'。

B.1.2下游引物R:5'-GACACAAGCCTATCATCGCCATAG-3'。

B.2鵝星狀病毒RT-PCR檢測方法及結(jié)果判定

B.2.1反應(yīng)體系及條件

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為30μL，包括2×PCR預(yù)混液15μL、上游和下游引物（10μmol/L）各

1μL、cDNA模板3μL，以及無菌ddH2O補(bǔ)足至30μL。各組分于冰上配制并充分混勻后，置于PCR擴(kuò)增

儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，隨后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30s、

62℃退火30s和72℃延伸45s，最終在72℃延伸10min后結(jié)束反應(yīng)。

B.2.2擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測

B.2.2.11.0%瓊脂糖凝膠板的制備及放置：按瓊脂糖與1×TAE緩沖液（W/V）配制1.0%濃度的瓊脂糖

凝膠，同時(shí)依據(jù)樣品數(shù)選用適宜的梳子；將1.0%瓊脂糖凝膠倒入放置在水平臺(tái)面上并插好梳子的凝膠

盤中，膠板厚5mm左右。待凝膠冷卻凝固后拔出梳子（膠中形成加樣孔），放入電泳槽中，加1×TAE

緩沖液沒過膠面。

B.2.2.2加樣：取6μL～8μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和2μL加樣緩沖液混勻后加入一個(gè)加樣孔。每次電泳同

時(shí)設(shè)DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。

B.2.2.3電泳：電壓80V～100V或電流40mA～50mA，電泳25min～30min。

B.3試驗(yàn)成立條件

電泳結(jié)束后，取出凝膠置于凝膠成像儀（或紫外透射儀）上觀察。陽性對(duì)照電泳結(jié)果應(yīng)出現(xiàn)約330bp

擴(kuò)增條帶，同時(shí)陰性對(duì)照無擴(kuò)增條帶。

陽性和陰性對(duì)照應(yīng)成立，否則，檢測結(jié)果判定為無效。

B.4結(jié)果判定

符合8.3的條件，被檢樣品擴(kuò)增產(chǎn)物電泳出現(xiàn)約330bp目標(biāo)條帶，則判為鵝星狀病毒核酸陽性；若

樣品無擴(kuò)增條帶，則為陰性。若對(duì)照未達(dá)標(biāo)，則本次檢測結(jié)果無效，應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

鵝星狀病毒RT-PCR檢測電泳圖如圖B.1所示。

6

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標(biāo)引序號(hào)說明：

M——2000bpDNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；

1——陰性對(duì)照；

2——陽性病料；

3——陽性對(duì)照。

圖B.1鵝星狀病毒RT-PCR檢測判定標(biāo)準(zhǔn)圖例

7

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C

C

附錄C

（規(guī)范性）

鵝星狀病毒RT-qPCR檢測

C.1引物（10μmol/L）

C.1.1上游引物F:5'-TGAAGCAACAGACAGAACGG-3'。

C.1.2下游引物R:5'-GGACAGGAAAAAGTAACGCA-3'。

C.2鵝星狀病毒RT-qPCR檢測方法及結(jié)果判定

C.2.1反應(yīng)體系及條件

RT-qPCR反應(yīng)體系總體積為20μL，包括2×FastSYBRGreenqPCRMasterMixUDG10μL、上游

和下游引物（10μmol/L）各0.4μL、模板1μL，加入無菌ddH2O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)體系配制后，混勻

并瞬時(shí)離心，置于熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序設(shè)定為：95℃預(yù)變性5s，60℃退火30s，共40

個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線分析，程序?yàn)椋?5℃15s，60℃60s，95℃15s，以驗(yàn)證擴(kuò)增

產(chǎn)物的特異性。

C.2.2結(jié)果判定

C.2.2.1閾值設(shè)定

檢測結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值直接讀取檢測結(jié)果，Ct值為每個(gè)反應(yīng)管的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)

定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。閾值設(shè)定原則是根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過正常陰性

樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。

C.2.2.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陽性對(duì)照Ct值<30.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，熔解曲線于80℃左右出現(xiàn)明顯的峰值。

陰性對(duì)照無Ct值，且無典型擴(kuò)增曲線；或陰性對(duì)照Ct值>35.0，出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，但熔解曲線于80℃

左右未出現(xiàn)明顯的峰值。

陽性和陰性對(duì)照應(yīng)成立，否則，檢測結(jié)果判定為無效。

C.2.2.3結(jié)果描述及判定

樣品檢測無Ct值；或雖有Ct值，但熔解曲線于80℃左右未出現(xiàn)明顯的峰值，判定為陰性。

Ct值<30.