專題突破10綜合PCR的基因工程問題課標要求闡明PCR的原理、反應(yīng)條件、反應(yīng)過程；用PCR擴增DNA片段并完成電泳鑒定?？记榉治鲆锏倪x擇和設(shè)計、PCR擴增結(jié)果的電泳鑒定與分析、PCR的應(yīng)用2024·湖南·T·山東·T32024·黑吉遼·T72023·江蘇·T·遼寧·T·江蘇·T24類型一PCR引物堿基序列的設(shè)計1．土壤鹽漬化影響水稻生長發(fā)育。將水稻耐鹽堿基因OsMYB56導(dǎo)入不耐鹽堿水稻品種吉粳88中，培育耐鹽堿水稻新品種，過程①PCR擴增OsMYB56需要添加引物，應(yīng)選用的引物組合為()A．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′B．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′C．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′D．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′答案A解析圖中所示堿基序列磷酸端為5′端，羥基端為3′端，在進行PCR操作時，引物應(yīng)分別與基因兩條鏈的3′端結(jié)合，根據(jù)圖中兩端的堿基序列，通常選擇5′－CTTGGATGAT－3′(上面鏈的引物)和5′－TCTGTTGAAT－3′(下面鏈的引物)作為引物對，A符合題意。2．(2021·湖北，16)某實驗利用PCR技術(shù)獲取目的基因，實驗結(jié)果顯示除目的基因條帶(引物與模板完全配對)外，還有2條非特異條帶(引物和模板不完全配對)。為了減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，以下措施中有效的是()A．增加模板DNA的量B．延長熱變性的時間C．延長延伸的時間D．提高復(fù)性的溫度答案D解析增加模板DNA的量可以提高反應(yīng)速度，但不能有效減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，A不符合題意；延長熱變性的時間不影響引物和模板配對，故不能有效減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，B不符合題意；一般根據(jù)待擴增片段的長度適當延長延伸的時間，但延伸時間過長可能會出現(xiàn)非特異性擴增，C不符合題意；復(fù)性溫度過低會造成引物與模板的結(jié)合位點增加，故可通過提高復(fù)性的溫度來減少反應(yīng)非特異條帶的產(chǎn)生，D符合題意。3．以下兩組引物設(shè)計的均不合理的原因是________________________________________________________________________________________________________________。答案引物Ⅰ和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效，引物Ⅰ′自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。引物設(shè)計的優(yōu)劣對PCR反應(yīng)的效率和特異性影響很大，引物設(shè)計的原則主要包括：(1)引物長度一般為20～30bp，可定位目的基因并為子鏈的延伸提供3′端。(2)引物中CG含量要適宜，CG含量越高，復(fù)性(退火)溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。(3)引物自身、引物之間不能有連續(xù)4個堿基互補，否則引物會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或二聚體，影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。(4)引物的5′端可以修飾(添加酶切位點、引入突變序列)，但3′端不可修飾(與模板DNA配對)。類型二利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物4．(2024·黑吉遼，7)關(guān)于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的實驗，下列敘述正確的是()A．瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小B．凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置C．在同一電場作用下，DNA片段越長，向負極遷移速率越快D．瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來答案A解析在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)，需根據(jù)待分離DNA片段的大小配制瓊脂糖溶液，故瓊脂糖凝膠濃度的選擇需要考慮待分離DNA片段的大小，A正確；凝膠載樣緩沖液指示劑通常是一種顏色較深的染料，可以作為電泳進度的指示分子，B錯誤；DNA片段的遷移速率與其大小成反比，且DNA在電場中從負極向正極移動，C錯誤；瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在波長為300nm的紫外燈(不是紫光燈)下被檢測，并且需染色，D錯誤。1．DNA電泳鑒定中的“兩液兩劑”兩液：電泳緩沖液與凝膠載樣緩沖液。電泳緩沖液能維持整個電泳體系的pH穩(wěn)定，提供導(dǎo)電介質(zhì)；凝膠載樣緩沖液可影響物質(zhì)的電泳遷移速率，主要用于樣品的稀釋和保護，同時通過指示劑指示樣品在凝膠中的位置。兩劑：核酸染料與指示劑。核酸染料是用來染色DNA或RNA分子的一種化學物質(zhì)，以便在紫外燈下觀察和檢測核酸條帶，最常用的核酸染料是溴化乙錠。最常用的指示劑是溴酚藍，它在電泳凝膠中的遷移速度與DNA或RNA分子的遷移速度相近。在電泳過程中，溴酚藍通常位于樣品的前沿，形成一個明顯的藍色條帶，這有助于實驗者判斷電泳是否完成，以及何時停止電泳。2．DNA遷移速率的影響因素(1)凝膠濃度：凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，DNA遷移受到的阻力越大，速率越慢。(2)DNA分子的大?。篋NA的分子量越大，遷移速率越慢。(3)DNA分子的構(gòu)象：三種構(gòu)象的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳的前后順序為環(huán)形超螺旋(DNA兩條鏈都是完整的質(zhì)粒)>線形>開環(huán)(DNA雙鏈斷了一條成為松弛的環(huán))。類型三利用PCR技術(shù)鑒定目的基因的連接方式——正向連接和反向連接5．(2019·江蘇，33節(jié)選)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計引物進行PCR鑒定。圖示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時應(yīng)選擇的一對引物是______。某學生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴增出了400bp片段，原因是________________。答案乙、丙目的基因反向連接解析分析題圖可知，理論上可以選擇的引物組合有甲和丙、乙和丙兩種情況。如果選擇甲和丙這對引物，則無論目的基因是否正確插入，擴增的片段都是50＋300＋100＝450(bp)，不符合要求；如果選擇乙和丙這對引物，正向連接和反向連接后所得結(jié)果不同，所以應(yīng)選擇乙和丙這對引物進行PCR鑒定。如果目的基因和質(zhì)粒反向連接，則引物乙會出現(xiàn)在重組質(zhì)粒的外側(cè)，此時若加入引物甲和乙，則可以擴增出300＋100＝400(bp)的片段。檢測目的基因在受體細胞內(nèi)是否穩(wěn)定存在是基因工程操作的重要步驟，可以借助載體上的標記基因、PCR技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)等方法鑒定受體細胞中是否轉(zhuǎn)入了目的基因。在實際操作中，PCR技術(shù)不僅可以精準地鑒定受體細胞是否轉(zhuǎn)入目的基因，還可以通過引物的巧妙設(shè)計鑒定目的基因的連接方式。類型四利用PCR技術(shù)引導(dǎo)基因定點突變及融合基因的重組構(gòu)建——重疊延伸PCR6．水蛭素是一種蛋白質(zhì)，可用于預(yù)防和治療血栓。某科研團隊運用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因中的特定位點引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密碼子為AAC、AAU)替換為賴氨酸(密碼子為AAA、AAG)，從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如圖。注：圖中的引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補的突變位點。(1)由以上事例可知，要對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行改造，需要通過________________來完成。(2)若擬突變位點的堿基對為A－T，則需要讓其突變?yōu)開_____________才能達到目的。引物2的突變位點(突起處)應(yīng)設(shè)計為______________(假設(shè)引物為單鏈DNA)。(3)在第一階段獲得2種具有重疊片段DNA的過程中，引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進行一次復(fù)制，共產(chǎn)生____種DNA分子。該階段必須將引物1、2和引物3、4置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中，這是因為_____________________________________________________________________________________________________________。(4)利用重疊延伸PCR技術(shù)還可以將兩個不同來源的DNA片段拼接起來。有人想利用該技術(shù)把基因M和N拼接在一起，設(shè)計基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在設(shè)計這4種引物時，特別要注意的問題是________________________________________________________________________________________________________________________。答案(1)改造基因(或基因定點突變)(2)T－A或C－GA或G(3)3引物2和3中存在互補配對片段，置于同一反應(yīng)系統(tǒng)時會結(jié)合而失去作用(4)M1、M2中的一種引物與N1、N2中的一種引物必須具有互補配對的片段解析(2)若擬突變位點的堿基對為A－T，則需要讓其突變?yōu)門－A或C－G，對應(yīng)的密碼子由AAU變成AAA或由AAC變成AAG，可使天冬酰胺替換為賴氨酸。(3)若兩個反應(yīng)系統(tǒng)均進行一次復(fù)制，則會產(chǎn)生3種不同的DNA分子，因為引物1和4產(chǎn)生的DNA分子是一樣的。(4)重疊互補引物的設(shè)計是重疊延伸PCR技術(shù)成功的關(guān)鍵。拼接基因M和N時，需要找到兩種基因的重疊部分，即M1、M2中的一種引物與N1、N2中的一種引物必須具有互補配對的片段。重疊延伸PCR技術(shù)：采用具有互補配對片段的引物，分別進行PCR，獲得有重疊鏈的兩種DNA片段，再在隨后的擴增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸獲得想要的目的基因或?qū)⒉煌瑏碓吹娜我釪NA片段連接起來。類型五利用PCR技術(shù)擴增未知基因序列——反向PCR7．(2020·江蘇，33節(jié)選)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖(以EcoRⅠ酶切為例)：請據(jù)圖回答問題：(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種______________酶，它通過識別特定的________________切割特定位點。(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′－羥基與5′－磷酸間形成________________；PCR循環(huán)中，升溫到95℃是為了獲得____________；TaqDNA聚合酶的作用是催化__________________________________________________________________。(3)若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是________(從引物①②③④中選擇，填編號)。DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′答案(1)限制性內(nèi)切核酸(或限制)核苷酸序列(2)磷酸二酯鍵DNA單鏈以DNA為模板的DNA鏈的延伸(3)②④解析(3)PCR過程中，根據(jù)已知的DNA序列合成兩個引物，要注意模板鏈和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能夠和相應(yīng)模板的核苷酸序列發(fā)生堿基互補配對，環(huán)狀DNA圖中顯示PCR過程是從已知DNA序列的兩端分別向相反方向形成子鏈，一個引物是與已知DNA序列的第一條鏈的左端互補結(jié)合延伸形成子鏈，該引物是④，另一個引物是與已知DNA序列的第二條鏈的右端互補結(jié)合延伸形成子鏈，該引物是②。反向PCR是反向互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段。利用在已知序列內(nèi)部沒有切點的限制性內(nèi)切酶對此段DNA進行酶切，在DNA連接酶作用下自連形成環(huán)狀DNA分子，然后利用方向合適并與已知序列兩端互補的引物，以連接成環(huán)的DNA為模板，經(jīng)PCR擴增，得到已知序列的旁側(cè)DNA片段。類型六利用PCR技術(shù)快速檢測病原體——熒光定量PCR8．猴痘是由猴痘病毒(一種RNA病毒)感染所致的一種病毒性人畜共患病，臨床上表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹、淋巴結(jié)腫大等。猴痘病毒感染的常規(guī)檢測方法是通過實時熒光PCR鑒定。(1)首先，從樣本中提取病毒RNA，經(jīng)________酶作用生成cDNA；然后以cDNA為模板進行實時熒光PCR擴增，測定樣品中病毒核酸量。(2)通過實時熒光PCR擴增目的基因，需額外添加熒光標記探針(一小段單鏈DNA，可與目的基因中部分序列特異性結(jié)合)。當探針完整時，不產(chǎn)生熒光。在PCR過程中，與目的基因結(jié)合的探針被TaqDNA聚合酶水解，R與Q分離后，R發(fā)出的熒光可被檢測到(如圖1)。①當樣本中有目的基因時，引物和探針與目的基因復(fù)性時，通過________________原則而特異性結(jié)合。②在PCR循環(huán)的延伸階段，TaqDNA聚合酶催化子鏈的合成并水解探針。檢測到的熒光強度與反應(yīng)體系中DNA分子數(shù)呈__________(填“正相關(guān)”或“負相關(guān)”)。(3)通過實時熒光PCR檢測猴痘病毒感染時，檢測到的熒光強度變化如圖2所示。①與指數(shù)增長期相比，線性增長期目的基因數(shù)量的增長率下降，原因可能有______________________________。②Ct值的含義：在PCR擴增過程中，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的熒光閾值時所經(jīng)歷的擴增循環(huán)數(shù)。因此，當樣本中初始模板越多時，Ct值就____________。③某新猴痘病毒核酸檢測說明書標明，Ct≤37判定為陽性，Ct>40或無Ct值判定為陰性。圖2所示猴痘病毒核酸檢測結(jié)果應(yīng)判定為____________。(4)陰性結(jié)果也不能排除猴痘病毒感染，可能產(chǎn)生假陰性的因素有____________(多選)。a．取樣太早，樣本中病毒量少，達不到實時熒光PCR檢測閾值b．樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解c．病毒發(fā)生變異答案(1)逆轉(zhuǎn)錄(2)①堿基互補配對②正相關(guān)(3)①TaqDNA聚合酶活性下降、引物濃度下降、原料dNTP濃度下降②越小③陽性(4)abc解析(1)由病毒RNA生成cDNA的過程屬于逆轉(zhuǎn)錄，需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化。(2)②在PCR循環(huán)的延伸階段，TaqDNA聚合酶催化子鏈的合成并水解探針。根據(jù)題干信息可知，熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物數(shù)量完全同步，檢測到的熒光強度與反應(yīng)體系中DNA分子數(shù)呈正相關(guān)。(3)②樣本中初始模板越多時，達到設(shè)定的熒光閾值時所經(jīng)歷的擴增循環(huán)數(shù)就越少，Ct值就越小。③Ct≤37判定為陽性，Ct>40或無Ct值判定為陰性。圖2中熒光閾值大概是25，猴痘病毒核酸檢測結(jié)果應(yīng)判定為陽性。(4)陰性結(jié)果也不能排除猴痘病毒感染，可能產(chǎn)生假陰性的因素有取樣太早，樣本中病毒量少，達不到實驗時熒光PCR檢測閾值；樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解，從而導(dǎo)致樣本中病毒量少；病毒發(fā)生變異，檢測不出來，從而出現(xiàn)假陰性，故選a、b、c。熒光定量PCR通過在反應(yīng)體系中加入能夠指示反應(yīng)進程的熒光探針，當耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會水解探針，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，即每擴增一次，就有一個熒光分子生成，通過熒光信號的積累來監(jiān)測擴增產(chǎn)物的積累。Ct值是熒光信號達到熒光閾值時PCR循環(huán)數(shù)，模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在一定線性關(guān)系，起始模板量濃度越高，Ct值越??；起始模板量濃度越低，Ct值越大。課時精練選擇題1～2題，每小題7分，3～8題，每小題8分，共62分。一、選擇題1．(2024·武漢期末)基因工程中，通過PCR可以特異性地快速擴增目的基因，PCR產(chǎn)物常采用瓊脂糖凝膠電泳實驗進行鑒定。下列有關(guān)該實驗的敘述，正確的是()A．在同一電場作用下，DNA片段越長遷移速率越快B．DNA分子在凝膠中的遷移速率與凝膠的濃度無關(guān)C．瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紅外燈下被檢測出來D．如果引物特異性不強，擴增出來的條帶可能不止一條答案D解析在同一電場作用下，DNA片段越長遷移速率越慢，A錯誤；凝膠的濃度會影響DNA分子在凝膠中的遷移速率，B錯誤；瓊脂糖凝膠中的DNA分子經(jīng)過核酸染料染色后可在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來，C錯誤；如果引物特異性不強，引物可能會與目的基因以外的其他的DNA片段結(jié)合，擴增出來的條帶可能不止一條，D正確。2．(2025·武漢一模)油菜的綠葉對黃化葉為顯性。與綠葉基因相比，黃化葉基因有一個堿基對發(fā)生了改變，從而出現(xiàn)一個限制酶B的酶切位點。為鑒定某綠葉油菜的基因型，提取其DNA進行了PCR和電泳。下列敘述正確的是()A．需設(shè)計能與目的基因結(jié)合的雙鏈DNA作為PCR引物B．應(yīng)在PCR擴增體系中添加Mg2＋，以激活DNA聚合酶C．可適當降低復(fù)性的溫度，以減少PCR中非特異性條帶的產(chǎn)生D．用限制酶B作用后進行電泳，若有2條電泳條帶可判斷為雜合子答案B解析引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，A錯誤；PCR過程中用到了緩沖液，緩沖液中一般要添加Mg2＋用于激活DNA聚合酶，B正確；復(fù)性溫度過低會導(dǎo)致引物與模板鏈的結(jié)合不牢固，會增加PCR中非特異性條帶，C錯誤；與綠葉基因相比，黃化葉基因有一個堿基對發(fā)生了改變，從而出現(xiàn)一個限制酶B的酶切位點，用限制酶B作用后進行電泳，若有3條電泳條帶可判斷為雜合子，D錯誤。3．(2024·廈門質(zhì)檢)如圖表示PCR過程中某個階段反應(yīng)體系的情況，①②③④表示相關(guān)物質(zhì)，L、R表示方向。下列敘述正確的是()A．②鏈從L到R的方向為3′→5′，①②鏈均可作為子鏈合成的模板B．PCR過程需要通過解旋酶斷開氫鍵，且為邊解旋邊復(fù)制C．以1個DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)需消耗8個引物③D．物質(zhì)③的5′端添加了某序列，至少需經(jīng)2次循環(huán)才可獲得該序列的雙鏈產(chǎn)物答案D解析根據(jù)DNA分子中兩條鏈的反向平行關(guān)系及圖示可判斷，②鏈從L到R的方向為5′→3′，A錯誤；PCR過程是通過高溫將雙鏈DNA之間的氫鍵斷開，并且是全部解旋之后才進行復(fù)制，B錯誤；以1個DNA為模板經(jīng)3次循環(huán)產(chǎn)生的DNA分子數(shù)目為23＝8，需消耗7個引物③，C錯誤。4．(2024·重慶模擬)不對稱PCR是利用不等量的一對引物來產(chǎn)生大量單鏈DNA(ssDNA)的方法，如圖所示。不對稱PCR中加入的一對引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較多的被稱為非限制性引物，兩者的比例通常為1∶100。PCR反應(yīng)最初的若干次循環(huán)中，其擴增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA(dsDNA)，但當限制性引物消耗完后，就會產(chǎn)生大量的ssDNA。下列相關(guān)說法錯誤的是()A．用不對稱PCR方法擴增目的基因時，不需要知道基因的全部序列B．進行最初若干次循環(huán)的目的是增加模板DNA的量C．最后大量獲得的ssDNA與圖中乙鏈的堿基序列一致D．因為雙鏈DNA和單鏈DNA的分子量大小不同，可通過電泳方法將其分離答案C解析不對稱PCR中加入的一對引物中含量較多的被稱為非限制性引物，非限制性引物與乙鏈結(jié)合，最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿基序列一致，C錯誤。5.反向PCR是一種通過已知序列設(shè)計引物對未知序列(圖中L、R)進行擴增的技術(shù)，其過程如圖所示。下列相關(guān)敘述不正確的是()A．過程①用同一種限制酶對未知序列兩端進行切割B．過程②需要使用DNA連接酶，形成磷酸二酯鍵C．過程③PCR體系需要添加耐高溫的DNA聚合酶和解旋酶D．該技術(shù)可檢測T－DNA整合到植物染色體DNA的位置答案C解析過程③即PCR擴增，PCR技術(shù)中DNA解旋是在高溫下實現(xiàn)的，不需要加入解旋酶，C錯誤。6．(2024·無錫模擬)重疊延伸PCR可實現(xiàn)定點基因誘變，其操作過程如圖所示(凸起處代表突變位點)。下列說法正確的是()A．過程①需要把兩對引物同時加入一個擴增體系以提高擴增效率B．過程①需要2輪PCR才能得到圖中所示PCR產(chǎn)物C．過程②的產(chǎn)物都可以完成延伸過程D．若過程④得到16個突變基因，則需要消耗15個通用引物RP2答案D解析兩種突變引物能互補配對，因此過程①必須分兩個反應(yīng)系統(tǒng)進行，A錯誤；過程①至少需要3輪PCR才能得到圖中所示PCR產(chǎn)物，B錯誤；過程②獲得的產(chǎn)物不都可以完成延伸過程，因為子鏈只能從引物的3′端開始延伸，C錯誤；若過程④得到16個突變基因，由于模板中不含有通用引物，則產(chǎn)生16個突變基因共需要消耗16×2－2＝30(個)通用引物，而需要通用引物RP2的數(shù)量為30÷2＝15(個)，D正確。7.(2024·安順調(diào)研)熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測樣本中DNA含量，用于病毒檢測。其原理是在PCR反應(yīng)體系中加入引物的同時，加入與某條模板鏈互補的熒光探針。當耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會水解探針，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，即每擴增一次，就有一個熒光分子生成(如圖)。通過實時檢測熒光信號強度，可得Ct值(熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù))。下列相關(guān)敘述錯誤的是()A．PCR每個循環(huán)包括變性、復(fù)性(引物和模板結(jié)合)、延伸3個階段B．耐高溫的DNA聚合酶在該反應(yīng)中的作用是形成磷酸二酯鍵和水解磷酸二酯鍵C．最終監(jiān)測的熒光強度與起始時反應(yīng)管內(nèi)樣本DNA的含量呈正相關(guān)D．Ct值越大表示被檢測樣本中病毒數(shù)目越多，患者危險性更高答案D解析Ct值越小，說明所需循環(huán)的次數(shù)越少，被檢測樣本中病毒數(shù)目越多，D錯誤。8．(2025·成都期末)某科研小組采用PCR技術(shù)構(gòu)建了紅色熒光蛋白基因(dsred2)和α淀粉酶基因(amy)的dsred2－amy融合基因，其過程如圖所示，其中引物②和引物③中部分序列(灰色區(qū)域)可互補配對。下列說法錯誤的是()A．利用PCR技術(shù)擴增基因時不需要解旋酶來打開DNA雙鏈B．不能在同一反應(yīng)體系中進行dsred2基因和amy基因的擴增C．dsred2基因和amy基因混合后只能得到一種類型的雜交鏈D．雜交鏈延伸得到dsred2－amy融合基因的過程不需要加引物答案C解析利用PCR技術(shù)擴增基因時，高溫變性使DNA雙鏈解旋，不需要解旋酶來打開DNA雙鏈，A正確；引物②和引物③中部分序列可互補配對，引物之間的結(jié)合會干擾引物和模板鏈的結(jié)合，從而影響PCR過程，因此不能在同一個反應(yīng)體系中進行dsred2基因和amy基因的擴增，B正確；dsred2基因和amy基因混合可以得到兩種類型的雜交鏈，C錯誤；雜交鏈延伸得到dsred2－amy融合基因的過程中，不需要加入引物，兩條母鏈的起始位置的堿基序列即為引物，可以作為子鏈合成的引物，D正確。二、非選擇題9．(12分)(2025·長沙模擬)水稻穗粒數(shù)可影響水稻產(chǎn)量。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的T－DNA可以轉(zhuǎn)移并隨機插入野生型水稻基因組中(可在基因組單一位點插入也可以同時插入多個位點)，導(dǎo)致被插入的基因功能喪失，從而得到一系列水稻突變體。研究者從中篩選得到一株穗粒數(shù)異常突變體，為確定T－DNA插入植物細胞的染色體位置，可根據(jù)T－DNA序列，擴增其兩側(cè)未知序列比對，從而確定插入的染色體。(1)圖1所示序列使用限制酶酶切后，將所得DNA使用__________酶連成環(huán)狀(如圖2)，再設(shè)計引物進行PCR擴增，其中復(fù)性過程的作用是____________________________。(2)請根據(jù)圖1的T－DNA的一條鏈的堿基序列，選出PCR中使用的引物序列是______和______(填序號)。T－DNA序列引物序列5′－AACTATGCGC……CGTAGCCTAT－3′①5′－GCGCATAGTT－3′②5′－ATAGGCTACG－3′③5′－CGTAGCCTAT－3′④5′－AACTATGCGC－3′(3)由圖2中環(huán)狀DNA至少經(jīng)過______輪循環(huán)才能得到圖示鏈狀PCR產(chǎn)物(如圖3)。(4)經(jīng)過與野生型水稻基因組序列比對，確定T－DNA插入2號染色體上的B基因中。研究發(fā)現(xiàn)，該突變體產(chǎn)量明顯低于野生型，據(jù)此推測B基因可______(填“促進”或“抑制”)水稻穗粒的形成，從而控制高產(chǎn)性狀。答案(1)DNA連接使引物通過堿基互補配對結(jié)合到模板鏈上(2)①③(3)3(4)促進解析(2)T－DNA序列引物序列5′—AACTATGCGC……CGTAGCCTAT—3′3′—TTGATACGCG……GCATCGGATA—5′5′—GCGCATAGTT—3′5′－CGTAGCCTAT－3′據(jù)上述分析，PCR中使用的引物序列是①和③。(4)該突變體產(chǎn)量明顯低于野生型，而突變體內(nèi)B基因由于插入了T－DNA功能喪失，據(jù)此推測B基因促進水稻穗粒的形成。10．(14分)(2025·安慶模擬)巢式PCR是一種特殊的聚合酶鏈式反應(yīng)，使用兩組不同的引物實現(xiàn)對目標DNA片段的擴增。第一組外引物大小為25bp，復(fù)性溫度較高(68℃)，擴增后得到中間產(chǎn)物；第二組內(nèi)引物大小為17bp，復(fù)性溫度較低(46℃)，內(nèi)引物的結(jié)合部位在中間產(chǎn)物內(nèi)部。具體過程如圖一所示，回答下列問題：(1)巢式PCR反應(yīng)體系中除模板、引物、Mg2＋外，還應(yīng)加入____________________________(答出兩點即可)等。(2)巢式PCR時，復(fù)性溫度與引物長度呈________(填“正相關(guān)”或“負相關(guān)”)。若使用外引物進行第一次PCR擴增時產(chǎn)生了錯誤片段，則使用內(nèi)引物進行第二次PCR擴增時，完成配對并擴增的概率會__________。由此可知，巢式PCR相較于常規(guī)PCR具有的優(yōu)點是________________________________________________________________________。(3)家畜胚胎的性別鑒定技術(shù)對畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義?？蒲腥藛T利用多重巢式PCR技術(shù)同時擴增奶牛Y染色體上的雄性決定基因(SRY)和常染色體上的酪蛋白基因(CSN1S1)，進行早期胚胎性別鑒定和胚胎移植，獲得高產(chǎn)奶牛。實驗?zāi)康姆椒ú襟E要點囊胚樣品DNA提取選取滋養(yǎng)層細胞提取DNAPCR引物的設(shè)計和合成根據(jù)牛的SRY和CSN1S1基因序列設(shè)計并合成a.______對引物PCR擴增預(yù)變性→變性→復(fù)性→延伸鑒定分析采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定，確定胚胎性別b._______________對受體奶牛注射前列腺素胚胎移植將符合要求的胚胎移植到受體奶牛的子宮內(nèi)①請將表格內(nèi)容補充完整：a是____________；b是________________。②巢式PCR產(chǎn)物鑒定結(jié)果如圖二所示，1～5號為取自不同胚胎的DNA樣品，其中符合要求的胚胎是__________。答案(1)緩沖液、耐高溫的DNA聚合酶(或TaqDNA聚合酶)、4種脫氧核苷酸(或dNTP)(2)正相關(guān)下降特異性強、靈敏度高(3)①4同期發(fā)情②1、2、4解析(2)PCR過程包括高溫變性、低溫復(fù)性、中溫延伸，巢式PCR時，復(fù)性溫度與引物長度呈正相關(guān)。巢式PCR時，若使用外引物進行第一次PCR擴增時產(chǎn)生了錯誤片段，再使用內(nèi)引物擴增，在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率會下降，因此，相比于常規(guī)PCR而言，巢式PCR特異性強、靈敏度高。(3)①本實驗用巢式PCR技術(shù)，用的是兩輪PCR，因此擴增一種基因片段則需要設(shè)計2對引物，而擴增2種基因片段則需要設(shè)計4對引物。在胚胎移植前需要對受體奶牛進行同期發(fā)情處理，便于移植。②題中利用多重巢式PCR技術(shù)同時擴增Y染色體上的雄性決定基因(SRY)和常染色體上的酪蛋白基因(CSNIS1)并進行電泳，雌性個體沒有SRY，只有一條帶，雄性有兩條帶，因此1、2、4是雌性，3、5是雄性，故符合要求的胚胎是1、2、4。11．(12分)(2023·江蘇，22節(jié)選)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達，運用重組酶技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒，如圖1所示。請回答下列問題：(1)分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應(yīng)體系中不同的有______________，擴增程序中最主要的不同是________________。(2)將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)化細菌。這一過程與傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建