流感病毒細(xì)胞

分離培養(yǎng)PPT匯

報

人：XXXX2025年12月16日流感病毒生物學(xué)特性MDCK細(xì)胞分離標(biāo)

準(zhǔn)操作引言與技術(shù)背景細(xì)胞分離培養(yǎng)基礎(chǔ)CONTENTS目

錄02040103新型懸浮細(xì)胞分離技術(shù)質(zhì)量控制與生物安全病毒鑒定與滴度測定應(yīng)用前景與技術(shù)挑戰(zhàn)CONTENTS目

錄0507060801引言與技術(shù)背景流感的疾病負(fù)擔(dān)與傳播特點流感是至今尚無法完全控制的病毒性急性呼吸道傳染病，具有高度傳染性，傳播速度快，抗原變

異性強(qiáng)，尤其甲型流感變異顯著,可引發(fā)季節(jié)性

流行甚至全球大流行，對人群健康造成嚴(yán)重威脅。為疫苗研發(fā)與疫情防控提供支撐流感監(jiān)測的主要目的是及時發(fā)現(xiàn)有意義的流感病

毒新變種，用于診斷試劑制備、疫苗生產(chǎn)及疫情預(yù)報。病毒分離培養(yǎng)技術(shù)為疫苗株的篩選和制備、

抗病毒藥物研發(fā)以及病毒抗原檢測等提供了重要

的實驗材料和技術(shù)支持。病毒分離是病原檢測的金標(biāo)準(zhǔn)病毒分離是診斷病毒性疾病最常用且高度敏感的方法之一，分離出的病毒可長期保存，用于抗原

性、基因特性或藥物敏感性等分析，在流感診斷

中具有不可替代的地位，是及時發(fā)現(xiàn)新變種(尤

其大流行株)的關(guān)鍵。我國流感監(jiān)測的國際關(guān)注度我國是流感的多發(fā)地，中國的流感動態(tài)受到世界

各國的關(guān)注。流感是國際上第一個實現(xiàn)全球監(jiān)測

的傳染病，我國實驗室采用的流感病毒分離方法

(

如MDCK細(xì)胞分離和雞胚分離)為全球流感防控

貢獻(xiàn)數(shù)據(jù)與力量。流感病毒的公共衛(wèi)生意義流感診斷的核心方法病毒分離是流感診斷最常用和最

可靠的方法之一，尤其在流感監(jiān)測中，對于及時發(fā)現(xiàn)有意義的流

感病毒新變種(尤其是大流行株)

具有不可替代的作用，可用于診

斷試劑制備、疫苗生產(chǎn)及疫情預(yù)

報。其他方法無法完全替代在流感診斷中，任何方法都不能完全替代病毒分離這一方法。盡

管有其他檢測技術(shù)的發(fā)展，但病

毒分離在病毒抗原性、基因特性

及藥物敏感性等分析方面具有獨

特優(yōu)勢，是流感病毒分離的金標(biāo)準(zhǔn)。高度敏感的病原檢測手段分離病毒是診斷病毒性疾病高度

敏感的方法之一，能從臨床標(biāo)本

中獲取活體病毒，為后續(xù)的免疫學(xué)、基因分析或電子顯微鏡鑒定確診提供基礎(chǔ)，且分離出的病毒

可長期保存用于深入研究。病毒分離培養(yǎng)的金標(biāo)準(zhǔn)地位01傳統(tǒng)雞胚培養(yǎng)技術(shù)的奠基早期流感病毒分離主要依賴雞胚培養(yǎng)，利用9-11日齡雞胚的羊膜腔和

尿囊腔進(jìn)行病毒增殖，具有操作簡單、病毒滴度高等優(yōu)點，但存在傳

代細(xì)胞含致癌因子、不適用于疫苗生產(chǎn)等局限，且對“0”相毒株敏感

性較低。02MDCK細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的興起隨著技術(shù)發(fā)展，

MDCK

(狗腎細(xì)胞)成為分離流感病毒的常用細(xì)胞系，

其分離陽性率高、應(yīng)急性強(qiáng)且經(jīng)濟(jì)方便。通過在維持液中添加TPCK處

理胰酶等關(guān)鍵試劑，可提高病毒復(fù)制能力，但該細(xì)胞屬腫瘤細(xì)胞系，

分離的病毒不能用于疫苗生產(chǎn)。03懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的突破為進(jìn)一步提升分離效率，懸浮細(xì)胞法應(yīng)運而生，如susMDCK細(xì)胞株。該

方法通過增加病毒與細(xì)胞接觸面積，簡化操作步驟(無需胰酶消化和

洗滌吸附),可提高H3N2等亞型流感病毒的分離率及血凝滴度，需專

用搖床等硬件支持。04多方法協(xié)同應(yīng)用的現(xiàn)狀目前實驗室普遍采用雞胚和MDCK細(xì)胞兩種方法協(xié)同分離病毒，同時積

極探索懸浮細(xì)胞法等新技術(shù)。傳統(tǒng)方法與現(xiàn)代技術(shù)結(jié)合，旨在平衡分

離效率、生物安全性及成本，以應(yīng)對流感病毒變異及監(jiān)測需求。細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展歷程02流感病毒生物學(xué)特性病毒結(jié)構(gòu)與關(guān)鍵蛋白功能核心結(jié)構(gòu)與基因組特點病毒核心包含單股負(fù)鏈RNA基因組，分為8個節(jié)

段，編碼10種蛋白?；|(zhì)蛋白(M1)

位于包膜

內(nèi)側(cè)，維持病毒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定并參與病毒組裝。包膜糖蛋白及其作用包膜上鑲嵌血凝素(HA)

和神經(jīng)氨酸酶(NA)

兩種糖蛋白刺突。HA可與宿主細(xì)胞表面唾液酸

受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒吸附與入侵；NA能水解唾液酸，促進(jìn)子代病毒釋放?？乖宰儺惻c病毒特性HA和NA的抗原性易發(fā)生變異，是病毒逃避宿主

免疫系統(tǒng)攻擊的關(guān)鍵，也是流感疫苗需要定期更新的重要原因。病毒顆粒形態(tài)特征流感病毒顆粒呈球形或絲狀，直徑約80-120納

米，由包膜、基質(zhì)蛋白

(M1)

及核心(包含基

因組)組成。細(xì)胞病變特征

(CPE)

表現(xiàn)MDCK細(xì)胞感染流感病毒后，典型病變?yōu)榧?xì)胞腫脹圓化、

間隙增大呈網(wǎng)狀，細(xì)胞核固縮或破裂，嚴(yán)重時細(xì)胞部分

或全部脫落。每日需在顯微鏡下觀察CPE,75%～100%細(xì)胞病變時即可收獲病毒。細(xì)胞受體特異性與宿主范圍病毒HA蛋白與宿主細(xì)胞表面特異性唾液酸受體結(jié)合，決定其宿主范圍和組織嗜性。不同動物流感病毒間存在種

間屏障，如人流感病毒主要識別α-2,6-糖苷鍵受體，禽流感病毒則偏好α-2,3-糖苷鍵受體。流感病毒復(fù)制周期階段流感病毒復(fù)制周期包括吸附與入侵、復(fù)制、組裝、釋放

四個階段。病毒通過HA蛋白與宿主細(xì)胞表面唾液酸受體

結(jié)合，經(jīng)內(nèi)吞作用入侵；在宿主細(xì)胞內(nèi)完成基因組復(fù)制

與病毒顆粒組裝后，通過細(xì)胞裂解或胞吐作用釋放子代

病

毒

。宿主細(xì)胞類型選擇依據(jù)流感病毒主要感染呼吸道上皮細(xì)胞，實驗室常用MDCK(犬腎細(xì)胞)、A549

(人肺癌細(xì)胞)和Vero

(非洲綠猴

腎細(xì)胞)等。

MDCK細(xì)胞因?qū)α鞲胁《久舾行愿?，是分離

培養(yǎng)的首選細(xì)胞系。病毒復(fù)制周期與細(xì)胞嗜性02040301傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的敏感性差異傳統(tǒng)MDCK細(xì)胞分離培養(yǎng)法對H3N2亞型流感病毒的分離率不及HIN1及Bv

、By亞型，毒株血凝滴度也相對

較低：雞胚培養(yǎng)法對目前H3N2亞型流感病毒則不敏

感?？乖儺惖暮诵奶卣髁鞲胁《究乖砸装l(fā)生變異，尤其是甲型流感病毒

的血凝素

(HA)

和神經(jīng)氨酸酶

(NA),

其變異可導(dǎo)

致病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊，是流感流行和大流

行的重要原因。"0"相毒株培養(yǎng)的特殊難題"0"相毒株在雞胚中生長特性較差，需要連續(xù)傳代多

次才能適應(yīng)雞胚培養(yǎng)，盲傳后HA滴度仍可能為陰性，

增加了分離培養(yǎng)的難度和周期。培養(yǎng)條件對變異株的影響細(xì)胞代數(shù)增加會導(dǎo)致MDCK細(xì)胞對病毒敏感性下降；

不同培養(yǎng)方法(如雞胚與細(xì)胞培養(yǎng))分離的病毒抗

原性狀可能存在差異，影響后續(xù)研究和應(yīng)用?？乖儺愋耘c培養(yǎng)挑戰(zhàn)03細(xì)胞分離培養(yǎng)基礎(chǔ)細(xì)胞分離基本原理利用MDCK等易感細(xì)胞系的增殖特性，使流感病毒在細(xì)

胞內(nèi)復(fù)制，通過觀察細(xì)胞病變效應(yīng)

(CPE)及后續(xù)鑒

定實現(xiàn)病毒分離。病毒表面血凝素

(HA)

與細(xì)胞表面

受體結(jié)合，在適宜培養(yǎng)條件下完成吸附、侵入、復(fù)制

和釋放過程。懸浮細(xì)胞分離原理采用susMDCK懸浮細(xì)胞株，通過無血清M-SUS培養(yǎng)液支

持細(xì)胞高密度擴(kuò)增，病毒接種無需洗滌和吸附步驟，

直接加入待檢標(biāo)本與TPCK-胰酶，在搖床培養(yǎng)條件下

利用增加的病毒吸附表面積提高分離效率。細(xì)胞分離技術(shù)核心優(yōu)勢病毒分離陽性率高，尤其對“0”相毒株敏感性優(yōu)于

雞胚；應(yīng)急性強(qiáng)，操作相對簡便經(jīng)濟(jì)；可減少宿主蛋

白成分，分離的病毒抗原性狀更接近自然流行株，為

疫苗研發(fā)和藥物敏感性分析提供優(yōu)質(zhì)毒株。傳統(tǒng)MDCK細(xì)胞分離原理選用75-90%成片生長的MDCK細(xì)胞，經(jīng)Hank's

液清洗后

接種臨床標(biāo)本，35℃、5%CO?培養(yǎng)箱吸附1-2小時，加

入含TPCK-胰酶的病毒生長液培養(yǎng)，通過觀察細(xì)胞腫

脹圓化、間隙增大、脫落等CPE判斷病毒增殖。細(xì)胞分離原理與技術(shù)優(yōu)勢Vero細(xì)胞系(非洲綠猴腎細(xì)胞)常用的哺乳動物細(xì)胞系，貼壁生長，對多種病毒敏感。在流感病毒研

究中也有應(yīng)用，可用于病毒分離和培養(yǎng)，但其對流感病毒的敏感性可

能稍低于MDCK細(xì)胞。該細(xì)胞系來源穩(wěn)定，常用于疫苗生產(chǎn)相關(guān)的研究，

但同樣需注意其生物安全性。susMDCK細(xì)胞系(懸浮MDCK細(xì)胞)由傳統(tǒng)貼壁MDCK細(xì)胞馴化而來的懸浮細(xì)胞系。與傳統(tǒng)MDCK細(xì)胞相比，

懸浮生長使其與病毒接觸面積增大，提高了病毒吸附和感染效率。培

養(yǎng)過程無需胰酶消化，標(biāo)本接種步驟簡化，可直接加入待檢標(biāo)本，便

于監(jiān)測病毒滴度，理論上能提高流感病毒分離陽性率和血凝滴度。MDCK細(xì)胞系(犬腎細(xì)胞)最常用的流感病毒分離細(xì)胞系，屬貼壁腫瘤細(xì)胞系。其表面存在流感

病毒特異性受體，對流感病毒敏感性高，能支持多種亞型流感病毒的

復(fù)制，可觀察到典型的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),如細(xì)胞腫脹圓化、間隙

增大、固縮脫落。但因是傳代腫瘤細(xì)胞系，分離的病毒不宜用于疫苗

生

產(chǎn)

。A549細(xì)胞系(人肺癌細(xì)胞)人源貼壁細(xì)胞系，可模擬人體呼吸道上皮細(xì)胞環(huán)境，用于研究流感病

毒與人類宿主細(xì)胞的相互作用。對流感病毒有一定的敏感性，能支持

病毒復(fù)制，但其分離效率可能不如MDCK細(xì)胞，更多應(yīng)用于病毒感染機(jī)

制等基礎(chǔ)研究。常用細(xì)胞系特性對比01020304核心設(shè)備與耗材要求MDCK細(xì)胞培養(yǎng)專用耗材需75-90%成片的MDCK細(xì)胞(如T-25培養(yǎng)瓶或細(xì)胞管)、

無菌移液管(1mL/10mL)

、15mL無菌離心管，以及細(xì)

胞凍存管(用于細(xì)胞株保存)。標(biāo)本處理與接種工具臨床標(biāo)本需置于2mL

Wheaton小瓶，配備雞蛋開孔器、

無菌注射器(用于雞胚接種)、照卵燈(雞胚定位)、

70-75%酒精(表面消毒)及無菌膠布/蠟(封孔用)。細(xì)胞培養(yǎng)核心設(shè)備包括35-37℃、5%CO?培養(yǎng)箱(控制細(xì)胞生長環(huán)境)、

40倍光學(xué)倒置顯微鏡(觀察細(xì)胞病變)、生物安全柜

(無菌操作平臺)、1000-3000rpm離心機(jī)(標(biāo)本及收

獲液離心處理)。關(guān)鍵試劑與培養(yǎng)基基礎(chǔ)試劑包括D-MEM培養(yǎng)基、1MHEPES緩沖液、TPCK

處理胰酶(終濃度2μg/mL)

、7.5%牛血清白蛋白組分

V

、10,000U/mL

青鏈霉素母液，均需在有效期內(nèi)使用。04MDCK細(xì)胞分離標(biāo)準(zhǔn)操作病毒生長液配制在500mlD-MEM液中加入5ml

青鏈霉素母液(終濃度100U/mL青霉素、100μg/mL鏈

霉素)、12.5ml7.5%牛血清

白蛋白組分V

(終濃度0.25%)

、12.5ml1MHEPES緩沖

液(終濃度25mM),

再加入

7.5%NaHCO310-15mL調(diào)節(jié)pH

至7.4-7.6,最后每500mL加

入0.5mLTPCK-胰酶母液(2mg/mL)

使終濃度達(dá)

2μg/mL。主要試劑與耗材包括TPCK處理胰酶(如SigmaT-8642)

、1MHEPES緩沖液、

D-MEM培養(yǎng)基

(GIBCO11965-

092)、青鏈霉素母液(10,000U/ml青霉素G,10,000μg/ml

硫酸鏈霉素)、

7.5%牛血清白蛋白組分V溶液，以及1ml和10ml無菌滴管、2ml

Wheaton小瓶盛放的臨床樣品。試劑管理要點嚴(yán)格檢查所有試劑有效期，確保在有效期內(nèi)使用；配制好的病毒生長液需現(xiàn)用現(xiàn)配，或按規(guī)定條件保存，避免反

復(fù)凍融影響活性。細(xì)胞與培養(yǎng)容器選用75-90%成片的MDCK細(xì)胞，

根據(jù)樣本量選擇T-25

培養(yǎng)瓶或組織培養(yǎng)管，確保細(xì)胞處

于對數(shù)生長期。實驗材料與試劑準(zhǔn)備基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇與添加物選用D-MEM培養(yǎng)基(如GIBCOBRL

Cat.#11965-092)作為基礎(chǔ)，每500ml中加入青、鏈霉素母液

5ml

(終濃度100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素)、7.5%牛血清

白蛋白組分V

12.5mL(終濃度0.25%)及1MHEPES緩沖液12.5mL

(終濃度25mM),調(diào)節(jié)pH至7.4-7.6。試劑有效期與配制要求嚴(yán)格檢查所有試劑有效期，HEPES緩沖液、胰酶等需按規(guī)定

條件儲存；配制過程全程無菌操

作

，NaHCO3調(diào)節(jié)終濃度至2-3%以

維持培養(yǎng)體系pH穩(wěn)定，配好的病

毒生長液應(yīng)在2-8℃短期保存并

盡快使用。病毒生長液關(guān)鍵成分在上述細(xì)胞維持液基礎(chǔ)上，每

500mL添加TPCK處理胰酶(如

Sigma

Cat.#T-8642或SIGMAT8802)0.5mL

(母液濃度2mg/mL),使終濃度達(dá)2μg/mL,

以促進(jìn)流感病毒HAO裂解為HA1+HA2,

增強(qiáng)病毒復(fù)制能力。培養(yǎng)基與病毒生長液配置吸附后清洗與營養(yǎng)液添加吸附結(jié)束后，用6mL

Hank's

液清洗細(xì)胞，去除未吸附的

標(biāo)本殘留物，加入5mL含2μg/mLTPCK-胰酶的病毒生

長液。接種前細(xì)胞清洗操作輕輕倒出MDCK細(xì)胞生長液，

用10mL無菌移液管吸取6mL

pH7.4-7.6

的Hank's

液清洗

細(xì)胞3遍，以去除殘留血清

及雜質(zhì)。臨床標(biāo)本接種方法用無菌移液管吸取500

μL處

理后的臨床樣品，均勻鋪于

細(xì)胞培養(yǎng)瓶底，溫和搖動使

標(biāo)本與細(xì)胞充分接觸。病毒吸附條件控制將接種后的細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于

35℃

、5%CO?培養(yǎng)箱中吸附

1～2h,

確保病毒顆粒有效

結(jié)合宿主細(xì)胞受體。標(biāo)本接種與吸附流程觀察工具與操作規(guī)范使用40倍光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀

態(tài)及病變情況，操作時需嚴(yán)格遵守生

物安全規(guī)定，在相應(yīng)生物安全級別的

實驗室中進(jìn)行。病變程度判斷標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)75%～100%細(xì)胞出現(xiàn)上述典型病

變特征時，即可判定為明顯病變并進(jìn)

行收獲；即使無明顯細(xì)胞病變，培養(yǎng)

至第7天也應(yīng)進(jìn)行收獲并檢測。細(xì)胞病變特征表現(xiàn)流感病毒感染MDCK細(xì)胞后，典型病變特征為細(xì)胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大

呈網(wǎng)狀，細(xì)胞核固縮或破裂，嚴(yán)重時

細(xì)胞部分或全部脫落。日常觀察頻率與時間將接種病毒后的細(xì)胞培養(yǎng)物放置于35℃5%CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日需在顯

微鏡下觀察細(xì)胞病變情況，直至第7

天無論是否出現(xiàn)病變均進(jìn)行收獲。細(xì)胞病變觀察與判斷標(biāo)準(zhǔn)病毒收獲與凍融處理05新型懸浮細(xì)胞分離技術(shù)病毒吸附能力提升懸浮狀態(tài)增加了病毒與細(xì)胞的吸

附表面積，提高了病毒吸附能力，

理論上能提高流感病毒分離陽性

率，尤其對H3N2亞型等傳統(tǒng)方法

敏感性較低的毒株效果顯著。培養(yǎng)操作簡化傳代只需稀釋無需胰酶消化，標(biāo)

本接種無需繁瑣的洗滌和吸附步

驟，可直接向細(xì)胞培養(yǎng)液中添加TPCK胰酶和標(biāo)本進(jìn)行病毒分離，

方便快捷。懸浮生長特性與貼壁MDCK細(xì)胞不同，susMDCK

細(xì)胞可在無血清的M-SUS培養(yǎng)液

中懸浮生長，搖床培養(yǎng)條件下細(xì)

胞計數(shù)可達(dá)(7~12)×10~6cell/mL。病毒滴度高效獲取使用專用無血清M-SUS培養(yǎng)液支

持細(xì)胞高密度擴(kuò)增，可獲得高效

價病毒，且便于隨時吸取上清進(jìn)

行血凝試驗監(jiān)測滴度。susMDCK細(xì)胞特性與優(yōu)勢細(xì)胞來源與馴化背景susMIDCK細(xì)胞株是由傳統(tǒng)貼壁MDCK細(xì)胞”馴化"而來的懸浮細(xì)胞

株，專為流感病毒分離培養(yǎng)優(yōu)化。病毒接種與培養(yǎng)選擇傳代培養(yǎng)3~4天、計數(shù)達(dá)(7~12)

×10?cell/mL

的細(xì)胞，用新鮮M-SUS培養(yǎng)液稀釋至(3.0~3.5)×10?cell/mL,加入適量TPCK胰酶和三抗后，直接加入待檢標(biāo)本，于37℃、

5%CO?、搖床轉(zhuǎn)速220rpm條件下培養(yǎng)。細(xì)胞復(fù)蘇與初始培養(yǎng)自液氮罐取出susMDCK細(xì)胞株，迅速

37℃水浴解凍，1000rpm離心5min,沉淀用1mL新鮮M-SUS培養(yǎng)液重懸后轉(zhuǎn)

移至含50mL新鮮M-SUS培養(yǎng)液的250mL

錐形瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱

搖床上，轉(zhuǎn)速120～130rpm。細(xì)胞傳代培養(yǎng)震蕩培養(yǎng)3~4天，細(xì)胞計數(shù)達(dá)(7~12)

×10?cell/mL

時，用新鮮M-SUS培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋至(0.81.2)×10?cell/mL,

相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)

培

養(yǎng)

。病毒收獲與監(jiān)測培養(yǎng)期間可隨時吸取上清進(jìn)行血凝試

驗監(jiān)測滴度，待病毒滴度達(dá)到要求或

培養(yǎng)至適宜天數(shù)后收獲病毒液，用于

后續(xù)鑒定或相關(guān)實驗。懸浮培養(yǎng)操作流程MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法vs

雞胚培養(yǎng)法：陽性率MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法在流感病毒分離中通常表現(xiàn)出更高的陽性率，尤其對于某些

亞型或“0”相毒株，其敏感性優(yōu)于雞胚培養(yǎng)法。MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法vs

雞胚培養(yǎng)法：操作便捷性MDCK細(xì)胞培養(yǎng)法操作相對簡便，無需繁瑣的雞胚準(zhǔn)備和接種過程，且結(jié)果判斷可通過觀察細(xì)胞病變

(CPE